यह प्रोटोकॉल मानव एम 1 में माइकोबैक्टीरियम तपेदिक संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है- या एम 2-ध्रुवीकृत मैक्रोफेज परिधीय-रक्त-मोनोसाइट्स के भेदभाव के आधार पर मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं के लिए जो जीएफपी-लेबल वाले उग्र तनाव एच37आरवी से संक्रमित हैं, और चयनित M1/M2 मार्कर की अभिव्यक्ति सहित 10-रंग पैनल का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री के साथ विश्लेषण किया।
मानव मैक्रोफेज इंट्रासेलुलर माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) संक्रमण की प्राथमिक मेजबान कोशिकाएं हैं और इस प्रकार तपेदिक (टीबी) के प्रतिरक्षा नियंत्रण में एक केंद्रीय भूमिका होती है। हमने एम 1 (शास्त्रीय रूप से सक्रिय) या एम 2 (वैकल्पिक रूप से सक्रिय) मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं में मायलॉयड-व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रतिरक्षा ध्रुवीकरण का पालन करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल स्थापित किया है, जो 10-रंग प्रवाह साइटोमेट्री पैनल के साथ मूल्यांकन के माध्यम से मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं को देखता है जो विविध मैक्रोफेज में एमटीबी लेबल वाले दृश्य और गहरे लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। स्वस्थ रक्तदाताओं से प्राप्त मोनोसाइट्स को क्रमशः ग्रैनुलोसिट मैक्रोफेज-कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) या मैक्रोफेज-कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) के साथ भेदभाव का उपयोग करके एम 1 या एम 2 कोशिकाओं में ध्रुवीकृत किया गया था, जिसके बाद क्रमशः आईएफएन-γ और लिपोपॉलिसाकराइड (एलपीएस) या आईएल-4 के साथ ध्रुवीकरण हुआ। पूरी तरह से ध्रुवीकृत M1 और M2 कोशिकाओं को 4 घंटे के लिए एमटीबी-GFP से संक्रमित थे इससे पहले कि अलग एमटीबी संक्रमित मैक्रोफेज 4 या 24 घंटे के बाद संक्रमण पर प्रवाह साइटोमेट्री के साथ दाग रहे थे । नमूना अधिग्रहण प्रवाह साइटोमेट्री के साथ किया गया था और डेटा का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। मैनुअल गेटिंग के साथ-साथ एक समान कई गुना सन्निकटन और प्रक्षेपण (यूएपी) और फेनोग्राफ विश्लेषण के साथ आयामीता में कमी की गई थी। इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप प्रभावी एम 1/एम 2 ध्रुवीकरण के परिणामस्वरूप CD64, CD86, TLR2, HLA-DR और CCR7 के असंक्रमित M1 कोशिकाओं पर ऊंचा स्तर की विशेषता है, जबकि असंक्रमित M2 कोशिकाओं ने M2 फेनोटाइप मार्कर CD163, CD200R, CD206 और CD80 के एक मजबूत अप-नियमन का प्रदर्शन किया । M1-ध्रुवीकृत कोशिकाओं में आम तौर पर M2-ध्रुवीकृत कोशिकाओं की तुलना में कम बैक्टीरिया होते थे। एमटीबी संक्रमण के बाद कई M1/M2 मार्कर को डाउनलेट किया गया था, जिससे पता चलता है कि एमटीबी मैक्रोफेज ध्रुवीकरण को मिला सकता है । इसके अलावा, विभिन्न आकारों के 24 विभिन्न सेल समूहों को संक्रमण के बाद 24 घंटे में एम 1 और एम 2 असंक्रमित और एमटीबी संक्रमित कोशिकाओं के बीच विशिष्ट रूप से वितरित किया गया । इस M1/M2 प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल एमटीबी-मैक्रोफेज अनुसंधान में एक रीढ़ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों में विशेष जरूरतों के लिए अपनाया जा सकता है ।
मैक्रोफेज प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं जो ऊतक होमोस्टेसिस, सूजन और रोग विकृतियों के नियमन में महत्वपूर्ण योगदान देती हैं। जन्मजात प्रतिरक्षा का एक अनिवार्य घटक होने के नाते, कोशिकाओं का मोनोसाइट-मैक्रोफेज वंश परिवर्तित पर्यावरणीय संकेतों के जवाब में विषम फेनोटाइप व्यक्त करता है, जो विभिन्न शारीरिक और प्रतिरक्षाीय स्थानों के लिए उनकी प्लास्टिसिटी और अनुकूलन को प्रतिबिंबित करता है1। विकास कारकों के आधार पर, माइक्रोएनवायरमेंट में मौजूद साइटोकाइन और अन्य मध्यस्थों, मैक्रोफेज को दो प्रमुख रिवर्सिबल आबादी में वर्गीकृत किया गया है, प्रत्येक बैक्टीरियल नियंत्रण और निकासी में एक अलग भूमिका के साथ2:प्रो-भड़काऊ, शास्त्रीय रूप से सक्रिय M1-ध्रुवीकृत मैक्रोफेज और विरोधी भड़काऊ, वैकल्पिक रूप से सक्रिय M2-ध्रुवीकृत मैक्रोफेज जो मूल रूप से टी हेल्पर (Th) सेलमेन नोक्चरल3की नकल करने के लिए नामित किए गए थे। प्रतिरक्षा ध्रुवीकृत मैक्रोफेज के इस समूह को अक्सर सरलीकृत माना जाता है, क्योंकि मैक्रोफेज सक्रियण और भेदभाव रैखिक नहीं होता है, लेकिन अधिक सटीक रूप से एक सातत्य के रूप में चित्रित किया जाता है जहां प्रत्येक जनसंख्या में रोग विकासऔर प्रगति4,5,6, 7के परिणाम में विभिन्न विशेषताएं और कार्यात्मक भूमिकाएं होती हैं। फिर भी, M1/M2 मैक्रोफेज मॉडल के साथ कई प्रयोगात्मक फायदे हैं जिनका उपयोग अनुसंधान के कई विभिन्न क्षेत्रों में किया जा सकता है।
माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) तपेदिक (टीबी) का कारक एजेंट है और हर सेकंड एक व्यक्ति को संक्रमित करने का अनुमान लगाया गया है और इसे दुनिया का सबसे घातक एकल संक्रामक एजेंट माना जाता है (ग्लोबल टीबी रिपोर्ट 2019)। चूंकि श्वसन तंत्र एमटीबी संक्रमण का मुख्य मार्ग है, इसलिए अल्वोलार मैक्रोफेज एमटीबी से संक्रमित होने वाली पसंदीदा मेजबान कोशिकाएं हैं और फेफड़ों में एमटीबी के लिए प्राथमिक बाधाओं और संक्रामक जलाशय दोनों का प्रतिनिधित्व करती हैं। विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में मैक्रोफेज ध्रुवीकरण का7 वर्षों में और अधिकांश प्रकाशित कार्य में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, विट्रो में मोनोसाइट संस्कृतियों का एम1 ध्रुवीकरण ग्रैनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) द्वारा आईएफएन-γ और एलपीएस8, 9के साथ प्रेरित होता है, जबकि एम 2 ध्रुवीकरण मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और आईएल-410, 11के साथ प्रेरित होता है। एम1 मैक्रोफेज शक्तिशाली प्रभावक कोशिकाएं हैं जो इंट्रासेलर रोगजनकों के खिलाफ एंटीमाइक्रोबियल प्रतिक्रियाओं में मध्यस्थता करती हैं और एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा12में एक आवश्यक भूमिका निभाती हैं। दूसरी ओर, एम 2 मैक्रोफेज में एक विरोधी भड़काऊ कार्य, उच्च फैगोसाइटिक क्षमता होती है और मुख्य रूप से घाव भरने और ऊतक की मरम्मत के साथ-साथ परजीवी संक्रमण12में शामिल होते हैं। तदनुसार, एम 1 मैक्रोफेज को एम 2 मैक्रोफेज13की तुलना में एमटीबी के इंट्रासेलुलर नियंत्रण में अधिक प्रभावी माना जाता है। हालांकि , एमटीबी बैक्टीरिया में14 , 15 , 16,17को जन्मजात प्रतिरक्षा को विकृत करने के लिए मैक्रोफेज ध्रुवीकरण को मिलानेकीक्षमता भी होती है ।
जबकि परिधीय रक्त18से प्राप्त मोनोसाइट्स के विभेदन से मैक्रोफेज उत्पन्न करना आम बात है, मैक्रोफेज भी प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी)19 या चूहों से बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज से20, 21से उत्पन्न हो सकते हैं। मोनोसाइट/मैक्रोफेज जनकों से प्राप्त प्राथमिक मैक्रोफेज कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए ये व्यवहार्य तकनीकें हैं जो परिपक्व मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं की समरूप आबादी में पैदा और अंतर करेंगी । हालांकि, ये प्रोटोकॉल शायद ही कभी प्राप्त कोशिकाओं के फेनोटाइप और कार्य पर गहरा ज्ञान प्रदान करते हैं और न ही वीवो में प्राप्त मैक्रोफेज के बीच देखी गई प्राकृतिक विषमता के लिए खाते हैं। चूंकि एमटीबी एक सख्त मानव रोगजनक है, इसलिए मानवीकृत मॉडल प्रणालियों में एमटीबी का अध्ययन करने का भी एक लाभ है। फ्लो साइटोमेट्री एक शक्तिशाली तकनीक है जो निलंबन22में एकल कोशिकाओं की कई फेनोटाइपिक और कार्यात्मक विशेषताओं का आकलन करने की संभावना प्रदान करती है , जो 23,24, 24के रूप में स्थूल कोशिकाओं के साथ काफी चुनौतीपूर्ण हो सकती है । दृढ़ता से अनुयायी मैक्रोफेज की रासायनिक टुकड़ी के अलावा, एमटीबी संक्रमण कोशिकाओं के लिए एक महत्वपूर्ण तनाव कारक पैदा कर सकता है जो एमटीबी-संक्रमित मैक्रोफेज के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण में जटिलता का एक और स्तर जोड़ता है।
इस प्रायोगिक प्रोटोकॉल में, हमने प्राथमिक परिधीय-रक्त-मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रतिरक्षा ध्रुवीकरण के आधार पर पहले से स्थापित मानव मैक्रोफेज संक्रमण मॉडल का उपयोग किया है जो उग्र प्रयोगशाला एमटीबी स्ट्रेन एच37आरवी से संक्रमित हैं, और चयनित एम 1 और एम 2 मार्कर25की अभिव्यक्ति सहित 10-रंग पैनल का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री के साथ विश्लेषण किया गया है। यह प्रोटोकॉल एम 1 या एम 2 ध्रुवीकृत मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में एमटीबी संक्रमण के जवाबों का अध्ययन करने के लिए एक कुशल और प्रजनन योग्य विधि प्रदान करता है। इसके अलावा, अनुयायी एमटीबी-संक्रमित मैक्रोफेज पर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग हमें पारंपरिक एम 1 और एम 2 मैक्रोफेज और एमटीबी संक्रमण के लिए उनकी देशांतर प्रतिक्रिया से जुड़े सतह मार्कर की एक किस्म का अध्ययन करने की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल को अन्य रोगजनकों के साथ संक्रमणों की जांच के लिए, ट्यूमर विरोधी अध्ययनों में या भड़काऊ स्थितियों के अध्ययन में, नशीली दवाओं की स्क्रीनिंग आदि के लिए आसानी से अपनाया जा सकता है और मानव नैदानिक नमूनों में M1/M2 मैक्रोफेज ध्रुवीकरण के आकलन के लिए भी शोषण किया जा सकता है ।
यह प्रायोगिक प्रोटोकॉल एम 1 या एम 2 फेनोटाइप में माइलॉयड-व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रभावी ध्रुवीकरण का वर्णन करता है जिसमें 10-रंग प्रवाह साइटोमेट्री पैनल के साथ मूल्यांकन शामिल है जो विविध मैक्रोफेज सबसेट में जीएफपी-लेबल एमटीबी के दृश्य और गहरे लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। हालांकि टीबी एक प्राचीन मानव रोग है, वर्तमान में एमटीबी-मैक्रोफेज इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए कोई सुनहरा मानक मॉडल नहीं है, और लिम्फोसाइट प्रतिक्रियाओं के विश्लेषणों की तुलना में मैक्रोफेज का बहु-रंग प्रवाह साइटोमेट्री जटिल हो सकता है। मानव मोनोसाइट्स के इन विट्रो भेदभाव के लिए मैक्रोफेज के लिए कुछ उपलब्ध प्रोटोकॉल उत्पन्न मैक्रोफेज के प्रकार का गहन ज्ञान प्रस्तुत करते हैं। मार्कर के ठोस पैनल का उपयोग करके मैक्रोफेज ध्रुवीकरण और मैक्रोफेज सक्रियण के प्रवाह साइटोमेट्रिक मूल्यांकन के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल संभवतः इस तरह के लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान कर सकता है और विभिन्न परिस्थितियों में इलाज की गई ध्रुवीकृत कोशिकाओं की अतिरिक्त सुविधाओं का पता लगाने के अवसर प्रदान कर सकता है। इसमें विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं के विश्लेषण के साथ-साथ नैदानिक नमूनों में वीवो में कोशिकाओं के विश्लेषण, यानी पीबीएमसी और शरीर के तरल पदार्थ (यानी ब्रोंकोएलवेलर लावगे) या समरूप ऊतक से एकल कोशिका निलंबन दोनों शामिल हैं । तदनुसार, रोगियों से प्राप्त मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज की भेदभाव और/या सक्रियण स्थिति रोग परिणाम से संबंधित हो सकती है । फेफड़े के टीबी रोगियों में परिधीय रक्त में CD16+CD163+ मोनोसाइट्स का विस्तार सूचित किया गया है । एटोपिक डर्मेटाइटिसरोगियोंकी सूजन वाली त्वचा में CD163+ कोशिकाओं की बढ़ी हुई आवृत्ति का भी पता चला . इसी प्रकार, CD206+ M2-जैसे मैक्रोफेज को एडीपोसाइट ऊतक32 के माइक्रोएनवायरनमेंट में कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव को रोकने और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल)29के रोगियों से अस्थि मज्जा के नमूनों में समृद्ध होने के लिए दिखाया गया है। ऑस्टियोआर्थराइटिस के रोगियों के पूरे रक्त में CD163 (M2) कोशिकाओं के लिए CD64 (M1) का एक ऊंचा अनुपात रोग गंभीरता३३से जुड़ा हुआ पाया गया । एक अन्य अध्ययन में CD86 (M1) और CD163 (M2) का उपयोग किया गया ताकि ऊतक में उच्च एम1 अभिव्यक्ति को घातक ब्रेन ट्यूमर34के एक उपसमूह में बदतर परिणाम से सहसंबद्ध किया जा सके।
इस प्रायोगिक M1/M2 प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल के कई महत्वपूर्ण फायदे हैं। यह मॉडल उग्र एमटीबी संक्रमण के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है और मिश्रित-लिम्फोसाइट प्रतिक्रियाओं (एमएलआर) में एम 1 या एम 2 मैक्रोफेज के साथ ऑटोलॉगस टी कोशिकाओं को जोड़कर अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के अध्ययन को नियंत्रित करने के लिए विकसित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल दवा स्क्रीनिंग और विभिन्न इम्यूनोमोडिलिएटरी और रोगाणुरोधी यौगिकों के परीक्षण के लिए भी उपयुक्त है। यहां, हमने पहले एमटीबी संक्रमण25,35के बाद माइलॉयड-व्युत्पन्न कोशिकाओं पर विटामिन डी और हिस्टोन डेसिटाइलीज अवरोधक फिनेलब्यूटिरेट के प्रभावों का अध्ययन किया है। M1/M2 प्रवाह साइटोमेट्री भी सेल संस्कृति supernatants या रोगी प्लाज्मा के साथ कंडीशनिंग के बाद मैक्रोफेज सक्रियण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जबकि एचआईवी या हेल्मिंथ या टीबी-मधुमेह सह-रुग्णता के साथ टीबी सह-संक्रमण के वीवो अध्ययन में चुनौतीपूर्ण हो सकता है, कम जटिल M1/M2 मॉडल विट्रो में सह-रुग्णताओं के अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकता है । इसी तरह, कोशिकाओं की एमटीबी संक्रमितता की जांच करने या फागोसिटिक के साथ-साथ व्यक्तिगत एम 1/एम2 कोशिकाओं की एंटीजन प्रस्तुति क्षमता की जांच करने के लिए संचरण अध्ययनों के लिए प्रोटोकॉल का दोहन किया जा सकता है । M1/M2 प्रवाह साइटोमेट्री भी बायोमार्कर और वैक्सीन अध्ययन में उपयोग के लिए आकर्षक है, उपचार के दौरान रोग पूर्वानुमान का पालन करने के लिए और myeloid-व्युत्पन्न कोशिकाओं को लक्षित उपचारों का परीक्षण करने के लिए । महत्वपूर्ण बात यह है कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 3 डी),वास्तविक समय पीसीआर, का उपयोग करके मैक्रोफेज ध्रुवीकरण फेनोटाइप और कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं के एक साथ मूल्यांकन के लिए साइटोमेट्री प्रवाह के समानांतर कई विभिन्न तरीकों को लागू किया जा सकता है। पश्चिमी दाग, मल्टीप्लेक्स परख और संस्कृति सुपरनेक्टेंट में घुलनशील कारकों के एलिसा के साथ-साथ जीएफपी-अभिव्यक्ति (प्रवाह साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी) और कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीआईएफयू) का उपयोग करके इंट्रासेलर बैक्टीरियल संक्रमितता और विकास का आकलन। एमटीबी-जीएफपी बैक्टीरिया के साथ एम 1 या एम 2 कोशिकाओं का संक्रमण भी एकल सेल-आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण के लिए एक ही नमूने से असंक्रमित और एमटीबी-संक्रमित कोशिकाओं को छांटने में सक्षम बनाता है।
वर्णित प्रोटोकॉल में तकनीकी और वैज्ञानिक दोनों नुकसान सहित कुछ सीमाएं भी हैं । मानव रक्तदाताओं से मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग करने वाली कमी यह है कि दाता परिवर्तनशीलता अक्सर अधिक होती है और तथ्य यह है कि कोशिकाओं को मानव ऊतकों के शारीरिक वातावरण में ध्रुवीकृत नहीं किया जाता है। M1/M2 ध्रुवीकरण प्रभावकारिता या एमटीबी-दाताओं के बीच संक्रामकता में बड़ी परिवर्तनशीलता के परिणामस्वरूप अंतर-और अंतरअधिग्रहीय विविधताओं, कम सांख्यिकीय शक्ति, और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए कई दानदाताओं को शामिल करने की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, पीबीएमसी से मोनोसाइट्स के प्लास्टिक पालन के परिणामस्वरूप मोनोसाइट्स/वेल की दाता-निर्भर संख्या होती है जो अंततः एक मनमाना एमओआई प्रदान कर सकती है जो एमटीबी संक्रमण के बाद मैक्रोफेज ध्रुवीकरण और कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकती है । प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों में कोशिका संस्कृतियों को दूषित करने के लिए अन्य कोशिकाओं के प्रकारों को रोकने के लिए उचित धोने शामिल हैं जो मैक्रोफेज ध्रुवीकरण को भी प्रभावित कर सकते हैं। जबकि एक बहुत कम MOI अव्यक्त टीबी संक्रमण की नकल कर सकते हैं, एक बहुत अधिक MOI कोशिकाओं को मार डालेगा, एक उपयुक्त MOI का उपयोग करने के महत्व पर प्रकाश डाला । इसके अलावा, टुकड़ी पर दृढ़ता से अनुयायी कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले कुछ मैक्रोफेज सबसेट का पक्षपातपूर्ण प्रतिनिधित्व हो सकता है। प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण कदम में मोतियों के क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स और नकारात्मक नियंत्रण जैसे अन दागदार कोशिकाओं या एफएमओ (फ्लोरेसेंस माइनस वन) नियंत्रणों का उचित उपयोग शामिल है ताकि सही मैनुअल गेटिंग सुनिश्चित की जा सके।
एक अन्य सीमा में रक्त से प्राप्त मोनोसाइट्स का ध्रुवीकरण शामिल है न कि स्थानीय ऊतक वातावरण से। मानव टीबी की पहचान एमटीबी संक्रमित ऊतकों में ग्रेनुलोमा का गठन है और इस प्रकार टीबी में इम्यूनोपैथोलॉजी का स्थानीय ऊतक स्थल पर अधिमानत अध्ययन किया जाना चाहिए । हालांकि, मोनोसाइट्स को सूजन/संक्रमण पर परिधीय रक्त से फेफड़ों में भर्ती किया जाता है, जहां कोशिकाएं जीएम-सीएसएफ12जैसे भड़काऊ साइटोकिन्स की उपस्थिति में मैक्रोफेज में अंतर कर सकती हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि वीवो में ऊतक के शारीरिक परिवेश में, मैक्रोफेज ध्रुवीकरण की एक बड़ी विषमता की संभावना है जिसमें एक मिश्रण और विविध एम 1-और एम 2-जैसे मैक्रोफेज आबादी का विभिन्न अनुपात शामिल है जो टीबी संक्रमण36के भाग्य में योगदान देते हैं। हमने पहले एक मानव ऑर्गेनोटिपिक फेफड़ों के ऊतक मॉडल विकसित किए हैं जो टीबी 37 में मैक्रोफेज-मध्यस्थता ग्रैनुलोमागठनके 3डी-अध्ययन को सक्षम बनाता है। यह फेफड़ों के ऊतकों मॉडल के साथ संयोजन में वर्तमान M1/M2 ध्रुवीकरण प्रोटोकॉल का फायदा उठाने के लिए आगे टीबी ग्रैनुलोमा गठन, प्रभावकार कार्यों और प्रयोगात्मक ऊतक में M1/M2 अनुपात का अध्ययन दिलचस्प हो सकता है ।
इस M1/M2 प्रवाहकंत्रक को आसानी से निरोधात्मक और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं से जुड़ी सुविधाओं के आकलन के लिए उपयोगी माइलॉयड मार्कर के एक विस्तारित पैनल को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । पीडी-1, एसआईआरपी-α, IDO और arginases जैसे निरोधात्मक प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अणुओं में एक महान शोध रुचि है जो मैक्रोफेज प्रतिक्रियाओंको 38से मिला सकता है। इस संदर्भ में, माइलॉयड कोशिकाओं के ध्रुवीकरण में अन्य उत्तेजनाएं भी शामिल हो सकती हैं जो इम्यूनोरेगुलेटरी मैक्रोफेज (एमआरईजी) या माइलॉयड-व्युत्पन्न दमन कोशिकाओं (एमडीएससी) को बढ़ावा देती हैं जिन्हें टीबी38सहित कई बीमारियों में शामिल दिखाया गया है। एम1/एम 2/एमआरईजी मैक्रोफेज सबसेट के अधिक उन्नत प्रवाह साइटोमेट्री पैनलों में साइटोकिन्स/केमोकिंस आईएल-1, टीएनएफ-α, आईएल-10 और एमसीपी-1 या अन्य घुलनशील कारकों या प्रभावक अणुओं जैसे प्रेरक नाइट्रिक ऑक्साइड (आईओएस) और एंटीमिक्रोबिल पेप्टाइड्स के इंट्रासेलुलर स्टेनिंग भी शामिल हो सकते हैं । यह पॉलीफंक्शनल मैक्रोफेज प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने की संभावनाओं को बढ़ा सकता है, जो टी कोशिकाओं39के लिए बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है।
वर्तमान में, फ्लो साइटोमेट्री स्टेनिंग पैनलों में 30-40 रंग शामिल हो सकते हैं, जो इम्यूनोफेनोटाइप मल्टीपल सेल सबसेट और अणुओं को एक साथ करने की क्षमता प्रदान करता है। इस M1/M2 प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल की बुनियादी प्रायोगिक स्थापना का उपयोग एक रीढ़ के रूप में किया जा सकता है जो अधिकांश पुराने और नए प्रवाह साइटोमीटर के साथ संगत है और बीएसएल-3 पर्यावरण में उग्र एमटीबी के साथ काम से उत्पन्न चुनौतियों सहित व्यक्तिगत जरूरतों के अनुसार बनाया और सिलवाया जा सकता है। आजकल, उमापी जैसी आयामीता कटौती तकनीक प्रवाह साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर के नए संस्करणों में उपलब्ध हैं, जो एकल-कोशिका अध्ययनों में उत्पन्न बड़ी संख्या में मापदंडों के विश्लेषण को सक्षम बनाता है जो बेहतर दृश्य और उच्च आयामी डेटा40की व्याख्या के लिए आवश्यक है। प्रवाह साइटोमेट्री में निरंतर तकनीकी सुधार आने वाले वर्षों में जारी रहेगा जिसमें आधुनिक सेल छंटाई क्षमताओं के साथ बहु-पैरामेट्रिक फेनोटाइपिंग का संयोजन शामिल है, जहां यह प्रोटोकॉल कई मैक्रोफेज आधारित एमटीबी संक्रमण परख में उपयोगी साबित हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम बीएसएल-3 प्रयोगशाला में सहायता के लिए स्वीडन की सार्वजनिक स्वास्थ्य एजेंसी, माटिल्डा स्वेनसन और सोलोमन घेब्रेमाइकल में अपने सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं ।
इस काम को स्वीडिश हार्ट एंड लंग फाउंडेशन (एचएलएफ) (2019-0299 और 2019-0302 से एसबी), स्वीडिश रिसर्च काउंसिल (वीआर) (2014-02592, से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था 2019-01744 और एसबी के लिए 2019-04720), फाउंडेशन एंटीबायोटिक प्रतिरोध (विरोध), कारोलिंस्का इंस्टीट्यूट फाउंडेशन और किड टू एसबी (मार्को लोरेटी के लिए डॉक्टरेट शिक्षा का आंशिक वित्तपोषण) को रोकने के लिए कारोलिंस्का इंस्टीट्यूट से । एमएल स्वीडिश बच्चों के कैंसर फाउंडेशन (TJ2018-0128 और PR2019-0100) से समर्थित था ।
8-well chamber slides | Lab-Tek | 154534 | |
BD Comp bead plus | BD | 560497 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
DAPI Mounting media | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
EDTA (0.5 M) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Falcon 6-well Flat Bottom plates | Corning Life Sciences | 353046 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Glycerol (70%) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
GM-CSF | Peprotech | 300-03 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | R37121 | Secondary antibody for CD64 |
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Secondary antibody for CD163 |
HEPES | GE Healthcare Life Sciences | SH30237.01 | |
IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
IL-4 | Peprotech | 200-04 | |
L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences | SH30034.01 | |
LPS (Escherichia coli O55:B5) | Sigma-Aldrich | L6529 | |
Lymphoprep | Alere Technologies AS | 11508545 | |
M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
Middle Brook 7H10 agar plates | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Middle Brook 7H9 media | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Mouse anti-human CD64 primary antibody | Bio-Rad | MCA756G | Clone: 10.1 |
Na-pyruvate | GE Healthcare Life Sciences | SH300239.01 | |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Rabbit anti-human CD163 primary antibody | GeneTex | GTX81526 | Polyclonal |
RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | SH30096.01 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
TubeSpin bioreactor tubes | TPP Techno Plastic Products AG | 87050 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Tween-80 | Sigma-Aldrich | P4780 |