Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Undersøgelse TGF-β Signalering og TGF-β-induceret Epitel-til-mesenchymal Overgang i brystkræft og normale celler

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61830
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Oncode Institute and Department of Cell Chemical Biology, Leiden University Medical Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Vi beskriver en systematisk arbejdsgang for at undersøge TGF-β signalering og TGF-β-induceret EMT ved at studere det protein- og genekspression, der er involveret i denne signalvej. Metoderne omfatter vestlig blotting, en luciferase reporter assay, qPCR, og immunofluorescens farvning.

Abstract

Transformering af vækstfaktor-β (TGF-β) er en udskilles multifunktionel faktor, der spiller en central rolle i intercellulær kommunikation. Perturbationer af TGF-β signalering kan føre til brystkræft. TGF-β fremkalder dens virkninger på spredning og differentiering via specifik celleoverflade TGF-β type I- og type II-receptorer (dvs. TβRI og TβRII), der indeholder et iboende serin/threonine kinase-domæne. Ved TGF-β-induceret heteromerisk kompleksdannelse fremkalder aktiveret TβRI intracellulær signalering ved fosforylerende SMAD2 og SMAD3. Disse aktiverede SMAD'er danner heteromeriske komplekser med SMAD4 for at regulere specifikke målgener, herunder plasminogen aktiveringshæmmer 1 (PAI-1, kodet af SERPINE1-genet). Induktionen af epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) tillader epitelkræftceller på det primære sted eller under kolonisering på fjerne steder for at få en invasiv fænotype og drive tumorprogression. TGF-β fungerer som en potent inducer af brystkræft invasion ved at køre EMT. Her beskriver vi systematiske metoder til at undersøge TGF-β signalering og EMT svar ved hjælp af premalignant menneskelige MCF10A-RAS (M2) celler og mus NMuMG epitelceller som eksempler. Vi beskriver metoder til at bestemme TGF-β-induceret SMAD2-fosforylering ved vestlig blotting, SMAD3/SMAD4-afhængig transskriptionsaktivitet ved hjælp af luciferase reporteraktivitet og SERPINE1-målgenudtryk ved kvantitativ kædereaktion i realtid polymerase (qRT-PCR). Desuden beskrives metoder til at undersøge TGF-β-induceret EMT ved at måle ændringer i morfologi, epitel og mesenchymal markørudtryk, filamentøs actin farvning og immunfluorescens farvning af E-cadherin. To selektive små molekyle TGF-β receptor kinase hæmmere, GW788388 og SB431542, blev brugt til at blokere TGF-β-induceret SMAD2 fosforylering, målgener og ændringer i EMT markør udtryk. Desuden beskriver vi transdifferentiation af mesenchymal bryst Py2T murine epitel tumorceller i adipocytter. Metoder til at undersøge TGF-β-induceret signalering og EMT i brystkræft kan bidrage til nye terapeutiske tilgange til brystkræft.

Introduction

Cytokintransformationen vækstfaktor-β (TGF-β) er prototypen på en stor gruppe strukturelt og funktionelt relaterede regulatoriske polypeptider, herunder TGF-βs (dvs. TGF-β1, -β2 og -β3), knoglemorfogene proteiner (BMP'er) og aktiviteter1,2. Disse cytokiner spiller alle vigtige roller i embryonal udvikling og i vedligeholdelsen af væv og organhomøostase3. Forkert regulering af TGF-β kan føre til en lang række sygdomme, herunder kræft4,5. TGF-β spiller en kompleks, dobbelt rolle i kræft progression: i normale og premalignant epitelceller, TGF-β opfører sig som en tumor-suppressor ved at hæmme spredning og fremkalde apoptose6,7; men på det sene stadium af tumor progression, når cytostatiske reaktioner blokeres af aktivering af onkogener eller tab af tumor suppressor gener, TGF-β fungerer som en tumorforstærker ved at fremme epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) i kræftceller, hvilket muliggør kræftcelleinvasion og metastaser, der virker på celler i tumormikromiljøet og stimulerer angiogenese og immununddragelse8,9,10.

TGF-β udskilles som et inaktivt prækursormolekyle, der indeholder den modne carboxyterminal TGF-β og latenstidsrelateret peptid (LAP)11. Dette lille kompleks kan kovalent bindes af latent TGF-β-bindende protein (LTBP)12. Frigivelsen af modne TGF-β kan medieres ved hjælp af specifikke proteaser, der kløver LAP eller ved mekanisk træk af LAP i en integrinafhængig proces13,14. Ud over LTBP, Glycoprotein A gentagelser fremherskende (GARP) er stærkt udtrykt på overfladen af regulerende T-celler (Tregs) og spiller en lignende rolle som LTBP i reguleringen af aktiveringen af TGF-β15,16. GARP binder sig direkte til latent TGF-β gennem disulfidforbindelse og ikke-valent tilknytning. Aktiveringen af TGF-β fra GARP/TGF-β-komplekset kræver integrins17. Modne TGF-β binder sig til TGF-β β serin β/threonine kinasereceptorer, dvs. Bindingen af TGF-β til TβRII fremmer ansættelsen af TβRI og dannelsen af et heteromerisk kompleks. Derefter fosforeres TβRI af TβRII kinase på serin- og threoninerester i et kort glycin- og serinrigt (GS) motiv, hvilket resulterer i dets aktivering19,20. Ved aktiveringen rekrutterer og fosforiske TβRI sine substrater: de to receptorspecifikke SMAD'er (R-SMADs), der omfatter SMAD2 og SMAD3 (Figur 1). R-SMADs deler en lignende overordnet struktur med to såkaldte Mad homologi domæner, MH1 og MH2, der er adskilt af en proline-rige linker region (Figur 2). DNA-bindingsmotivet inden for SMAD3's MH1-domæne bevares ikke mellem SMAD2 og SMAD3, og SMAD2 kan ikke binde DNA direkte på grund af to indsættelser i mh1-domænet (exon 3 og L1). SMAD2 og SMAD3 kan aktiveres ved fosforylering af SSXS-motivet i deres C-termini (Figur 2). Fosforinerede SMAD2/3 danner heteromeriske komplekser med en fælles SMAD-mægler, SMAD4, som omfordeler til kernen for at modulere transskriptionen af målgener (Figur 1)7,21. Denne kanoniske SMAD-signalvej er præcist reguleret og genererer specifikke cellulære og vævsresponser såsom regulering af celle skæbne og tumorcellemetastase og invasion22. Ud over TGF-β-SMAD-signalering kan ikke-SMAD-signalveje også aktiveres direkte af receptorer for at regulere downstream-cellulære reaktioner23.

Under tumor progression, aktivering af TGF-β-induceret SMAD-afhængige og SMAD-uafhængige veje er nødvendige for induktion af EMT. EMT er en reversibel proces, hvor tumorceller dedifferentierer fra en epitel fænotype, som er forbundet med tab af cellecellekontakter og nedsat apikale-basal polaritet, til en mesenchymal fænotype med forbedret motilitet og invasionsevne24. EMT er kendetegnet ved øget ekspression af mesenchymale markørproteiner, herunder N-cadherin, vimentin, Zeb2 og Snail1/2, og den samtidige nedregulering af epitelmarkører, såsom E-cadherin og β-catenin (Figur 3)25. Overgangen fra en epitel til en mesenchymal tilstand er imidlertid ofte ufuldstændig, og celler får blandede epitel- og mesenchymale (E/M) egenskaber. I et nyligt dokument fra Den Internationale EMT-sammenslutning blev det foreslået at beskrive processen med celler, der gennemgår mellemliggende E/M-fænotypiske tilstande, som epitel-mesenchymal plasticitet (EMP)26. Denne plasticitet refererer til delvis EMT, en hybrid E/M-status, en metastable EMT-tilstand, et EMT-kontinuum og et EMT-spektrum26. Under EMT, tumorceller få kræft stamceller (CSC) egenskaber og blive mere resistente over for løsrivelse-induceret apoptose27. Mens EMT er ansvarlig for erhvervelsen af en invasiv fænotype i primære tumorceller og driver kræft progression, derimod, mesenchymal-epitel overgang (MET) har vist sig at spille en vigtig rolle i udvæksten af formidlede tumorceller på fjerne metastatiske steder28,29. En nylig undersøgelse viste, at EMT-afledte brystkræftceller kan transdifferentieres til adipocytter, som kan give mulighed for at hæmme metastaser og overvinde terapiresistens i tumorceller og tilbagefald kræft30. På grund af den vigtige rolle, som TGF-β signalering spiller i aktiveringen af EMT i bryst carcinogenese, vi præsenterer detaljerede protokoller for vestlig blotting, en luciferase transskriptionel reporter assay, kvantitative real-time-polymerase kædereaktion (qRT-PCR), og immunofluorescens til undersøgelse af TGF-β signalering, TGF-β-induceret EMT, og transdifferentiering af EMT-afledte murine bryst epitel tumorceller i adipocytter. Disse teknikker er de mest anvendte analytiske værktøjer inden for cellebiologi. qRT-PCR bruges til at registrere, karakterisere og kvantificere mRNA-udtryksniveauer på en kvantitativ måde. Sammenlignet med kvantitativ PCR (qPCR), en alternativ teknik, kan den omvendte transskription (RT)-PCR bruges til at bestemme mRNA-udtryk på en semi-kvantitativ måde31,32. Vestlig blotting anvendes til at undersøge specifikke proteinniveauer i en given celle lysatprøve med fordele af følsomhed og specificitet, på en semi-kvantitativ måde. Således præsenterer vi en systematisk arbejdsgang til at analysere ændringer fra genekspression til proteinudtryk for at hjælpe med at undersøge TGF-β signalering, der også kan anvendes på andre signalveje.

Protocol

1. Analyse af TGF-β-induceret SMAD2 fosforylering ved hjælp af vestlig blotting

BEMÆRK: Premalignant humane bryst MCF10A-Ras celler blev brugt som et eksempel til at undersøge TGF-β signalering svar33. I princippet gælder de metoder, der er beskrevet nedenfor, også for andre TGF-β-responsive cellelinjer.

  1. Kultur brystepitelecellelinjen MCF10A-Ras ved 37 °C i Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM)/F12 indeholdende L-glutamin med 5% hesteserum 20 ng/mL epidermal vækstfaktor (EGF), 10 mg/mL insulin, 100 ng/mL kolera enterotoxin, 0,5 mg/mL hydrocortison og 1:100 penicillin-streptomycin (Pen-Strep).
  2. Trypsiniser MCF10A-Ras celler med 1 mL på 0,25% trypsin-EDTA i 1 minut og tæl levedygtige celler ved hjælp af en celletæller.
  3. Frøceller i 6-brønds plader med en tæthed på 5×105 celler / brønd.
  4. Efter natten vækst, behandle celler med enten TGF-β (5 ng/mL) eller ligand buffer (4 mM HCl, 0,1% fedtsyre-fri kvæg serum albumin (BSA)) i 1 time, og derefter fjerne kultur medium og forsigtigt vaske cellerne to gange med 1 mL fosfat-buffered saltvand (PBS).
  5. Cellerne afkøles i 6-brønds plader på is og tilsættes 150 μL prækølet radio immunudfældningsanalyse (RIPA) lysis buffer (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% natrium deoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, og frisk tilsat mini protease inhibitor cocktail). Lad lysis fortsætte på is i 10 minutter.
  6. Skrab vedhængende celler af skålen ved hjælp af en plastikcelleskraber, og overfør derefter forsigtigt celleaffjedringen til et forkølet mikrocentrifugerør.
  7. Cellens lysat centrifugeres i 10 minutter ved 150 centrifugalkraft (x g) ved 4 °C, og supernatanten overføres til et friskt mikrocentrifugerør på 1,5 mL.
  8. Proteinkoncentrationen måles ved hjælp af et vaskemiddelkompatibelt (DC) proteinanalysesæt.
  9. 30 μg protein fra hver prøve indlæses på en 10% natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophoresisgelgelforese (SDS-PAGE) gel og køre gelen ved en spænding på 100 V i 1,5-2 timer.
  10. Overfør proteinerne fra gelen til en 45-μm polyvinyliden difluoridmembran (PVDF) ved en spænding på 110 V i 1-1,5 timer.
  11. Overfør PVDF-membranen til en passende beholder med proteinsiden (den side, der stod over for gelen) op, og skyl kortvarigt membranen i destilleret vand.
  12. Kassér vandet, tilsæt Ponceau S-opløsning, og læg membranen på en gyngeplatform i 1-2 minutter.
  13. Afbehul membranen med destilleret vand ved hurtigt at skylle den og derefter vaske den i 1 minut.
  14. Sæt derefter PVDF-membranen på en lyskasse, og tag et billede for at kontrollere for lige store samlede proteinbelastninger.
  15. Vask membranen med Tris-buffered saltvand med Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl og 0,1% Tween 20), indtil der ikke er nogen synlig farvning.
  16. Sæt membranen i blokeringsbuffer (5% skummetmælk i TBST-opløsning) og inkuber den i 1 time ved stuetemperatur.
  17. Vask membranen to gange med TBST.
  18. Membranen inkuberes med primære antistoffer mod fosfor-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, hjemmelavet 34), i alt SMAD2/3 1:1000 og glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH; 1:1000), natten over ved 4 °C.
  19. Vask membranen to gange med TBST og inkuber membranen med et sekundært antistof mod kanin eller mus (1:5000) i 2 timer.
  20. Inkuber PVDF-membranen med vestligt ECL-substrat i 30 sekunder, og detekteres signalet ved hjælp af et billedsystem.
  21. Gentag forsøgene mindst tre gange for at opnå biologiske triplikater.

2. Analyse af TGF-β-inducerede SMAD3-afhængige transskriptionelle svar

  1. Udfør SMAD3/SMAD4-afhængige CAGA 12-luciferase transskriptionel reporter assay.
    1. Kultur og trypsinisere MCF10A-Ras celler som beskrevet i trin 1. Frøceller i 24-brønds plader ved 5×104 celler / godt og lad cellerne til at overholde natten over.
    2. Dagen efter såning, cotransfect cellerne i hver brønd med 100 ng af TGF-β/SMAD3-inducible (CAGA)12 luciferase transskriptionel reporter konstruere35 og 80 ng af β-galactosidase udtryk konstruere ved hjælp af polyethylenimine (PEI). Transfekten af β-galactosidase bruges til at normalisere forskelle i transfekteffektivitet mellem forskellige brønde. Opret hver eksperimentel gruppe i tre eksemplarer.
    3. Efter 24 timers inkubation, sulte celler med serum-fri DMEM-høj glukose og, 6 timer senere, tilføje TGF-β (5 ng/ mL) eller ligand buffer (4 mM HCl, 0,1% BSA) som et køretøj kontrol til cellerne.
    4. Efter yderligere 24 timers inkubation vaskes celler to gange med førvarmet PBS.
    5. Der tilsættes 120 μL/brønd 1× lysisbuffer, og pladen rystes forsigtigt ved 4 °C i 20 minutter.
    6. Der overføres 30 μL lysat til hver brønd af en 96-brønds hvid analysemikroplade for at måle luciferaseaktiviteten ved hjælp af et luminometer.
    7. Der overføres 50 μL lysat til hver brønd af en gennemsigtig plade med 96 brønde til måling af β-galactosidase-aktivitet.
    8. Luciferaseaktiviteten normaliseres til aktiviteten β-galactosidase, og eksperimenterne gentages mindst tre gange for at opnå biologiske triplicater.
  2. Analyser ekspressionen af TGF-β målgener ved hjælp af kvantitativ kædereaktion i realtid (qRT-PCR).
    1. Kultur og trypsinisere MCF10A-Ras celler som beskrevet i trin 1. Frøceller i 6-brønds plader ved 5×105 celler / godt og lad cellerne klæbe natten over.
    2. Behandl celler med TGF-β (5 ng/mL) eller ligand buffer (4 mM HCl, 0,1% BSA) i 6 timer, og vask derefter cellerne to gange med 1 mL PBS.
    3. Isoler det samlede RNA ved hjælp af et RNA-isolationssæt.
    4. RNA-koncentrationen bestemmes med en NanoDrop, og cDNA-syntesen udføres med 1 μg RNA ved hjælp af et første streng cDNA syntesesæt.
    5. Brug et pcr-detektionssystem i realtid til at udføre kvantitativ pcr (qRT-PCR) i realtid med ti gange fortyndet cDNA i en 10 μL reaktionsblanding, der omfatter specifikke humane fremad- og omvendte primere til GAPDH (til normalisering), SERPINE1 (kodning af PAI-1-proteinet, et TGF-β/SMAD-målgen),SMAD7 (TGF-β/SMAD-målgen) og qPCR Master Mix. Opret hver eksperimentel gruppe i tre eksemplarer.
      BEMÆRK: De primersekvenser, der anvendes til at detektere målgener i qRT-PCR, er anført i tabel 1.
    6. Brug følgende qPCR-reaktionsbetingelser: initialisering, 95 °C i 3 minutter; denaturering, 95 °C i 10 sekunder udglødning, 60 °C i 30 sekunder og forlængelse, 80 °C i 10 sekunder denaturering, udglødning og forlængelse gentages 40 gange.
    7. Gentag forsøgene mindst tre gange for at opnå biologiske triplikater.

3. Analyse af TGF-β-induceret EMT

  1. Analyser ekspressionen af EMT-markører på proteinniveau ved hjælp af vestlig blotting.
    BEMÆRK: Analysen af TGF-β-induceret EMT vises ved hjælp af mus NMuMG epitelceller som eksempel36,37.
    1. Dyrkning NMuMG celler ved 37 °C i DMEM-høj glukose medium suppleret med 10% føtal kvæg serum og 1:100 Pen-Strep. Brug metoder, der er beskrevet i trin 1, til proteinisolation og -detektion.
      BEMÆRK: Følgende antistoffer anvendes i dette eksperiment: E-cadherin, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; Snegl, 1:1000; Slug, 1:1000; Tubulin, 1:1000 (Figur 3).
  2. Analyser udtrykket af EMT-markører på mRNA-niveau ved hjælp af kvantitativ PCR i realtid som beskrevet i trin 2.2.
    BEMÆRK: Alle museprimere, der anvendes til qRT-PCR, herunder CDH1 (kodning af E-cadherinproteinet), SNAILog ZEB2 (Figur 3), er anført i tabel 1.
  3. Analysere EMT-processen ved hjælp af indirekte immunfluorescens og direkte fluorescens farvning.
    1. Indirekte immunfluorescens farvning af E-cadherin
      1. Placer sterile 18 mm-side firkantede glas coverslips i 6-brønds plader (en coverslip per brønd).
      2. Frø 1×105 NMuMG celler med 2 mL komplet DMEM pr 6-brønds plade og lad cellerne til at overholde natten.
      3. Flyt forsigtigt coverlips med vedhængende celler til en ny 6-brønds plade og tilsæt 2 mL dyrkningsmedium til brøndene.
      4. Cellerne behandles med TGF-β (5 ng/mL) eller ligand buffer (4 mM HCl, 0,1% BSA) i 2 dage.
      5. Fjern dyrkningsmediet, og vask forsigtigt cellerne to gange med 1 mL førvarmet PBS.
      6. Ret cellerne ved at tilsætte 1 mL 4% paraformaldehyd og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Vask derefter forsigtigt cellerne to gange med 1 mL PBS.
      7. Gennemtræng de faste celler med 0,1% Triton X-100 i 10 minutter ved stuetemperatur og vask cellerne to gange med PBS.
      8. Bloker cellerne med 5% BSA i PBS i 1 time ved stuetemperatur og vask cellerne to gange med PBS.
      9. Det primære antistof mod E-cadherin (fortyndet 1:1000 i PBS) til toppen af hver coverslip og inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
      10. Fjern det primære antistof og vask coverlip med PBS tre gange.
      11. Tilsæt Alexa Fluor 555 sekundære antistof (fortyndet 1:500 i PBS) til toppen af hver coverslip og inkuber i 1 time ved stuetemperatur, mens du dækker med aluminiumsfolie for at beskytte mod lys.
      12. Fjern det sekundære antistof og vask coverlip med PBS tre gange.
      13. Dækslet (cellerne nedad) monteres på glasrutsjebaner med monteringsmedium med 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og opbevares i en kasse ved 4 °C, beskyttet mod lys.
      14. Overhold farvning med SP8 konfokal mikroskopi.
    2. Direkte fluorescens farvning af filamentøs (F)-actin.
      1. Forbered prøver efter trin 3.3.1.1. til 3.3.1.9.
      2. Plette cellerne ved at tilføje Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) i 1 time ved stuetemperatur i mørke for at visualisere filamentous actin (F-actin).
      3. Vask celler tre gange med PBS.
      4. Monter coverlip på glas dias ved hjælp af montering medium med DAPI og tage billeder med SP8 confocal mikroskopi.

Representative Results

Analyse af TGF-β signalering
Det vigtigste trin i TGF-β signalering er fosforyleringen af de to mest carboxylte serinrester i SSXS-motivet (Figur 2) af TβRI kinase38,39. For at undersøge TGF-β signaleringsresponser udførte vi vestlig blotting af fosforlateret SMAD2. I de præmalignante humane bryst MCF10A-Ras-celler steg fosforyleringen af SMAD2 betydeligt som reaktion på TGF-β stimulation i 1 time, mens udtrykket af total SMAD2/3 ikke blev påvirket af TGF-β behandling (Figur 4A). Ved at bruge TGF-β-induceret SMAD3/4-drevet CAGA-luc transskriptionel reporter assay, fandt vi, at TGF-β markant induceret luciferase reporter i MCF10A-Ras celler linje i forhold til ikke-behandlede celler (Figur 4B). Desuden bemærkede vi, at velkaraktererede direkte transskriptionelle genmål for TGF-β herunder SMAD7 og SERPINE1 (kodning af PAI-1-proteinet), var stærkt udtrykt i TGF-β-behandlede MCF10A-Ras-celler (Figur 4C).

Analyse af TGF-β-induceret EMT
Vi vurderede TGF-β-induceret EMT med forskellige metoder, såsom morfologiske ændringer, ekspressionen af EMT-markører ved mRNA- og proteinniveauer og immunfluorescens farvning af EMT-markører36. NMuMG epitelceller behandlet med TGF-β i 1 og 2 dage ændret fra en klassisk epitelmorfologi til en spindelformet mesenchymal-lignende morfologi, som vist ved fasekontrastmikroskopi (Figur 5A). I overensstemmelse med de morfologiske ændringer observerede vi, at TGF-β behandling førte til en stigning i proteinudtrykket af mesenchymale markører, herunder N-cadherin, Snail og Slug37 (Figur 5B). I modsætning hertil blev E-cadherin, en epitelmarkør, nedreguleret i NMuMG-celler efter 2 dages TGF-β behandling (Figur 5B). Derudover udførte vi kvantitativ kædereaktion i realtid (qRT-PCR) for at undersøge genekspressionen af EMT-markører. CDH1 (kodning af E-cadherinproteinet) faldt betydeligt, mens mesenchymale markører som SNAIL og Zinkfinger E-box-binding homeobox 2 (ZEB2) blev markant forøget efter TGF-β stimulation i NMuMG-celler sammenlignet med ubehandlede celler (Figur 5C). TGF-β-induceret EMT i NMuMG celler blev yderligere bekræftet af immunofluorescens farvning af E-cadherin. Ved TGF-β stimulation i 2 dage udtrykte NMuMG-celler mindre E-cadherin end celler i den ikke-inducerede kontrolgruppe, som analyseret ved konfokal mikroskopi (Figur 5D). Desuden dannede NMuMG-celler i nærværelse af TGF-β mere actin stressfibre, som det fremgår af konfokal mikroskopi (Figur 5E).

SB431542 og GW788388 hæmmer TGF-β signalering og TGF-β-induceret EMT
SB431542 er en ATP konkurrencehæmmer af kinase domæne TβRI, også præget activin receptor-lignende kinase 5 (ALK5), mens GW788388 hæmmer TβRI og TβRII kinase aktivitet. Begge hæmmere kan hæmme TGF-β receptor signalering40. Således behandlede vi NMuMG-celler med forskellige koncentrationer af GW788388 i nærværelse af TGF-β i 1 time. Som forventet hæmmede GW788388 TGF-β-induceret SMAD2-fosforylering på en dosisafhængig måde (Figur 6A). Desuden blev TGF-β-medieret fosforylering af SMAD2 blokeret af SB431542-behandling (Figur 6A). Fosforinerede SMAD2/3 danner et heteromerisk kompleks med SMAD4 og omfordeler til kernen for at modulere transskriptionen af målgener. Derfor undersøgte vi translokationen af SMAD2/3 i NMuMG-celler ved immunfluorescensfarvning af SMAD2/3. Dataene viste, at både SB431542 og GW788388 hæmmede TGF-β-induceret nuklear translokation og akkumulering af SMAD2/3 i NMUMG-celler (Figur 6B). Desuden blev de hæmmende virkninger af SB431542 og GW788388 også observeret i mRNA-ekspressionsniveauerne for vigtige TGF-β målgener, der er involveret i EMT, herunder PAI-1, SNAIL, E-cadherin og Fibronectin (Figur 6C). Disse data tydede på, at SB431542 og GW788388 blokerede TGF-β signalering og TGF-β-induceret EMT.

Analyse af transdifferentiering af mesenchymale brystkræftceller til adipocytter
EMT spiller en afgørende rolle i at øge cellulær plasticitet i kræft og resulterer i udviklingen af terapi resistens. Kræft celle plasticitet kan være direkte målrettet og hæmmet med en trans-differentiering tilgang, såsom tvungen adipogenesis30. Vi brugte Py2T murine brystkræftceller, som stammer fra brystkirtlen af en mus mammary tumor virus-polyoma midten tumor-antigen (MMTV-PyMT) transgen mus, som en cellulær model af EMT-induceret kræft celle plasticitet. Baseret på en etableret protokol41, vi behandlede EMT-afledte Py2T murine brystkræftceller med anti-diabetisk stof rosiglitazone i 10 dage for at fremkalde adipogenesis. Adipogenesis blev vurderet ved at visualisere lipiddråber ved hjælp af olierød O farvning. Fedtceller blev let påvist i rosiglitazone-behandlede Py2T murine brystkræftceller (Figur 7), som viste, at behandling med rosiglitazone alene er tilstrækkelig til at fremme transdifferentiering af EMT-afledte brystkræftceller i adipocytter.

Figure 1
Figur 1: TGF-β/SMAD-signalering. TGF-β signalering indledes med binding af TGF-β til TGF-β type II receptor (TβRII), en konstituerende aktiv kinase, der fosforeller TGF-β type I receptor (TβRI). Derefter aktiveres TβRI kinase phosphorylates SMAD2/3. En peptid, der indeholder SSXS-motivet af SMAD2 med to carboxylterminalphorylaterede serinrester, blev anvendt til at opnå polyklonale antisera, der genkender fosfor-SMAD2 (p-SMAD2). Derfor kan analysen af p-SMAD2 udtryk ved vestlig blotting bruges til at bestemme aktiveringen af TGF-β signalering vej. Fosforinerede SMAD2/3 kan danne heteromeriske komplekser med SMAD4, som derefter omfordeler til kernen for at modulere transskriptionelle svar. CAGA12-luciferase reporter assay og kvantitative realtid PCR (qRT-PCR) for mRNA udtryk for TGF-β målrette gener som SMAD7 og SERPINE1 (kodning PAI-1 protein), kan bruges til at analysere TGF-β-induceret SMAD3-afhængige transskriptionelle svar. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk struktur af R-SMADs (SMAD2 og SMAD3). MH1-domænerne (blå) og MH2 -domæner (gul) bevares blandt R-SMAD'er, men linkerområdet (gråt) bevares ikke. MH1 domæne SMAD3 har et DNA-bindende motiv, mens SMAD2 ikke direkte kan binde DNA på grund af en indsættelse (exon 3) i sit MH1-domæne. MH2-domænet formidler SMAD-oligomerisering, interaktion med TGF-β-receptorer og proteinbinding og er involveret i transskriptionel regulering. SMAD2 og SMAD3 kan aktiveres ved fosforylering af SSXS-motivet (med rødt) i deres C-termini. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: TGF-β-induceret EMT. Under TGF-β-induceret epitel-mesenchymal overgang (EMT), gennemgår cellerne tab af epitel og erhvervelse af mesenchymale egenskaber med forbedret cellemotilitet og invasionsevne. Induktionen af EMT fører til udtryk for mesenchymale markører som N-cadherin, Zeb2 og Snail1/2 samt nedregulering af epitelmarkører, herunder E-cadherin, β-catenin og claudin-1. Det akkumulerede tab eller gevinst af epitel-/mesenchymale (E/M) egenskaber får en celle til at gå ind i mellemliggende tilstande på en reversibel måde. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: TGF-β signaleringsresponser i MCF10A-Ras-celler. (A) MCF10A-Ras-celler blev behandlet enten med eller uden TGF-β (2,5 ng/mL) i 1 time, og cellelysater blev immunoblottet for fosforinerede SMAD2 (p-SMAD2), total SMAD2/3 og GAPDH (som lastekontrol). Størrelsesmærket vises til højre. Con: Kontrolgruppe uden TGF-β behandling. (B) Analyse af TGF-β (5 ng/mL) aktivitet ved hjælp af SMAD3-SMAD4-afhængige CAGA12-luciferase (LUC) transskriptionel reporter i MCF10A-Ras celler. Værdierne normaliseres til β-galactosidase (βGal) aktivitet. Data udtrykkes som middelværdien ± s.d., n = 3. Student's t test, *** P ≤ 0,001 (C) qRT-PCR analyse af TGF-β mål gener SMAD7 og SERPINE1 (kodning af PAI-1 protein) i MCF10A-Ras celler behandlet med TGF-β (2,5 ng / mL) i 6 timer. GAPDH blev brugt som en intern kontrol. Data udtrykkes som middelværdien ± s.d., n = 3. Student's t test, *** P ≤ 0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: TGF-β-induceret EMT i NMuMG-celler. (A) Morfologi af NMuMG-celler behandlet med TGF-β (2,5 ng/mL) i 1 eller 2 dage. I nærværelse af TGF-β, NMuMG celler transdifferentieret til en mesenchymal fænotype. Skalalinje = 150 μm (B) NMuMG-celler blev behandlet med eller uden TGF-β (5 ng/mL) i 2 dage, og EMT-markører blev analyseret ved vestlig blotting. Størrelsesmarkøren er som angivet til højre. Con: Kontrolgruppe uden TGF-β behandling. (C) Genekspressionsanalyse af EMT-markører (CDH1 (kodning af E-cadherinproteinet),SNAIL og ZEB2) i NMuMG-celler behandlet i 2 dage med TGF-β (5 ng/mL). GAPDH blev brugt som en intern kontrol. Resultaterne udtrykkes som middelværdien ± s.d., n = 3. Student's t-test, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001. (D) NMuMG-celler blev plettet af immunfluorescens for at detektere ekspressionen af epitelmarkøren E-cadherin (rød) efter TGF-β (2,5 ng/mL) behandling i 2 dage. Nuclei blev modstællet med DAPI (blå). Billeder blev taget med konfokal mikroskopi. Skala bar = 50 μm (E) NMuMG celler blev farvet med fluorescein-phalloidin (grøn) for at visualisere F-actin. Nuclei blev modstællet med DAPI (blå). Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: TGF-βsignaling og TGF-β-induceret EMT blev hæmmet af SB431542 og GW788388. (A) NMuMG-celler blev behandlet med 10 μM SB431542 (SB) eller de angivne koncentrationer af GW788388 (GW) i nærværelse af eller fravær af TGF-β (5 ng/mL) i 1 time. Celle lysater blev immunoblotted for p-SMAD2, SMAD2 / 3 og GAPDH. (B) NMuMG-celler blev behandlet med 5 μM SB431542 (SB) eller 10 μM GW788388 (GW) i nærværelse af eller fravær af 5 ng/mL TGF-β i 1 time og plettet ved immunfluorescens til påvisning af nuklear translokation af SMAD2/3 (grøn). Billeder blev taget med konfokal mikroskopi. (C) Ekspression af TGF-β målgener, herunder PAI-1 og gener, der koder EMT-markører, herunder SNAIL, E-Cadherin og Fibronectin, blev analyseret ved omvendt transskriptionase polymerasekædereaktion (RT-PCR) i NMuMG-celler efter SB- eller GW-behandling og TGF-β stimulation i 48 timer. GAPDH fungerede som en lastekontrol. Kontrolelementet angiver ikke-bebehandlede celler. Dette tal er blevet ændret fra Petersen M. et al.. 34 med tilladelse fra udgiveren. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: EMT-afledte Py2T murin brystkræftceller kan induceres til at differentiere sig til adipocytter. Py2T murin brystkræftceller blev stimuleret med 2 ng / mL TGF-β i 20 dage for at fremkalde fuldstændig EMT. Derefter blev cellerne behandlet enten med DMSO som et køretøj kontrol eller rosiglitazone (2 μM) i 10 dage for at tillade differentiering af mesenchymale kræftceller og fremkalde adipogenesis. Mediet blev ændret hver anden dag. Efter 10 dages behandling blev cellerne plettet med olierød O. Skalastang = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Arter Gennavn Fremad (5' til 3') Omvendt (5' til 3')
Menneskelige GAPDH TGCACCACCAACTGCTTAGC GGCATGGACTGTGGTCATGAG
SMAD7 TCCAGATGCTGTGCCTTCC GTCCGAATTGAGCTGTCCG
SERPINE1 CACAAATCAGACGGCAGCACT CATCGGGCGTGGTGAACTC
Musen GAPDH TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC AAGATGGTGATGGGCTTCCCG
CDH1 ACCAAAGTGACGCTGAAGTC GAGGATGTACTTGGCAATGG
Sneglen CAGCTGGCCAGGCTCTCGGT GCGAGGGCCTCCGGAGCA
ZEB2 TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC TTCTGGCCCCATTGCATCAT

Tabel 1: Primere, der bruges til qRT-PCR.

Discussion

TGF-β/SMAD signalering spiller en central rolle i brystkræft progression, da det kan fremme brystkræft celle invasivitet og metastaser ved at fremkalde EMT7. Her beskrev vi en logisk arbejdsgang for at undersøge TGF-β-initieret signalering fra receptor-induceret SMAD-aktivering til SMAD-medierede transskriptionelle og biologiske reaktioner. Vi startede med at beskrive analysen af SMAD2 fosforylering, fortsatte med TGF-β-induceret SMAD3-afhængige transskriptionelle reaktioner og EMT-markørudtryk på både gen- og proteinniveauer for at analysere TGF-β / SMAD-signalrespons og undersøgte endelig TGF-β-induceret EMT. Vi brugte CAGA12-luciferase transskriptionel reporter, der indeholder CAGA bokse stammer fra PAI-1 initiativtageren, til at overvåge aktiviteten af TGF-β/SMAD signalering vej35. Denne reporterkonstruktion kræver SMAD3 og SMAD4 til aktivering. Tidligere undersøgelser har vist , at knockdown af SMAD4 svækkede TGF-β-induceret CAGA12-luciferase aktivitet37. Ud over reporter assay, bestemmelse af fosforylering status af endogene SMADs, herunder SMAD2 og SMAD3, er en anden måde at undersøge TGF-β signalering svar. Faktisk andre medlemmer af TGF-β familie, såsom vækst og differentiering faktor (GDF)-8/myostatin og GDF-9, også transduce signaler via SMAD2 / 3 proteiner ved at engagere TβRI42,43,44. Ud over CAGA12-luciferase reporter, flere lignende journalister er blevet brugt til at opdage aktiveringen af TGF-β signalering. For eksempel kan en transskriptionel (SBE)4-Lux reporter med responselementer afledt af JunB-initiativtageren effektivt induceres af TGF-β, aktiviteter og BMP'er45.

Vestlig blotting og qPCR blev brugt til at analysere TGF-β-induceret EMT, som er klassiske metoder til at undersøge udtrykket af epitelmarkører (dvs. E-cadherin) og mesenchymale markører (dvs. N-cadherin, Snail, Slug og Zeb2). Vi har også udført indirekte immunfluorescens farvning af E-cadherin og direkte fluorescens farvning af F-actin. Disse assays yderligere valideret mesenchymal fænotype af celler efter TGF-β behandling. Begrænsningen af immunfluorescensfarvning er, at celler skal rettes før inkubation med antistoffer og billeddannelse, og det er vanskeligt at undersøge ændringer i EMT-markørudtryk i levende celler. For nylig har udformningen af EMT reporter cellelinjer, såsom A549 lunge adenocarcinoma-vimentin-RFP, gjort det muligt at overvåge omdannelsen af epitelceller til mesenchymale celler i realtid via udtryk for rødt fluorescerende protein (RFP)-mærket vimentin. Denne platform kunne bruges til narkotikascreening og ny lægemiddeludvikling46. LifeAct farvestof, en 17-amino-syre peptid, der kan plette F-actin strukturer i levende celler, er ved at blive et værdifuldt redskab til at visualisere actin cytoskeleton i realtid uden at forstyrre cellulære processer47. I denne undersøgelse brugte vi to småmolekylehæmmere, SB431542 og GW788388, til at validere deres hæmmende virkning på TGF-β signalering og TGF-β-induceret EMT. Især GW788388 hæmmer kraftigt TβRI- og TβRII-aktiviteten, mens SB431542 kun har en hæmmende virkning på TβRI (og ALK4 og ALK7). Tidligere undersøgelser viste, at GW788388 er mere potent in vivo end SB43154240. Ud over hæmning af EMT reducerede GW788388 udtrykket af fibrosemarkører i nyrerne, og oral administration af GW788388 i diabetiske mus faldt markant glomerulopati25,48.

EMT spiller en væsentlig rolle i at fremme kræft celle plasticitet og resulterer i resistens over for lægemidler og metastaser 49. Derfor er det blevet foreslået at målrette EMT-afledte celler med specifikke cytotoksiske lægemidler50 eller fremkalde redifferentiering via mesenchymal-til-epitelovergang (MET)51 som en tilgang til at overvinde kræftcellemetastase og terapiresistens. Met bidrager imidlertid til spredning af udbredte kræftceller i fjerne organer52, som kan virke mod hensigten, når der anvendes terapeutisk reversion af EMT. For nylig rapporterede en ny undersøgelse en terapeutisk transdifferentiation tilgang ved direkte at målrette EMT-afledte brystkræftceller til differentiering i adipocytter30. Undersøgelsen af Ishay-Ronen et. al.30 brugte Py2T murine epitelkræftceller, der havde gennemgået en overgang til mesenchymale celler som reaktion på langvarig behandling med TGF-β. De viste, at rosiglitazone i kombination med MEK-hæmmere forbedrede epiteldifferentiering og adipogenesis. Men vi fandt, at rosiglitazone alene var tilstrækkelig til at fremkalde transdifferentiation af mesenchymale Py2T murinceller i adipocytter.

Sammenfattende gav de metoder, der blev anvendt i denne undersøgelse, en logisk arbejdsgang til at undersøge TGF-β signalering og TGF-β-induceret EMT. De to hæmmere, SB431542 og GW788388, kan blokere TGF-β-inducerede reaktioner og EMT. Derudover har vi også vist rosiglitazone alene inducerer adipogenesis i visse TGF-β-induceret mesenchymale brystkræftceller. Selv om vi brugte kun flere brystkræft cellelinjer til at undersøge TGF-β svar, de metoder, der er beskrevet her kunne ekstrapoleres til andre (kræft) celler. Her brugte vi forskellige TGF-β koncentrationer til at fremkalde cellulære reaktioner. I de fleste celletyper udøver TGF-β sin biologiske aktivitet i koncentrationsområdet 0,01-10 ng/mL53 og fremkalder signalering i et dosisresponsmønster. I primære endotelceller, herunder kvægaortatelceller, nåede TGF-β det betydelige udtryk for fosforineret SMAD2 ved 0,025 ng/mL, et maksimum på 0,25 mL og forblev på dette niveau som reaktion på højerekoncentrationer 53. I vores undersøgelse, brugte vi en høj koncentration af TGF-β (5 ng / mL) i MCF10A-Ras celler for transskriptionelle reporter analyse for at opnå stærke reaktioner. SMAD2 fosforylering og målgenkspression kan induceres af TGF-β ved en lav dosis; således brugte vi 2,5 ng / mL TGF-β til behandling af celler. Den mest egnede arbejdskoncentration afhænger imidlertid af celletypen og de anslåede virkninger. For at bestemme den bedste koncentration af TGF-β anbefales det at behandle cellerne med forskellige doser (fra lav til høj).

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender støtten fra det kinesiske stipendieråd (CSC) til J.Z. og Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC. NL) til P.t.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
18 mm-side square glass coverslips Menzel Gläser 631-1331
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories H-1200
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 555 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21422
Anti-E-cadherin antibody BD Biosciences 610181
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody Merck Millipore MAB374
Anti-N-cadherin antibody BD Biosciences 610920
Anti-Slug antibody Cell Signaling Technology 9585
anti-SMAD2/3 antibody Becton Dickinson 610842
Anti-Snail antibody Cell Signaling Technology 3879
Anti-Tubulin antibody Cell Signaling Technology 2148
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Cholera enterotoxin Sigma-Aldrich C8052
Clarity Western ECL Substrate Bio-Rad 1705060
DC protein assay kit Bio-Rad 5000111
DMEM-high glucose Thermo Fisher Scientific 11965092
DMEM-high glucose medium Thermo Fisher Scientific 11965092
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12 Thermo Fisher Scientific 11039047
epidermal growth factor (EGF) Merck Millipore 01-107
Fetal bovine serum (FBS) BioWest S1860-500
GoTaq qPCR Master Mix PROMEGA A600X
Horse serum Thermo Fisher Scientific 26050088
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0135
Insulin Sigma-Aldrich 91077C
Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
NucleoSpin RNA II kit BIOKE´ 740955
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Thermo Fisher Scientific 15140148
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck Millipore IPVH00010
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific K1621
Rosiglitazone Sigma-Aldrich 557366-M
Skimmed milk Campina: Elk
Equipment
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad 17001402
CFX Connect Detection System Bio-Rad 1855201
Luminometer Perkin Elmer 2030-0050
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tzavlaki, K., Moustakas, A. TGF-β Signaling. Biomolecules. 10 (3), (2020).
  2. Hao, Y., Baker, D., Ten Dijke, P. TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Cancer Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), (2019).
  3. Morikawa, M., Derynck, R., Miyazono, K. TGF-β and the TGF-β Family: Context-Dependent Roles in Cell and Tissue Physiology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (5), (2016).
  4. Derynck, R., Akhurst, R. J. Differentiation plasticity regulated by TGF-β family proteins in development and disease. Nature Cell Biology. 9 (9), 1000-1004 (2007).
  5. Massague, J. How cells read TGF-β signals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (3), 169-178 (2000).
  6. Seoane, J., Gomis, R. R. TGF-β Family Signaling in Tumor Suppression and Cancer Progression. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (12), (2017).
  7. Colak, S., Ten Dijke, P. Targeting TGF-β Signaling in Cancer. Trends in Cancer. 3 (1), 56-71 (2017).
  8. Suriyamurthy, S., Baker, D., ten Dijke, P., Iyengar, P. V. Epigenetic Reprogramming of TGF-β Signaling in Breast Cancer. Cancers (Basel). 11 (5), (2019).
  9. Drabsch, Y., Ten Dijke, P. TGF-β signalling and its role in cancer progression and metastasis). Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3-4), 553-568 (2012).
  10. Goumans, M. J., Ten Dijke, P. TGF-β Signaling in Control of Cardiovascular Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), (2018).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-β and TGF-β-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), (2016).
  12. Robertson, I. B., et al. Latent TGF-β-binding proteins. Matrix Biology. 47, 44-53 (2015).
  13. Khan, Z., Marshall, J. F. The role of integrins in TGF-β activation in the tumour stroma. Cell and Tissue Research. 365 (3), 657-673 (2016).
  14. Jenkins, G. The role of proteases in transforming growth factor-β activation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1068-1078 (2008).
  15. Tran, D. Q., et al. GARP (LRRC32) is essential for the surface expression of latent TGF-β on platelets and activated FOXP3+ regulatory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13445-13450 (2009).
  16. Stockis, J., Colau, D., Coulie, P. G., Lucas, S. Membrane protein GARP is a receptor for latent TGF-β on the surface of activated human Treg. European Journal of Immunology. 39 (12), 3315-3322 (2009).
  17. Wang, R., et al. GARP regulates the bioavailability and activation of TGF-β. Molecular Biology of the Cell. 23 (6), 1129-1139 (2012).
  18. Vander Ark, A., Cao, J., Li, X. TGF-β receptors: In and beyond TGF-β signaling. Cellular Signalling. 52, 112-120 (2018).
  19. Heldin, C. H., Miyazono, K., ten Dijke, P. TGF-β signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature. 390 (6659), 465-471 (1997).
  20. ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signalling. Trends in Biochemical Sciences. 29 (5), 265-273 (2004).
  21. Miyazono, K. TGF-β signaling by Smad proteins. Cytokine & Growth Factor Reviews. 11 (1-2), 15-22 (2000).
  22. Yu, Y., Feng, X. H. TGF-β signaling in cell fate control and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 61, 56-63 (2019).
  23. Zhang, Y. E. Non-Smad pathways in TGF-β signaling. Cell Research. 19 (1), 128-139 (2009).
  24. Katsuno, Y., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-β signaling and epithelial-mesenchymal transition in cancer progression. Current Opinion in Oncology. 25 (1), 76-84 (2013).
  25. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (3), 178-196 (2014).
  26. Yang, J., et al. Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 341-352 (2020).
  27. Zhang, Y., Weinberg, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition in cancer: complexity and opportunities. Frontiers in Medicine. 12 (4), 361-373 (2018).
  28. Brabletz, T., Kalluri, R., Nieto, M. A., Weinberg, R. A. EMT in cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (2), 128-134 (2018).
  29. Ocana, O. H., et al. Metastatic colonization requires the repression of the epithelial-mesenchymal transition inducer Prrx1. Cancer Cell. 22 (6), 709-724 (2012).
  30. Ishay-Ronen, D., et al. Gain Fat-Lose Metastasis: Converting Invasive Breast Cancer Cells into Adipocytes Inhibits Cancer Metastasis. Cancer Cell. 35 (1), 17-32 (2019).
  31. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiology Ecology. 67 (1), 6-20 (2009).
  32. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  33. Sundqvist, A., et al. JUNB governs a feed-forward network of TGF-β signaling that aggravates breast cancer invasion. Nucleic Acids Research. 46 (3), 1180-1195 (2018).
  34. Persson, U., et al. The L45 loop in type I receptors for TGF-β family members is a critical determinant in specifying Smad isoform activation. FEBS Letters. 434 (1-2), 83-87 (1998).
  35. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF-β-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. The EMBO Journal. 17 (11), 3091-3100 (1998).
  36. Piek, E., Moustakas, A., Kurisaki, A., Heldin, C. H., ten Dijke, P. TGF-β type I receptor/ALK-5 and Smad proteins mediate epithelial to mesenchymal transdifferentiation in NMuMG breast epithelial cells. Journal of Cell Science. 112, Pt 24 4557-4568 (1999).
  37. Deckers, M., et al. The tumor suppressor Smad4 is required for transforming growth factor-β-induced epithelial to mesenchymal transition and bone metastasis of breast cancer cells. Cancer Research. 66 (4), 2202-2209 (2006).
  38. Souchelnytskyi, S., et al. Phosphorylation of Ser465 and Ser467 in the C terminus of Smad2 mediates interaction with Smad4 and is required for transforming growth factor-β signaling. Journal of Biological Chemistry. 272 (44), 28107-28115 (1997).
  39. Abdollah, S., et al. TβRI phosphorylation of Smad2 on Ser465 and Ser467 is required for Smad2-Smad4 complex formation and signaling. Journal of Biological Chemistry. 272 (44), 27678-27685 (1997).
  40. Petersen, M., et al. Oral administration of GW788388, an inhibitor of TGF-β type I and II receptor kinases, decreases renal fibrosis. Kidney International. 73 (6), 705-715 (2008).
  41. Gubelmann, C., et al. Identification of the transcription factor ZEB1 as a central component of the adipogenic gene regulatory network. Elife. 3, 03346 (2014).
  42. Nickel, J., Ten Dijke, P., Mueller, T. D. TGF-β family co-receptor function and signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 50 (1), 12-36 (2018).
  43. Mazerbourg, S., et al. Growth differentiation factor-9 signaling is mediated by the type I receptor, activin receptor-like kinase 5. Molecular Endocrinology. 18 (3), 653-665 (2004).
  44. Rebbapragada, A., Benchabane, H., Wrana, J. L., Celeste, A. J., Attisano, L. Myostatin signals through a transforming growth factor-β-like signaling pathway to block adipogenesis. Molecular and Cellular Biology. 23 (20), 7230-7242 (2003).
  45. Jonk, L. J., Itoh, S., Heldin, C. H., ten Dijke, P., Kruijer, W. Identification and functional characterization of a Smad binding element (SBE) in the JunB promoter that acts as a transforming growth factor-β, activin, and bone morphogenetic protein-inducible enhancer. Journal of Biological Chemistry. 273 (33), 21145-21152 (1998).
  46. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
  47. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  48. Gellibert, F., et al. Discovery of 4-{4-[3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H- pyran-4-yl)benzamide (GW788388): a potent, selective, and orally active transforming growth factor-β type I receptor inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (7), 2210-2221 (2006).
  49. Ishay-Ronen, D., Christofori, G. Targeting Cancer Cell Metastasis by Converting Cancer Cells into Fat. Cancer Research. 79 (21), 5471-5475 (2019).
  50. Gupta, P. B., et al. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. Cell. 138 (4), 645-659 (2009).
  51. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), (2016).
  52. Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Research. 72 (6), 1384-1394 (2012).
  53. Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-β type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).

Tags

Cancer Research omdanne vækstfaktor-β epitel-til-mesenchymal overgang brystkræft vestlige blotting transskriptionel reporter immunofluorescens hæmmere adipogenesis

Erratum

Formal Correction: Erratum: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells
Posted by JoVE Editors on 12/15/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. NMuMG was mislabeled as cancer cells.

NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-β in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

Undersøgelse TGF-β Signalering og TGF-β-induceret Epitel-til-mesenchymal Overgang i brystkræft og normale celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Thorikay, M., van der… More

Zhang, J., Thorikay, M., van der Zon, G., van Dinther, M., ten Dijke, P. Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. J. Vis. Exp. (164), e61830, doi:10.3791/61830 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter