Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Co-translationel indsættelse af membranproteiner i præformerede nanodiscs

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61844
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biophysical Chemistry, Goethe University Frankfurt

Summary

Co-translationel indsættelse i præformede nanodiscs gør det muligt at studere cellefrie syntetiserede membranproteiner i definerede lipidmiljøer uden kontakt med vaskemidler. Denne protokol beskriver forberedelsen af væsentlige systemkomponenter og de kritiske parametre til forbedring af ekspressionseffektivitet og prøvekvalitet.

Abstract

Cellefrie ekspressionssystemer muliggør skræddersyet design af reaktionsmiljøer til at understøtte funktionel foldning af selv komplekse proteiner såsom membranproteiner. De eksperimentelle procedurer for co-translationel indsættelse og foldning af membranproteiner i præformerede og definerede membraner, der leveres som nanodiscs, demonstreres. Protokollen er helt vaskemiddelfri og kan generere milligram rensede prøver inden for en dag. De resulterende membranprotein / nanodiscprøver kan bruges til en række funktionelle undersøgelser og strukturelle anvendelser såsom krystallisation, nuklear magnetisk resonans eller elektronmikroskopi. Fremstillingen af grundlæggende nøglekomponenter såsom cellefrie lysater, nanodiscs med designede membraner, kritiske lageropløsninger samt samling af to-rums cellefrie ekspressionsreaktioner er beskrevet. Da foldekrav til membranproteiner kan være meget forskellige, er et vigtigt fokus i denne protokol modulering af parametre og reaktionstrin, der er vigtige for prøvekvalitet, såsom kritiske basiske reaktionsforbindelser, membransammensætning af nanodiscs, redox- og chaperonmiljø eller DNA-skabelondesign. Hele processen demonstreres med syntesen af proteorhodopsin og en G-proteinkoblet receptor.

Introduction

Membranproteiner (MP'er) er udfordrende mål i proteinproduktionsundersøgelser på grund af deres uopløselighed i vandige miljøer. Konventionelle MP-produktionsplatforme omfatter cellebaserede systemer såsom E. coli, gær eller eukaryote celler. De syntetiserede rekombinante parlamentsmedlemmer ekstraheres enten fra cellemembraner eller genfoldes fra inklusionslegemer1. Efter opløselse af vaskemidler kan parlamentsmedlemmer overføres til egnede membranmiljøer ved hjælp af etablerede in vitro-rekonstitutionsprotokoller. Udover vesikler og liposomer er MP-rekonstitution til plane membraner i form af nanodiscs2 - eller salipro3-partikler blevet rutineteknikker i nyere tid. Imidlertid indebærer alle disse strategier vaskemiddelkontakt med parlamentsmedlemmer, der kan resultere i destabilisering, dissociation af oligomerer og endda tab af proteinstruktur og aktivitet4. Screening for optimale opløselige vaskemiddel- og rekonstitutionsforhold kan derfor være kedelig og tidskrævende5.

Den åbne natur af cellefrie (CF) systemer gør det muligt at forsyne ekspressionsreaktionen direkte med præformede membraner med en defineret lipidsammensætning. I denne lipidbaserede ekspressionstilstand (L-CF) har de syntetiserede parlamentsmedlemmer mulighed for co-translationelt at indsætte i de medfølgende dobbeltlag 6,7 (figur 1). Nanodiscs bestående af et membranstilladsprotein (MSP) omkring en plan lipid dobbeltlagsskive8 synes at være særligt velegnet til denne strategi 9,10. Nanodiscs kan rutinemæssigt samles in vitro med en række forskellige lipider, de er meget stabile, og lagre kan koncentreres op til 1 mM. Imidlertid er MSP-ekspression i E. coli og dens oprensning nødvendig. Som en alternativ strategi kan MFP udtrykkes sammen med mål-MP i CF-reaktioner forsynet med liposomer11,12,13. DNA-skabeloner til både MSP og MP tilføjes i reaktionen, og MP/nanodiscs kan dannes ved ekspression. Mens MSP-produktion undgås, kræver co-ekspressionsstrategien omhyggelig finjustering af de endelige DNA-skabelonkoncentrationer, og der kan forventes højere variationer i effektiviteten af prøveproduktion.

Den co-translationelle indsættelse af parlamentsmedlemmer i membraner af præformerede nanodiscs er en ikke-fysiologisk og stadig stort set ukendt mekanisme uafhængig af translocon maskiner og signalsekvenser13,14,15,16. Hoveddeterminanter for indsættelseseffektiviteten er typen af membranprotein såvel som lipidsammensætningen af den tilvejebragte membran, med en hyppig præference for negativt ladede lipider15,17. Da nanodiscmembranerne er relativt begrænsede i størrelse, frigives en betydelig mængde lipider ved MP-indsættelse18. Variation af nanodisc-størrelse muliggør indsættelse og tuning af højere oligomere MP-komplekser15,18. Blandt andet blev den korrekte samling af homooligomere komplekser vist for ionkanalen KcsA, for ionpumpen proteorhodopsin (PR) og for multidrugtransportøren EmrE15,18. Parlamentsmedlemmer vil sandsynligvis komme ind i den symmetriske nanodiscmembran fra begge sider med relativt lige frekvens. Det bør derfor tages i betragtning, at forskellige monomerer eller oligomerer, der indsættes i en nanodisk, kan have modsatte retninger. En skævhed i orienteringen kan imidlertid være forårsaget af kooperative indsættelsesmekanismer som rapporteret for dannelsen af PR-hexamerer og KcsA-tetramerer18. En yderligere bias i MP-orientering kan skyldes orienteringsafbrydere af indsatte parlamentsmedlemmer, sandsynligvis ved kanten af nanodiscmembranerne.

Produktionen af CF-lysater fra E. coli-stammer er en pålidelig rutineteknik og kan udføres i næsten ethvert biokemisk laboratorium19,20. Det skal overvejes, at udover disulfidbrodannelse er de fleste andre posttranslationelle modifikationer fraværende, hvis et MP syntetiseres ved hjælp af E. coli-lysater. Selv om dette kan generere mere homogene prøver til strukturelle undersøgelser, kan det være nødvendigt at udelukke potentielle virkninger på funktionen af individuelle MP-mål. Den effektive produktion af prøver af høj kvalitet af G-proteinkoblede receptorer (GPCR)14,21,22, eukaryote transportører 23 eller store heteromere samlinger 24 i E. coli CF-lysater indikerer imidlertid deres egnethed til selv komplekse mål. Præparative skalamængder (≈ 1 mg/ml) af en prøve kan opnås med konfigurationen af den to-rums kontinuerlige udvekslingscellefri (CECF), der består af en reaktionsblanding (RM) og et fødeblandingsrum (FM). FM-volumenet overstiger RM-volumenet 15 til 20 gange og giver et reservoir af lavmolekylære energiforbindelser og prækursorer19. Udtryksreaktionen forlænges således i flere timer, og det endelige udbytte af MP-målet øges. RM- og FM-rummene er adskilt af en dialysemembran med en 10-14 kDa afskæring. De to rum kræver en særlig konstruktion af CECF-reaktionsbeholderen (figur 1). Kommercielle dialysekassetter som RM-beholdere i kombination med skræddersyede plexiglasbeholdere, der holder FM, er egnede eksempler. MP-udbytter kan yderligere manipuleres ved at ændre RM: FM-forholdet eller ved at udveksle FM efter en vis inkubationsperiode.

Udbytte og kvalitet af en MP kræver ofte intens optimering af reaktionsparametre. En vigtig fordel ved CF-ekspression er muligheden for at ændre og finjustere næsten enhver forbindelse i henhold til de individuelle krav til et MP. En ligetil strategi er først at fokusere på at forbedre udbyttet af en MP ved at etablere en grundlæggende produktionsprotokol og derefter optimere MP-kvaliteten ved at finjustere reaktions- og foldeforhold. Fraværet af fysiologiske processer i CF-lysater og deres reducerede kompleksitet resulterer i høje succesrater for effektiv produktion af parlamentsmedlemmer25. Rutinemæssige overvejelser om DNA-skabelondesign og optimering af Mg 2+ ionkoncentration er i de fleste tilfælde tilstrækkelige til at opnå tilfredsstillende udbytter26. Afhængigt af udtrykstilstand kan optimering af MP-kvalitet blive tidskrævende, da en større række parametre skal screenes14,17,22.

For at etablere den beskrevne CF-ekspressionsplatform er protokoller nødvendige til fremstilling af E. coli CF-lysat (i), T7 RNA-polymerase (ii), nanodiscs (iii) og de basiske CECF-reaktionsforbindelser (iv) (figur 1). E. coli K12 stamme A1927 eller BL21 derivater anvendes ofte til fremstilling af effektive S30 (centrifugering ved 30.000 x g) lysater. Ud over S30-lysater kan tilsvarende lysater, der centrifugeres ved andre g-kræfter (f.eks. S12), anvendes. Lysaterne adskiller sig i ekspressionseffektivitet og i proteomkompleksitet. Proteomet af S30-lysatet fremstillet af den beskrevne protokol er blevet undersøgt i detaljer28. S30-proteomet indeholder stadig nogle resterende ydre membranproteiner, som kan give baggrundsproblemer ved ekspression og analyse af ionkanaler. Til sådanne mål anbefales brugen af S80-S100 lysater. En værdifuld modifikation under lysatforberedelse er induktionen af SOS-responsen ved kombineret varmechok og ethanolforsyning i cellernes midt-logvækstfase. De resulterende HS30-lysater er beriget med chaperoner og kan bruges i blandinger med S30-lysater for forbedret MP-foldning22. CF-ekspression i E. coli-lysater drives som en koblet transkriptions-/translationsproces med DNA-skabeloner indeholdende promotorer kontrolleret af T7 RNA-polymerase (T7RNAP). Enzymet kan produceres effektivt i BL21 (DE3) stjerneceller, der bærer pAR1219 plasmidet29.

To kopier af MSP1E3D1 samles i en nanodisc med en diameter på 10-12 nm, men protokollen beskrevet nedenfor kan også fungere for andre MSP-derivater. Imidlertid har nanodiscs, der er større end dem, der er dannet med MSP1E3D1, en tendens til at være mindre stabile, mens mindre nanodiscs dannet med MSP-derivater såsom MSP1 muligvis ikke rummer større parlamentsmedlemmer eller MP-komplekser. MSP1E3D1 nanodiscs kan samles in vitro med en lang række forskellige lipider eller lipidblandinger. Præformede nanodiscs er normalt stabile i > 1 år ved -80 °C, mens stabiliteten kan variere for forskellige lipidkomponenter. Til screening af lipideffekter på foldning og stabilitet af en MP er det nødvendigt at forberede et omfattende sæt nanodiscs samlet med et repræsentativt udvalg af lipider / lipidblandinger. Følgende lipider kan give et godt startvalg: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC).

En protokol til fremstilling af en 3 ml CECF-reaktion er beskrevet. Yderligere op- eller nedskalering i forholdet 1:1 er mulig. Til CECF-konfigurationen med to rum skal der fremstilles en RM, der indeholder alle forbindelser, og en FM, der kun indeholder lavmolekylære forbindelser. Kommercielle 3 ml dialyseanordninger med 10-14 kDa MWCO kan bruges som RM-containere, som derefter placeres i specialfremstillede plexiglasbeholdere, der holder FM (figur 1D)30. Forholdet mellem RM: FM er 1:20, så 60 ml FM skal forberedes til 3 ml RM. Kvalitet, koncentration eller type af flere komponenter kan være kritisk for det endelige udbytte og / eller kvaliteten af den syntetiserede MP (tabel 1). DNA-skabeloner skal udarbejdes i henhold til offentliggjorte retningslinjer, og kodonoptimering af målets læseramme kan yderligere forbedre produktudbyttet26. For præparativ skala CECF-reaktion beskrives en etableret protokol til produktion af PR. For at etablere udtryksprotokoller for nye parlamentsmedlemmer er det normalt nødvendigt at udføre optimeringsskærme af visse forbindelser (tabel 1) for at forbedre udbytte og kvalitet. For Mg2+ ioner findes der en velfokuseret koncentrationsoptimal, der ofte viser betydelig variation for forskellige DNA-skabeloner. Andre CF-reaktionsforbindelser, såsom nye batcher af T7RNAP- eller S30-lysater, kan yderligere ændre den optimale Mg2+ koncentration. Som et eksempel beskrives en typisk Mg 2+ skærm inden for området 14-24 mM koncentration og i trin på 2 mM. Hver koncentration screenes i dubletter og i analyseskala CECF-reaktioner. Som CECF-reaktionsbeholder anvendes specialfremstillede Mini-CECF plexiglasbeholdere30 , der holder RM, i kombination med standard 24-brønds mikroplader, der holder FM (figur 1B). Alternativt kan der anvendes kommercielle dialysepatroner i kombination med 96-dybe brøndmikroplader eller andre kommercielle dialysatoranordninger i passende opsætninger (figur 1C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tilberedning af S30-lysat

  1. Dag 1: Stribe celler ud fra glycerollagre på en LB-agarplade og inkuberes ved 37 °C natten over.
  2. Dag 2: Der podes 200 ml LB-medium med cellerne fra agarpladen, og der inkuberes ved 37 °C i 12-14 timer.
  3. Dag 3: Pod 10 L sterilt YPTG-medium (10 g / L gærekstrakt, 16 g / L tryptone, 5 g / L NaCl, 19,8 g / L glucose, 4,4 mM KH 2 PO 4, 8 mM K2HPO4) hærdet til 37 ° C i en 15 L rørt tankreaktor med 100 ml forkultur (1:100). Dyrk ved 37 °C, 500 o / min og høj beluftning (~ 3 luftmængder pr. Minut). For at forhindre overdreven skumdannelse tilsættes sterilt antiskum.
  4. Mål optisk tæthed (OD) ved 600 nm i regelmæssige tidsintervaller. Efter ca. 2 timer går kulturen ind i logfasen.
  5. Modifikation for HS30 lysat: Når celler er i midten af logfasen (OD600 ≈ 3,6-4,2), tilsættes 300 ml ethanol til dyrkningsmediet og fortsætter dyrkningen ved 42 ° C, 500 o / min og høj beluftning (ca. 3 luftmængder pr. Minut) i yderligere 45 minutter. Fortsæt derefter med afkøling og høst af cellekulturen som beskrevet i trin 1.6. Til fremstilling af standard S30-lysat skal du springe dette trin over og fortsætte med trin 1.6.
  6. Når celler er i midten af logfasen (OD600 ≈ 3,6-4,2), afkøles fermentoren under 20 ° C inden for < 30 minutter. Den endelige OD600 skal være omkring 4,5-5,5. Høst celler ved 4.500 x g i 20 minutter ved 4 °C og kassér supernatanten. Hold cellerne ved 4 °C i følgende trin.
    BEMÆRK: Under afkøling kan der forekomme overdreven skumdannelse. I dette tilfælde tilsættes enten antiskum eller reduceres omrøringshastigheden og/eller luftstrømmen i bioreaktoren.
  7. Celler suspenderes fuldstændigt i 300 ml S30-A-buffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,2, 14 mM Mg (OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-mercaptoethanol) ved hjælp af en spatel efterfulgt af pipettering af suspensionen op og ned indtil homogenitet. Centrifuge ved 8.000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Gentag dette trin to gange.
    FORSIGTIG: 2-mercaptoethanol er giftigt. Undgå kontakt med hud eller luftveje. Hvis det er muligt, skal du arbejde under en hætte. Det tomme centrifugebæger vejes inden det sidste vasketrin. Efter centrifugering vejes vådcellepelleten og enten fortsættes med trin 1.8, eller pelleten opbevares indtil yderligere brug.
    BEMÆRK: Vægten af vådcellepellet er 5-7 g pr. 1 L bioreaktorkultur. På dette tidspunkt kan protokollen sættes på pause, og pelleten kan fryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C i 4-8 uger.
  8. S30-B buffer suspenderes grundigt i 1,1 volumener (1 g = 1 ml) (10 mM Tris-HCI, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 tablet cOmplete proteasehæmmer). Fyld suspensionen i en forkølet stempeltrykcelle og afbryd cellerne ved 1.000 psig. Send celler gennem den franske presse en gang.
  9. Lysatet centrifugeres ved 30.000 x g i 30 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et frisk rør og gentag centrifugeringstrinnet.
    BEMÆRK: Et løst og slimet lag kan være til stede oven på pelleten efter den første centrifugering, som ikke bør overføres med supernatanten.
  10. Påfør et højt salt- og varmetrin for at fjerne ustabile lysatkomponenter og frigive mRNA fra ribosomer. Lysatet justeres til 0,4 M NaCl, og der inkuberes ved 42 °C i 45 minutter i et vandbad.
    BEMÆRK: Dette trin vil medføre betydelig bundfaldsdannelse. Vend eller inverter røret under inkubation fra tid til anden.
  11. Overfør den uklare suspension (normalt 50-80 ml) til dialyserør med en 10-14 kDa cutoff og dialysér mod 5 L S30-C buffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,2, 14 mM Mg (OAc)2, 60 mM KOAc, 0,5 mM DTT). Udskift S30-C dialysebufferen efter 2-3 timer og dialysér i yderligere 12-14 timer.
  12. Dag 4: Den dialyserede suspension overføres til centrifugerør og centrifugeres ved 30.000 x g i 30 minutter ved 4 °C. Overfør supernatant (S30 lysat) til friske 50 ml rør og bland forsigtigt. Proteinkoncentrationen af lysatet skal være ca. 30-40 mg / ml. Stødfrysning af alikvoter (f.eks. 0,5 ml, 1 ml) i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C. Aliquoterne er stabile i > 1 år.

2. Ekspression og oprensning af T7 RNA-polymerase

  1. Dag 1: Der podes 200 ml LB-medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin med nybelagte BL21(DE3)-stjerner x pAR1219-celler, og der inkuberes ved 37 °C og 180 o/min. i 12-16 timer.
  2. Dag 2: Pod 1 L fantastisk bouillon (12 g / L tryptone, 24 g / L gærekstrakt, 4 ml / l glycerol) i en 2 L forvirret kolbe med 10 ml forkultur og inkuberes ved 37 ° C og 180 o / min omrøring. Start-OD600 skal være omkring 0,1.
  3. Når OD600 når 0,6-0,9, tilsættes IPTG til en endelig koncentration på 1 mM for at inducere T7RNAP-ekspression og fortsætte dyrkningen i yderligere 5 timer.
  4. Celler høstes ved centrifugering ved 4.500 x g i 20 minutter ved 4 °C. Celler fryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
  5. Dag 3: Der tilsættes 30 ml iskold suspensionsbuffer (30 mM Tris-HCI, pH 8,0 med en tablet cOmplete proteasehæmmer) til den frosne cellepellet, og pelleten optøes i et vandbad ved stuetemperatur. Suspender derefter pelleten ved at pipettere op og ned indtil homogenitet.
  6. Udfør celleforstyrrelse ved hjælp af en stempelkande som beskrevet i det foregående afsnit, eller brug en sonikeringsenhed i henhold til producentens anbefalinger. Derefter centrifugeres ved 20.000 x g i 30 minutter ved 4 °C, og supernatant overføres til et frisk rør.
  7. For at udfælde genomisk DNA tilsættes streptomycinsulfat langsomt og under blid omrøring til supernatanten, indtil en endelig koncentration på 3% (w / v) er nået. Inkuberes ved 4 °C i 5-10 minutter under blid omrøring. Centrifuge ved 20.000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
  8. Supernatanten filtreres med et 0,45 μm filter, og den lægges på en Q-Sepharose-søjle med et søjlevolumen (CV) på 40 ml ækvilibreret med 2 CV-ækvilibreringsbuffer (30 mM Tris-HCI, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% glycerol og 10 mM 2-mercaptoethanol) ved hjælp af en peristaltisk pumpe med en strømningshastighed på 4 ml/min. Tilslut derefter søjlen til en UV-detektor og fortsæt elutionen med ligevægtsbuffer, indtil UV-signalet ved 280 nm når en stabil basislinje.
  9. Elute T7RNAP med en gradient fra 50 mM til 500 mM NaCl pr. CV ved en strømningshastighed på 3 ml/min. Indsaml 1 ml fraktioner og forbered prøver til SDS-PAGE analyse ved at blande 10 μL af hver fraktion med 2 x SDS prøvebuffer. Kør SDS-PAGE og pletter gelen med Coomassie Blue R. T7RNAP skal fremstå som et fremtrædende bånd på ca. 90 kDa sammen med adskillige yderligere bånd af urenheder.
  10. Poolfraktioner indeholdende T7RNAP og dialysering ved hjælp af membraner med en 12-14 kDa MWCO i 12-16 timer i dialysebuffer (10 mM K 2 HPO 4/KH2PO4, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% (w/v) glycerol).
  11. Dag 4: T7RNAP-opløsning opsamles og koncentreres ved hjælp af filterenheder med 12-14 MWCO til en slutkoncentration på 3-10 mg/ml. T7RNAP kan begynde at udfælde under koncentration. Stop koncentrationen øjeblikkeligt, så snart turbiditet i prøven opstår. Tilsæt glycerol til en endelig koncentration på 50% (w / v) og bland forsigtigt. Stødfrysning 0,5-1 ml alikvoter og opbevares ved -80 °C. Arbejdende T7RNAP-alikvoter kan opbevares ved -20 °C.
    BEMÆRK: Ca. 20-40 ml 5 mg / ml delvist oprenset T7RNAP med 20.000-40.000 enheder skal opnås ved en 1 L fermentering. For at teste den optimale mængde af hver T7RNAP-batch skal CF-ekspressionsreaktioner af grønt fluorescerende protein (GFP) indeholdende 0,02 mg / ml-0,1 mg / ml af den forberedte T7RNAP-prøve udføres.

3. Ekspression og rensning af MSP1E3D1

  1. Dag 1: Transformer E. coli BL21 (DE3) stjerneceller med pET28(a)-MSP1E3D1 vektor31 ved hjælp af standard varmechoktransformation eller elektroporationsprotokoller. Stribe ud eller pladetransformerede celler på LB agar indeholdende 30 μg / ml kanamycin og inkuberes ved 37 ° C i 12-16 timer.
  2. Dag 2: Der podes 200 ml LB-medium suppleret med 0,5 % (w/v) glucose og 30 μg/ml kanamycin med en enkelt koloni plukket fra agarpladen og inkuberes ved 37 °C ved 180 o/min i 12-16 timer.
  3. Dag 3: Pod 10 L LB medium suppleret med 0,5% (w / v) glucose og 30 μg / ml kanamycin med 100 ml forkultur i en omrørt tank bioreaktor. Gennemfør gæring ved 37 °C, 500 o / min og beluftning af ca. 3 bioreaktorvolumener pr. Minut. I tilfælde af overdreven skumdannelse tilsættes antiskum.
    BEMÆRK: Forvirret rystekolber kan bruges i stedet for en fermentor.
  4. Ved OD600 på 6,5-7,5 tilsættes IPTG til en slutkoncentration på 1 mM og inkubationen fortsættes ved 37 °C i 1 time. Celler høstes ved centrifugering ved 4.500 x g i 20 minutter ved 4 °C. Cellepiller vaskes med 200 ml 0,9% (w/v) NaCl og centrifuger igen ved 8.000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kassér supernatant og overfør celler til 50 ml rør ved hjælp af en spatel. Den forventede våde pelletsvægt er 8-12 g pr. L bioreaktorkultur. Stødfrysende cellepellets i flydende nitrogen opbevares ved -80 °C indtil videre brug.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
  5. Dag 4: Til rensning optøes cellepiller i et vandbad ved RT. Suspender cellerne i MSP-A-buffer (40 mM Tris-HCI, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w / v) Triton X-100, 1 tablet c0mplet proteasehæmmercocktail pr. 50 ml cellesuspension) for at give en 30-40% (w / v) cellesuspension.
  6. Forstyrre celler ved sonikering eller ved hjælp af en stempelkande og centrifuge ved 30.000 x g i 30 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et frisk rør og filtrer gennem et 0,45 μm filter. Filtratet påføres på en Ni2+ fyldt nitrilotrieddikesyresøjle (CV > 15 ml), der er ækvilibreret med 5 CV MSP-B-buffer (40 mM Tris-HCI, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100) ved hjælp af en peristaltisk pumpe.
    BEMÆRK: For at lette filtrering kan supernatanten sonikeres i endnu et minut for at nedbryde store DNA-fragmenter.
  7. Efter prøveindlæsning vaskes kolonnen med 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl, 50 mM cholsyre), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl) og 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol).
    BEMÆRK: Cholsyre i MSP-C-bufferen er vigtig for at fjerne lipider bundet til MSP. Cholsyre er ikke fuldstændigt opløselig ved lave pH-værdier. PH-værdien skal derfor justeres til 8,9 i MSP-C og MSP-D. Det er vigtigt at vaske søjlen med MSP-D-buffer, da en lavere pH-værdi kan få resterende cholsyre til at udfældes og blokere eller beskadige søjlen.
  8. Elute MSP med MSP-G (40 mM Tris-HCI, pH 8,0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol). Saml fraktioner på 1 ml og overvåg UV-absorption ved 280 nm. Saml og saml fraktionerne af elutionstoppen.
  9. Overfør poolede MSP-fraktioner til 12-14 kDa MWCO-dialysemembranrør og dialysér mod 5 L MSP-H (40 mM Tris-HCI, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol) i 2-3 timer ved 4 °C. Skift til frisk 5 L MSP-H buffer og dialysér i yderligere 12-16 timer ved 4 °C.
  10. Dag 5: MSP-opløsning overføres til centrifugerør, og centrifuge ved 18.000 x g i 30 minutter ved 4 °C fjernes bundfald. Overfør supernatant til et frisk rør og koncentrer til 200-800 μM ved hjælp af ultrafiltreringsenheder med 12-14 kDa MWCO ved 4 °C. Koncentrationen måles ved hjælp af et UV/VIS-måleapparat. Brug udryddelseskoefficient på 27,31 M-1 cm-1 og molekylmassen på 31,96 kDa til beregning af koncentration.
    BEMÆRK: Ekspression i en bioreaktor giver normalt 15-30 mg MSP1E3D1 pr. L-kultur.
  11. Stødfrysende alikvoter af den koncentrerede MSP-opløsning i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.

4. Samling af MSP1E3D1 nanodiscs

  1. Dag 1: Forbered 1-2 ml 50 mM lipidbestande (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC eller POPC) i 100 mM natriumcholat. Opbevares ved -20 °C, hvis det ikke anvendes samme dag.
    BEMÆRK: Lipidopløsningen skal være klar. Hvis opløsningen ikke er klar, kan natriumcholatkoncentrationen øges til 150 mM.
  2. Bland MSP1E3D1-opløsningen med lipidopløsningen. Der tilsættes dodecylphosphocholin (DPC) i en slutkoncentration på 0,1 % (w/v). Samlingsreaktioner kan justeres til endelige volumener på 3 ml (tabel 2) eller 12 ml svarende til typiske volumener af dialysekassetter (10 kDa MWCO). Inkuber samlingsreaktioner i 1 time ved 21 °C under blid omrøring.
    BEMÆRK: For hvert lipid skal der anvendes et specifikt MSP1E3D1: lipidforhold for at sikre homogent nanodiscpræparat (tabel 2). For nye lipider eller lipidblandinger bør det optimale forhold bestemmes ved et pilotforsøg og størrelsesekskluderingskromatografianalyse14.
  3. Forvåd membranen i en dialysekassette med skivedannelsesbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl). Overfør samlingsblandingen til dialysekassetten med en sprøjte. Potentielle luftbobler kan fjernes ved aspiration ved hjælp af sprøjten.
  4. Dag 1-4: Dialysér mod 3 x 5 L DF-buffer i 10-20 timer ved RT under omrøring ved hjælp af en omrøringsstang. Overfør derefter samlingsblandingen fra dialysekassetten til centrifugalfilterenheder med 10 kDa MWCO ligestillet med DF-buffer. Koncentreres ved 4 000 x g ved 4 °C.
    BEMÆRK: En grumset dialyseblanding kan indikere et forkert støkiometrisk forhold mellem MSP: lipid. Bundfaldet skal fjernes ved 18 000 x g i 20 minutter ved 4 °C før prøvens koncentration. For at undgå nedbør under prøvekoncentrationen skal du bruge ultrafiltreringsenheder med et stort dødstop.
  5. De samlede nanodiscs koncentreres til en koncentration på mindst 300 μM. Mål koncentrationen ved hjælp af en UV/VIS-læser. Overvej at en nanodisc er dannet af to MSP1E3D1 molekyler, og derfor skal koncentrationen af MSP divideres med 2 for at bestemme den korrekte mængde nanodiscs.
    BEMÆRK: Den beskrevne opsætning (tabel 2) giver 0,6-1 ml af en 300 μM nanodisc-opløsning.
  6. Det koncentrerede nanodiscpræparat centrifugeres ved 18.000 x g i 20 minutter ved 4 °C for at fjerne bundfald. Derefter opsuges supernatanten og stødfryses 50 μL aliquoter i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
    BEMÆRK: Det anbefales at evaluere succesen med nanodisc-dannelse ved hjælp af størrelsesekskluderingskromatografi. Prøven skal være monodisperse og bør kun indeholde en lav mængde aggregater. Aggregater indikerer, at mængden af lipid i opsætningen er for høj. Som reference kan renset MSP1E3D1 anvendes. Hvis nanodiscpræparatet viser en top på højden af reference-MSP1E3D1-toppen, var det valgte lipid til MSP1E3D1-forhold for lavt.

5. Præparativ skala 3 ml CECF-reaktionsopsætning

  1. Dag 1: Alle nødvendige stamopløsninger forberedes som anført (tabel 3). Lagrene opbevares ved -20 °C og optøes ved stuetemperatur. Sørg for at blande alle bestande grundigt efter optøning og inden pipettering. Beregn de krævede mængder for alle lagre og lav et pipetteringsskema (tabel 4). Højmolekylære forbindelser vil kun blive tilsat til RM. For lavmolekylære forbindelser kan der fremstilles en kombineret 3 x mastermix til RM og FM.
    BEMÆRK: De endelige volumener af sammensatte blandinger kan være mindre end beregnet på grund af volumentab under blanding. Dette kan undgås ved at tilføje et overskydende volumen på 2-5% for at kompensere for volumentab.
  2. Ligevægt på membranen i en 3 ml dialysekassette i 100 mM Trisacetat, pH 8,0. Sørg for at fjerne overskydende buffer.
  3. Brug af en sprøjte til at overføre RM til dialysekassetten. Fjern overdreven luft i RM-rummet ved aspiration med sprøjten. Placer dialysekassetten i dialysekammeret.
  4. Fyld dialysekammeret op med 60 ml FM. Placer låget på kammeret og stram skruerne for at fastgøre det. Der inkuberes kammeret i 12-16 timer ved 30 °C ved 200 o/min.
    BEMÆRK: Sørg for, at kammeret forbliver i opretstående stilling under omrøring, ellers vil udveksling af lavmolekylære forbindelser blive hæmmet.
  5. Dag 2: Brug en sprøjte til at opsuge RM fra dialysekammeret. RM overføres til friske rør, og centrifugeres ved 16.000 x g ved 4 °C i 10 minutter for at fjerne bundfaldet. Overfør supernatanten til friske rør. Proteinet i supernatanten kan nu analyseres yderligere.
    BEMÆRK: I nogle tilfælde vil en pellet være til stede efter centrifugering. Dette kan give vigtige oplysninger om egnetheden af de analyserede nanodiscs eller reaktionsforbindelserne til at holde den syntetiserede MP opløselig. Det er derfor tilrådeligt at analysere mængden af mål, der potentielt er til stede i bundfaldet ved hjælp af SDS-PAGE, Western Blot, eller ved visuel evaluering af pelletstørrelsen.

6. Analytisk skala 60 μL CECF-reaktionsopsætning til Mg2+ ionscreening

  1. Dag 1: Bland alle komponenter i den respektive 3x master mix og fordel 60 μL til RM og 825 μL til FM. Fyld FM op med H2O og bland FM ved hvirvelstrøm. Overfør FM til 3 brønde af 24 brønde mikroplade (tabel 5).
    BEMÆRK: Da den tilpassede Mini-CECF-beholder muligvis ikke er tilgængelig, beregnes mængderne i tabel 5 for en reaktion udført i dialysepatroner (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) med et FM-volumen på 1,7 ml i 96 dybe brøndplader (2 ml) (figur 1).
  2. Skær regenererede cellulosedialyserør med en 10-14 kDa MWCO i stykker på ca. 25 x 20 mm og opbevar i H2O med 0,05% (w/v) natriumazid.
    FORSIGTIG: Natriumazid er meget giftigt. Undgå enhver kontakt med hud eller slimhinde. Brug ikke metalbeholdere, da natriumazid kan reagere med metaller for at danne eksplosive metalazider.
  3. Før Mini-CECF-beholdermontering fjernes overdreven H2O fra dialysemembranerne med et væv. Placer et membranstykke på hver beholder og fastgør membranerne med en polytetrafluorethylenring.
  4. Overfør Mini-CECF-beholderen til brøndene på en 24-brøndsplade med 825 μL FM. Undgå luftbobler under dialysemembranen i Mini-CECF-beholderen.
  5. Der tilsættes højmolekylære komponenter til RM som beskrevet (tabel 5), og der blandes ved pipettering op og ned. Der tilsættes 60 μL til reaktionsbeholderen. Undgå luftbobler under overførsel af den tyktflydende opløsning.
  6. Skær 2 8 x 10 cm ark af en forseglende termoplastisk film og pakk dem rundt om 24-brøndspladen med reaktionsbeholderne indeni. Dette vil reducere fordampningen fra reaktionsblandingen. Placer nu låget på cellekulturpladen på pladen og fastgør den med tape. Der inkuberes pladen ved 30 °C og 200 omdr./min. omrøring i 12-16 timer.
  7. Dag 2: Høst reaktionsblandingen ved at gennembore dialysemembranen med pipetspidsen ved Mini-CECF-beholderen og opsuge RM. Overfør RM til friske rør og centrifuger ved 16.000 x g ved 4 °C i 10 minutter for at fjerne bundfald. Overfør supernatanten til friske rør. Proteinet i supernatanten kan nu analyseres yderligere.
    BEMÆRK: I nogle tilfælde vil der efter centrifugering være en pellet til stede. Dette kan give vigtige oplysninger om egnetheden af de analyserede nanodiscs eller andre reaktionsforbindelser til at holde den syntetiserede MP opløselig. Det er derfor tilrådeligt at analysere mængden af mål, der potentielt er til stede i bundfaldet ved SDS-PAGE, Western Blot, eller visuel evaluering af pelletstørrelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Virkningen af finjustering af reaktionsforbindelser på det endelige udbytte eller kvalitet af syntetiserede parlamentsmedlemmer er eksemplificeret. En hyppig rutinemæssig tilgang er at justere den optimale Mg2+ koncentration i CF-reaktioner ved ekspression af grønt fluorescerende protein (GFP) som en bekvem overvågning af systemeffektiviteten. Som et eksempel blev GFP syntetiseret fra en pET-21a (+) vektor ved Mg 2+ koncentrationer mellem 14 og24 mM (figur 2). SDS-PAGE-analyse identificerede den optimale Mg 2+ koncentration ved 20 mM (figur 2A), hvilket er i god overensstemmelse med komplementære fluorescensmålinger (excitation ved 485 nm, emissionsmåling ved 535 nm) af CF-reaktionssupernatanten (figur 2B). For CF-ekspressionen af den bakterielle PR udtrykt fra pIVEX 2.3-vektoren og af kalkunen β 1 adrenerg receptor (Tβ1AR) udtrykt fra pET-21a(+)-vektoren blev den optimale Mg 2+-koncentration identificeret ved 20-22 mM.

Som et yderligere eksempel vises kvalitetsforbedring af syntetiserede parlamentsmedlemmer med den beskrevne strategi. Indstillelige parametre for co-translationel indsættelse af parlamentsmedlemmer i præformede nanodiscs er (i) lipidsammensætningen af nanodiscmembranen og (ii) den endelige nanodisckoncentration i reaktionen. Det er velkendt, at det hydrofobe miljø er en vigtig parameter for korrekt foldning, oligomer samling og stabilitet af parlamentsmedlemmer. Da lipidsammensætning i nanodiscs kan moduleres, muliggør den beskrevne tilgang en ligetil systematisk screening af lipideffekter på struktur og funktion af en MP. I indledende forsøg anbefales det at screene lipider med phosphatidylcholin (PC) og phosphatidylglycerol (PG) hovedgrupper og at teste forskellige kædelængder og mætninger. Virkningen af membransammensætning og nanodisckoncentration på opløselighedseffektiviteten og kvaliteten af to forskellige MP'er er vist. PR er en let aktiveret protonpumpe og en meget stabil og stærkt syntetiseret MP, der når endelige koncentrationer på > 100 μM i RM. Det anbefales derfor at bruge det som en positiv kontrol for at sikre korrekt reaktionsopsætning, da PR-koncentration let kan vurderes ved måling af absorption ved 530 nm i RM-supernatanten. I modsætning hertil er Tβ1AR et eksempel på den store familie af eukaryote G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) og er en kompleks og ustabil MP. Til bekvem overvågning blev en Tβ1AR-GFP fusionskonstruktion syntetiseret, og den samlede koncentration af nanodisc opløselig receptor i CF-reaktionerne blev bestemt via GFP-fluorescens (figur 3A). Fraktionen af funktionelt foldet og ligandbindende aktiv receptor blev yderligere bestemt ved hjælp af et filterbindende assay og den mærkede ligand [3H]-dihydroalprenolol (figur 3B). Filterbindingsanalysen blev udført som beskrevet tidligere14. Kort fortalt blev Tβ1AR-GFP-koncentrationen i RM bestemt via dens fluorescens. GPCR blev inkuberet med den radioaktivt mærkede ligand i 1 time ved 20 °C, påført et filter, og ubundet ligand blev vasket af. Til bestemmelse af uspecifik [3H]-dihydroalprenololbinding blev receptoren mættet med umærket alprenolol i en kontrolreaktion. Tællingerne af den radioaktive ligand i filtrene blev målt i en scintillationstæller, og mængden af bundet ligand blev bestemt via dens specifikke etiketaktivitet. Procent GPCR-bindingsaktivitet blev derefter beregnet ud fra mængden af bundet ligand, Tβ1AR-GFP-koncentrationen og analysevolumenet. Den samlede syntese og nanodisc-opløselighed af Tβ1AR-GFP er ens med alle analyserede membransammensætninger og inden for området 8-13 μM (figur 3A). I modsætning hertil kan en meget højere variation påvises i kvaliteten af den syntetiserede GPCR. Laveste aktivitet med mindre end 10% aktiv fraktion opnås med lipiderne DMPC og POPC. Med DOPG og POPG kunne den aktive fraktion af Tβ1AR-GFP øges til ca. 30% (figur 3B). Resultaterne indikerer, at ladning af lipidhovedgruppen samt fleksibilitet i fedtsyrekæden er vigtige modulatorer til foldning og aktivitet af denne GPCR.

Udover nanodisc-sammensætning kan deres endelige koncentration i CF-reaktionen være en vigtig faktor for MP-kvaliteten. Når en passende membransammensætning af en nanodisc er blevet identificeret, skal dens koncentration under MP-syntese screenes. Det er indlysende, at nanodisckoncentrationen skal justeres i henhold til ekspressionseffektiviteten af en MP. CF-syntese af Tβ1AR-GFP-receptor og PR resulterer i endelige koncentrationer på henholdsvis ca. 10 μM og 100 μM i RM. Hvis nanodisckoncentrationen screenes inden for et interval på 3,75-60 μM, opnås en fuldstændig opløselighed af GPCR ved ca. 30 μM nanodiscs, hvilket giver et forhold på Tβ 1 AR: nanodisc på1: 3 (figur 4A). I modsætning hertil opnås fuldstændig opløselighed af PR allerede med ca. 10 μM nanodiscs og giver et PR: nanodisc-forhold på 10: 1 (figur 4B). Et overskud af nanodiscs er derfor nødvendigt for at opnå næsten fuldstændig opløselighed af Tβ1AR-GFP, mens et omvendt forhold i tilfælde af PR indikerer indsættelse af flere PR-kopier i en nanodisc. Efterfølgende undersøgelser af oprensede PR/nanodisc-komplekser med indfødt massespektrometri bekræftede denne observation og fandt en prævalens af højere oligomere former for PR, hvis de syntetiseres ved lavere nanodisc-koncentrationer15,18. Titreringen af CF-syntetiserede parlamentsmedlemmer med nanodiscs kan derfor bruges som et værktøj til at udløse oligomere samlinger og til at studere deres virkninger på MP-funktionen.

Figure 1
Figur 1: CECF-ekspressionsstrategi for indsættelse af membranproteiner i nanodiscs. (A) Grundlæggende arbejdsgang, der illustrerer de vigtigste trin i processen. (B) Tilpassede reaktionsbeholdere med analytisk skala til CECF-ekspression. (C) Kommercielt tilgængelige dialysepatroner til CECF-opsætning i analyseskala. (D) Opsætning af forberedt skala (3 ml RM) inklusive en 3 ml dialysekassette og en tilpasset plexiglas FM-beholder. (E) Co-translationel indsættelse af parlamentsmedlemmer i præformede nanodiscs og lipidscreening i CECF-konfigurationen. RM indeholder de nødvendige transkriptions-/oversættelsesmaskiner og nanodiscs, mens forbindelser med lav molekylvægt er til stede i begge rum. Biokemiske og strukturelle anvendelser af de producerede MP/nanodisc-prøver illustreres yderligere. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Effekt af forskellige Mg2+ koncentrationer på CF GFP syntese. GFP blev syntetiseret i CF-reaktioner med Mg 2+ koncentrationer inden for et interval på14-24 mM. (A) SDS-PAGE analyse viser det stærkeste bånd af GFP ved 20 mM Mg2+. M: Markør. (B) GFP-fluorescens efter CF-ekspression med forskellige Mg2+ koncentrationer. Den maksimale GFP-fluorescens ved 20 mM Mg2+ svarer til 4,6 mg/ml. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen for en dobbeltmåling. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Effekt af nanodiscmembransammensætning på opløselighed og kvalitet af en CF-syntetiseret GPCR. Udbytte og aktivitet af Tβ1AR-GFP syntetiseret i nærværelse af 30 μM nanodiscs indeholdende forskellige membransammensætninger. Det totale syntetiserede protein ( A ) og fraktionen af ligandbindende aktiv receptor (B) er givet i μM. Den samlede koncentration blev bestemt via fluorescensmåling af GFP-fusionen. Aktiviteten blev målt via filterbindende assay med den radioaktivt mærkede ligand [3H]-dihydroalprenolol. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelser for uafhængige tredobbelt. Data hentet fra tidligere udgivet manuskript14. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Solubiliseringsskærm af CF-syntetiserede parlamentsmedlemmer med stigende nanodisc-koncentrationer. Parlamentsmedlemmerne blev syntetiseret i nærværelse af leverede nanodiscs inden for et interval på 3,75-60 μM. (A) Ekspression af Tβ1AR-GFP med nanodiscs (DMPC) i CF-reaktionen. Den samlede koncentration blev bestemt ved fluorescensmåling af GFP-fusionen. Data hentet fra tidligere udgivet manuskript14. Affinitetsmærkerensede prøver blev analyseret af SDS-PAGE, og Coomassie-Blue-farvning viser to fremtrædende bånd svarende til Tβ1AR-GFP ved ca. 50 kDa og MSP1E3D1 over 25 kDa (B) Ekspression af PR med nanodiscs (DOPG) i CF-reaktionen. Den samlede PR-koncentration blev bestemt ved absorptionsmåling ved 530 nm. Data hentet fra tidligere udgivet manuskript10,18. Billederne viser den røde farve af de endelige reaktioner på grund af tilstedeværelsen af foldet PR. Piktogrammerne illustrerer den modulerede PR-samling mod lavere oligomere konformationer ved øgede nanodisckoncentrationer, som afsløret af efterfølgende indfødt massespektrometri18. Affinitetsmærkerensede prøver blev analyseret af SDS-PAGE, og Coomassie-Blue-farvning viser to fremtrædende bånd svarende til PR ved ca. 20 kDa og MSP1E3D1 over 25 kDa. Klik her for at se en større version af denne figur.

Forbindelse Endeligt koncentrationsinterval Effekt på MP-prøve
Mg2+ 10 - 30 mM give efter
DTT 1 - 20 mM disulfid brodannelse, foldning
20 Aminosyreblanding1 0,2 – 2 mM give efter
GSSG: GSH2 (1-10 μM): (1-10 μM) disulfid brodannelse, foldning
Nanodiscs 10 - 100 μM opløselighed, oligomer samling, foldning
Lipid type opløselighed, oligomer samling, foldning
S30 : HS30 lysat3 (50-100 %) : (50-100 %) Folde
S12 - S100 20 – 50 % udbytte, MP-baggrund i kanalanalyser
DNA-skabelon 0,5 – 30 ng/μL RM udbytte, oligomer samling, foldning
Design af DNA-skabelon give efter
1, kan blandingen varieres alt efter den enkelte sammensætning af et MP for f.eks. at forbedre udbyttet eller optimere NMR-mærkningsordninger.
2, GSH skal altid tilberedes frisk.
3, bør den samlede CF-lysatkoncentration i RM være mindst 35 % med et S30-indhold på mindst 50 % for at sikre høje ekspressionsniveauer.

Tabel 1: Kritiske screeningskomponenter af CF-reaktioner.

Msp1E3D1 Lipid DPC
Forhold (410 μM lager) (50 000 μM lagre) (10 % (uden lager)
Lipid Lipid: MSP V(MSP) c(MSPendelig) V(lipid) c(lipidendelig) V(DPC) c(DPCendelig) DF-buffer
[μL] [μM] [μL] [μM] [μL] [%] [μL]
Dmppc 115 : 1 1500.0 205.0 1415.0 23 575 30.0 0.1 55.5
Dopc 80 :1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPC 85 : 1 1500.0 205.0 1046.0 17 425 30.0 0.1 425.0
Dmpg 110 : 1 1500.0 205.0 1353.0 22 550 30.0 0.1 117.0
DOPG 80 : 1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPG 90 : 1 1500.0 205.0 1107.0 18 450 30.0 0.1 363.0

Tabel 2: Lipid til MSP1E3D1-forhold for 3 ml in vitro-samlingsopsætninger.

Forbindelse Koncentration Præparation
DNA-plasmid skabelon1 > 400 μg/ml i 10 mM Tris-HCl pH 8,0 Midi/Maxi kit (f.eks. Qiagen) forberedelse2
Blanding af 20 aminosyrer3 25 mM hver i H2O bundfald forbliver4
Blanding af 4 NTP'er (75 x) c(CTP) 240 mM, c(ATP) 360 mM, c(UTP) 240 mM, c(GTP) 240 mM
i H2O. Juster pH til 7-8 med KOH		 Lidt bundfald forbliver4
Acetylphosphat 1 M i H2O, juster pH 7-8 med KOH bundfald forbliver4
Fosfo(enol)pyruvinsyre (K+) 1 M i H2O, juster pH 7-8 med KOH
Folinsyre 10 mg/ml i H2O bundfald forbliver4
DTT 0,5 m i H2O
C0mplete proteasehæmmer cocktail 1 tablet pr. 1 ml i H2O
Tris-acetat, pH 8,0 2,4 M i H2O
Mg(OAc)2 1 m i H2O
KOAc 10 m i H2O
Ribolock RNase-hæmmer 40 U/ml Thermo Fisher Videnskabelig
tRNA (E. coli) 40 mg/ml i H2O Roche (Tyskland)
T7RNAP 3-7 mg/ml5 Se protokolafsnit 2
Pyruvat kinase 10 mg/ml Roche (Tyskland)
Nanodiscs (DMPG) 0,2-1,0 mM6 i 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 100 mM NaCl Se protokolafsnit 3 og 4
1, PCR-skabelon kunne bruges ved lignende koncentrationer.
2, kvaliteten af "Mini"-kit forberedt DNA er ikke tilfredsstillende.
3, cystein har tendens til at være ustabil og kan tilsættes separat.
4, opløsningen er overmættet, grundig blanding øjeblikkeligt, før fjernelse af alikvoter er nødvendig.
5, for hver ny T7RNAP-batch anbefales en indledende skærm for at identificere den bedste endelige koncentration.
6, opløselighed af nanodiscs kan afhænge af deres lipidsammensætning.

Tabel 3: Fremstilling af CF-stamopløsninger.

Forbindelse
Til Mastermix (3,0 x) c(endelig) V [μL]
Blanding af 20 aminosyrer 1 mM 2520.0
Blanding af 4 NTP'er (75 x) 1x 840.0
Acetylphosphat 20 mM 1260.0
Phospho(enol)
pyruvinsyre		 20 mM 1260.0
Folinsyre 0,1 mg/ml 630.0
Tris-acetat, pH 8,0 100 mM 2625.0
c0mplete 50 x 1x 1260.0
Mg(OAc)2 19,8 (= 20)1 mM 1260.0
KOAc 180 (= 270)2 mM 1140.0
DTT 2 mM 252.0
H2O 7953.0
Total 21 000
For RM c(endelig) V [μL]
3x Mastermix 1 x 1000.0
RNase hæmmer 0,3 U/μL 22.5
tRNA (E. coli) 0,5 mg/ml 37.5
Nanodiscs (DMPG)3 10 μM 75.0
DNA-skabelon4 0,015 ng/μL 112.5
Pyruvat kinase 0,04 mg/ml 12.0
T7RNAP5 0,03 mg/ml 15.0
S30 lysat 0.35 % 1050.0
All-trans retinal6 0,6 mM 9.0
H2O - 666.5
Total 3000.0
Til FM c(endelig) V [μL]
Mastermix (3 x) 1 x 20 000
H2O - 40 000
Total 60 000
1, 0,2 mM Mg2+ er bidraget fra S30 lysat.
2, 90 mM K + er bidraget fra acetylphosphat og phospho (enol) pyruvinsyre.
3, beregnet stamopløsning er 400 μM.
4, beregnet stamopløsning er 400 μg/ml.
5, beregnet stamopløsning er 6 mg/ml.
6, specifik cofaktor for PR, lageropløsning er 200 mM i DMSO.

Tabel 4: Pipetteringsskema for en CECF-reaktion med 3 ml RM og 60 ml FM

Forbindelse
Til Mastermix (3,0 x) c(endelig) V [μL]
Blanding af 20 aminosyrer 1 mM 864.0
Blanding af 4 NTP'er 1x 288.0
Acetylphosphat 20 mM 432.0
Fospho(enol)pyruvinsyre 20 mM 432.0
Folinsyre 0,1 mg/ml 216.0
Tris-acetat, pH 8,0 100 mM 900.0
c0mplete 1x 432.0
Mg(OAc)2 13,8 (= 14) mM1 298.0
KOAc 180 (= 270) mM2 389.0
DTT 2 mM 86.4
H2O - 2862.6
I alt [μL]1 - 7200.0
Mg2+ koncentration
14 mM 16 mM 18 mio. 20 mM 22 mio. kr. 24 mM
For RM c(endelig) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0
0,1 mio. mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0
RNase hæmmer 0,3 U/μL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
tRNA (E. coli) 0,5 mg/ml 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
DNA-skabelon3 0,015 ng/μL 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5
Pyruvat kinase 0,04 mg/ml 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
T7RNAP4 0,03 mg/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
S30 lysat 35 % 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0
H2O - 49.7 45.7 41.7 37.7 33.7 29.7
I alt [μL]5 - 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0
Mg2+ koncentration
14 mM 16 mM 18 mio. 20 mM 22 mio. kr. 24 mM
For RM c(endelig) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0
0,1 mio. mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 68.0 136.0 204.0 272.0 340.0
H2O - 2267.0 2199.0 2131.0 2064.0 1995.0 1927.0
I alt [μL]5 - 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0
1, 0,2 mM Mg2+ er bidraget fra S30 lysat. Mastermixet justeres til den laveste screeningskoncentration.
2, 90 mM K + er bidraget fra acetly phosphat og phospho (enol) pyruvinsyre.
3, beregnet stamopløsning er 400 μg/ml.
4, beregnet stamopløsning er 6 mg/ml.
5, reaktioner udføres i dubletter.

Tabel 5: Pipetteringsskema for Mg2+ koncentrationsskærm med 100 μL RM og 1,7 ml FM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Opsætningen og strategierne til optimering af CF-ekspressionen og co-translationel indsættelse af funktionelle parlamentsmedlemmer i nanodiscs er beskrevet. Det nødvendige udstyr omfatter en bioreaktor, en stempelkande eller lignende, en UV/VIS og fluorescenslæser, CF-reaktionsbeholdere, der er egnede til en konfigurationsopsætning med to rum, og en temperaturstyret inkubator. Yderligere standardudstyr er centrifuger til høst af E. coli-celler samt bordpladecentrifuger, der når mindst 30.000 x g til fremstilling af S30-lysater. Hvis S80-S100 lysater skal fremstilles, er ultracentrifuger nødvendige. Det anførte udstyr er regelmæssigt tilgængeligt i biokemiske laboratorier, og der kræves ingen større indledende investeringer for at komme i gang med CF-ekspression. Desuden er fermentering og håndtering af E. coli-celler til CF-lysat- og T7RNAP-præparater almindelige og robuste teknikker. De dyreste forbindelser er CF-lysat, T7RNAP og nanodiscs. De kan udarbejdes ved hjælp af pålidelige og effektive protokoller, og aliquoterne er stabile i årevis ved -80 °C. Protokollerne kræver tre dage hver for CF-lysat- og T7RNAP-præparation og ca. en uge til ekspression og oprensning af MSP og præformning af nanodiscs. Målskabelon-DNA kan leveres ved hjælp af pET-21, pIVEX eller lignende vektorsystemer. Til opsætning og optimering af CF-ekspressionssystemer kan produktionen af GFP-varianter såsom skiftet GFP (GFP+) eller superfolderGFP bruges som monitor20,32. For MP-produktionsforhold er udtrykket af PR et godt modelsystem eller positiv kontrol, da det foldes under mange forskellige forhold og let kan overvåges ved absorbans ved 530 nm10,15,18. For at etablere en effektiv CF-ekspressionsprotokol for en ny MP anbefales kodonoptimering af målaflæsningsrammen og brug af fusioner med C-terminalt tilsluttet GFP25,26. Yderligere nødvendige materialer omfatter kemikalier og enzymer, der alle er kommercielt tilgængelige. Disse komponenter skal opnås i høj kvalitet, og en samlet omkostningsberegning for den beskrevne CF-reaktion med 3 ml RM og 60 ml FM ville beløbe sig til ca. 150-200 €. En primær anvendelse til CF-ekspressionssystemer er derfor produktionen af proteiner, der er vanskelige at opnå i klassiske cellebaserede ekspressionssystemer såsom mange parlamentsmedlemmer eller toksiner. CF-systemer er desuden kerneplatforme inden for syntetisk biologi, og stadigt voksende anvendelsesområder gør dem stadig mere uundværlige som et værktøj i molekylær forskning. Rutinemæssige anvendelser er blandt andet mærkning af proteiner, processer med høj kapacitet eller syntetisk celledesign.

Den demonstrerede strategi muliggør vaskemiddelfri produktion af rene parlamentsmedlemmer, der allerede er indsat i ønskede lipidmiljøer af meget opløselige nanodiscs. Når CF-ekspressionsprotokollen for en MP er etableret og optimeret, er produktionen meget hurtig, og rene prøver kan opnås på mindre end 24 timer, selv i præparativ skala. MP/nanodisc-komplekserne renses direkte fra CF-reaktionen via streptavidin II eller polyhistidin-tags fastgjort til MP. Processen muliggør parallel funktionel og strukturel analyse af identiske MP-prøver ved hjælp af en række forskellige teknikker33. Strategiens hurtighed og effektivitet er derfor konkurrencedygtig i forhold til konventionelle tilgange, der anvender cellebaserede ekspressionssystemer og vaskemiddelekstraktion af parlamentsmedlemmer fra cellemembraner efterfulgt af rutinemæssig in vitro-rekonstitution 5,34. Den åbne tilgængelighed af CF-reaktioner letter yderligere adskillige unikke mekanistiske undersøgelser af MP-foldning og membranindsættelse 15,16,18, MP-kompleks samling15,18,24 eller funktionel regulering 23.

En vigtig forskel i CF-ekspression i forhold til cellebaseret ekspression er fraværet af kvalitetskontrolsystemer for det syntetiserede proteinprodukt. Ethvert oversat polypeptid uafhængigt af dets funktionelle foldning vil ende i den endelige produktprøve. Desuden er indsættelsesprocessen i nanodiscmembraner kunstig og translocon uafhængig og kan resultere i enten ufuldstændig integration eller muligvis slet ikke fungere med en række MP-mål. Den endeligt opløselige produktfraktion i en CF-reaktion kunne således være ret heterogen indeholdende fuldt indsatte, men også kun delvist integrerede eller membranassocierede MP'er. Derfor kan kun en lille brøkdel af en renset prøve af MP/nanodisc-komplekser foldes funktionelt. Ændring af membransammensætning og omhyggelig finjustering af MP til nanodisc-forhold ved at modulere koncentrationerne af nanodiscs og DNA-skabeloner er egnede værktøjer til optimering. Ikke desto mindre er downstream-kvalitetskontrolmetoder såsom størrelsesekskluderingsprofilering og målspecifikke kvantitative funktionelle assays altid nødvendige for optimering af CF-ekspressionsprotokoller. Tilgængeligheden af sådanne assays kan derfor begrænse applikationer, især i projekter, herunder parlamentsmedlemmer, der kræver liposommiljøer til funktion såsom transportører, kanaler eller pumper. Desuden kan størrelsesbegrænsningerne for nanodiscs begrænse indsættelsen af store MP-samlinger.

I de dokumenterede eksempler ligger variationen i den funktionelt foldede fraktion af GPCR Tβ1AR-GFP inden for et par procent, op til ca. 30%. Funktionel foldning kræver omhyggelig justering af en række parametre14 , og en lignende individuel og kedelig optimeringsproces kan også være nødvendig for andre GPCR'er22. Det endelig opnåede udbytte af funktionelt foldet GPCR er imidlertid konkurrencedygtigt med andre produktionssystemer og tillader opsætning af > 1.000 radioassays til ligandbindingsundersøgelser fra en enkelt 60 μL reaktion i en analytisk skala Mini-CECF-reaktor. Det er værd at nævne, at ligandbindende undersøgelser af GPCR-GFP-fusionskonstruktioner ikke kræver nogen rensningstrin. Om nødvendigt kan rensning opnås ved at drage fordel af affinitetsmærker, der er knyttet til den syntetiserede MP, såsom His-tags eller Strep-tag II. RM fortyndes derefter i den ønskede buffer og indlæses på den tilsvarende affinitetskromatografikolonne, der er blevet præ-ligevægtet i overensstemmelse hermed. Den strukturelle evaluering af PR og andre CF-syntetiserede parlamentsmedlemmer ved NMR-spektroskopi eller krystallisering har allerede bidraget til at etablere CF-ekspressionssystemer som kerneplatforme i MP-forskning. Den beskrevne strategi for produktion af MP/nanodisc-komplekser kan blive særlig interessant for fremtidige strukturelle undersøgelser ved elektronmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) bevilling BE1911/8-1, LOEWE-projektet GLUE og det kollaborative forskningscenter Transport and Communication across Membranes (SFB807) for økonomisk støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) Carl Roth (Germany) 4855
2-Mercaptoethanol Carl Roth (Germany) 4227
2-Propanol Carl Roth (Germany) 9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride American Radiolabeled Chemicals (USA) ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) Merck (Germany) 1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) Sigma Aldrich (Germany) A9251
Alprenolol hydrochloride Merck (Germany) A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® Sigma-Aldrich (Germany) Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1 Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1 B.Braun (Germany)
Centrifuge Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid Carl Roth (Germany) 8137
Coomassie Brilliant Blue R250 Carl Roth (Germany) 3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt Sigma-Aldrich (Germany) C1506
D-glucose monohydrate Carl Roth (Germany) 6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate Carl Roth (Germany) 6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing Fisher Scientific (Germany) 8700152
Dithiothreit Carl Roth (Germany) 6908
Ethanol Carl Roth (Germany) K928
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma-Aldrich (Germany) 47612
French pressure cell disruptor SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol Carl Roth (Germany) 3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) Sigma-Aldrich (Germany) G8877
Hydrochloric Acid Carl Roth (Germany) K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL GE Life Sciences (Germany) GE17-5248
Imidazole Carl Roth (Germany) 3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Carl Roth (Germany) 2316
Kanamycin Carl Roth (Germany) T832
L-Alanine Carl Roth (Germany) 3076.1
L-Arginine Carl Roth (Germany) 6908
L-Asparagine Carl Roth (Germany) HN23
L-Aspartic Acid Carl Roth (Germany) T202
L-Cysteine Carl Roth (Germany) T203
L-Glutamic Acid Carl Roth (Germany) 3774
L-Glutamine Carl Roth (Germany) 3772
L-Glycine Carl Roth (Germany) 3187
L-Histidine Carl Roth (Germany) 3852
L-Isoleucine Carl Roth (Germany) 3922
L-Leucine Carl Roth (Germany) 1699
L-Lysine Carl Roth (Germany) 4207
L-Methionine Carl Roth (Germany) 9359
L-Proline Carl Roth (Germany) 1713
L-Phenylalanine Carl Roth (Germany) 1709
L-Serine Carl Roth (Germany) 4682
L-Threonine Carl Roth (Germany) 1738
L-Tryptophane Carl Roth (Germany) 7700
L-Tyrosine Carl Roth (Germany) T207
MD100 dialysis units Scienova (Germany) 40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) Carl Roth (Germany) 6763
n-dodecylphosphocholine Antrace (USA) F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000 Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine Carl Roth (Germany) 6681
Peristaltic pump: ip-12 Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt Sigma Aldrich (Germany) 860077
Potassium dihydrogen phosphate Carl Roth (Germany) P018
Potassium acetate Carl Roth (Germany) 4986
Potassium chloride Carl Roth (Germany) 6781
Pyruvate Kinase Roche (Germany) 10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL Hidex (Finland)
SDS pellets Carl Roth (Germany) 8029
Sodium azide Sigma-Aldrich (Germany) K305
Sodium chloride Carl Roth (Germany) P029
Spectrophotometer Nanodrop Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli) Roche (Germany) 10109550001
Ultra sonificator Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) Sigma-Aldrich (Germany) U6625
Y-30 antifoam Sigma-Aldrich (Germany) A6457
Yeast extract Carl Roth (Germany) 2904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  2. Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
  3. Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  4. Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
  5. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  6. Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
  7. Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
  8. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  9. Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
  10. Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
  11. Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
  12. Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
  14. Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
  15. Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
  16. Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  17. Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
  18. Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
  19. Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
  20. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  21. Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
  22. Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
  23. Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
  24. Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
  25. Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
  26. Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
  27. Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
  28. Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
  29. Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
  30. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  31. Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
  32. Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
  33. Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
  34. Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).

Tags

Biokemi udgave 165 In vitro-ekspression cellefri L-CF vaskemiddelfri nanodiscs membranproteiner G-proteinkoblede receptorer proteorhodopsin membrandesign co-translationel membranindsættelse
Co-translationel indsættelse af membranproteiner i præformerede nanodiscs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levin, R., Koeck, Z., Dötsch,… More

Levin, R., Koeck, Z., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs. J. Vis. Exp. (165), e61844, doi:10.3791/61844 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter