Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Co-translationele insertie van membraaneiwitten in voorgevormde nanodiscs

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61844
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biophysical Chemistry, Goethe University Frankfurt

Summary

Co-translationele insertie in voorgevormde nanodiscs maakt het mogelijk om celvrije gesynthetiseerde membraaneiwitten te bestuderen in gedefinieerde lipideomgevingen zonder contact met detergentia. Dit protocol beschrijft de voorbereiding van essentiële systeemcomponenten en de kritieke parameters voor het verbeteren van de expressie-efficiëntie en monsterkwaliteit.

Abstract

Celvrije expressiesystemen maken het op maat gemaakte ontwerp van reactieomgevingen mogelijk om de functionele vouwing van zelfs complexe eiwitten zoals membraaneiwitten te ondersteunen. De experimentele procedures voor het co-translationeel inbrengen en vouwen van membraaneiwitten in voorgevormde en gedefinieerde membranen die als nanodiscs worden geleverd, worden gedemonstreerd. Het protocol is volledig wasmiddelvrij en kan binnen één dag milligrammen gezuiverde monsters genereren. De resulterende membraaneiwit / nanodisc-monsters kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan functionele studies en structurele toepassingen zoals kristallisatie, nucleaire magnetische resonantie of elektronenmicroscopie. De bereiding van belangrijke basiscomponenten zoals celvrije lysaten, nanodiscs met ontworpen membranen, kritieke voorraadoplossingen en de assemblage van celvrije expressiereacties met twee compartimenten wordt beschreven. Aangezien de vouwvereisten van membraaneiwitten zeer divers kunnen zijn, is een belangrijke focus van dit protocol de modulatie van parameters en reactiestappen die belangrijk zijn voor de monsterkwaliteit, zoals kritische basisreactieverbindingen, membraansamenstelling van nanodiscs, redox- en chaperonneomgeving of DNA-sjabloonontwerp. Het hele proces wordt aangetoond met de synthese van proteorhodopsine en een G-eiwit gekoppelde receptor.

Introduction

Membraaneiwitten (MPs) zijn uitdagende doelen in eiwitproductiestudies vanwege hun onoplosbaarheid in waterige omgevingen. Conventionele MP-productieplatforms omvatten celgebaseerde systemen zoals E. coli, gist of eukaryote cellen. De gesynthetiseerde recombinante parlementsleden worden ofwel geëxtraheerd uit celmembranen of opnieuw gevouwen uit inclusielichamen1. Na detergentische oplosbaarheid kunnen parlementsleden worden overgebracht naar geschikte membraanomgevingen door middel van vastgestelde in vitro reconstitutieprotocollen. Naast blaasjes en liposomen zijn MP-reconstitutie in planaire membranen in de vorm van nanodiscs2 - of salipro3-deeltjes de afgelopen tijd routinetechnieken geworden. Al deze strategieën impliceren echter detergentcontact met parlementsleden dat kan leiden tot destabilisatie, dissociatie van oligomeren en zelfs verlies van eiwitstructuur en -activiteit4. Screening op optimale oplosbaarheid en reconstitutie van wasmiddelen kan daarom vervelend en tijdrovend zijn5.

Het open karakter van celvrije (CF) systemen maakt het mogelijk om de expressiereactie direct te voeden met voorgevormde membranen met een gedefinieerde lipidesamenstelling. In deze lipide-gebaseerde expressiemodus (L-CF) hebben de gesynthetiseerde parlementsleden de mogelijkheid om co-translationeelin te voegen in de geleverde bilayers 6,7 (figuur 1). Nanodiscs bestaande uit een membraansteigereiwit (MSP) rondom een vlakke lipide bilayer schijf8 blijken bijzonder geschikt voor deze strategie 9,10. Nanodiscs kunnen routinematig in vitro worden geassembleerd met een verscheidenheid aan verschillende lipiden, ze zijn zeer stabiel en voorraden kunnen tot 1 mM worden geconcentreerd. MSP-expressie in E. coli en de zuivering ervan is echter noodzakelijk. Als alternatieve strategie kan MSP samen met de beoogde MP worden uitgedrukt in CF-reacties die worden geleverd met liposomen 11,12,13. DNA-sjablonen voor zowel MSP als MP worden toegevoegd aan de reactie en MP / nanodiscs kunnen zich vormen bij expressie. Hoewel MSP-productie wordt vermeden, vereist de co-expressiestrategie een zorgvuldige verfijning van de uiteindelijke DNA-sjabloonconcentraties en kunnen hogere variaties in de efficiëntie van de monsterproductie worden verwacht.

De co-translationele insertie van parlementsleden in membranen van voorgevormde nanodiscs is een niet-fysiologisch en nog grotendeels onbekend mechanisme dat onafhankelijk is van transloconmachines en signaalsequenties 13,14,15,16. Belangrijke determinanten van de insertie-efficiëntie zijn het type membraaneiwit en de lipidesamenstelling van het geleverde membraan, met een frequente voorkeur voor negatief geladen lipiden 15,17. Omdat de nanodisc-membranen relatief beperkt zijn in grootte, komt een aanzienlijke hoeveelheid lipiden vrij bij mp-insertie18. Variatie van nanodisc-grootte maakt het mogelijk om hogere oligomere MP-complexen in te brengen en af te stemmen15,18. De juiste assemblage van homooligomeercomplexen werd onder andere aangetoond voor het ionkanaal KcsA, voor de ionpomp proteorhodopsine (PR) en voor de multidrugtransporter EmrE15,18. Kamerleden zullen waarschijnlijk van beide kanten met een relatief gelijke frequentie het symmetrische nanodisc-membraan betreden. Daarom moet ervan worden uitgegaan dat verschillende monomeren of oligomeren die in één nanodisc worden ingebracht, tegengestelde oriëntaties kunnen hebben. Een vertekening in oriëntatie kan echter worden veroorzaakt door coöperatieve insertiemechanismen zoals gerapporteerd voor de vorming van PR-hexameren en KcsA-tetrameren18. Een verdere vertekening in MP-oriëntatie kan het gevolg zijn van oriëntatieschakelaars van ingebrachte parlementsleden, waarschijnlijk aan de rand van de nanodisc-membranen.

De productie van CF-lysaten uit E. coli-stammen is een betrouwbare routinetechniek en kan in bijna elk biochemisch laboratorium worden uitgevoerd19,20. Er moet rekening mee worden gehouden dat naast de vorming van disulfidebrug, de meeste andere posttranslationele modificaties afwezig zijn als een MP wordt gesynthetiseerd met behulp van E. coli-lysaten. Hoewel dit meer homogene monsters voor structurele studies kan genereren, kan het nodig zijn om mogelijke effecten op de functie van individuele MP-doelen uit te sluiten. De efficiënte productie van hoogwaardige monsters van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR)14,21,22, eukaryote transporters23 of grote heteromere assemblages24 in E. coli CF-lysaten geeft echter aan dat ze geschikt zijn voor zelfs complexe doelen. Preparatieve schaalhoeveelheden (≈ 1 mg/ml) van een monster kunnen worden verkregen met de cecf-configuratie (continuous exchange cell-free) met twee compartimenten, bestaande uit een reactiemengsel (RM) en een voedingsmengselcompartiment (FM). Het FM-volume overschrijdt het RM-volume 15 tot 20-voudig en biedt een reservoir van laagmoleculaire energieverbindingen en precursoren19. De expressiereactie wordt dus enkele uren verlengd en de uiteindelijke opbrengst van het MP-doel wordt verhoogd. De RM- en FM-compartimenten worden gescheiden door een dialysemembraan met een cutoff van 10-14 kDa. De twee compartimenten vereisen een speciaal ontwerp van de CECF-reactiecontainer (figuur 1). Commerciële dialysecassettes als RM-containers in combinatie met op maat gemaakte plexiglas containers met de FM zijn geschikte voorbeelden. MP-opbrengsten kunnen verder worden gemanipuleerd door de RM:FM-verhoudingen te wijzigen of door de FM na een bepaalde incubatieperiode uit te wisselen.

Opbrengst en kwaliteit van een MP vereisen vaak een intensieve optimalisatie van de reactieparameters. Een belangrijk voordeel van CF-expressie is de mogelijkheid om bijna elke verbinding te wijzigen en af te stemmen volgens de individuele vereisten van een MP. Een eenvoudige strategie is om je eerst te concentreren op het verbeteren van de opbrengst van een MP door een basisproductieprotocol op te stellen en vervolgens de MP-kwaliteit te optimaliseren door de reactie- en vouwomstandigheden te verfijnen. De afwezigheid van fysiologische processen in CF-lysaten en hun verminderde complexiteit resulteren in hoge slagingspercentages voor de efficiënte productie van parlementsleden25. Routinematige overwegingen voor het ontwerp van DNA-sjablonen en optimalisatie van mg2 + ionenconcentratie zijn in de meeste gevallen voldoende om bevredigende opbrengsten te verkrijgen26. Afhankelijk van de expressiemodus kan optimalisatie van mp-kwaliteit tijdrovend worden, omdat een grotere verscheidenheid aan parameters moet worden gescreend 14,17,22.

Om het beschreven CF-expressieplatform vast te stellen, zijn protocollen nodig voor de productie van E. coli CF-lysaat (i), T7-RNA-polymerase (ii), nanodiscs (iii) en de basis CECF-reactieverbindingen (iv) (figuur 1). De E. coli K12 stam A1927 of BL21 derivaten worden vaak gebruikt voor de bereiding van efficiënte S30 (centrifugatie bij 30.000 x g) lysaten. Naast S30-lysaten mogen overeenkomstige lysaten worden gebruikt die bij andere g-krachten zijn gecentrifugeerd (bv. S12). De lysaten verschillen in expressie-efficiëntie en in proteoomcomplexiteit. Het proteoom van het S30-lysaat, bereid door het beschreven protocol, is in detail bestudeerd28. Het S30-proteoom bevat nog steeds enkele resterende buitenmembraaneiwitten die achtergrondproblemen kunnen geven bij expressie en analyse van ionkanalen. Voor dergelijke doelen wordt het gebruik van S80-S100-lysaten aanbevolen. Een waardevolle wijziging tijdens de lysaatvoorbereiding is de inductie van de SOS-respons door gecombineerde hitteschok- en ethanoltoevoer in de mid-log groeifase van de cellen. De resulterende HS30-lysaten zijn verrijkt met chaperones en kunnen worden gebruikt in mengsels met S30-lysaten voor verbeterdeMP-vouwing 22. CF-expressie in E. colilysaten wordt gebruikt als een gekoppeld transcriptie-/translatieproces met DNA-sjablonen die promotors bevatten die worden gecontroleerd door T7-RNA-polymerase (T7RNAP). Het enzym kan efficiënt worden geproduceerd in BL21(DE3) Stercellen die het pAR1219plasmide 29 dragen.

Twee kopieën van MSP1E3D1 worden samengevoegd tot één nanodisc met een diameter van 10-12 nm, maar het hieronder beschreven protocol kan ook werken voor andere MSP-derivaten. Nanodiscs groter dan die gevormd met MSP1E3D1 zijn echter meestal minder stabiel, terwijl kleinere nanodiscs gevormd met MSP-derivaten zoals MSP1 mogelijk geen grotere parlementsleden of MP-complexen herbergen. MSP1E3D1 nanodiscs kan in vitro worden geassembleerd met een grote verscheidenheid aan verschillende lipiden of lipidenmengsels. Voorgevormde nanodiscs zijn meestal stabiel voor > 1 jaar bij -80 °C, terwijl de stabiliteit kan variëren voor verschillende lipidecomponenten. Voor de screening van lipide-effecten op vouwen en stabiliteit van een MP, is het noodzakelijk om een uitgebreide set nanodiscs te bereiden die zijn samengesteld met een representatieve verscheidenheid aan lipiden / lipidemengsels. De volgende lipiden kunnen een goede startselectie geven: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (POPG) en 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC).

Een protocol voor de bereiding van een 3 ml CECF-reactie wordt beschreven. Verder omhoog of omlaag schalen in een verhouding van 1:1 is mogelijk. Voor de CECF-configuratie met twee compartimenten moet een RM worden bereid die alle verbindingen bevat en een FM die alleen de verbindingen met een laag molecuulgewicht bevat. Commerciële dialyseapparaten van 3 ml met 10-14 kDa MWCO kunnen worden gebruikt als RM-containers, die vervolgens in op maat gemaakte plexiglascontainers worden geplaatst met de FM (figuur 1D) 30. De verhouding van RM: FM is 1: 20, dus 60 ml FM moet worden voorbereid op 3 ml RM. Kwaliteit, concentratie of type van verschillende componenten kan van cruciaal belang zijn voor de uiteindelijke opbrengst en / of kwaliteit van de gesynthetiseerde MP (tabel 1). DNA-sjablonen moeten worden voorbereid volgens gepubliceerde richtlijnen en codonoptimalisatie van het leesframe van het doelwit kan de productopbrengst verder aanzienlijk verbeteren26. Voor cecf-reactie op preparatieve schaal wordt een vastgesteld protocol voor de productie van PR beschreven. Om expressieprotocollen voor nieuwe parlementsleden op te stellen, is het meestal nodig om optimalisatieschermen van bepaalde verbindingen uit te voeren (tabel 1) om de opbrengst en kwaliteit te verbeteren. Voor Mg2+ ionen bestaat een goed gericht concentratieoptimum dat vaak significante variatie vertoont voor verschillende DNA-sjablonen. Andere CF-reactieverbindingen zoals nieuwe partijen T7RNAP- of S30-lysaten kunnen de optimale Mg2+ concentratie verder verschuiven. Als voorbeeld wordt een typisch Mg2+ scherm binnen het bereik van 14-24 mM concentratie en in stappen van 2 mM beschreven. Elke concentratie wordt gescreend in duplicaten en in CECF-reacties op analytische schaal. Als CECF-reactiecontainer worden op maat gemaakte Mini-CECF-plexiglascontainers30 met de RM gebruikt in combinatie met standaard 24-well microplaten die de FM vasthouden (figuur 1B). Als alternatief kunnen commerciële dialysecartridges in combinatie met 96-diepe putmicroplaten of andere commerciële dialysatorapparaten in geschikte opstellingen worden gebruikt (figuur 1C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van S30-lysaat

  1. Dag 1: Streep cellen uit glycerolvoorraden op een LB-agarplaat en incubeer 's nachts bij 37 °C.
  2. Dag 2: Ent 200 ml LB-medium in met de cellen van de agarplaat en incubeer bij 37 °C gedurende 12-14 uur.
  3. Dag 3: Ent 10 L steriel YPTG-medium (10 g/L gistextract, 16 g/L trypton, 5 g/L NaCl, 19,8 g/L glucose, 4,4 mM KH2PO4, 8 mM K2HPO4) getemperd tot 37 °C in een 15 L geroerde tankreactor met 100 ml van de voorcultuur (1:100). Telen bij 37 °C, 500 tpm en hoge beluchting (~ 3 luchtvolumes per minuut). Om overmatig schuimen te voorkomen, voegt u steriel antischuim toe.
  4. Meet de optische dichtheid (OD) bij 600 nm in regelmatige tijdsintervallen. Na ongeveer 2 uur komt de kweek in de log-fase.
  5. Modificatie voor HS30 lysaat: Wanneer cellen zich in de middenlogfase bevinden (OD600 ≈ 3,6-4,2), voeg dan 300 ml ethanol toe aan het kweekmedium en ga verder met de teelt bij 42 °C, 500 tpm en hoge beluchting (ongeveer 3 luchtvolumes per minuut) gedurende nog eens 45 minuten. Ga vervolgens verder met het koelen en oogsten van de celcultuur zoals beschreven in stap 1.6. Voor de productie van standaard S30-lysaat slaat u deze stap over en gaat u verder met stap 1.6.
  6. Wanneer cellen zich in de middenlogfase bevinden (OD600 ≈ 3,6-4,2), koelt u de fermentor binnen < 30 min. De uiteindelijke OD600 zou ongeveer 4,5-5,5 moeten zijn. Oogst cellen bij 4.500 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Houd cellen op 4 °C gedurende de volgende stappen.
    OPMERKING: Tijdens het afkoelen kan overmatig schuimvorming optreden. Voeg in dit geval antischuim toe of verlaag de roersnelheid en/of verlaag de luchtstroom in de bioreactor.
  7. Suspensie cellen volledig in 300 ml S30-A-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-mercaptoethanol) met behulp van een spatel gevolgd door het pipetteren van de suspensie op en neer tot homogeniteit. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Herhaal deze stap twee keer.
    LET OP: 2-mercaptoethanol is giftig. Vermijd contact met de huid of de luchtwegen. Werk indien mogelijk onder een motorkap. Weeg het lege centrifugebeker voor de laatste wasstap. Weeg na het centrifugeren de natte celpellet en ga verder met stap 1.8 of bewaar de pellet tot verder gebruik.
    OPMERKING: Het gewicht van de natte celkorrel is 5-7 g per 1 L bioreactorcultuur. Op dit punt kan het protocol worden gepauzeerd en kan de pellet worden ingevroren in vloeibare stikstof en gedurende 4-8 weken bij -80 °C worden bewaard.
  8. Suspensie cellen grondig in 1,1 volumes (1 g = 1 ml) S30-B-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 tablet cOmpletete-proteaseremmer). Vul de suspensie in een voorgekoelde Franse persdrukcel en verstoor cellen bij 1.000 psig. Passeer cellen een keer door de Franse pers.
  9. Centrifugeer het lysaat bij 30.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een verse buis en herhaal de centrifugatiestap.
    OPMERKING: Een losse en slijmerige laag kan na de eerste centrifugatie bovenop de pellet aanwezig zijn, die niet met het supernatant mag worden overgebracht.
  10. Breng een hoge zout- en warmtestap aan om onstabiele lysaatcomponenten te verwijderen en mRNA uit ribosomen vrij te maken. Breng het lysaat op 0,4 M NaCl en incubeer bij 42 °C gedurende 45 minuten in een waterbad.
    OPMERKING: Deze stap zal een aanzienlijke precipitatievorming veroorzaken. Draai of keer de buis om tijdens de incubatie van tijd tot tijd.
  11. Breng de troebele suspensie (meestal 50-80 ml) over in dialysebuizen met een afsnijding van 10-14 kDa en dialyseer tegen 5 L S30-C buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 0,5 mM DTT). Verwissel de S30-C dialysebuffer na 2-3 uur en dialyseer nog eens 12-14 uur.
  12. Dag 4: Breng de gedialyseerde suspensie over in centrifugebuizen en centrifugeer bij 30.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Breng supernatant (S30 lysaat) over in verse buizen van 50 ml en meng voorzichtig. De eiwitconcentratie van het lysaat moet ongeveer 30-40 mg / ml zijn. Bevries aliquots (bijv. 0,5 ml, 1 ml) in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C. De aliquots zijn > 1 jaar stabiel.

2. Expressie en zuivering van T7 RNA polymerase

  1. Dag 1: Ent 200 ml LB medium met 100 μg/ml ampicilline met vers vergulde BL21(DE3) Star x pAR1219 cellen en incubeer bij 37 °C en 180 tpm gedurende 12-16 uur.
  2. Dag 2: Ent 1 L geweldige bouillon (12 g/L trypton, 24 g/L gistextract, 4 ml/l glycerol) in een verbijsterde kolf van 2 l met 10 ml van de voorcultuur en incubeer bij 37 °C en 180 tpm roeren. De beginnende OD600 zou ongeveer 0,1 moeten zijn.
  3. Wanneer de OD600 0,6-0,9 bereikt, voegt u IPTG toe aan een eindconcentratie van 1 mM om T7RNAP-expressie te induceren en de teelt nog eens 5 uur voort te zetten.
  4. Oogst cellen door centrifugeren bij 4.500 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Vries cellen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken.
  5. Dag 3: Voeg 30 ml ijskoude suspensiebuffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0 met één tablet cOmplete-proteaseremmer) toe aan de bevroren celpellet en ontdooi de pellet in een waterbad bij kamertemperatuur. Hang vervolgens de pellet op door op en neer te pipetteren tot de homogeniteit.
  6. Voer celverstoring uit met behulp van een Franse pers zoals beschreven in de vorige sectie of gebruik een ultrasoonapparaat volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Vervolgens centrifugeren bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C en supernatant overbrengen in een verse buis.
  7. Om genomisch DNA neer te slaan, voegt u streptomycinesulfaat langzaam en onder zachte agitatie toe aan het supernatant totdat een uiteindelijke concentratie van 3% (w / v) is bereikt. Incubeer bij 4 °C gedurende 5-10 minuten onder voorzichtig roeren. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  8. Filtreer het supernatant met een filter van 0,45 μm en laad het op een Q-Sepharose-kolom met een kolomvolume (CV) van 40 ml met 2 CV-equilibratiebuffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% glycerol en 10 mM 2-mercaptoethanol) met behulp van een peristaltische pomp met een debiet van 4 ml / min. Sluit vervolgens de kolom aan op een UV-detector en ga door met elutie met equilibratiebuffer totdat het UV-signaal bij 280 nm een stabiele basislijn bereikt.
  9. Elute T7RNAP met een gradiënt van 50 mM tot 500 mM NaCl per CV bij een debiet van 3 ml/min. Verzamel 1 ml fracties en bereid monsters voor SDS-PAGE-analyse voor door 10 μL van elke fractie te mengen met 2 x SDS-monsterbuffer. Voer SDS-PAGE uit en kleur de gel met Coomassie Blue R. T7RNAP moet verschijnen als een prominente band op ongeveer 90 kDa, samen met tal van extra banden van onzuiverheden.
  10. Poolfracties die T7RNAP bevatten en dialyseren met behulp van membranen met een 12-14 kDa MWCO gedurende 12-16 uur in dialysebuffer (10 mM K2HPO4/KH2PO4, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% (w/v) glycerol).
  11. Dag 4: Verzamel de T7RNAP-oplossing en concentreer met behulp van filtereenheden met 12-14 MWCO tot een eindconcentratie van 3-10 mg / ml. T7RNAP kan tijdens de concentratie beginnen neer te slaan. Stop de concentratie onmiddellijk zodra troebelheid in het monster optreedt. Voeg glycerol toe aan een eindconcentratie van 50% (g/v) en meng voorzichtig. Shock-freeze 0,5-1 ml aliquots en bewaren bij -80 °C. Werkende T7RNAP aliquots kunnen worden bewaard bij -20 °C.
    OPMERKING: Ongeveer 20-40 ml van 5 mg / ml gedeeltelijk gezuiverde T7RNAP met 20.000-40.000 eenheden moet worden verkregen uit een fermentatie van 1 l. Om de optimale hoeveelheid van elke T7RNAP-batch te testen, moeten CF-expressiereacties van groen fluorescerend eiwit (GFP) met 0,02 mg/ml-0,1 mg/ml van het bereide T7RNAP-monster worden uitgevoerd.

3. Expressie en zuivering van MSP1E3D1

  1. Dag 1: Transformeer E. coli BL21 (DE3) Stercellen met de pET28(a)-MSP1E3D1 vector31 met behulp van standaard heat shock transformatie of elektroporatie protocollen. Streep uit of plaat getransformeerde cellen op LB agar met 30 μg/ml kanamycine en incubeer bij 37 °C gedurende 12-16 uur.
  2. Dag 2: Ent 200 ml LB-medium aangevuld met 0,5% (w /v) glucose en 30 μg / ml kanamycine met een enkele kolonie geplukt uit de agarplaat en incubeer bij 37 ° C bij 180 tpm gedurende 12-16 uur.
  3. Dag 3: Ent 10 L LB medium aangevuld met 0,5% (w/v) glucose en 30 μg/ml kanamycine met 100 ml van de voorcultuur in een geroerde bioreactor. Voer fermentatie uit bij 37 °C, 500 rpm en beluchting van ongeveer 3 bioreactorvolumes per minuut. Voeg in het geval van overmatig schuimen antischuim toe.
    OPMERKING: Verbijsterde schudkolven kunnen worden gebruikt in plaats van een fermentor.
  4. Voeg bij OD600 van 6,5-7,5 IPTG toe aan een eindconcentratie van 1 mM en zet de incubatie bij 37 °C gedurende 1 uur voort. Oogst cellen door centrifugeren bij 4.500 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Was celpellets met 200 ml 0,9% (w/v) NaCl en centrifugeer opnieuw bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi supernatant weg en breng cellen over in buizen van 50 ml met behulp van een spatel. Het verwachte natte pelletgewicht is 8-12 g per L bioreactorcultuur. Bevries celpellets in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
  5. Dag 4: Voor zuivering ontdooien celpellets in een waterbad bij RT. Suspensie de cellen in MSP-A buffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100, 1 tablet c0mplete protease inhibitor cocktail per 50 ml celsuspensie) om een celsuspensie van 30-40% (w/v) op te leveren.
  6. Verstoor cellen door ultrasoonapparaat of met behulp van een Franse pers en centrifugeer bij 30.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over in een verse buis en filtreer door een filter van 0,45 μm. Breng het filtraat aan op een Ni2+ geladen nitrilotriacetinezuurkolom (CV > 15 ml) in evenwicht met 5 CV MSP-B-buffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100) met behulp van een peristaltische pomp.
    OPMERKING: Om filtratie te vergemakkelijken, kan het supernatant nog een minuut worden gesoniseerd om grote DNA-fragmenten af te breken.
  7. Was na het laden van het monster de kolom met 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl, 50 mM ylzuur), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl) en 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 50 mM imidazool).
    OPMERKING: Cholzuur in de MSP-C-buffer is belangrijk om lipiden te verwijderen die aan MSP zijn bevestigd. Cholzuur is niet volledig oplosbaar bij lage pH-waarden. De pH-waarde moet daarom worden aangepast naar 8,9 in MSP-C en MSP-D. Het is belangrijk om de kolom te wassen met MSP-D-buffer, omdat een lagere pH ervoor kan zorgen dat resterend cholzuur neerslaat en de kolom blokkeert of beschadigt.
  8. Elute MSP met MSP-G (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazool). Verzamel fracties van 1 ml en controleer de UV-absorptie bij 280 nm. Verzamel en pool de fracties van de elutiepiek.
  9. Breng gepoolde MSP-fracties over in 12-14 kDa MWCO dialysemembraanbuizen en dialyseer tegen 5 L MSP-H (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol) gedurende 2-3 uur bij 4 °C. Wissel over op verse 5 L MSP-H buffer en dialyseer nog eens 12-16 uur bij 4 °C.
  10. Dag 5: Breng MSP-oplossing over in centrifugebuizen en centrifugeer bij 18.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om neerslag te verwijderen. Breng supernatant over in een verse buis en concentraat tot 200-800 μM met behulp van ultrafiltratie-apparaten met 12-14 kDa MWCO bij 4 °C. Meet de concentratie met behulp van een UV/VIS-meetapparaat. Gebruik de extinctiecoëfficiënt van 27,31 M-1 cm-1 en de molecuulmassa van 31,96 kDa voor de berekening van de concentratie.
    OPMERKING: Expressie in een bioreactor levert meestal 15-30 mg MSP1E3D1 per L-cultuur op.
  11. Bevries aliquots van de geconcentreerde MSP-oplossing in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.

4. Assemblage van MSP1E3D1 nanodiscs

  1. Dag 1: Bereid 1-2 ml lipidevoorraden (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC of POPC) in 100 mM natriumsirolaat. Bewaren bij -20 °C indien niet op dezelfde dag gebruikt.
    OPMERKING: De lipide-oplossing moet duidelijk zijn. Als de oplossing niet helder is, kan de natrium cholaatconcentratie worden verhoogd tot 150 mM.
  2. Meng de MSP1E3D1-oplossing met de lipidenoplossing. Voeg dodecylfosfocholine (DPC) toe in een eindconcentratie van 0,1% (w/v). Assemblagereacties kunnen worden aangepast tot eindvolumes van 3 ml (tabel 2) of 12 ml, wat overeenkomt met typische volumes dialysecassettes (10 kDa MWCO). Incubeer de assemblagereacties gedurende 1 uur bij 21 °C onder voorzichtig roeren.
    OPMERKING: Voor elk lipide moet een specifieke MSP1E3D1:lipideverhouding worden gebruikt om een homogene nanodisc-voorbereiding te garanderen (tabel 2). Voor nieuwe lipiden of lipidenmengsels moet de optimale verhouding worden bepaald met een proefexperiment en een chromatografieanalyse van degrootte-uitsluiting 14.
  3. Maak het membraan van een dialysecassette met schijfvormingsbuffer (DF) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl) vooraf nat. Breng het assemblagemengsel met een spuit over in de dialysecassette. Potentiële luchtbellen kunnen worden verwijderd door aspiratie met behulp van de spuit.
  4. Dag 1-4: Dialyseer tegen 3 x 5 L DF buffer gedurende 10-20 h bij RT onder roeren met behulp van een roerstaaf. Breng vervolgens het assemblagemengsel van de dialysecassette over in centrifugale filtereenheden met 10 kDa MWCO in evenwicht met DF-buffer. Concentraat bij 4.000 x g bij 4 °C.
    OPMERKING: Een troebele dialysemix kan wijzen op een verkeerde stoichiometrische verhouding van MSP:lipide. Neerslag moet worden verwijderd bij 18.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C vóór de concentratie van het monster. Om neerslag tijdens de monsterconcentratie te voorkomen, gebruikt u ultrafiltratie-eenheden met een grote deadstop.
  5. Concentreer de geassembleerde nanodiscs tot een concentratie van ten minste 300 μM. Meet de concentratie met behulp van een UV/VIS-lezer. Bedenk dat één nanodisc wordt gevormd door twee MSP1E3D1-moleculen en dus moet de concentratie MSP worden gedeeld door 2 om de juiste hoeveelheid nanodiscs te bepalen.
    OPMERKING: De beschreven opstelling (tabel 2) levert 0,6-1 ml van een nanodisc-oplossing van 300 μM op.
  6. Centrifugeer het geconcentreerde nanodisc-preparaat bij 18.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C om neerslag te verwijderen. Aspirateer vervolgens het supernatant en bevries 50 μL aliquots in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.
    OPMERKING: Het is raadzaam om het succes van nanodisc-vorming te evalueren met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie. Het monster moet monodisperse zijn en mag slechts een kleine hoeveelheid aggregaten bevatten. Aggregaten geven aan dat de hoeveelheid lipide in de opstelling te hoog is. Als referentie kan gezuiverde MSP1E3D1 worden gebruikt. Als het nanodisc-preparaat een piek vertoont op de hoogte van de referentie MSP1E3D1-piek, was de gekozen lipide-MSP13D1-verhouding te laag.

5. Preparatieve schaal 3 ml CECF-reactie-instelling

  1. Dag 1: Bereid alle benodigde voorraadoplossingen voor zoals vermeld (tabel 3). De voorraden worden opgeslagen bij -20 °C en ontdooid bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat u alle voorraden grondig mengt na het ontdooien en voor het pipetteren. Bereken de benodigde volumes voor alle voorraden en maak een pipetteerschema (tabel 4). Verbindingen met een hoog molecuulgewicht worden alleen aan de RM toegevoegd. Voor de verbindingen met een laag molecuulgewicht kan een gecombineerde 3 x mastermix voor RM en FM worden bereid.
    OPMERKING: De uiteindelijke volumes van samengestelde mengsels kunnen minder zijn dan berekend als gevolg van volumeverlies tijdens het mengen. Dit kan worden vermeden door een overtollig volume van 2-5% toe te voegen om volumeverlies te compenseren.
  2. Equilibrate het membraan van een 3 ml dialysecassette in 100 mM Tris-acetaat, pH 8,0. Zorg ervoor dat u overtollige buffer verwijdert.
  3. Gebruik een spuit om de RM in de dialysecassette over te brengen. Verwijder overtollige lucht in het RM-compartiment door aspiratie met de spuit. Plaats de dialysecassette in de dialysekamer.
  4. Vul de dialysekamer met 60 ml FM. Plaats het deksel op de kamer en draai de schroeven vast om deze te bevestigen. Incubeer de kamer gedurende 12-16 uur bij 30 °C bij 200 tpm.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de kamer tijdens het roeren rechtop blijft staan, anders wordt de uitwisseling van laagmoleculaire verbindingen belemmerd.
  5. Dag 2: Gebruik een spuit om de RM uit de dialysekamer te zuigen. Breng de RM over in verse buizen en centrifugeer bij 16.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten om neerslag te verwijderen. Breng het supernatant over in verse buizen. Het eiwit in het supernatant kan nu verder geanalyseerd worden.
    OPMERKING: In sommige gevallen zal een pellet aanwezig zijn na centrifugeren. Dit kan belangrijke informatie opleveren over de geschiktheid van de geanalyseerde nanodiscs of de reactieverbindingen om het gesynthetiseerde MP oplosbaar te houden. Het is daarom raadzaam om de hoeveelheid doelwit die mogelijk aanwezig is in het neerslag te analyseren met behulp van SDS-PAGE, Western Blot of door visuele evaluatie van de pelletgrootte.

6. Analytische schaal 60 μL CECF-reactie-instelling voor Mg2+ ionenscreening

  1. Dag 1: Meng alle componenten van de respectievelijke 3x master mix en verdeel 60 μL over de RM en 825 μL over de FM. Vul FM met H2O en meng FM door vortexing. Breng FM over in 3 putten van de 24 putjes microplaat (tabel 5).
    OPMERKING: Aangezien de aangepaste Mini-CECF-container mogelijk niet toegankelijk is, worden de volumes in tabel 5 berekend voor een reactie die wordt uitgevoerd in dialysepatronen (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) met een FM-volume van 1,7 ml in 96 deep-well (2 ml) platen (figuur 1).
  2. Snijd geregenereerde cellulosedialysebuizen met een 10-14 kDa MWCO in stukken van ongeveer 25 x 20 mm en bewaar in H2O met 0,05% (w/v) natriumazide.
    LET OP: Natriumazide is zeer giftig. Vermijd elk contact met de huid of het slijmvlies. Gebruik geen metalen containers omdat natriumazide kan reageren met metalen om explosieve metaalaziden te vormen.
  3. Verwijder vóór de assemblage van de Mini-CECF-container overtollige H2O uit de dialysemembranen met een tissue. Plaats een membraanstuk op elke container en bevestig de membranen met een polytetrafluorethyleenring.
  4. Breng de Mini-CECF-container over in de putjes van een 24-wellsplaat met 825 μL FM. Vermijd luchtbellen onder het dialysemembraan van de Mini-CECF-container.
  5. Voeg hoogmoleculaire componenten toe aan de RM zoals beschreven (tabel 5) en meng door op en neer te pipetteren. Voeg 60 μL toe aan de reactiecontainer. Vermijd luchtbellen tijdens de overdracht van de viskeuze oplossing.
  6. Snijd 2 vellen van 8 x 10 cm van een afdichtende thermoplastische film en wikkel ze rond de 24-wellsplaat met de reactiecontainers erin. Dit vermindert de verdamping van het reactiemengsel. Plaats nu het deksel van de celkweekplaat op de plaat en bevestig deze met tape. Incubeer de plaat bij 30 °C en 200 tpm roeren gedurende 12-16 uur.
  7. Dag 2: Oogst het reactiemengsel door met de pipetpunt bij de Mini-CECF-container door het dialysemembraan te prikken en de RM aan te zuigen. Breng RM over in verse buizen en centrifugeer bij 16.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten om neerslag te verwijderen. Breng het supernatant over in verse buizen. Het eiwit in het supernatant kan nu verder geanalyseerd worden.
    OPMERKING: In sommige gevallen zal na centrifugeren een pellet aanwezig zijn. Dit kan belangrijke informatie opleveren over de geschiktheid van de geanalyseerde nanodiscs of andere reactieverbindingen om het gesynthetiseerde MP oplosbaar te houden. Het is daarom raadzaam om de hoeveelheid doelwit die mogelijk aanwezig is in het neerslag te analyseren door SDS-PAGE, Western Blot of visuele evaluatie van de pelletgrootte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De impact van fijnafstemmingsreactieverbindingen op de uiteindelijke opbrengst of kwaliteit van gesynthetiseerde parlementsleden wordt geïllustreerd. Een frequente routinebenadering is om de optimale Mg2+ concentratie in CF-reacties aan te passen door expressie van groen fluorescerend eiwit (GFP) als een handige monitor van systeemefficiëntie. Als voorbeeld werd GFP gesynthetiseerd uit een pET-21a(+) vector bij Mg2+ concentraties tussen 14 en 24 mM (figuur 2). Sds-PAGE-analyse identificeerde de optimale Mg2+ concentratie bij 20 mM (figuur 2A), die in goede overeenstemming is met complementaire fluorescentiemetingen (excitatie bij 485 nm, emissiemeting bij 535 nm) van het CF-reactiesupernatant (figuur 2B). Voor de CF-expressie van de bacteriële PR uitgedrukt uit pIVEX 2.3 vector en van de kalkoen β1 adrenerge receptor (Tβ1AR) uitgedrukt uit pET-21a(+) vector, werd de optimale Mg2+ concentratie geïdentificeerd bij 20-22 mM.

Als ander voorbeeld wordt de kwaliteitsverfijning van gesynthetiseerde Kamerleden met de beschreven strategie getoond. Instelbare parameters voor de co-translationele insertie van parlementsleden in voorgevormde nanodiscs zijn (i) de lipidesamenstelling van het nanodisc-membraan en (ii) de uiteindelijke nanodisc-concentratie in de reactie. Het is bekend dat de hydrofobe omgeving een belangrijke parameter is voor een correcte vouwing, oligomere assemblage en stabiliteit van Kamerleden. Aangezien de lipidesamenstelling in nanodiscs kan worden gemoduleerd, maakt de beschreven aanpak een eenvoudige systematische screening van lipide-effecten op structuur en functie van een MP mogelijk. In de eerste experimenten wordt aanbevolen om lipiden te screenen met fosfatidylcholine (PC) en fosfatidylglycerol (PG) hoofdgroepen en om verschillende ketenlengtes en verzadigingen te testen. De impact van membraansamenstelling en nanodisc-concentratie op de oplosefficiëntie en kwaliteit van twee verschillende parlementsleden wordt getoond. PR is een licht geactiveerde protonpomp en een zeer stabiele en sterk gesynthetiseerde MP die eindconcentraties van > 100 μM in de RM bereikt. Daarom wordt aanbevolen om het als een positieve controle te gebruiken om een correcte reactie-instelling te garanderen, omdat de PR-concentratie gemakkelijk kan worden beoordeeld door meting van absorptie bij 530 nm in het RM-supernatant. Tβ1AR daarentegen is een voorbeeld van de grote familie van eukaryote G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) en is een complexe en onstabiele MP. Voor gemakkelijke monitoring werd een Tβ1AR-GFP fusieconstruct gesynthetiseerd en de totale concentratie van nanodisc opgeloste receptor in de CF-reacties werd bepaald via GFP-fluorescentie (figuur 3A). De fractie van functioneel gevouwen en ligandbindende actieve receptor werd verder bepaald met behulp van een filterbindingstest en het gelabelde ligand [3H]-dihydroalprenolol (figuur 3B). De filterbindingstest werd uitgevoerd zoals eerder beschreven14. In het kort werd de Tβ1AR-GFP-concentratie in de RM bepaald via de fluorescentie ervan. De GPCR werd gedurende 1 uur geïncubeerd met het radioactief gelabelde ligand bij 20 °C, aangebracht op een filter en ongebonden ligand werd afgewassen. Voor de bepaling van niet-specifieke [3H]-dihydroalprenololbinding was de receptor verzadigd met ongelabeld alprenolol in een controlereactie. De tellingen van het radioactieve ligand in de filters werden gemeten in een scintillatieteller en de hoeveelheid gebonden ligand werd bepaald via de specifieke labelactiviteit. Procent GPCR-bindingsactiviteit werd vervolgens berekend op basis van de hoeveelheid gebonden ligand, de Tβ1AR-GFP-concentratie en het testvolume. De algehele synthese en nanodisc-oplosbaarheid van Tβ1AR-GFP is vergelijkbaar met alle geanalyseerde membraansamenstellingen en binnen het bereik van 8-13 μM (figuur 3A). Daarentegen is een veel hogere variatie waarneembaar in de kwaliteit van de gesynthetiseerde GPCR. Laagste activiteit met minder dan 10% actieve fractie wordt verkregen met de lipiden DMPC en POPC. Met DOPG en POPG kon de actieve fractie van Tβ1AR-GFP worden verhoogd tot ongeveer 30% (figuur 3B). De resultaten geven aan dat lading van de lipidekopgroep en flexibiliteit van de vetzuurketen belangrijke modulatoren zijn voor het vouwen en de activiteit van deze GPCR.

Naast de samenstelling van nanodisc kan hun uiteindelijke concentratie in de CF-reactie een belangrijke factor zijn voor de MP-kwaliteit. Zodra een geschikte membraansamenstelling van een nanodisc is geïdentificeerd, moet de concentratie ervan tijdens MP-synthese worden gescreend. Het is duidelijk dat de nanodisc-concentratie moet worden aangepast aan de expressie-efficiëntie van een MP. CF-synthese van Tβ1AR-GFP-receptor en PR resulteren in eindconcentraties van respectievelijk ongeveer 10 μM en 100 μM in de RM. Als de nanodisc-concentratie wordt gescreend binnen een bereik van 3,75-60 μM, wordt een volledige oplosbaarheid van de GPCR verkregen bij ongeveer 30 μM nanodiscs, waardoor een verhouding van Tβ1AR: nanodisc van 1: 3 ontstaat (figuur 4A). Daarentegen wordt volledige oplosbaarheid van PR al bereikt met ongeveer 10 μM nanodiscs en geeft een PR:nanodisc ratio van 10:1 (figuur 4B). Een overmaat aan nanodiscs is daarom noodzakelijk om een bijna volledige oplosbaarheid van Tβ1AR-GFP te bereiken, terwijl een omgekeerde verhouding in het geval van PR duidt op het invoegen van meerdere PR-kopieën in één nanodisc. Latere studies van gezuiverde PR/nanodisc-complexen met native massaspectrometrie bevestigden deze waarneming en vonden een prevalentie van hogere oligomere vormen van PR indien gesynthetiseerd bij lagere nanodiscconcentraties15,18. De titratie van CF-gesynthetiseerde parlementsleden met nanodiscs kan daarom worden gebruikt als een hulpmiddel om oligomere assemblages te activeren en hun effecten op de MP-functie te bestuderen.

Figure 1
Figuur 1: CECF-expressiestrategie voor het inbrengen van membraaneiwitten in nanodiscs. (A) Basisworkflow die de belangrijkste stappen van het proces illustreert. (B) Aangepaste reactievaten op analytische schaal voor CECF-expressie. (C) In de handel verkrijgbare dialysecartridges voor CECF-opstelling op analytische schaal. (D) Preparatieve schaalopstelling (3 ml RM) inclusief een dialysecassette van 3 ml en een aangepaste FM-container van plexiglas. (E) Co-translationele invoeging van parlementsleden in voorgevormde nanodiscs en lipidenscreening in de CECF-configuratie. De RM bevat de vereiste transcriptie-/vertaalmachines en nanodiscs, terwijl verbindingen met een laag molecuulgewicht in beide compartimenten aanwezig zijn. Biochemische en structurele toepassingen van de geproduceerde MP/nanodisc-monsters worden verder geïllustreerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Effect van verschillende Mg2+ concentraties op CF GFP synthese. GFP werd gesynthetiseerd in CF-reacties met Mg2+ concentraties binnen een bereik van 14-24 mM. (A) SDS-PAGE analyse toont de sterkste band van GFP bij 20 mM Mg2+. M: Markering. (B) GFP-fluorescentie na CF-expressie met verschillende Mg2+ concentraties. De maximale GFP-fluorescentie bij 20 mM Mg2+ komt overeen met 4,6 mg/ml. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van een dubbele meting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Effect van nanodisc membraansamenstelling op oplosbaarheid en kwaliteit van een CF gesynthetiseerde GPCR. Opbrengst en activiteit van Tβ1AR-GFP gesynthetiseerd in aanwezigheid van 30 μM nanodiscs met verschillende membraansamenstellingen. Het totaal gesynthetiseerde eiwit (A) en de fractie van ligandbindende actieve receptor (B) worden gegeven in μM. De totale concentratie werd bepaald via fluorescentiemeting van de GFP-fusie. De activiteit werd gemeten via filterbindingstest met het radioactief gelabelde ligand [3H]-dihydroalprenolol. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties van onafhankelijke drievoudanten. Gegevens uit eerder gepubliceerd manuscript14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Oplosbaarheidsscreening van CF-gesynthetiseerde parlementsleden met toenemende nanodisc-concentraties. De parlementsleden werden gesynthetiseerd in aanwezigheid van geleverde nanodiscs binnen een bereik van 3,75-60 μM. (A) Expressie van Tβ1AR-GFP met nanodiscs (DMPC) in de CF-reactie. De totale concentratie werd bepaald via fluorescentiemeting van de GFP-fusie. Gegevens uit eerder gepubliceerd manuscript14. Affinity-tag gezuiverde monsters werden geanalyseerd door SDS-PAGE en Coomassie-Blue kleuring toont twee prominente banden die overeenkomen met Tβ1AR-GFP bij ongeveer 50 kDa en MSP1E3D1 boven 25 kDa (B) Expressie van PR met nanodiscs (DOPG) in de CF-reactie. De totale concentratie pr werd bepaald via absorptiemeting bij 530 nm. Gegevens uit eerder gepubliceerd manuscript10,18. De foto's tonen de rode kleur van de eindreacties door de aanwezigheid van gevouwen PR. De pictogrammen illustreren de gemoduleerde PR-assemblage naar lagere oligomere conformaties bij verhoogde nanodisc-concentraties, zoals blijkt uit de daaropvolgende inheemse massaspectrometrie18. Affinity-tag gezuiverde monsters werden geanalyseerd door SDS-PAGE en Coomassie-Blue kleuring toont twee prominente banden die overeenkomen met PR bij ongeveer 20 kDa en MSP1E3D1 boven 25 kDa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Verbinding Eindconcentratiebereik Effect op MP-voorbeeld
mg2+ 10 - 30 mM opbrengst
DTT 1 - 20 mM disulfidebrugvorming, vouwen
20 Aminozuurmengsel1 0,2 – 2 mM opbrengst
GSSG : GSH2 (1-10 μM) : (1-10 μM) disulfidebrugvorming, vouwen
Nanodiscs 10 - 100 μM oplosbaarheid, oligomere assemblage, vouwen
Lipide type oplosbaarheid, oligomere assemblage, vouwen
S30 : HS30 lysaat3 (50-100 %) : (50-100 %) Vouwen
S12 - S100 20 – 50 % yield, MP achtergrond in kanaal assays
DNA-sjabloon 0,5 – 30 ng/μL RM opbrengst, oligomere assemblage, vouwen
DNA-sjabloonontwerp opbrengst
1, kan het mengsel worden gevarieerd naar gelang van de individuele samenstelling van een MP om bijvoorbeeld de opbrengst te verbeteren of de NMR-etiketteringsschema's te optimaliseren.
2, GSH moet altijd vers worden bereid.
3, de totale CF-lysaatconcentratie in de RM moet ten minste 35 % bedragen met een S30-gehalte van ten minste 50 % om hoge expressieniveaus te garanderen.

Tabel 1: Kritische screeningcomponenten van CF-reacties.

MSP1E3D1 Lipide DPC
Verhouding (410 μM voorraad) (50 000 μM voorraden) (10 % (m/v) voorraad)
Lipide Lipide : MSP V(MSP) c(MSPdefinitief) V(lipide) c(lipidedefinitief) V(DPC) c(DPCdefinitief) DF-buffer
[μL] [μM] [μL] [μM] [μL] [%] [μL]
Dmpc 115 : 1 1500.0 205.0 1415.0 23 575 30.0 0.1 55.5
Dopc 80 :1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPC 85 : 1 1500.0 205.0 1046.0 17 425 30.0 0.1 425.0
Dmpg 110 : 1 1500.0 205.0 1353.0 22 550 30.0 0.1 117.0
Dopg 80 : 1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
Popg 90 : 1 1500.0 205.0 1107.0 18 450 30.0 0.1 363.0

Tabel 2: Lipide/MSP1E3D1 verhoudingen voor 3 ml in vitro assemblage opstellingen.

Verbinding Concentratie Voorbereiding
DNA plasmide sjabloon1 > 400 μg/ml in 10 mM Tris-HCl pH 8,0 Midi/Maxi kit (bijv. Qiagen) voorbereiding2
Mengsel van 20 aminozuren3 25 mM elk in H2O neerslagresten4
Mengsel van 4 NTP's (75 x) c (CTP) 240 mM, c (ATP) 360 mM, c (UTP) 240 mM, c (GTP) 240 mM
in H2O. Stel de pH in op 7-8 met KOH		 Een beetje neerslag blijft4
Acetylfosfaat 1 M in H2O, pH 7-8 aanpassen met KOH neerslagresten4
Fosfo(enol)pyruvinezuur (K+) 1 M in H2O, pH 7-8 aanpassen met KOH
Folinezuur 10 mg/ml in H2O neerslagresten4
DTT 0,5 M in H2O
c0mplete proteaseremmer cocktail 1 tablet per 1 ml in H2O
Tris-acetaat, pH 8,0 2,4 M in H2O
mg(oac)2 1 M in H2O
KoAc 10 M in H2O
Ribolock RNase-remmer 40 U/ml Thermo Fisher Wetenschappelijk
tRNA (E. coli) 40 mg/ml in H2O Roche (Duitsland)
T7RNAP 3-7 mg/ml5 zie protocol paragraaf 2
Pyruvaatkinase 10 mg/ml Roche (Duitsland)
Nanodiscs (DMPG) 0,2-1,0 mM6 in 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 100 mM NaCl zie protocol secties 3 en 4
1, PCR-sjabloon kan worden gebruikt bij vergelijkbare concentraties.
2, de kwaliteit van "Mini"-kit bereid DNA is niet bevredigend.
3, cysteïne heeft de neiging om onstabiel te zijn en kan afzonderlijk worden toegevoegd.
4, oplossing is oververzadigd, grondig mengen onmiddellijk voordat aliquots worden verwijderd, is noodzakelijk.
5, voor elke nieuwe T7RNAP-batch wordt een eerste scherm aanbevolen om de beste eindconcentratie te bepalen.
6, oplosbaarheid van nanodiscs kan afhangen van hun lipidesamenstelling.

Tabel 3: Bereiding van CF-stamoplossingen.

Verbinding
Voor Mastermix (3,0 x) c(definitief) V [μL]
Mengsel van 20 aminozuren 1 mM 2520.0
Mengsel van 4 NTP's (75 x) 1x 840.0
Acetylfosfaat 20m 1260.0
Fosfo(enol)
pyruvic zuur		 20m 1260.0
Folinezuur 0,1 mg/ml 630.0
Tris-acetaat, pH 8,0 100m 2625.0
C0mplete 50 x 1x 1260.0
mg(oac)2 19,8 (= 20)1 mM 1260.0
KoAc 180 (= 270)2 mM 1140.0
DTT 2mM 252.0
H2O 7953.0
Totaal 21 000
Voor RM c(definitief) V [μL]
3x Mastermix 1 x 1000.0
RNase-remmer 0,3 U/μL 22.5
tRNA (E. coli) 0,5 mg/ml 37.5
Nanodiscs (DMPG)3 10 μM 75.0
DNA-sjabloon4 0,015 ng/μL 112.5
Pyruvaatkinase 0,04 mg/ml 12.0
T7RNAP5 0,03 mg/ml 15.0
S30 lysaat 0.35 % 1050.0
All-trans retinaal6 0,6 mM 9.0
H2O - 666.5
Totaal 3000.0
Voor FM c(definitief) V [μL]
Mastermix (3 x) 1 x 20 000
H2O - 40 000
Totaal 60 000
1, 0,2 mM Mg2+ worden bijgedragen door het S30-lysaat.
2, 90 mM K + worden bijgedragen uit acetylfosfaat en fosfo (enol) pyruvinezuur.
3, berekende stamoplossing is 400 μM.
4, berekende stamoplossing is 400 μg/ml.
5, berekende stamoplossing is 6 mg / ml.
6, specifieke cofactor voor PR, voorraadoplossing is 200 mM in DMSO.

Tabel 4: Pipetteerschema voor een CECF-reactie met 3 ml RM en 60 ml FM

Verbinding
Voor Mastermix (3,0 x) c(definitief) V [μL]
Mengsel van 20 aminozuren 1 mM 864.0
Mengsel van 4 NTP's 1x 288.0
Acetylfosfaat 20m 432.0
Fosfo(enol)pyruvinezuur 20m 432.0
Folinezuur 0,1 mg/ml 216.0
Tris-acetaat, pH 8,0 100m 900.0
c0mplete 1x 432.0
mg(oac)2 13,8 (= 14) mM1 298.0
KoAc 180 (= 270) mM2 389.0
DTT 2mM 86.4
H2O - 2862.6
Totaal [μL]1 - 7200.0
Mg2+ concentratie
14 mM 16 mM 18mM 20m 22mM 24mM
Voor RM c(definitief) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0
0,1 m mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0
RNase-remmer 0,3 U/μL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
tRNA (E. coli) 0,5 mg/ml 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
DNA-sjabloon3 0,015 ng/μL 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5
Pyruvaatkinase 0,04 mg/ml 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
T7RNAP4 0,03 mg/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
S30 lysaat 35 % 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0
H2O - 49.7 45.7 41.7 37.7 33.7 29.7
Totaal [μL]5 - 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0
Mg2+ concentratie
14 mM 16 mM 18mM 20m 22mM 24mM
Voor RM c(definitief) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0
0,1 m mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 68.0 136.0 204.0 272.0 340.0
H2O - 2267.0 2199.0 2131.0 2064.0 1995.0 1927.0
Totaal [μL]5 - 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0
1, 0,2 mM Mg2+ worden bijgedragen door het S30-lysaat. De mastermix wordt aangepast aan de laagste zeefconcentratie.
2, 90 mM K + worden bijgedragen uit aceetfosfaat en fosfo (enol) pyruvinezuur.
3, berekende stamoplossing is 400 μg/ml.
4, berekende stamoplossing is 6 mg / ml.
5, reacties worden uitgevoerd in duplicaten.

Tabel 5: Pipetteerschema voor Mg2+ concentratiescherm met 100 μL RM en 1,7 ml FM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De opzet en strategieën om de CF-expressie en co-translationele invoeging van functionele parlementsleden in nanodiscs te optimaliseren, worden beschreven. De benodigde apparatuur bestaat uit een bioreactor, een Frans persapparaat of iets dergelijks, een UV/VIS- en fluorescentielezer, CF-reactievaten die geschikt zijn voor een configuratie-opstelling met twee compartimenten en een temperatuurgecontroleerde incubator. Andere standaarduitrusting zijn centrifuges voor het oogsten van E. coli-cellen en tafelcentrifuges met een bereik van ten minste 30.000 x g voor de bereiding van S30-lysaten. Als S80-S100-lysaten moeten worden bereid, zijn ultracentrifuges nodig. De vermelde apparatuur is regelmatig beschikbaar in biochemische laboratoria en er zijn geen grotere initiële investeringen nodig om aan de slag te gaan met CF-expressie. Bovendien zijn fermentatie en behandeling van E. coli-cellen voor CF-lysaat- en T7RNAP-preparaten gebruikelijke en robuuste technieken. De duurste verbindingen zijn CF-lysaat, T7RNAP en nanodiscs. Ze kunnen worden bereid door betrouwbare en efficiënte protocollen en aliquots zijn jarenlang stabiel bij -80 °C. De protocollen vereisen elk drie dagen voor CF-lysaat- en T7RNAP-bereiding en ongeveer een week voor expressie en zuivering van MSP en preforming van nanodiscs. Doelsjabloon-DNA kan worden geleverd met behulp van pET-21, pIVEX of vergelijkbare vectorsystemen. Voor het opzetten en optimaliseren van CF-expressiesystemen kan de productie van GFP-varianten zoals shifted GFP (GFP+) of superfolderGFP worden gebruikt als monitor20,32. Voor MP-productieomstandigheden is de expressie van PR een goed modelsysteem of positieve controle, omdat het onder veel verschillende omstandigheden vouwt en gemakkelijk kan worden bewaakt door absorptie bij 530 nm 10,15,18. Om een efficiënt CF-expressieprotocol voor een nieuwe MP op te stellen, wordt codonoptimalisatie van het doelleesframe en het gebruik van fusies met C-terminally attached GFP aanbevolen25,26. Andere vereiste materialen zijn chemicaliën en enzymen die allemaal in de handel verkrijgbaar zijn. Deze componenten moeten in hoge kwaliteit worden verkregen en een algemene kostenberekening voor de beschreven CF-reactie met 3 ml RM en 60 ml FM zou ongeveer 150-200 € bedragen. Een belangrijke toepassing voor CF-expressiesystemen is daarom de productie van eiwitten die moeilijk te verkrijgen zijn in klassieke celgebaseerde expressiesystemen zoals veel parlementsleden of toxines. CF-systemen zijn bovendien kernplatforms in de synthetische biologie en voortdurend groeiende toepassingsgebieden maken ze steeds onmisbaarder als hulpmiddel in moleculair onderzoek. Routinematige toepassingen zijn onder andere het labelen van eiwitten, high-throughput processen of synthetisch celontwerp.

De gedemonstreerde strategie maakt wasmiddelvrije productie mogelijk van pure parlementsleden die al zijn ingebracht in de gewenste lipideomgevingen van zeer oplosbare nanodiscs. Zodra het CF-expressieprotocol voor een MP is vastgesteld en geoptimaliseerd, is de productie zeer snel en kunnen pure monsters worden verkregen in minder dan 24 uur, zelfs op preparatieve schaal. De MP/nanodisc-complexen worden rechtstreeks uit de CF-reactie gezuiverd via streptavidin II of polyhistidine-tags die aan het MP zijn bevestigd. Het proces maakt parallelle functionele en structurele analyse van identieke MP-monsters mogelijk door een reeks verschillende technieken33. De snelheid en efficiëntie van de strategie is daarom concurrerend met conventionele benaderingen die gebruikmaken van celgebaseerde expressiesystemen en detergentextractie van parlementsleden uit celmembranen, gevolgd door routinematige in vitro reconstitutie 5,34. De open toegankelijkheid van CF-reacties vergemakkelijkt verder talrijke unieke mechanistische studies van MP-vouwing en membraaninbrenging15,16,18, MP-complexe assemblage 15,18,24 of functionele regulatie23.

Een belangrijk verschil tussen CF-expressie en celgebaseerde expressie is de afwezigheid van kwaliteitscontrolesystemen voor het gesynthetiseerde eiwitproduct. Elk vertaald polypeptide dat onafhankelijk is van zijn functionele vouwing, zal in het uiteindelijke productmonster terechtkomen. Bovendien is het inbrengproces in nanodisc-membranen kunstmatig en translocononafhankelijk en kan het resulteren in onvolledige integratie of helemaal niet werken met een aantal MP-doelen. De uiteindelijk opgeloste productfractie in een CF-reactie zou dus vrij heterogeen kunnen zijn met volledig ingebrachte maar ook slechts gedeeltelijk geïntegreerde of membraangebonden parlementsleden. Bijgevolg kan slechts een klein deel van een gezuiverd monster van MP / nanodisc-complexen functioneel worden gevouwen. Het wijzigen van de membraansamenstelling en het zorgvuldig afstemmen van MP tot nanodisc-verhoudingen door de concentraties van nanodiscs en DNA-sjablonen te moduleren, zijn geschikte hulpmiddelen voor optimalisatie. Niettemin zijn downstream-kwaliteitsbeheersingsbenaderingen zoals profilering van grootte-uitsluiting en doelspecifieke kwantitatieve functionele testen altijd nodig voor optimalisatie van CF-expressieprotocollen. De beschikbaarheid van dergelijke testen kan daarom toepassingen beperken, met name in projecten, waaronder parlementsleden die liposoomomgevingen nodig hebben voor functies zoals transporters, kanalen of pompen. Bovendien kunnen de groottebeperkingen van nanodiscs de invoeging van grote MP-assemblages beperken.

In de gedocumenteerde voorbeelden ligt de variatie in de functioneel gevouwen fractie van de GPCR Tβ1AR-GFP binnen het bereik van enkele procenten, tot ongeveer 30%. Functioneel vouwen vereist een zorgvuldige aanpassing van een aantal parameters14 en een vergelijkbaar individueel en vervelend optimalisatieproces kan nodig zijn voor andere GPCR'sen 22. De uiteindelijk behaalde opbrengst van functioneel gevouwen GPCR is echter concurrerend met andere productiesystemen en maakt het mogelijk om > 1.000 radioassays voor ligandbindingsstudies op te zetten uit een enkele 60 μL-reactie in een mini-CECF-reactor op analytische schaal. Het is vermeldenswaard dat ligandbindingsstudies van GPCR-GFP-fusieconstructies geen zuiveringsstappen vereisen. Indien nodig kan zuivering worden bereikt door gebruik te maken van affiniteitstags die aan de gesynthetiseerde MP zijn bevestigd, zoals His-tags of Strep-tag II. De RM wordt vervolgens verdund in de gewenste buffer en geladen op de overeenkomstige affiniteitschromatografiekolom die dienovereenkomstig is voorgebalanceerd. De structurele evaluatie van PR en andere CF-gesynthetiseerde parlementsleden door NMR-spectroscopie of kristallisatie hebben al bijgedragen aan het opzetten van CF-expressiesystemen als kernplatforms in MP-onderzoek. De beschreven strategie voor de productie van MP/nanodisc-complexen zou bijzonder interessant kunnen worden voor toekomstige structurele studies door elektronenmicroscopie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We willen de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) subsidie BE1911/8-1, het LOEWE project GLUE en het collaboratieve onderzoekscentrum Transport and Communication across Membranes (SFB807) bedanken voor financiële steun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) Carl Roth (Germany) 4855
2-Mercaptoethanol Carl Roth (Germany) 4227
2-Propanol Carl Roth (Germany) 9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride American Radiolabeled Chemicals (USA) ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) Merck (Germany) 1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) Sigma Aldrich (Germany) A9251
Alprenolol hydrochloride Merck (Germany) A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® Sigma-Aldrich (Germany) Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1 Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1 B.Braun (Germany)
Centrifuge Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid Carl Roth (Germany) 8137
Coomassie Brilliant Blue R250 Carl Roth (Germany) 3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt Sigma-Aldrich (Germany) C1506
D-glucose monohydrate Carl Roth (Germany) 6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate Carl Roth (Germany) 6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing Fisher Scientific (Germany) 8700152
Dithiothreit Carl Roth (Germany) 6908
Ethanol Carl Roth (Germany) K928
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma-Aldrich (Germany) 47612
French pressure cell disruptor SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol Carl Roth (Germany) 3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) Sigma-Aldrich (Germany) G8877
Hydrochloric Acid Carl Roth (Germany) K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL GE Life Sciences (Germany) GE17-5248
Imidazole Carl Roth (Germany) 3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Carl Roth (Germany) 2316
Kanamycin Carl Roth (Germany) T832
L-Alanine Carl Roth (Germany) 3076.1
L-Arginine Carl Roth (Germany) 6908
L-Asparagine Carl Roth (Germany) HN23
L-Aspartic Acid Carl Roth (Germany) T202
L-Cysteine Carl Roth (Germany) T203
L-Glutamic Acid Carl Roth (Germany) 3774
L-Glutamine Carl Roth (Germany) 3772
L-Glycine Carl Roth (Germany) 3187
L-Histidine Carl Roth (Germany) 3852
L-Isoleucine Carl Roth (Germany) 3922
L-Leucine Carl Roth (Germany) 1699
L-Lysine Carl Roth (Germany) 4207
L-Methionine Carl Roth (Germany) 9359
L-Proline Carl Roth (Germany) 1713
L-Phenylalanine Carl Roth (Germany) 1709
L-Serine Carl Roth (Germany) 4682
L-Threonine Carl Roth (Germany) 1738
L-Tryptophane Carl Roth (Germany) 7700
L-Tyrosine Carl Roth (Germany) T207
MD100 dialysis units Scienova (Germany) 40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) Carl Roth (Germany) 6763
n-dodecylphosphocholine Antrace (USA) F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000 Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine Carl Roth (Germany) 6681
Peristaltic pump: ip-12 Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt Sigma Aldrich (Germany) 860077
Potassium dihydrogen phosphate Carl Roth (Germany) P018
Potassium acetate Carl Roth (Germany) 4986
Potassium chloride Carl Roth (Germany) 6781
Pyruvate Kinase Roche (Germany) 10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL Hidex (Finland)
SDS pellets Carl Roth (Germany) 8029
Sodium azide Sigma-Aldrich (Germany) K305
Sodium chloride Carl Roth (Germany) P029
Spectrophotometer Nanodrop Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli) Roche (Germany) 10109550001
Ultra sonificator Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) Sigma-Aldrich (Germany) U6625
Y-30 antifoam Sigma-Aldrich (Germany) A6457
Yeast extract Carl Roth (Germany) 2904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  2. Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
  3. Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  4. Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
  5. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  6. Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
  7. Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
  8. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  9. Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
  10. Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
  11. Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
  12. Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
  14. Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
  15. Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
  16. Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  17. Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
  18. Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
  19. Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
  20. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  21. Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
  22. Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
  23. Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
  24. Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
  25. Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
  26. Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
  27. Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
  28. Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
  29. Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
  30. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  31. Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
  32. Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
  33. Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
  34. Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).

Tags

Biochemie Uitgave 165 In vitro expressie celvrij L-CF detergent-vrij nanodiscs membraaneiwitten G-eiwit gekoppelde receptoren proteorhodopsine membraanontwerp co-translationele membraaninbrenging
Co-translationele insertie van membraaneiwitten in voorgevormde nanodiscs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levin, R., Koeck, Z., Dötsch,… More

Levin, R., Koeck, Z., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs. J. Vis. Exp. (165), e61844, doi:10.3791/61844 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter