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Biochemistry

पूर्वनिर्मित नैनोडिस्क में मेम्ब्रेन प्रोटीन का सह-ट्रांसलेशनल सम्मिलन

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61844
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biophysical Chemistry, Goethe University Frankfurt

Summary

पूर्व-गठित नैनोडिस्क में सह-ट्रांसलेशनल सम्मिलन डिटर्जेंट के संपर्क के बिना परिभाषित लिपिड वातावरण में सेल-मुक्त संश्लेषित झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करना संभव बनाता है। यह प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति दक्षता और नमूना गुणवत्ता में सुधार के लिए आवश्यक सिस्टम घटकों और महत्वपूर्ण मापदंडों की तैयारी का वर्णन करता है।

Abstract

सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली प्रतिक्रिया वातावरण के अनुरूप डिजाइन को झिल्ली प्रोटीन जैसे जटिल प्रोटीन के कार्यात्मक तह का समर्थन करने की अनुमति देती है। नैनोडिस्क के रूप में आपूर्ति की गई पूर्वनिर्मित और परिभाषित झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन के सह-ट्रांसलेशनल सम्मिलन और तह के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया है। प्रोटोकॉल पूरी तरह से डिटर्जेंट मुक्त है और एक दिन के भीतर शुद्ध नमूने के मिलीग्राम उत्पन्न कर सकता है। नैनोडिस्क नमूनों का उपयोग विभिन्न कार्यात्मक अध्ययनों और संरचनात्मक अनुप्रयोगों जैसे क्रिस्टलीकरण, परमाणु चुंबकीय अनुनाद, या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए किया जा सकता है। सेल-फ्री लाइसेट, डिज़ाइन किए गए झिल्ली के साथ नैनोडिस्क, महत्वपूर्ण स्टॉक समाधान के साथ-साथ दो-कम्पार्टमेंट सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं की असेंबली जैसे बुनियादी प्रमुख घटकों की तैयारी का वर्णन किया गया है। चूंकि झिल्ली प्रोटीन की तह आवश्यकताएं अत्यधिक विविध हो सकती हैं, इसलिए इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख फोकस नमूना गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों और प्रतिक्रिया चरणों का मॉड्यूलेशन है जैसे कि महत्वपूर्ण बुनियादी प्रतिक्रिया यौगिक, नैनोडिस्क की झिल्ली संरचना, रेडॉक्स और चैपरोन पर्यावरण, या डीएनए टेम्पलेट डिजाइन। पूरी प्रक्रिया को प्रोटियोरोडोप्सिन और जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर के संश्लेषण के साथ प्रदर्शित किया जाता है।

Introduction

मेम्ब्रेन प्रोटीन (एमपी) जलीय वातावरण में उनकी अघुलनशीलता के कारण प्रोटीन उत्पादन अध्ययन में चुनौतीपूर्ण लक्ष्य हैं। पारंपरिक एमपी उत्पादन प्लेटफार्मों में ई कोलाई, खमीर या यूकेरियोटिक कोशिकाओं जैसे सेल-आधारित सिस्टम शामिल हैं। संश्लेषित पुनः संयोजक सांसदों को या तो कोशिका झिल्ली से निकाला जाता है या समावेशनिकायों से फिर से मोड़ दिया जाता है। डिटर्जेंट घुलनशीलता के बाद, सांसदों को इन विट्रो पुनर्गठन प्रोटोकॉल स्थापित करके उपयुक्त झिल्ली वातावरण में स्थानांतरित किया जा सकता है। पुटिकाओं और लिपोसोम्स के अलावा, नैनोडिस्क2 या सालिप्रो3 कणों के रूप में प्लानर झिल्ली में एमपी पुनर्गठन हाल के दिनों में नियमित तकनीक बन गई है। हालांकि, इन सभी रणनीतियों का अर्थ है सांसदों के साथ डिटर्जेंट संपर्क जिसके परिणामस्वरूप अस्थिरता, ऑलिगोमर्स का पृथक्करण और यहां तक कि प्रोटीन संरचना और गतिविधि 4 का नुकसान होसकता है। इष्टतम डिटर्जेंट घुलनशीलता और पुनर्गठन स्थितियों के लिए स्क्रीनिंग इसलिए थकाऊ और समय लेने वाली हो सकतीहै।

सेल-फ्री (सीएफ) सिस्टम की खुली प्रकृति अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया को सीधे परिभाषित लिपिड संरचना के साथ पूर्वनिर्मित झिल्ली के साथ आपूर्ति करने की अनुमति देती है। इस लिपिड-आधारित अभिव्यक्ति मोड (एल-सीएफ) में, संश्लेषित सांसदों के पास प्रदान किए गए बाइलेयर 6,7 (चित्रा 1) में सह-अनुवाद करने का अवसर होता है। एक प्लानर लिपिड बाइलेयर डिस्क8 के आसपास एक झिल्ली मचान प्रोटीन (एमएसपी) से युक्त नैनोडिस्क इस रणनीति 9,10 के लिए विशेष रूप से उपयुक्त प्रतीत होते हैं। नैनोडिस्क को नियमित रूप से विभिन्न लिपिड की एक किस्म के साथ विट्रो में इकट्ठा किया जा सकता है, वे बहुत स्थिर होते हैं, और स्टॉक को 1 एमएम तक केंद्रित किया जा सकता है। हालांकि, ई कोलाई में एमएसपी अभिव्यक्ति और इसका शुद्धिकरण आवश्यक है। एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में, एमएसपी को लिपोसोम 11,12,13 के साथ आपूर्ति की गई सीएफ प्रतिक्रियाओं में लक्ष्य एमपी के साथ सह-व्यक्त किया जा सकता है। MSP और MP दोनों के लिए डीएनए टेम्प्लेट प्रतिक्रिया में जोड़े जाते हैं और MP / nanodiscs अभिव्यक्ति पर बन सकते हैं। जबकि एमएसपी उत्पादन से बचा जाता है, सह-अभिव्यक्ति रणनीति को अंतिम डीएनए टेम्पलेट सांद्रता के सावधानीपूर्वक ठीक करने की आवश्यकता होती है और नमूना उत्पादन की दक्षता में उच्च भिन्नता की उम्मीद की जा सकती है।

पूर्वनिर्मित नैनोडिस्क की झिल्लियों में सांसदों का सह-ट्रांसलेशनल सम्मिलन एक गैर-शारीरिक और अभी भी काफी हद तक अज्ञात तंत्र है जो ट्रांसलोकन मशीनरी और सिग्नल अनुक्रम 13,14,15,16 से स्वतंत्र है। सम्मिलन दक्षता के प्रमुख निर्धारक झिल्ली प्रोटीन के प्रकार के साथ-साथ प्रदान की गई झिल्ली की लिपिड संरचना हैं, जिसमें नकारात्मक रूप से चार्ज लिपिड15,17 के लिए लगातार प्राथमिकता है। चूंकि नैनोडिस्क झिल्ली आकार में अपेक्षाकृत सीमित हैं, इसलिए एमपी सम्मिलन18 पर पर्याप्त मात्रा में लिपिड जारी किए जाते हैं। नैनोडिस्क आकार की भिन्नता उच्च ऑलिगोमेरिक एमपी कॉम्प्लेक्स15,18 के सम्मिलन और ट्यूनिंग को सक्षम बनाती है। दूसरों के बीच, होमोलिगोमेरिक कॉम्प्लेक्स की सही असेंबली आयन चैनल केसीएसए के लिए, आयन पंप प्रोटियोरोडोप्सिन (पीआर) के लिए और मल्टीड्रग ट्रांसपोर्टर एमरई15,18 के लिए दिखाई गई थी। सांसदों को अपेक्षाकृत समान आवृत्ति पर दोनों तरफ से सममित नैनोडिस्क झिल्ली में प्रवेश करने की संभावना है। इसलिए यह माना जाना चाहिए कि एक नैनोडिस्क में डाले गए विभिन्न मोनोमर्स या ऑलिगोमर्स में विपरीत झुकाव हो सकते हैं। हालांकि, अभिविन्यास में पूर्वाग्रह सहकारी सम्मिलन तंत्र के कारण हो सकता है जैसा कि पीआर हेक्सामर्स और केसीएसए टेट्रामर्स18 के गठन के लिए बताया गया है। एमपी ओरिएंटेशन में एक और पूर्वाग्रह संभवतः नैनोडिस्क झिल्ली के रिम पर डाले गए सांसदों के अभिविन्यास स्विच के परिणामस्वरूप हो सकता है।

कोलाई उपभेदों से सीएफ लाइसेट का उत्पादन एक विश्वसनीय नियमित तकनीक है और इसे लगभग किसी भी जैव रासायनिक प्रयोगशाला19,20 में किया जा सकता है। यह माना जाना चाहिए कि डाइसल्फ़ाइड पुल गठन के अलावा, अधिकांश अन्य पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन अनुपस्थित हैं यदि ई कोलाई लाइसेट का उपयोग करके एक एमपी को संश्लेषित किया जाता है। हालांकि यह संरचनात्मक अध्ययनों के लिए अधिक समरूप नमूने उत्पन्न कर सकता है, लेकिन व्यक्तिगत एमपी लक्ष्यों के कार्य पर संभावित प्रभावों को बाहर करना आवश्यक हो सकता है। हालांकि, जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) 14,21,22, यूकेरियोटिक ट्रांसपोर्टर23 या ई कोलाई सीएफ लाइसेट में बड़े हेटरोमेरिक असेंबली24 के उच्च गुणवत्ता वाले नमूनों का कुशल उत्पादन जटिल लक्ष्यों के लिए उनकी उपयुक्तता को इंगित करता है। एक नमूने की प्रारंभिक स्केल मात्रा (≈ 1 मिलीग्राम / एमएल) को दो-कम्पार्टमेंट निरंतर विनिमय सेल-फ्री (सीईसीएफ) कॉन्फ़िगरेशन के साथ प्राप्त किया जा सकता है, जो एक प्रतिक्रिया मिश्रण (आरएम) और एक फीडिंग मिश्रण (एफएम) डिब्बे से बना है। एफएम वॉल्यूम आरएम वॉल्यूम 15 से 20 गुना से अधिक है और कम आणविक भार ऊर्जा यौगिकों और अग्रदूतों का एक भंडार प्रदान करताहै। इस प्रकार अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया को कई घंटों तक बढ़ाया जाता है और एमपी लक्ष्य की अंतिम उपज में वृद्धि होती है। आरएम और एफएम डिब्बों को 10-14 केडीए कटऑफ के साथ डायलिसिस झिल्ली द्वारा अलग किया जाता है। दो डिब्बों को सीईसीएफ प्रतिक्रिया कंटेनर (चित्रा 1) के एक विशेष डिजाइन की आवश्यकता होती है। एफएम को पकड़ने वाले अनुरूप प्लेक्सीग्लास कंटेनरों के साथ संयोजन में आरएम कंटेनर के रूप में वाणिज्यिक डायलिसिस कैसेट उपयुक्त उदाहरण हैं। एमपी यील्ड को आरएम: एफएम अनुपात को संशोधित करके या इनक्यूबेशन की एक निश्चित अवधि के बाद एफएम का आदान-प्रदान करके हेरफेर किया जा सकता है।

एक एमपी की उपज और गुणवत्ता को अक्सर प्रतिक्रिया मापदंडों के गहन अनुकूलन की आवश्यकता होती है। सीएफ अभिव्यक्ति का एक महत्वपूर्ण लाभ एक सांसद की व्यक्तिगत आवश्यकताओं के अनुसार लगभग किसी भी यौगिक को संशोधित और ठीक करने की संभावना है। एक सीधी रणनीति पहले एक बुनियादी उत्पादन प्रोटोकॉल स्थापित करके एक एमपी की उपज में सुधार करने पर ध्यान केंद्रित करना है और फिर प्रतिक्रिया और फोल्डिंग स्थितियों को ठीक करके एमपी गुणवत्ता को अनुकूलित करना है। सीएफ लाइसेट में शारीरिक प्रक्रियाओं की अनुपस्थिति और उनकी कम जटिलता के परिणामस्वरूप सांसदों के कुशल उत्पादन के लिए उच्च सफलता दरहोती है। डीएनए टेम्पलेट डिजाइन और एमजी2 + आयन एकाग्रता के अनुकूलन के लिए नियमित विचार ज्यादातर मामलों में संतोषजनकउपज प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैं। अभिव्यक्ति मोड के आधार पर, एमपी गुणवत्ता का अनुकूलन समय लेने वाला हो सकता है, क्योंकि विभिन्न प्रकार के मापदंडों की जांच करने की आवश्यकता होती है 14,17,22।

वर्णित सीएफ अभिव्यक्ति मंच स्थापित करने के लिए, ई कोलाई सीएफ लाइसेट (i), T7 आरएनए पोलीमरेज़ (ii), नैनोडिस्क (iii), और बुनियादी सीईसीएफ प्रतिक्रिया यौगिकों (iv) (चित्रा 1) के उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल आवश्यक हैं। ई कोलाई के 12 स्ट्रेन ए 1 927 या बीएल 21 डेरिवेटिव का उपयोग अक्सर कुशल एस 30 (30,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन) लाइसेट की तैयारी के लिए किया जाता है। एस 30 लाइसेट के अलावा, अन्य जी-बलों (जैसे एस 12) पर संबंधित लाइसेट सेंट्रीफ्यूज का उपयोग किया जा सकता है। लाइसेट अभिव्यक्ति दक्षता और प्रोटिओम जटिलता में भिन्न होते हैं। वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा तैयार एस 30 लाइसेट के प्रोटिओमका विस्तार से अध्ययन किया गया है। एस 30 प्रोटिओम में अभी भी कुछ अवशिष्ट बाहरी झिल्ली प्रोटीन होते हैं जो आयन चैनलों की अभिव्यक्ति और विश्लेषण पर पृष्ठभूमि की समस्याएं दे सकते हैं। ऐसे लक्ष्यों के लिए, एस 80-एस 100 लाइसेट के उपयोग की सिफारिश की जाती है। लाइसेट तैयारी के दौरान एक मूल्यवान संशोधन कोशिकाओं के मध्य-लॉग विकास चरण में संयुक्त गर्मी के झटके और इथेनॉल की आपूर्ति द्वारा एसओएस प्रतिक्रिया का प्रेरण है। परिणामस्वरूप एचएस 30 लाइसेट चैपरोन में समृद्ध होते हैं और बेहतर एमपी फोल्डिंग22 के लिए एस 30 लाइसेट के साथ मिश्रणों में उपयोग किया जा सकता है। ई कोलाई लाइसेट में सीएफ अभिव्यक्ति को टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ (टी 7 आरएनएपी) द्वारा नियंत्रित प्रमोटरों वाले डीएनए टेम्पलेट्स के साथ एक युग्मित प्रतिलेखन / अनुवाद प्रक्रिया के रूप में संचालित किया जाता है। एंजाइम को बीएल 21 (डीई 3) स्टार कोशिकाओं में कुशलतापूर्वक उत्पादित किया जा सकता है जो पीएआर 1219 प्लास्मिड29 ले जाते हैं।

MSP1E3D1 की दो प्रतियां 10-12 एनएम के व्यास के साथ एक नैनोडिस्क में इकट्ठा होती हैं, लेकिन नीचे वर्णित प्रोटोकॉल अन्य एमएसपी डेरिवेटिव के लिए भी काम कर सकता है। हालांकि, MSP1E3D1 के साथ गठित नैनोडिस्क की तुलना में बड़े नैनोडिस्क कम स्थिर होते हैं, जबकि MSP1 जैसे MSP डेरिवेटिव के साथ गठित छोटे नैनोडिस्क बड़े सांसदों या एमपी कॉम्प्लेक्स को समायोजित नहीं कर सकते हैं। MSP1E3D1 नैनोडिस्क को विभिन्न लिपिड या लिपिड मिश्रण की एक बड़ी विविधता के साथ विट्रो में इकट्ठा किया जा सकता है। पूर्वनिर्मित नैनोडिस्क आमतौर पर -80 डिग्री सेल्सियस पर > 1 वर्ष के लिए स्थिर होते हैं, जबकि स्थिरता विभिन्न लिपिड घटकों के लिए भिन्न हो सकती है। एक एमपी की तह और स्थिरता पर लिपिड प्रभावों की स्क्रीनिंग के लिए, लिपिड / लिपिड मिश्रण की प्रतिनिधि विविधता के साथ इकट्ठे नैनोडिस्क का एक व्यापक सेट तैयार करना आवश्यक है। निम्नलिखित लिपिड एक अच्छा प्रारंभिक चयन दे सकते हैं: 1,2-डाइमिस्टोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फो-(1'-आरएसी-ग्लिसरॉल) (डीएमपीजी), 1,2-डाइमिरस्टोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीएमपीसी), 1,2 डायलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फो-आरएसी-3-फॉस्फो-3-फॉस्फो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-पामिटोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (पीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (पीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (पीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (पीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (पीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (पीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी), 1-2-एलियोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी),

3 एमएल सीईसीएफ प्रतिक्रिया की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। 1: 1 अनुपात में आगे ऊपर या नीचे स्केलिंग संभव है। दो-कम्पार्टमेंट सीईसीएफ कॉन्फ़िगरेशन के लिए, सभी यौगिकों वाला एक आरएम और केवल कम आणविक भार वाले यौगिकों वाला एफएम तैयार किया जाना है। 10-14 केडीए एमडब्ल्यूसीओ के साथ वाणिज्यिक 3 एमएल डायलिसिस उपकरणों का उपयोग आरएम कंटेनर के रूप में किया जा सकता है, जिन्हें बाद में एफएम (चित्रा 1 डी) 30 रखने वाले कस्टम निर्मित प्लेक्सीग्लास कंटेनरों में रखा जाता है। RM: FM का अनुपात 1: 20 है, इसलिए 3 mL RM के लिए 60 mL FM तैयार किया जाना चाहिए। संश्लेषित MP की अंतिम उपज और / या गुणवत्ता के लिए कई घटकों की गुणवत्ता, एकाग्रता या प्रकार महत्वपूर्ण हो सकता है (तालिका 1)। डीएनए टेम्प्लेट प्रकाशित दिशानिर्देशों के अनुसार तैयार किए जाने चाहिए और लक्ष्य के रीडिंग फ्रेम के कोडन अनुकूलन से उत्पाद उपज में काफी सुधार हो सकताहै। प्रारंभिक पैमाने पर सीईसीएफ प्रतिक्रिया के लिए, पीआर के उत्पादन के लिए एक स्थापित प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। नए सांसदों के लिए अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए, उपज और गुणवत्ता में सुधार के लिए आमतौर पर कुछ यौगिकों (तालिका 1) के अनुकूलन स्क्रीन करना आवश्यक है। एमजी2 + आयनों के लिए, एक अच्छी तरह से केंद्रित एकाग्रता इष्टतम मौजूद है जो अक्सर विभिन्न डीएनए टेम्पलेट्स के लिए महत्वपूर्ण भिन्नता दिखाती है। अन्य सीएफ प्रतिक्रिया यौगिक जैसे कि टी 7 आरएनएपी या एस 30 लाइसेट के नए बैच इष्टतम एमजी2 + एकाग्रता को और बदल सकते हैं। एक उदाहरण के रूप में,14-24 mM एकाग्रता की सीमा के भीतर और 2 mM के चरणों में एक विशिष्ट Mg 2+ स्क्रीन का वर्णन किया गया है। प्रत्येक एकाग्रता डुप्लिकेट और विश्लेषणात्मक पैमाने पर सीईसीएफ प्रतिक्रियाओं में जांच की जाती है। सीईसीएफ प्रतिक्रिया कंटेनर के रूप में, आरएम को पकड़ने वाले कस्टम-निर्मित मिनी-सीईसीएफ प्लेक्सीग्लास कंटेनर30 का उपयोग एफएम (चित्रा 1 बी) को पकड़ने वाले मानक 24-वेल माइक्रोप्लेट्स के साथ संयोजन में किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, उचित सेटअप में 96-गहरे वेल माइक्रोप्लेट्स या अन्य वाणिज्यिक डायलाइज़र उपकरणों के साथ संयोजन में वाणिज्यिक डायलिसिस कारतूस का उपयोग किया जा सकता है (चित्रा 1 सी)।

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Protocol

1. एस 30 लाइसेट की तैयारी

  1. दिन 1: एलबी एगर प्लेट पर ग्लिसरॉल स्टॉक से कोशिकाओं को बाहर निकालें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. दूसरा दिन: आगर प्लेट से कोशिकाओं के साथ 200 एमएल एलबी माध्यम को टीका लगाएं और 12-14 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. तीसरा दिन: 10 लीटर बाँझ वाईपीटीजी माध्यम (10 ग्राम /एल खमीर निकालने, 16 ग्राम / एल ट्रिप्टोन, 5 ग्राम / एल एनएसीएल, 19.8 ग्राम / एल ग्लूकोज, 4.4 एमएम केएच2पीओ4, 8 एमएम के2एचपीओ4) को 100 एमएल प्री-कल्चर (1: 100) के साथ 15 एल हलचल टैंक रिएक्टर में 37 डिग्री सेल्सियस तक टेम्परेटेड किया गया। 37 डिग्री सेल्सियस, 500 आरपीएम और उच्च वातन (~ 3 वायु मात्रा प्रति मिनट) पर खेती करें। अत्यधिक फोमिंग को रोकने के लिए, बाँझ एंटीफोम जोड़ें।
  4. नियमित समय अंतराल में 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को मापें। लगभग 2 घंटे के बाद संस्कृति लॉग-चरण में प्रवेश करेगी।
  5. HS30 लाइसेट के लिए संशोधन: जब कोशिकाएं मध्य लॉग चरण (OD600 ≈ 3.6-4.2) में होती हैं, तो संस्कृति माध्यम में 300 मिलीलीटर इथेनॉल जोड़ें और 42 डिग्री सेल्सियस, 500 आरपीएम और उच्च वातन (लगभग 3 वायु मात्रा प्रति मिनट) पर खेती को आगे बढ़ाएं। फिर चरण 1.6 में वर्णित सेल संस्कृति के शीतलन और कटाई के साथ आगे बढ़ें। मानक एस 30 लाइसेट के उत्पादन के लिए, इस चरण को छोड़ दें और चरण 1.6 के साथ आगे बढ़ें।
  6. जब कोशिकाएं मध्य लॉग चरण (OD600 ≈ 3.6-4.2) में होती हैं, तो < 30 मिनट के भीतर 20 °C से नीचे ठंडा किण्वक होता है। अंतिम OD600 लगभग 4.5-5.5 होना चाहिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 4,500 x g पर कोशिकाओं को काटें और सुपरनैटेंट को त्याग दें। निम्नलिखित चरणों में कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: ठंडा होने के दौरान, अत्यधिक फोमिंग हो सकती है। इस मामले में, या तो एंटीफोम जोड़ें या सरगर्मी की गति को कम करें और / या बायोरिएक्टर में वायु प्रवाह को कम करें।
  7. एस 30-ए बफर (10 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8.2, 14 एमएम एमजी (ओएसी)2, 60 एमएम केसीएल, 6 एमएम 2-मर्काप्टोएथेनॉल) के 300 एमएल में कोशिकाओं को पूरी तरह से निलंबित करें, इसके बाद समरूपता तक निलंबन को ऊपर और नीचे करें। सेंट्रीफ्यूज 8,000 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। इस चरण को दो बार दोहराएं।
    चेतावनी: 2-मर्काप्टोएथेनॉल विषाक्त है। त्वचा या श्वसन पथ के संपर्क से बचें। यदि संभव हो, तो एक हुड के नीचे काम करें। अंतिम धोने के चरण से पहले खाली सेंट्रीफ्यूज बीकर का वजन करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, गीले सेल पेलेट का वजन करें और या तो चरण 1.8 के साथ आगे बढ़ें या आगे के उपयोग तक गोली को स्टोर करें।
    नोट: गीले सेल गोली का वजन 5-7 ग्राम प्रति 1 एल बायोरिएक्टर संस्कृति है। इस बिंदु पर प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है और गोली को तरल नाइट्रोजन में जमे हुए और 4-8 सप्ताह के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  8. एस 30-बी बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.2, 14 एमएम एमजी (ओएसी)2, 60 एमएम केओएसी, 1 एमएम डीटीटी, कोम्पलेट प्रोटीज इनहिबिटर की 1 गोली) के 1.1 वॉल्यूम (1 जी = 1 एमएल) में कोशिकाओं को अच्छी तरह से निलंबित करें। निलंबन को एक प्री-कूल्ड फ्रेंच प्रेस प्रेशर सेल में भरें और 1,000 पीएसआईजी पर कोशिकाओं को बाधित करें। कोशिकाओं को एक बार फ्रेंच प्रेस के माध्यम से पारित करें।
  9. लाइसेट को 30,000 x g पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को दोहराएं।
    नोट: पहले सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद गोली के शीर्ष पर एक ढीली और पतली परत मौजूद हो सकती है, जिसे सतह पर तैरने वाले के साथ स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए।
  10. अस्थिर लाइसेट घटकों को हटाने और राइबोसोम से एमआरएनए जारी करने के लिए एक उच्च नमक और गर्मी चरण लागू करें। लाइसेट को 0.4 एम एनएसीएल में समायोजित करें और पानी के स्नान में 45 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह कदम महत्वपूर्ण अवक्षेप गठन का कारण बनेगा। समय-समय पर इनक्यूबेशन के दौरान ट्यूब को पलटें या उलट दें।
  11. टर्बिड सस्पेंशन (आमतौर पर 50-80 एमएल) को 10-14 केडीए कटऑफ के साथ डायलिसिस ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 5 एल एस 30-सी बफर (10 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8.2, 14 एमएम एमजी (ओएसी) 2, 60 एमएम केओएसी, 0.5 एमएम डीटीटी) के खिलाफ डायलाइज करें। 2-3 घंटे के बाद एस 30-सी डायलिसिस बफर का आदान-प्रदान करें और 12-14 घंटे के लिए डायलाइज़ करें।
  12. चौथा दिन: डायलाइज्ड सस्पेंशन को सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 30,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट (एस 30 लाइसेट) को ताजा 50 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें और धीरे से मिलाएं। लाइसेट की प्रोटीन एकाग्रता लगभग 30-40 मिलीग्राम / एमएल होनी चाहिए। शॉक फ्रीज एलिकोट (जैसे 0.5 एमएल, 1 एमएल) तरल नाइट्रोजन में और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एलिकोट 1 वर्ष > लिए स्थिर हैं।

2. टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण

  1. दिन 1: 200 एमएल एलबी माध्यम जिसमें 100 μg/mL एम्पीसिलीन होता है, को ताजा प्लेटेड BL21 (DE3) स्टार x pAR1219 कोशिकाओं के साथ टीका लगाएं और 12-16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें।
  2. दूसरा दिन: 1 लीटर भयानक शोरबा (12 ग्राम / एल ट्रिप्टोन, 24 ग्राम / एल खमीर अर्क, 4 एमएल / एल ग्लिसरॉल) को 2 एल चकरा फ्लास्क में 10 एमएल प्री-कल्चर के साथ इंजेक्ट करें और 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम आंदोलन पर इनक्यूबेट करें। शुरुआती OD600 लगभग 0.1 होना चाहिए।
  3. जब OD600 0.6-0.9 तक पहुंच जाता है, तो T7RNAP अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 1 mM की अंतिम सांद्रता में IPTG जोड़ें और अगले 5 घंटे तक खेती जारी रखें।
  4. सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 4,500 x g पर कोशिकाओं की कटाई करें। तरल नाइट्रोजन में कोशिकाओं को फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  5. तीसरा दिन: जमे हुए सेल पेलेट में 30 एमएल आइस-कोल्ड सस्पेंशन बफर (30 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0 के साथ एक गोली को ओम्पलेट प्रोटीज इनहिबिटर) जोड़ें और कमरे के तापमान पर पानी के स्नान में गोली को पिघलाएं। फिर, समरूपता तक ऊपर और नीचे पाइप करके गोली को निलंबित करें।
  6. पिछले अनुभाग में वर्णित फ्रेंच प्रेस का उपयोग करके सेल व्यवधान करें या निर्माता की सिफारिशों के अनुसार सोनिकेशन डिवाइस का उपयोग करें। इसके बाद, सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 x g पर और एक ताजा ट्यूब में सतह पर तैरने वाला स्थानांतरित करता है।
  7. जीनोमिक डीएनए को अवक्षेपित करने के लिए, स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट को धीरे-धीरे और कोमल आंदोलन के तहत सुपरनैटेंट में जोड़ें जब तक कि 3% (डब्ल्यू / वी) की अंतिम एकाग्रता तक नहीं पहुंच जाती। कोमल आंदोलन के तहत 5-10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सेंट्रीफ्यूज 20,000 x g पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  8. सुपरनैटेंट को 0.45 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें और इसे 40 mL के कॉलम वॉल्यूम (CV) के साथ Q-Sepharose कॉलम पर लोड करें, जिसमें 2 CV संतुलन बफर (30 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% ग्लिसरॉल और 10 mM 2-mercaptoethanol) के साथ 4 mL/min की प्रवाह दर पर होता है। फिर, कॉलम को यूवी डिटेक्टर से कनेक्ट करें और 280 एनएम पर यूवी सिग्नल एक स्थिर बेसलाइन तक पहुंचने तक संतुलन बफर के साथ क्षालन जारी रखें।
  9. 3 एमएल /मिनट की प्रवाह दर पर 50 mM से 500 mM NaCl प्रति CV तक ढाल के साथ Elute T7RNAP। 1 एमएल अंश एकत्र करें और 2 x एसडीएस नमूना बफर के साथ प्रत्येक अंश के 10 μL को मिलाकर एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करें। एसडीएस-पेज चलाएं और जेल को कूमासी ब्लू आर टी 7आरएनएपी के साथ दाग दें, अशुद्धियों के कई अतिरिक्त बैंड के साथ लगभग 90 केडीए पर एक प्रमुख बैंड के रूप में दिखाई देना चाहिए।
  10. पूल अंश जिसमें टी7आरएनएपी होता है और डायलिसिस बफर में 12-16 घंटे के लिए 12-14 केडीए एमडब्ल्यूसीओ के साथ झिल्ली का उपयोग करके डायलाइज होता है (10 एमएम के2एचपीओ4/केएच2पीओ4, पीएच 8.0, 10 एमएम एनएसीएल, 0.5 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम डीटीटी, 5% (डब्ल्यू / वी) ग्लिसरॉल)।
  11. चौथा दिन: टी 7 आरएनएपी समाधान एकत्र करें और 12-14 एमडब्ल्यूसीओ के साथ फ़िल्टर इकाइयों का उपयोग करके 3-10 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर ध्यान केंद्रित करें। टी 7 आरएनएपी एकाग्रता के दौरान अवक्षेपित होना शुरू कर सकता है। जैसे ही नमूने में टर्बिडिटी होती है, एकाग्रता तुरंत बंद कर दें। ग्लिसरॉल को 50% (w/v) की अंतिम सांद्रता में जोड़ें और धीरे से मिलाएं। शॉक-फ्रीज 0.5-1 एमएल एलिकोट और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। काम करने वाले टी 7 आरएनएपी एलिकोट को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: 20,000-40,000 इकाइयों के साथ 5 मिलीग्राम / एमएल के लगभग 20-40 एमएल आंशिक रूप से शुद्ध टी 7आरएनएपी को 1 एल किण्वन से प्राप्त किया जाना चाहिए। प्रत्येक टी 7 आरएनएपी बैच की इष्टतम मात्रा का परीक्षण करने के लिए, तैयार टी 7 आरएनएपी नमूने के 0.02 मिलीग्राम / एमएल -0.1 मिलीग्राम / एमएल युक्त हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की सीएफ अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया जाना चाहिए।

3. MSP1E3D1 की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण

  1. दिन 1: मानक हीट शॉक परिवर्तन या इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल का उपयोग करके ई कोलाई बीएल 21 (डीई 3) स्टार कोशिकाओं को पीईटी 28 (ए) -एमएसपी1 ई 3 डी 1 वेक्टर 31 के साथ बदलें। एलबी एगर पर स्ट्रीक आउट या प्लेट रूपांतरित कोशिकाएं जिसमें 30 μg / mL kanamycin होता है और 12-16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट होता है।
  2. दूसरा दिन: 200 एमएल एलबी माध्यम को 0.5% (डब्ल्यू / वी) ग्लूकोज और 30 μg / mL kanamycin के साथ पूरक किया जाता है, जिसमें एगर प्लेट से उठाया जाता है और 12-16 घंटे के लिए 180 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है।
  3. तीसरा दिन: 10 एल एलबी माध्यम को 0.5% (डब्ल्यू / वी) ग्लूकोज और 30 μg / mL kanamycin के साथ एक हलचल-टैंक बायोरिएक्टर में पूर्व-संस्कृति के 100 एमएल के साथ पूरक किया जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस, 500 आरपीएम पर किण्वन और प्रति मिनट लगभग 3 बायोरिएक्टर वॉल्यूम का वातन करें। अत्यधिक फोमिंग के मामले में, एंटीफोम जोड़ें।
    नोट: किण्वक के बजाय चकित हिलाने वाले फ्लास्क का उपयोग किया जा सकता है।
  4. 6.5-7.5 के OD600 पर, IPTG को 1 mM की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 °C पर इनक्यूबेशन जारी रखें। सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 4,500 x g पर कोशिकाओं की कटाई करें। सेल छर्रों को 0.9% (w/v) NaCl के 200 mL के साथ धोएं और सेंट्रीफ्यूज को फिर से 8,000 x g पर 4 °C पर 10 मिनट के लिए धोएं। सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और स्पैटुला का उपयोग करके कोशिकाओं को 50 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। अपेक्षित गीला गोली वजन बायोरिएक्टर कल्चर के प्रति एल 8-12 ग्राम है। तरल नाइट्रोजन में शॉक-फ्रीज सेल छर्रों को स्टोर करें और आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।
  5. चौथा दिन: शुद्धिकरण के लिए, आरटी में पानी के स्नान में सेल छर्रों को पिघलाएं। एमएसपी-ए बफर (40 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0, 300 एमएम एनएसीएल, 1% (डब्ल्यू / वी) ट्राइटन एक्स -100, 1 टैबलेट सी0एमपीलेट प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल प्रति 50 एमएल सेल सस्पेंशन) में कोशिकाओं को निलंबित करें ताकि 30-40% (डब्ल्यू / वी) सेल निलंबन प्राप्त हो सके।
  6. सोनिकेशन द्वारा या 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 30,000 x g पर फ्रेंच प्रेस और सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके कोशिकाओं को बाधित करें। सुपरनैटेंट को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और 0.45 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। एक पेरिस्टालिक पंप का उपयोग करके एनआई2 + लोडेड नाइट्रिलोट्रिएसेटिक एसिड कॉलम (सीवी > 15 एमएल) पर फिल्ट्रेट लागू करें, जो एमएसपी-बी बफर (40 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8.0, 300 एमएम एनएसीएल, 1% (डब्ल्यू / वी) ट्राइटन एक्स -100) के 5 सीवी के साथ समतुल्य है।
    नोट: निस्पंदन की सुविधा के लिए, बड़े डीएनए टुकड़ों को तोड़ने के लिए सुपरनैटेंट को एक और मिनट के लिए सोनिकेट किया जा सकता है।
  7. नमूना लोडिंग के बाद, कॉलम को 5 सीवी एमएसपी-बी, 5 सीवी एमएसपी-सी (40 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8.9, 300 एमएम एनएसीएल, 50 एमएम कोलिक एसिड), 5 सीवी एमएसपी-डी (40 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.9, 300 एमएम एनएसीएल), 5 एमएसपी सीवी-ई (40 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8.0, 300 एमएम एनएसीएल) और 5 एमएम एमएसपी-एफ (40 एमएम) के साथ धोएं। 300 mM NaCl, 50 mM imidazole)।
    नोट: एमएसपी-सी बफर में कोलिक एसिड एमएसपी से जुड़े लिपिड को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है। कोलिक एसिड कम पीएच मानों पर पूरी तरह से घुलनशील नहीं है। इसलिए एमएसपी-सी और एमएसपी-डी में पीएच वैल्यू को 8.9 में समायोजित किया जाना चाहिए। कॉलम को एमएसपी-डी बफर के साथ धोना महत्वपूर्ण है, क्योंकि कम पीएच अवशिष्ट कोलिक एसिड को अवक्षेपित करने और कॉलम को अवरुद्ध या नुकसान पहुंचाने का कारण बन सकता है।
  8. एमएसपी-जी (40 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8.0, 300 एमएम एनएसीएल, 300 एमएम इमिडाज़ोल) के साथ न्यूनतम समर्थन मूल्य। 1 एमएल के अंश एकत्र करें और 280 एनएम पर यूवी अवशोषण की निगरानी करें। क्षालन शिखर के अंशों को इकट्ठा और पूल करें।
  9. एमएसपी अंशों को 12-14 केडीए एमडब्ल्यूसीओ डायलिसिस झिल्ली ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे के लिए एमएसपी-एच (40 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8.0, 300 एमएम एनएसीएल, 10% (डब्ल्यू / वी) ग्लिसरॉल) के 5 एल के खिलाफ डायलाइज करें। ताजा 5 एल एमएसपी-एच बफर में बदलें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए डायलाइज करें।
  10. पांचवां दिन: अवक्षेप को हटाने के लिए 30 मिनट के लिए 18,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों और सेंट्रीफ्यूज में एमएसपी समाधान स्थानांतरित करें। एक ताजा ट्यूब में सतह पर तैरने वाला स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 12-14 केडीए एमडब्ल्यूसीओ के साथ अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपकरणों का उपयोग करके 200-800 μM पर ध्यान केंद्रित करें। यूवी / वीआईएस मापने वाले उपकरण का उपयोग करके एकाग्रता को मापें। एकाग्रता की गणना के लिए 27.31 एम -1 सेमी -1 के विलोपन गुणांक और 31.96 केडीए के आणविक द्रव्यमान का उपयोग करें।
    नोट: एक बायोरिएक्टर में अभिव्यक्ति आमतौर पर प्रति एल संस्कृति में 15-30 मिलीग्राम एमएसपी 1 ई 3 डी 1 उत्पन्न करती है।
  11. तरल नाइट्रोजन में केंद्रित एमएसपी समाधान के शॉक-फ्रीज एलिकोट और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. MSP1E3D1 नैनोडिस्क की असेंबली

  1. दिन 1: 100 एमएम सोडियम कोलेट में 50 एमएम लिपिड स्टॉक (डीएमपीजी, डीओपीजी, पीओपीजी डीएमपीसी, डीओपीसी या पीओपीसी) के 1-2 एमएल तैयार करें। यदि उसी दिन उपयोग नहीं किया जाता है तो -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: लिपिड समाधान स्पष्ट होना चाहिए। यदि समाधान स्पष्ट नहीं है, तो सोडियम कोलेट एकाग्रता 150 एमएम तक बढ़ाई जा सकती है।
  2. MSP1E3D1 समाधान को लिपिड समाधान के साथ मिलाएं। 0.1% (w/v) की अंतिम सांद्रता पर डोडेसिल फॉस्फोकोलाइन (DPC) जोड़ें। असेंबली प्रतिक्रियाओं को डायलिसिस कैसेट्स (10 केडीए एमडब्ल्यूसीओ) की विशिष्ट मात्रा के अनुरूप 3 एमएल (तालिका 2) या 12 एमएल के अंतिम संस्करणों में समायोजित किया जा सकता है। कोमल आंदोलन के तहत 21 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए असेंबली प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्रत्येक लिपिड के लिए, सजातीय नैनोडिस्क तैयारी सुनिश्चित करने के लिए एक विशिष्ट MSP1E3D1: लिपिड अनुपात का उपयोग किया जाना चाहिए (तालिका 2)। नए लिपिड या लिपिड मिश्रण के लिए, इष्टतम अनुपात एक पायलट प्रयोग और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण14 के साथ निर्धारित किया जाना चाहिए।
  3. डिस्क गठन (डीएफ) बफर (10 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8.0, 100 एमएम एनएसीएल) के साथ डायलिसिस कैसेट की झिल्ली को पूर्व-गीला करें। असेंबली मिश्रण को सिरिंज के साथ डायलिसिस कैसेट में स्थानांतरित करें। सिरिंज का उपयोग करके आकांक्षा द्वारा संभावित हवा के बुलबुले को हटाया जा सकता है।
  4. दिन 1-4: एक उत्तेजक पट्टी का उपयोग करके आंदोलन के तहत आरटी में 10-20 घंटे के लिए 3 x 5 एल डीएफ बफर के खिलाफ डायलाइज़ करें। फिर डायलिसिस कैसेट से असेंबली मिश्रण को डीएफ बफर के साथ 10 केडीए एमडब्ल्यूसीओ के साथ केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 4,000 x g पर ध्यान केंद्रित करें।
    नोट: एक टर्बिड डायलिसिस मिश्रण एमएसपी: लिपिड के गलत स्टोइकोमेट्रिक अनुपात का संकेत दे सकता है। नमूने की एकाग्रता से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 18,000 x g पर अवक्षेप को हटा दिया जाना चाहिए। नमूना एकाग्रता के दौरान वर्षा से बचने के लिए, एक बड़े डेडस्टॉप के साथ अल्ट्राफिल्ट्रेशन इकाइयों का उपयोग करें।
  5. इकट्ठे नैनोडिस्क को कम से कम 300 μM की एकाग्रता पर केंद्रित करें। यूवी / वीआईएस रीडर का उपयोग करके एकाग्रता को मापें। विचार करें कि एक नैनोडिस्क दो MSP1E3D1 अणुओं द्वारा बनता है और इस प्रकार, नैनोडिस्क की सही मात्रा निर्धारित करने के लिए MSP की एकाग्रता को 2 से विभाजित किया जाना चाहिए।
    नोट: वर्णित सेटअप (तालिका 2) 300 μM नैनोडिस्क समाधान के 0.6-1 एमएल का उत्पादन करेगा।
  6. अवक्षेप को हटाने के लिए 20 मिनट के लिए 18,000 x g पर केंद्रित नैनोडिस्क तैयारी को सेंट्रीफ्यूज करें। फिर, सतह पर तैरने वाले और शॉक-फ्रीज 50 μL एलिकोट को तरल नाइट्रोजन में रखें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके नैनोडिस्क गठन की सफलता का मूल्यांकन करना उचित है। नमूना मोनोस्प्रेट होना चाहिए और इसमें केवल कम मात्रा में समुच्चय होना चाहिए। समुच्चय इंगित करते हैं कि सेटअप में लिपिड की मात्रा बहुत अधिक है। एक संदर्भ के रूप में, शुद्ध MSP1E3D1 का उपयोग किया जा सकता है। यदि नैनोडिस्क तैयारी संदर्भ एमएसपी 1 ई 3 डी 1 शिखर की ऊंचाई पर एक शिखर दिखाती है, तो चुने हुए लिपिड से एमएसपी 1 ई 3 डी 1 अनुपात बहुत कम था।

5. प्रीपेरेटिव स्केल 3 एमएल सीईसीएफ प्रतिक्रिया सेटअप

  1. दिन 1: सूचीबद्ध के रूप में सभी आवश्यक स्टॉक समाधान तैयार करें (तालिका 3)। स्टॉक को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है और कमरे के तापमान पर पिघलाया जाता है। पिघलने के बाद और पाइपिंग से पहले सभी स्टॉक को अच्छी तरह से मिलाना सुनिश्चित करें। सभी स्टॉक के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें और एक पाइपलाइन योजना बनाएं (तालिका 4)। उच्च आणविक भार यौगिकों को केवल आरएम में जोड़ा जाएगा। कम आणविक भार यौगिकों के लिए, आरएम और एफएम के लिए एक संयुक्त 3 एक्स मास्टरमिक्स तैयार किया जा सकता है।
    नोट: मिश्रण के दौरान मात्रा हानि के कारण यौगिक मिश्रण की अंतिम मात्रा गणना से कम हो सकती है। वॉल्यूम लॉस की भरपाई के लिए 2-5% की अतिरिक्त मात्रा जोड़कर इससे बचा जा सकता है।
  2. 100 एमएम ट्राइस-एसीटेट, पीएच 8.0 में 3 एमएल डायलिसिस कैसेट की झिल्ली को बराबर करें। अतिरिक्त बफर को हटाना सुनिश्चित करें।
  3. डायलिसिस कैसेट में आरएम को स्थानांतरित करने के लिए सिरिंज का उपयोग करना। सिरिंज के साथ आकांक्षा करके आरएम डिब्बे में अत्यधिक हवा निकालें। डायलिसिस कैसेट को डायलिसिस कक्ष में रखें।
  4. 60 एमएल एफएम के साथ डायलिसिस कक्ष भरें। कक्ष पर ढक्कन रखें और इसे ठीक करने के लिए शिकंजा कसें। 200 आरपीएम पर 30 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए कक्ष को इनक्यूबेट करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि आंदोलन के दौरान कक्ष सीधी स्थिति में रहता है, अन्यथा कम आणविक यौगिकों का आदान-प्रदान बाधित होगा।
  5. दूसरा दिन: एक सिरिंज का उपयोग करके, डायलिसिस कक्ष से आरएम को एस्पिरेट करें। अवक्षेप को हटाने के लिए आरएम को ताजा ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को ताजा ट्यूबों में स्थानांतरित करें। सुपरनैटेंट में प्रोटीन का अब और विश्लेषण किया जा सकता है।
    नोट: कुछ मामलों में, सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद एक गोली मौजूद होगी। यह संश्लेषित एमपी घुलनशील रखने के लिए विश्लेषण किए गए नैनोडिस्क या प्रतिक्रिया यौगिकों की उपयुक्तता पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है। इसलिए एसडीएस-पेज, वेस्टर्न ब्लॉट, या गोली के आकार के दृश्य मूल्यांकन का उपयोग करके अवक्षेप में संभावित रूप से मौजूद लक्ष्य की मात्रा का विश्लेषण करना उचित है।

6. एमजी2 + आयन स्क्रीनिंग के लिए विश्लेषणात्मक पैमाने 60 μL CECF प्रतिक्रिया सेटअप

  1. दिन 1: संबंधित 3x मास्टर मिश्रण के सभी घटकों को मिलाएं और RM में 60 μL और FM में 825 μL वितरित करें। FM कोH2O के साथ भरें और भंवर द्वारा FM मिलाएं। एफएम को 24 वेल माइक्रोप्लेट के 3 कुओं में स्थानांतरित करें (तालिका 5)।
    नोट: चूंकि अनुकूलित मिनी-सीईसीएफ कंटेनर सुलभ नहीं हो सकता है, इसलिए तालिका 5 में वॉल्यूम की गणना डायलिसिस कारतूस (10-14 केडीए एमडब्ल्यूसीओ, आरएम: 100 μL) में की गई प्रतिक्रिया के लिए की जाती है, जिसमें 96 गहरे-वेल (2 एमएल) प्लेटों में 1.7 एमएल की एफएम मात्रा होती है (चित्रा 1)।
  2. 10-14 केडीए एमडब्ल्यूसीओ के साथ पुनर्जीवित सेल्यूलोज डायलिसिस ट्यूबों को लगभग 25 x 20 मिमी आकार के टुकड़ों में काटें और 0.05% (डब्ल्यू / वी) सोडियम एज़ाइड के साथ एच2ओ में स्टोर करें।
    चेतावनी: सोडियम एज़ाइड बहुत विषाक्त है। त्वचा या श्लेष्म झिल्ली के साथ किसी भी संपर्क से बचें। धातु के कंटेनरों का उपयोग न करें क्योंकि सोडियम एज़ाइड विस्फोटक धातु एज़ाइड बनाने के लिए धातुओं के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है।
  3. मिनी-सीईसीएफ कंटेनर असेंबली से पहले, एक ऊतक के साथ डायलिसिस झिल्ली से अत्यधिक एच2ओ हटा दें। प्रत्येक कंटेनर पर एक झिल्ली का टुकड़ा रखें और एक पॉलीटेट्राफ्लोरेथिलीन रिंग के साथ झिल्ली को ठीक करें।
  4. मिनी-सीईसीएफ कंटेनर को 825 μL FM के साथ 24-वेल प्लेट के कुओं में स्थानांतरित करें। मिनी-CECF कंटेनर के डायलिसिस झिल्ली के नीचे हवा के बुलबुले से बचें।
  5. वर्णित आरएम में उच्च आणविक घटक जोड़ें (तालिका 5) और ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। प्रतिक्रिया कंटेनर में 60 μL जोड़ें। चिपचिपे घोल के हस्तांतरण के दौरान हवा के बुलबुले से बचें।
  6. सीलिंग थर्मोप्लास्टिक फिल्म की 2 8 x 10 सेमी शीट काटें और उन्हें अंदर प्रतिक्रिया कंटेनरों के साथ 24-वेल प्लेट के चारों ओर लपेटें। यह प्रतिक्रिया मिश्रण से वाष्पीकरण को कम करेगा। अब प्लेट पर सेल कल्चर प्लेट का ढक्कन रखें और इसे टेप से ठीक करें। प्लेट को 30 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर 12-16 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. दूसरा दिन: मिनी-सीईसीएफ कंटेनर में पिपेट टिप के साथ डायलिसिस झिल्ली के माध्यम से छेदकर प्रतिक्रिया मिश्रण को काटें और आरएम को ताजा ट्यूबों में स्थानांतरित करें और अवक्षेप को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज स्थानांतरित करें। सतह पर तैरने वाले को ताजा ट्यूबों में स्थानांतरित करें। सुपरनैटेंट में प्रोटीन का अब और विश्लेषण किया जा सकता है।
    नोट: कुछ मामलों में, सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद एक गोली मौजूद होगी। यह संश्लेषित एमपी घुलनशील रखने के लिए विश्लेषण किए गए नैनोडिस्क या अन्य प्रतिक्रिया यौगिकों की उपयुक्तता पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है। इसलिए एसडीएस-पेज, वेस्टर्न ब्लॉट, या गोली के आकार के दृश्य मूल्यांकन द्वारा अवक्षेप में संभावित रूप से मौजूद लक्ष्य की मात्रा का विश्लेषण करना उचित है।

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Representative Results

संश्लेषित सांसदों की अंतिम उपज या गुणवत्ता पर प्रतिक्रिया यौगिकों को ठीक करने का प्रभाव उदाहरण दिया गया है। एक लगातार नियमित दृष्टिकोण सिस्टम दक्षता के सुविधाजनक मॉनिटर के रूप में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की अभिव्यक्ति द्वारा सीएफ प्रतिक्रियाओं में इष्टतम एमजी2 + एकाग्रता को समायोजित करना है। एक उदाहरण के रूप में, जीएफपी को 14 और 24 एमएम (चित्रा 2) के बीच एमजी2 + सांद्रता पर पीईटी -21 ए (+) वेक्टर से संश्लेषित किया गया था। एसडीएस-पेज विश्लेषण ने20 एमएम (चित्रा 2 ए) पर इष्टतम एमजी 2 + एकाग्रता की पहचान की, जो सीएफ प्रतिक्रिया सुपरनैटेंट (चित्रा 2 बी) के पूरक प्रतिदीप्ति माप (485 एनएम पर उत्तेजना, 535 एनएम पर उत्सर्जन माप) के अनुसार है। PIVEX 2.3 वेक्टर से व्यक्त बैक्टीरियल पीआर की सीएफ अभिव्यक्ति और pET-21a (+) वेक्टर से व्यक्त टर्की β1एड्रीनर्जिक रिसेप्टर (T1 AR) के लिए, इष्टतम Mg2+ एकाग्रता की पहचान 20-22 mM पर की गई थी।

एक और उदाहरण के रूप में, वर्णित रणनीति के साथ संश्लेषित सांसदों का गुणवत्ता शोधन दिखाया गया है। पूर्वनिर्मित नैनोडिस्क में सांसदों के सह-ट्रांसलेशनल सम्मिलन के लिए असमर्थ पैरामीटर हैं (i) नैनोडिस्क झिल्ली की लिपिड संरचना और (ii) प्रतिक्रिया में अंतिम नैनोडिस्क एकाग्रता। यह सर्वविदित है कि हाइड्रोफोबिक वातावरण सांसदों की सही तह, ओलिगोमेरिक असेंबली और स्थिरता के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। चूंकि नैनोडिस्क में लिपिड संरचना को संशोधित किया जा सकता है, वर्णित दृष्टिकोण एक एमपी की संरचना और कार्य पर लिपिड प्रभावों की एक सीधी व्यवस्थित जांच को सक्षम बनाता है। प्रारंभिक प्रयोगों में, फॉस्फेटिडिलकोलाइन (पीसी) और फॉस्फेटिडिलग्लिसरॉल (पीजी) हेडग्रुप के साथ लिपिड को स्क्रीन करने और विभिन्न श्रृंखला लंबाई और संतृप्ति का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। दो अलग-अलग सांसदों की घुलनशीलता दक्षता और गुणवत्ता पर झिल्ली संरचना और नैनोडिस्क एकाग्रता का प्रभाव दिखाया गया है। पीआर एक हल्का सक्रिय प्रोटॉन पंप है और एक बहुत ही स्थिर और अत्यधिक संश्लेषित एमपी है जो आरएम में > 100 μM की अंतिम सांद्रता तक पहुंचता है। इस प्रकार, सही प्रतिक्रिया सेटअप सुनिश्चित करने के लिए इसे सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि आरएम सुपरनैटेंट में 530 एनएम पर अवशोषण के माप द्वारा पीआर एकाग्रता का आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है। इसके विपरीत,टी 1एआर यूकेरियोटिक जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) के बड़े परिवार का एक उदाहरण है और एक जटिल और अस्थिर एमपी है। सुविधाजनक निगरानी के लिए, एक टी1एआर-जीएफपी संलयन निर्माण को संश्लेषित किया गया था और सीएफ प्रतिक्रियाओं में नैनोडिस्क घुलनशील रिसेप्टर की कुल एकाग्रता जीएफपी फ्लोरेसेंस (चित्रा 3 ए) के माध्यम से निर्धारित की गई थी। कार्यात्मक रूप से मुड़े हुए और लिगैंड-बाइंडिंग सक्रिय रिसेप्टर के अंश को फ़िल्टर बाइंडिंग परख और लेबल लिगैंड [3एच]-डायहाइड्रोएल्प्रेनोलोल (चित्रा 3 बी) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। फ़िल्टर बाइंडिंग परख पहलेवर्णित 14 के रूप में किया गया था। संक्षेप में, आरएम में टी1एआर-जीएफपी एकाग्रता को इसकी प्रतिदीप्ति के माध्यम से निर्धारित किया गया था। जीपीसीआर को 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए रेडियोलेबल लिगैंड के साथ इनक्यूबेट किया गया था, एक फिल्टर पर लागू किया गया था, और अनबाउंड लिगैंड को धोया गया था। अस्पष्ट [3एच]-डायहाइड्रोएल्प्रोनोलोल बाइंडिंग के निर्धारण के लिए, रिसेप्टर को एक नियंत्रण प्रतिक्रिया में बिना लेबल वाले एल्प्रेनोलोल के साथ संतृप्त किया गया था। फिल्टर में रेडियोधर्मी लिगैंड की गिनती को एक सिंटिलेशन काउंटर में मापा गया था और बाध्य लिगैंड की मात्रा इसकी विशिष्ट लेबल गतिविधि के माध्यम से निर्धारित की गई थी। प्रतिशत जीपीसीआर बाइंडिंग गतिविधि की गणना तब बाध्य लिगैंड की मात्रा, टी1एआर-जीएफपी एकाग्रता और परख मात्रा से की गई थी। टी1 एआर-जीएफपी का समग्र संश्लेषण और नैनोडिस्क घुलनशीलता सभी विश्लेषणकी गई झिल्ली रचनाओं के साथ और 8-13 μM (चित्रा 3 ए) की सीमा के भीतर समान है। इसके विपरीत, संश्लेषित जीपीसीआर की गुणवत्ता में बहुत अधिक भिन्नता का पता लगाया जा सकता है। 10% से कम सक्रिय अंश के साथ सबसे कम गतिविधि लिपिड डीएमपीसी और पीओपीसी के साथ प्राप्त की जाती है। डीओपीजी और पीओपीजी के साथ,टी1एआर-जीएफपी के सक्रिय अंश को लगभग 30% तक बढ़ाया जा सकता है (चित्रा 3 बी)। परिणाम बताते हैं कि लिपिड हेडग्रुप के चार्ज के साथ-साथ फैटी एसिड श्रृंखला का लचीलापन इस जीपीसीआर की तह और गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण मॉड्यूलेटर हैं।

नैनोडिस्क संरचना के अलावा, सीएफ प्रतिक्रिया में उनकी अंतिम एकाग्रता एमपी गुणवत्ता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हो सकती है। एक बार नैनोडिस्क की एक उपयुक्त झिल्ली संरचना की पहचान हो जाने के बाद, एमपी संश्लेषण के दौरान इसकी एकाग्रता की जांच की जानी चाहिए। यह स्पष्ट है कि नैनोडिस्क एकाग्रता को एक सांसद की अभिव्यक्ति दक्षता के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता है। टी1एआर-जीएफपी रिसेप्टर और पीआर के सीएफ संश्लेषण के परिणामस्वरूप क्रमशः आरएम में लगभग 10 μM और 100 μM की अंतिम सांद्रता होती है। यदि नैनोडिस्क सांद्रता को 3.75-60 μM की सीमा के भीतर जांचा जाता है, तो GPCR का पूर्ण घुलनशीलता लगभग 30 μM नैनोडिस्क पर प्राप्त की जाती है, जिससे1: 3 के T1 AR: nanodisc का अनुपात मिलता है (चित्रा 4A)। इसके विपरीत, पीआर का पूर्ण घुलनशीलीकरण पहले से ही लगभग 10 μM नैनोडिस्क के साथ हासिल किया जाता है और 10: 1 का पीआर: नैनोडिस्क अनुपात देता है (चित्रा 4 बी)। इसलिएटी1एआर-जीएफपी के लगभग पूर्ण घुलनशीलीकरण को प्राप्त करने के लिए नैनोडिस्क की अधिकता आवश्यक है, जबकि पीआर के मामले में एक उलटा अनुपात एक नैनोडिस्क में कई पीआर प्रतियों के सम्मिलन को इंगित करता है। देशी मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ शुद्ध पीआर / नैनोडिस्क कॉम्प्लेक्स के बाद के अध्ययनों ने इस अवलोकन की पुष्टि की और कम नैनोडिस्क सांद्रता15,18 पर संश्लेषित होने पर पीआर के उच्च ओलिगोमेरिक रूपों का प्रसार पाया। नैनोडिस्क के साथ सीएफ संश्लेषित सांसदों के अनुमापन का उपयोग इसलिए ऑलिगोमेरिक असेंबली को ट्रिगर करने और एमपी फ़ंक्शन पर उनके प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: नैनोडिस्क में झिल्ली प्रोटीन के सम्मिलन के लिए सीईसीएफ अभिव्यक्ति रणनीति। (ए) प्रक्रिया के प्रमुख चरणों को दर्शाते हुए मूल वर्कफ़्लो। (बी) सीईसीएफ अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित विश्लेषणात्मक पैमाने प्रतिक्रिया वाहिकाएं। (ग) विश्लेषणात्मक पैमाने पर सीईसीएफ सेटअप के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डायलिसिस कारतूस। (डी) प्रीपेरेटिव स्केल सेटअप (3 एमएल आरएम) जिसमें 3 एमएल डायलिसिस कैसेट और एक अनुकूलित प्लेक्सीग्लास एफएम कंटेनर शामिल है। (ई) सीईसीएफ विन्यास में पूर्वनिर्मित नैनोडिस्क और लिपिड स्क्रीनिंग में सांसदों का सह-ट्रांसलेशनल सम्मिलन। आरएम में आवश्यक प्रतिलेखन / अनुवाद मशीनरी और नैनोडिस्क होते हैं जबकि कम आणविक भार यौगिक दोनों डिब्बों में मौजूद होते हैं। नैनोडिस्क नमूनों के जैव रासायनिक और संरचनात्मक अनुप्रयोगों को आगे चित्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सीएफ जीएफपी संश्लेषण पर विभिन्न एमजी2 + सांद्रता का प्रभाव। जीएफपी को 14-24 एमएम की सीमा के भीतर एमजी2 + सांद्रता के साथ सीएफ प्रतिक्रियाओं में संश्लेषित किया गया था। (ए) एसडीएस-पेज विश्लेषण 20 एमएम एमजी 2 + पर जीएफपी का सबसे मजबूत बैंडदिखाता है। एम: मार्कर। (बी) विभिन्न एमजी2 + सांद्रता के साथ सीएफ अभिव्यक्ति के बाद जीएफपी प्रतिदीप्ति। 20 mM Mg 2+ पर अधिकतम GFP प्रतिदीप्ति 4.6 mg / mL से मेल खाती है। त्रुटि पट्टियाँ डुप्लिकेट माप के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सीएफ संश्लेषित जीपीसीआर के घुलनशीलता और गुणवत्ता पर नैनोडिस्क झिल्ली संरचना का प्रभाव। विभिन्न झिल्ली रचनाओं वाले 30 μM नैनोडिस्क की उपस्थिति में संश्लेषित T1 AR-GFP की उपज और गतिविधि। कुल संश्लेषित प्रोटीन (ए) और लिगैंड-बाइंडिंग सक्रिय रिसेप्टर (बी) का अंश μM में दिया गया है। कुल एकाग्रता GFP संलयन के प्रतिदीप्ति माप के माध्यम से निर्धारित की गई थी। गतिविधि को रेडियोलेबल लिगैंड [3एच]-डायहाइड्रोएल्प्रेनोलोल के साथ फ़िल्टर बाइंडिंग परख के माध्यम से मापा गया था। त्रुटि पट्टियाँ स्वतंत्र तीन प्रतियों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. पहले प्रकाशित पांडुलिपि14 से लिया गया डेटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: बढ़ती नैनोडिस्क सांद्रता के साथ सीएफ संश्लेषित सांसदों की घुलनशीलता स्क्रीन। सांसदों को 3.75-60 μM की सीमा के भीतर आपूर्ति किए गए नैनोडिस्क की उपस्थिति में संश्लेषित किया गया था। कुल एकाग्रता जीएफपी संलयन के प्रतिदीप्ति माप के माध्यम से निर्धारित की गई थी। पहले प्रकाशित पांडुलिपि14 से लिया गया डेटा। एफिनिटी-टैग शुद्ध नमूनों का विश्लेषण एसडीएस-पेज द्वारा किया गया था और कूमासी-ब्लू स्टेनिंग लगभग 50 केडीए पर टी1एआर-जीएफपी और 25 केडीए (बी) से ऊपर एमएसपी 1 ई 3 डी 1 के अनुरूप दो प्रमुख बैंड दिखाता है। पीआर की कुल एकाग्रता 530 एनएम पर अवशोषण माप के माध्यम से निर्धारित की गई थी। पहले प्रकाशित पांडुलिपि10,18 से लिया गया डेटा। तस्वीरें मुड़े हुए पीआर की उपस्थिति के कारण अंतिम प्रतिक्रियाओं के लाल रंग को दिखाती हैं। पिक्टोग्राम नैनोडिस्क सांद्रता में वृद्धि पर कम ऑलिगोमेरिक अनुरूपता की ओर मॉड्यूलेटेड पीआर असेंबली को चित्रित करते हैं, जैसा कि बाद में देशी मास स्पेक्ट्रोमेट्री18 द्वारा पता चला है। एफिनिटी-टैग शुद्ध नमूनों का विश्लेषण एसडीएस-पेज द्वारा किया गया था और कूमासी-ब्लू स्टेनिंग पीआर के अनुरूप दो प्रमुख बैंड दिखाता है जो लगभग 20 केडीए और एमएसपी 1 ई 3 डी 1 25 केडीए से ऊपर है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यौगिक अंतिम एकाग्रता सीमा एमपी नमूने पर प्रभाव
Mg2+ 10 - 30 mM उपज
DTT 1 - 20 mM डाइसल्फ़ाइड पुल का निर्माण, तह
20 अमीनो एसिड मिश्रण1 0.2 – 2 mM उपज
GSSG : GSH2 (1-10 μM) : (1-10 μM) डाइसल्फ़ाइड पुल का निर्माण, तह
नैनोडिस्क 10 - 100 μM घुलनशीलता, ओलिगोमेरिक असेंबली, फोल्डिंग
लिपिड प्रकार घुलनशीलता, ओलिगोमेरिक असेंबली, फोल्डिंग
S30 : HS30 लाइसेट3 (50-100 %) : (50-100 %) तह
S12 - S100 20 – 50 % चैनल परख में उपज, एमपी पृष्ठभूमि
डीएनए टेम्पलेट 0.5 – 30 ng/μL RM उपज, ऑलिगोमेरिक असेंबली, फोल्डिंग
डीएनए टेम्पलेट डिजाइन उपज
1, मिश्रण एक एमपी की व्यक्तिगत संरचना के अनुसार भिन्न हो सकता है जैसे उपज में सुधार या एनएमआर लेबलिंग योजनाओं को अनुकूलित करना।
2, जीएसएच हमेशा ताजा तैयार किया जाना चाहिए।
3, उच्च अभिव्यक्ति स्तर सुनिश्चित करने के लिए आरएम में कुल सीएफ लाइसेट एकाग्रता कम से कम 35% होनी चाहिए, जिसमें कम से कम 50% की एस 30 सामग्री होनी चाहिए।

तालिका 1: सीएफ प्रतिक्रियाओं के महत्वपूर्ण स्क्रीनिंग घटक।

MSP1E3D1 लिपिड DPC
अनुपात (410 μM स्टॉक) (50,000 μM स्टॉक) (10% (w/v) स्टॉक)
लिपिड लिपिड: एमएसपी V (MSP) c(MSPअंतिम) वी (लिपिड) सी (लिपिडफाइनल) V (DPC) c(DPCफाइनल) DF बफर
[μL] [μM] [μL] [μM] [μL] [%] [μL]
DMPC 115 : 1 1500.0 205.0 1415.0 23 575 30.0 0.1 55.5
DOPC 80 :1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPC 85 : 1 1500.0 205.0 1046.0 17 425 30.0 0.1 425.0
DMPG 110 : 1 1500.0 205.0 1353.0 22 550 30.0 0.1 117.0
DOPG 80 : 1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPG 90 : 1 1500.0 205.0 1107.0 18 450 30.0 0.1 363.0

तालिका 2: 3 एमएल इन विट्रो असेंबली सेटअप के लिए लिपिड से एमएसपी 1 ई 3 डी 1 अनुपात।

यौगिक एकाग्रता तैयारी
डीएनए प्लास्मिड टेम्पलेट1 > 10 mM Tris-HCl pH 8.0 में 400 μg/mL मिडी/मैक्सी किट (जैसे क्यूजेन) तैयारी2
20 अमीनो एसिड का मिश्रण3 H 2 O में प्रत्येक में25mM अवक्षेप4 रहता है
4 NTP का मिश्रण (75 x) c(CTP) 240 mM, c(ATP) 360 mM, c(UTP) 240 mM, c(GTP) 240 mM
H2O में PH को KOH के साथ 7-8 समायोजित करें		 एक छोटा सा अवक्षेप4 रहता है
एसिटाइल फॉस्फेट H2O में 1 M, KOH के साथ pH 7-8 समायोजित करें अवक्षेप4 रहता है
फॉस्फो (एनोल) पाइरुविक एसिड (के +) H2O में 1 M, KOH के साथ pH 7-8 समायोजित करें
फोलिनिक एसिड H2O में 10 mg/mL अवक्षेप4 रहता है
DTT H2O में 0.5 M
c0mplete प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल H2O में 1 गोली प्रति 1 mL
ट्राइस-एसीटेट, पीएच 8.0 H 2 O में2.4M
Mg (OAC)2 H2O में 1 M
KOAC H2O में 10 M
राइबोलॉक RNase-अवरोधक 40 U/ थर्मो फिशर वैज्ञानिक
टीआरएनए (ई कोलाई) H2O में 40 mg/mL रोशे (जर्मनी)
T7RNAP 3-7 मिलीग्राम / प्रोटोकॉल अनुभाग 2 देखें
पाइरूवेट काइनेज 10 मिलीग्राम / रोशे (जर्मनी)
नैनोडिस्क (DMPG) 0.2-1.0 mM6 में 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 100 mM NaCl प्रोटोकॉल अनुभाग 3 और 4 देखें
1, पीसीआर टेम्पलेट का उपयोग समान सांद्रता पर किया जा सकता है।
2, "मिनी" किट तैयार डीएनए की गुणवत्ता संतोषजनक नहीं है।
3, सिस्टीन अस्थिर होता है और इसे अलग से जोड़ा जा सकता है।
4, समाधान ओवरसैचुरेटेड है, एलिकोट को हटाने से पहले तुरंत पूरी तरह से मिश्रण आवश्यक है।
5, प्रत्येक नए टी 7आरएनएपी बैच के लिए, सर्वोत्तम अंतिम एकाग्रता की पहचान करने के लिए एक प्रारंभिक स्क्रीन की सिफारिश की जाती है।
6, नैनोडिस्क की घुलनशीलता उनकी लिपिड संरचना पर निर्भर कर सकती है।

तालिका 3: सीएफ स्टॉक समाधान की तैयारी।

यौगिक
मास्टरमिक्स के लिए (3.0 x) c (अंतिम) V [μL]
20 अमीनो एसिड का मिश्रण 1 mM 2520.0
4 NTP का मिश्रण (75 x) 1x 840.0
एसिटाइल फॉस्फेट 20 mM 1260.0
फॉस्फो (एनोल)
पाइरुविक एसिड		 20 mM 1260.0
फोलिनिक एसिड 0.1 मिलीग्राम / 630.0
ट्राइस-एसीटेट, पीएच 8.0 100 mM 2625.0
c0mplete 50 x 1x 1260.0
Mg (OAC)2 19.8 (= 20)1 mM 1260.0
KOAC 180 (= 270)2 mM 1140.0
DTT 2 mM 252.0
H2O 7953.0
कुल 21 000
आरएम के लिए c (अंतिम) V [μL]
3x Mastermix 1 x 1000.0
RNase अवरोधक 0.3 U/μL 22.5
टीआरएनए (ई कोलाई) 0.5 मिलीग्राम / 37.5
नैनोडिस्क (DMPG) 3 10 μM 75.0
डीएनए टेम्पलेट4 0.015 ng/μL 112.5
पाइरूवेट काइनेज 0.04 मिलीग्राम / 12.0
T7RNAP5 0.03 मिलीग्राम / 15.0
S30 लाइसेट 0.35 % 1050.0
ऑल-ट्रांस रेटिना6 0.6 mM 9.0
H2O - 666.5
कुल 3000.0
एफएम के लिए c (अंतिम) V [μL]
मास्टरमिक्स (3 x) 1 x 20 000
H2O - 40 000
कुल 60 000
एस 30 लाइसेट से 1, 0.2 एमएम एमजी2 + का योगदान दिया जाता है।
2, 90 एमएम के + एसिटाइल फॉस्फेट और फॉस्फो (एनोल) पाइरुविक एसिड से योगदान दिया जाता है।
3, गणना की गई स्टॉक समाधान 400 μM है।
4, गणना की गई स्टॉक समाधान 400 μg / mL है।
5, गणना स्टॉक समाधान 6 मिलीग्राम / एमएल है।
6, पीआर के लिए विशिष्ट कोफ़ेक्टर, स्टॉक समाधान डीएमएसओ में 200 एमएम है।

तालिका 4: 3 एमएल आरएम और 60 एमएल एफएम के साथ सीईसीएफ प्रतिक्रिया के लिए पाइपलाइन योजना

यौगिक
मास्टरमिक्स के लिए (3.0 x) c (अंतिम) V [μL]
20 अमीनो एसिड का मिश्रण 1 mM 864.0
4 NTP का मिश्रण 1x 288.0
एसिटाइल फॉस्फेट 20 mM 432.0
फॉस्फो (एनोल) पाइरुविक एसिड 20 mM 432.0
फोलिनिक एसिड 0.1 मिलीग्राम / 216.0
ट्राइस-एसीटेट, पीएच 8.0 100 mM 900.0
c0mplete 1x 432.0
Mg (OAC)2 13,8 (= 14) mM1 298.0
KOAC 180 (= 270) mM2 389.0
DTT 2 mM 86.4
H2O - 2862.6
Total [μL]1 - 7200.0
Mg2+ सांद्रता
14 mM 16 mM 18 mM 20 mM 22 mM 24 mM
आरएम के लिए c (अंतिम) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0
0.1 एम एमजी (ओएसी) 2 14-24 mM 0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0
RNase अवरोधक 0.3 U/μL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
टीआरएनए (ई कोलाई) 0.5 मिलीग्राम / 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
डीएनए टेम्पलेट3 0.015 ng/μL 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5
पाइरूवेट काइनेज 0.04 मिलीग्राम / 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
T7RNAP4 0.03 मिलीग्राम / 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
S30 लाइसेट 35 % 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0
H2O - 49.7 45.7 41.7 37.7 33.7 29.7
Total [μL]5 - 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0
Mg2+ सांद्रता
14 mM 16 mM 18 mM 20 mM 22 mM 24 mM
आरएम के लिए c (अंतिम) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0
0.1 एम एमजी (ओएसी) 2 14-24 mM 0.0 68.0 136.0 204.0 272.0 340.0
H2O - 2267.0 2199.0 2131.0 2064.0 1995.0 1927.0
Total [μL]5 - 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0
एस 30 लाइसेट से 1, 0.2 एमएम एमजी2 + का योगदान दिया जाता है। मास्टरमिक्स को सबसे कम स्क्रीनिंग एकाग्रता में समायोजित किया जाता है।
2, 90 एमएम के + एसिटाइल फॉस्फेट और फॉस्फो (एनोल) पाइरुविक एसिड से योगदान दिया जाता है।
3, गणना की गई स्टॉक समाधान 400 μg / mL है।
4, गणना स्टॉक समाधान 6 मिलीग्राम / एमएल है।
5, प्रतिक्रियाएं डुप्लिकेट में की जाती हैं।

तालिका 5: आरएम के 100 μL और 1.7 mL एफएम के साथ Mg2+ एकाग्रता स्क्रीन के लिए पाइपलाइन योजना।

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Discussion

सीएफ अभिव्यक्ति को अनुकूलित करने और नैनोडिस्क में कार्यात्मक सांसदों के सह-अनुवाद सम्मिलन के लिए सेटअप और रणनीतियों का वर्णन किया गया है। आवश्यक उपकरणों में एक बायोरिएक्टर, एक फ्रेंच प्रेस डिवाइस या इसी तरह, एक यूवी / वीआईएस और फ्लोरेसेंस रीडर, दो-कम्पार्टमेंट कॉन्फ़िगरेशन सेटअप के लिए उपयुक्त सीएफ प्रतिक्रिया वाहिकाएं और एक तापमान-नियंत्रित इनक्यूबेटर शामिल हैं। इसके अलावा मानक उपकरण ई कोलाई कोशिकाओं की कटाई के लिए सेंट्रीफ्यूज के साथ-साथ एस 30 लाइसेट की तैयारी के लिए कम से कम 30,000 x g तक पहुंचने वाले टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज हैं। यदि एस 80-एस 100 लाइसेट तैयार किया जाना चाहिए, तो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज आवश्यक हैं। सूचीबद्ध उपकरण जैव रासायनिक प्रयोगशालाओं में नियमित रूप से उपलब्ध हैं और सीएफ अभिव्यक्ति के साथ शुरू करने के लिए कोई बड़े प्रारंभिक निवेश की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, सीएफ लाइसेट और टी 7 आरएनएपी तैयारी के लिए ई कोलाई कोशिकाओं का किण्वन और हैंडलिंग सामान्य और मजबूत तकनीकें हैं। सबसे महंगे यौगिक सीएफ लाइसेट, टी 7 आरएनएपी और नैनोडिस्क हैं। उन्हें विश्वसनीय और कुशल प्रोटोकॉल द्वारा तैयार किया जा सकता है और एलिकोट -80 डिग्री सेल्सियस पर वर्षों तक स्थिर होते हैं। प्रोटोकॉल में सीएफ लाइसेट और टी7आरएनएपी तैयारी के लिए तीन-तीन दिन और एमएसपी की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण तथा नैनोडिस्क के पूर्वनिर्माण के लिए लगभग एक सप्ताह की आवश्यकता होती है। लक्ष्य टेम्पलेट डीएनए को पीईटी -21, पीआईवीएक्स, या इसी तरह के वेक्टर सिस्टम का उपयोग करके आपूर्ति की जा सकती है। सीएफ अभिव्यक्ति प्रणालियों के सेटअप और अनुकूलन के लिए, स्थानांतरित जीएफपी (जीएफपी +) या सुपरफोल्डरजीएफपी जैसे जीएफपी वेरिएंट के उत्पादन का उपयोग मॉनिटर20,32 के रूप में किया जा सकता है। एमपी उत्पादन स्थितियों के लिए, पीआर की अभिव्यक्ति एक अच्छा मॉडल सिस्टम या सकारात्मक नियंत्रण है क्योंकि यह कई अलग-अलग परिस्थितियों में फोल्ड होता है और आसानी से 530 एनएम 10,15,18 पर अवशोषण द्वारा निगरानी की जा सकती है। एक नए एमपी के लिए एक कुशल सीएफ अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए, लक्ष्य रीडिंग फ्रेम के कोडन अनुकूलन और सी-टर्मिनल रूप से संलग्न जीएफपी के साथ संलयन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। आगे आवश्यक सामग्रियों में रसायन और एंजाइम शामिल हैं जो सभी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इन घटकों को उच्च गुणवत्ता में प्राप्त करने की आवश्यकता है और आरएम के 3 एमएल और एफएम के 60 एमएल के साथ वर्णित सीएफ प्रतिक्रिया के लिए समग्र लागत गणना लगभग 150-200 € होगी। सीएफ अभिव्यक्ति प्रणालियों के लिए एक प्रमुख अनुप्रयोग इसलिए कई सांसदों या विषाक्त पदार्थों जैसे शास्त्रीय सेल-आधारित अभिव्यक्ति प्रणालियों में प्रोटीन का उत्पादन प्राप्त करना मुश्किल है। सीएफ सिस्टम सिंथेटिक जीव विज्ञान में कोर प्लेटफॉर्म हैं और अनुप्रयोगों के लगातार बढ़ते क्षेत्र उन्हें आणविक अनुसंधान में एक उपकरण के रूप में तेजी से अपरिहार्य बनाते हैं। दूसरों के बीच, नियमित अनुप्रयोग प्रोटीन, उच्च-थ्रूपुट प्रक्रियाओं या सिंथेटिक सेल डिजाइन के लेबलिंग हैं।

प्रदर्शित रणनीति पहले से ही अत्यधिक घुलनशील नैनोडिस्क के वांछित लिपिड वातावरण में डाले गए शुद्ध सांसदों के डिटर्जेंट-मुक्त उत्पादन को सक्षम बनाती है। एक बार जब एक एमपी के लिए सीएफ अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल स्थापित और अनुकूलित हो जाता है, तो उत्पादन बहुत तेज होता है और शुद्ध नमूने 24 घंटे से कम समय में प्राप्त किए जा सकते हैं, यहां तक कि प्रारंभिक पैमाने पर भी। नैनोडिस्क कॉम्प्लेक्स को एमपी से जुड़े स्ट्रेप्टाविडिन II या पॉलीहिस्टिडाइन टैग के माध्यम से सीएफ प्रतिक्रिया से सीधे शुद्ध किया जाता है। प्रक्रिया विभिन्न तकनीकों की एक सरणी द्वारा समान एमपी नमूनों के समानांतर कार्यात्मक और संरचनात्मक विश्लेषण की अनुमति देतीहै। इसलिए रणनीति की गति और दक्षता सेल-आधारित अभिव्यक्ति प्रणालियों और कोशिका झिल्ली से सांसदों के डिटर्जेंट निष्कर्षण को नियोजित करने वाले पारंपरिक दृष्टिकोणों के लिए प्रतिस्पर्धी है, जिसके बाद नियमित इन विट्रो पुनर्गठन 5,34 है। सीएफ प्रतिक्रियाओं की खुली पहुंच एमपी फोल्डिंग और झिल्ली सम्मिलन15,16,18, एमपीकॉम्प्लेक्स असेंबली 15,18,24 या कार्यात्मक विनियमन 23 के कई अद्वितीय यांत्रिक अध्ययनों की सुविधा प्रदान करतीहै।

सेल-आधारित अभिव्यक्ति पर सीएफ अभिव्यक्ति का एक महत्वपूर्ण अंतर संश्लेषित प्रोटीन उत्पाद के लिए गुणवत्ता नियंत्रण प्रणाली की अनुपस्थिति है। इसके कार्यात्मक तह से स्वतंत्र कोई भी अनुवादित पॉलीपेप्टाइड अंतिम उत्पाद नमूने में समाप्त हो जाएगा। इसके अलावा, नैनोडिस्क झिल्ली में सम्मिलन प्रक्रिया कृत्रिम और ट्रांसलोकन स्वतंत्र है और इसके परिणामस्वरूप या तो अपूर्ण एकीकरण हो सकता है या कई एमपी लक्ष्यों के साथ बिल्कुल काम नहीं कर सकता है। सीएफ प्रतिक्रिया में अंत में घुलनशील उत्पाद अंश इस प्रकार काफी विषम हो सकता है जिसमें पूरी तरह से डाला गया है लेकिन केवल आंशिक रूप से एकीकृत या झिल्ली से जुड़े सांसद भी हैं। नतीजतन, एमपी / नैनोडिस्क कॉम्प्लेक्स के शुद्ध नमूने का केवल एक छोटा सा अंश कार्यात्मक रूप से मुड़ा जा सकता है। झिल्ली संरचना को संशोधित करना और नैनोडिस्क और डीएनए टेम्प्लेट की सांद्रता को संशोधित करके एमपी से नैनोडिस्क अनुपात की सावधानीपूर्वक बारीकी से ट्यूनिंग अनुकूलन के लिए उपयुक्त उपकरण हैं। फिर भी, डाउनस्ट्रीम गुणवत्ता नियंत्रण दृष्टिकोण जैसे आकार बहिष्करण प्रोफाइलिंग और लक्ष्य विशिष्ट मात्रात्मक कार्यात्मक परख हमेशा सीएफ अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए आवश्यक होते हैं। इसलिए इस तरह के परीक्षणों की उपलब्धता अनुप्रयोगों को सीमित कर सकती है, विशेष रूप से सांसदों सहित परियोजनाओं में जिन्हें ट्रांसपोर्टरों, चैनलों या पंपों जैसे कार्यों के लिए लिपोसोम वातावरण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, नैनोडिस्क की आकार सीमाएं बड़ी एमपी विधानसभाओं के सम्मिलन को प्रतिबंधित कर सकती हैं।

प्रलेखित उदाहरणों में, जीपीसीआर टी1एआर-जीएफपी के कार्यात्मक रूप से मुड़े हुए अंश में भिन्नता कुछ प्रतिशत की सीमा के भीतर है, लगभग 30% तक। कार्यात्मक तह के लिए कई मापदंडों के सावधानीपूर्वक समायोजन की आवश्यकता होती है14 और अन्य जीपीसीआर के साथ-साथ22 के लिए भी एक समान व्यक्तिगत और थकाऊ अनुकूलन प्रक्रिया आवश्यक हो सकती है। हालांकि, कार्यात्मक रूप से मुड़े हुए जीपीसीआर की अंतिम रूप से प्राप्त उपज अन्य उत्पादन प्रणालियों के साथ प्रतिस्पर्धी है और एक विश्लेषणात्मक पैमाने मिनी-सीईसीएफ रिएक्टर में एकल 60 μL प्रतिक्रिया से लिगैंड बाइंडिंग अध्ययन के लिए > 1,000 रेडियोसेस की स्थापना की अनुमति देती है। यह उल्लेखनीय है कि जीपीसीआर-जीएफपी संलयन संरचनाओं के लिगैंड बाइंडिंग अध्ययनों को किसी भी शुद्धिकरण चरणों की आवश्यकता नहीं है। यदि आवश्यक हो, तो संश्लेषित एमपी से जुड़े आत्मीयता-टैग का लाभ उठाकर शुद्धिकरण प्राप्त किया जा सकता है, जैसे कि हिस-टैग या स्ट्रेप-टैग II। आरएम को तब वांछित बफर में पतला किया जाता है और संबंधित आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कॉलम पर लोड किया जाता है जिसे तदनुसार पूर्व-समतुल्य किया गया है। एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी या क्रिस्टलीकरण द्वारा पीआर और अन्य सीएफ संश्लेषित एमपी के संरचनात्मक मूल्यांकन ने पहले से ही एमपी अनुसंधान में कोर प्लेटफार्मों के रूप में सीएफ अभिव्यक्ति प्रणाली स्थापित करने में मदद की है। नैनोडिस्क कॉम्प्लेक्स के उत्पादन के लिए वर्णित रणनीति इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा भविष्य के संरचनात्मक अध्ययनों के लिए विशेष रूप से दिलचस्प हो सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम वित्तीय सहायता के लिए ड्यूश फोर्सचुंग्सगेमिनशाफ्ट (डीएफजी) अनुदान बीई 1911/8-1, एलओईडब्ल्यूई परियोजना गोंद, और सहयोगी अनुसंधान केंद्र ट्रांसपोर्ट एंड कम्युनिकेशन इन मेम्ब्रेन (एसएफबी 807) को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) Carl Roth (Germany) 4855
2-Mercaptoethanol Carl Roth (Germany) 4227
2-Propanol Carl Roth (Germany) 9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride American Radiolabeled Chemicals (USA) ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) Merck (Germany) 1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) Sigma Aldrich (Germany) A9251
Alprenolol hydrochloride Merck (Germany) A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® Sigma-Aldrich (Germany) Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1 Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1 B.Braun (Germany)
Centrifuge Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid Carl Roth (Germany) 8137
Coomassie Brilliant Blue R250 Carl Roth (Germany) 3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt Sigma-Aldrich (Germany) C1506
D-glucose monohydrate Carl Roth (Germany) 6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate Carl Roth (Germany) 6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing Fisher Scientific (Germany) 8700152
Dithiothreit Carl Roth (Germany) 6908
Ethanol Carl Roth (Germany) K928
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma-Aldrich (Germany) 47612
French pressure cell disruptor SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol Carl Roth (Germany) 3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) Sigma-Aldrich (Germany) G8877
Hydrochloric Acid Carl Roth (Germany) K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL GE Life Sciences (Germany) GE17-5248
Imidazole Carl Roth (Germany) 3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Carl Roth (Germany) 2316
Kanamycin Carl Roth (Germany) T832
L-Alanine Carl Roth (Germany) 3076.1
L-Arginine Carl Roth (Germany) 6908
L-Asparagine Carl Roth (Germany) HN23
L-Aspartic Acid Carl Roth (Germany) T202
L-Cysteine Carl Roth (Germany) T203
L-Glutamic Acid Carl Roth (Germany) 3774
L-Glutamine Carl Roth (Germany) 3772
L-Glycine Carl Roth (Germany) 3187
L-Histidine Carl Roth (Germany) 3852
L-Isoleucine Carl Roth (Germany) 3922
L-Leucine Carl Roth (Germany) 1699
L-Lysine Carl Roth (Germany) 4207
L-Methionine Carl Roth (Germany) 9359
L-Proline Carl Roth (Germany) 1713
L-Phenylalanine Carl Roth (Germany) 1709
L-Serine Carl Roth (Germany) 4682
L-Threonine Carl Roth (Germany) 1738
L-Tryptophane Carl Roth (Germany) 7700
L-Tyrosine Carl Roth (Germany) T207
MD100 dialysis units Scienova (Germany) 40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) Carl Roth (Germany) 6763
n-dodecylphosphocholine Antrace (USA) F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000 Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine Carl Roth (Germany) 6681
Peristaltic pump: ip-12 Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt Sigma Aldrich (Germany) 860077
Potassium dihydrogen phosphate Carl Roth (Germany) P018
Potassium acetate Carl Roth (Germany) 4986
Potassium chloride Carl Roth (Germany) 6781
Pyruvate Kinase Roche (Germany) 10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL Hidex (Finland)
SDS pellets Carl Roth (Germany) 8029
Sodium azide Sigma-Aldrich (Germany) K305
Sodium chloride Carl Roth (Germany) P029
Spectrophotometer Nanodrop Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli) Roche (Germany) 10109550001
Ultra sonificator Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) Sigma-Aldrich (Germany) U6625
Y-30 antifoam Sigma-Aldrich (Germany) A6457
Yeast extract Carl Roth (Germany) 2904

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References

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