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Biochemistry

Inserimento co-traduzionale di proteine di membrana in nanodischi preformati

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61844
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biophysical Chemistry, Goethe University Frankfurt

Summary

L'inserimento co-traduzionale in nanodischi preformati rende possibile lo studio di proteine di membrana sintetizzate prive di cellule in ambienti lipidici definiti senza contatto con detergenti. Questo protocollo descrive la preparazione dei componenti essenziali del sistema e i parametri critici per migliorare l'efficienza dell'espressione e la qualità del campione.

Abstract

I sistemi di espressione cell-free consentono la progettazione su misura di ambienti di reazione per supportare il ripiegamento funzionale di proteine anche complesse come le proteine di membrana. Vengono dimostrate le procedure sperimentali per l'inserimento e il ripiegamento co-traduzionale di proteine di membrana in membrane preformate e definite fornite come nanodischi. Il protocollo è completamente privo di detergenti e può generare milligrammi di campioni purificati in un giorno. I campioni di proteine di membrana/nanodisco risultanti possono essere utilizzati per una varietà di studi funzionali e applicazioni strutturali come la cristallizzazione, la risonanza magnetica nucleare o la microscopia elettronica. Viene descritta la preparazione di componenti chiave di base come lisati cell-free, nanodischi con membrane progettate, soluzioni stock critiche e l'assemblaggio di reazioni di espressione prive di cellule a due compartimenti. Poiché i requisiti di ripiegamento delle proteine di membrana possono essere molto diversi, un obiettivo principale di questo protocollo è la modulazione dei parametri e delle fasi di reazione importanti per la qualità del campione come i composti critici di reazione di base, la composizione della membrana dei nanodischi, l'ambiente redox e chaperone o la progettazione del modello di DNA. L'intero processo è dimostrato con la sintesi di proteorodopsina e un recettore accoppiato alla proteina G.

Introduction

Le proteine di membrana (MP) sono obiettivi impegnativi negli studi sulla produzione di proteine a causa della loro insolubilità in ambienti acquosi. Le piattaforme di produzione MP convenzionali comprendono sistemi basati su cellule come E. coli, lievito o cellule eucariotiche. Gli MP ricombinanti sintetizzati vengono estratti dalle membrane cellulari o ripiegati dai corpi di inclusione1. Dopo la solubilizzazione del detergente, gli MP possono essere trasferiti in ambienti di membrana adatti mediante protocolli di ricostituzione in vitro stabiliti. Oltre alle vescicole e ai liposomi, la ricostituzione di MP nelle membrane planari sotto forma di nanodischi2 o particelle salipro3 è diventata una tecnica di routine negli ultimi tempi. Tuttavia, tutte queste strategie implicano il contatto del detergente con i MP che può provocare destabilizzazione, dissociazione degli oligomeri e persino perdita della struttura e dell'attività proteica4. Lo screening per condizioni ottimali di solubilizzazione e ricostituzione del detergente può quindi essere noioso e richiedere molto tempo5.

La natura aperta dei sistemi cell-free (CF) consente di fornire direttamente la reazione di espressione con membrane preformate con una composizione lipidica definita. In questa modalità di espressione a base lipidica (L-CF), i MP sintetizzati hanno l'opportunità di inserire co-traduzionalmente nei doppi strati forniti 6,7 (Figura 1). I nanodischi costituiti da una proteina di scaffold di membrana (MSP) che circonda un disco planare lipidico a doppio strato8 sembrano essere particolarmente adatti per questa strategia 9,10. I nanodischi possono essere assemblati di routine in vitro con una varietà di lipidi diversi, sono molto stabili e le scorte possono essere concentrate fino a 1 mM. Tuttavia, l'espressione della MSP in E. coli e la sua purificazione sono necessarie. Come strategia alternativa, la MSP può essere co-espressa insieme al target MP nelle reazioni CF fornite con liposomi11,12,13. I modelli di DNA sia per MSP che MP vengono aggiunti nella reazione e MP/nanodischi possono formarsi durante l'espressione. Mentre la produzione di MSP è evitata, la strategia di co-espressione richiede un'attenta messa a punto delle concentrazioni finali del modello di DNA e ci si possono aspettare variazioni più elevate nell'efficienza della produzione del campione.

L'inserimento co-traduzionale di MP in membrane di nanodischi preformati è un meccanismo non fisiologico e ancora in gran parte sconosciuto indipendente dai macchinari translocon e dalle sequenze di segnale13,14,15,16. I principali determinanti dell'efficienza di inserzione sono il tipo di proteina di membrana e la composizione lipidica della membrana fornita, con una frequente preferenza per i lipidi caricati negativamente15,17. Poiché le membrane dei nanodischi sono di dimensioni relativamente limitate, una notevole quantità di lipidi viene rilasciata dopo l'inserimento MP18. La variazione della dimensione del nanodisco consente l'inserimento e la messa a punto di complessi MP oligomerici superiori15,18. Tra gli altri, è stato dimostrato il corretto assemblaggio di complessi omooligomerici per il canale ionico KcsA, per la pompa ionica proteorodopsina (PR) e per il trasportatore multifarmaco EmrE15,18. È probabile che gli MP entrino nella membrana simmetrica del nanodisco da entrambi i lati con una frequenza relativamente uguale. Va pertanto considerato che diversi monomeri o oligomeri inseriti in un nanodisco possono avere orientamenti opposti. Tuttavia, un bias nell'orientamento potrebbe essere causato da meccanismi di inserzione cooperativa come riportato per la formazione di esameri PR e tetrameri KcsA18. Un'ulteriore distorsione nell'orientamento MP potrebbe derivare da interruttori di orientamento di MP inseriti probabilmente sul bordo delle membrane del nanodisco.

La produzione di lisati CF da ceppi di E. coli è una tecnica di routine affidabile e può essere eseguita in quasi tutti i laboratori biochimici19,20. Va considerato che, oltre alla formazione di ponti disolfuro, la maggior parte delle altre modifiche post-traduzionali sono assenti se un MP viene sintetizzato usando lisati di E. coli. Sebbene ciò possa generare campioni più omogenei per gli studi strutturali, potrebbe essere necessario escludere potenziali effetti sulla funzione dei singoli bersagli MP. Tuttavia, la produzione efficiente di campioni di alta qualità di recettori accoppiati a proteine G (GPCR)14,21,22, trasportatori eucariotici 23 o grandi gruppi eteromerici 24 in lisati CF di E. coli indica la loro idoneità anche per bersagli complessi. Le quantità su scala preparativa (≈ 1 mg/ml) di un campione possono essere ottenute con la configurazione senza cella a scambio continuo a due compartimenti (CECF), composta da un compartimento di una miscela di reazione (RM) e da un compartimento di miscela di alimentazione (FM). Il volume FM supera il volume RM da 15 a 20 volte e fornisce un serbatoio di composti energetici a basso peso molecolare e precursori19. La reazione di espressione viene così estesa per diverse ore e la resa finale del target MP viene aumentata. I compartimenti RM e FM sono separati da una membrana di dialisi con un cutoff di 10-14 kDa. I due compartimenti richiedono un design speciale del contenitore di reazione CECF (Figura 1). Le cassette di dialisi commerciali come contenitori RM in combinazione con contenitori in plexiglass su misura contenenti il FM sono esempi adatti. Le rese MP possono essere ulteriormente manipolate modificando i rapporti RM:FM o scambiando l'FM dopo un certo periodo di incubazione.

La resa e la qualità di un MP richiedono spesso un'intensa ottimizzazione dei parametri di reazione. Un importante vantaggio dell'espressione CF è la possibilità di modificare e mettere a punto quasi tutti i composti in base alle esigenze individuali di un MP. Una strategia semplice consiste nel concentrarsi prima sul miglioramento della resa di un MP stabilendo un protocollo di produzione di base e quindi sull'ottimizzazione della qualità MP regolando le condizioni di reazione e piegatura. L'assenza di processi fisiologici nei lisati CF e la loro ridotta complessità si traducono in alti tassi di successo per la produzione efficiente di MP25. Le considerazioni di routine per la progettazione del modello di DNA e l'ottimizzazione della concentrazione di ioni Mg 2+ sono nella maggior parte dei casi sufficienti per ottenere rendimenti soddisfacenti26. A seconda della modalità di espressione, l'ottimizzazione della qualità MP può richiedere molto tempo, poiché è necessario esaminare una maggiore varietà di parametri14,17,22.

Per stabilire la piattaforma di espressione CF descritta, sono necessari protocolli per la produzione di E. coli CF lisato (i), T7 RNA polimerasi (ii), nanodischi (iii) e composti di reazione CECF di base (iv) (Figura 1). I derivati di E. coli K12 ceppo A1927 o BL21 sono frequentemente utilizzati per la preparazione di lisati efficienti S30 (centrifugazione a 30.000 x g). Oltre ai lisati S30, possono essere utilizzati lisati corrispondenti centrifugati ad altre forze g (ad esempio S12). I lisati differiscono nell'efficienza di espressione e nella complessità del proteoma. Il proteoma del lisato S30 preparato dal protocollo descritto è stato studiato in dettaglio28. Il proteoma S30 contiene ancora alcune proteine residue della membrana esterna che potrebbero dare problemi di fondo durante l'espressione e l'analisi dei canali ionici. Per tali obiettivi, si raccomanda l'uso di lisati S80-S100. Una preziosa modifica durante la preparazione del lisato è l'induzione della risposta SOS mediante shock termico combinato e fornitura di etanolo nella fase di crescita intermedia delle cellule. I lisati HS30 risultanti sono arricchiti in chaperoni e possono essere utilizzati in miscele con lisati S30 per migliorare il ripiegamento MP22. L'espressione di CF in lisati di E. coli è operata come un processo di trascrizione/traduzione accoppiato con modelli di DNA contenenti promotori controllati dalla T7 RNA polimerasi (T7RNAP). L'enzima può essere prodotto in modo efficiente nelle cellule stellari BL21(DE3) che trasportano il plasmide 29 pAR1219.

Due copie di MSP1E3D1 si assemblano in un nanodisco con un diametro di 10-12 nm, ma il protocollo descritto di seguito può funzionare anche per altri derivati MSP. Tuttavia, i nanodischi più grandi di quelli formati con MSP1E3D1 tendono ad essere meno stabili, mentre i nanodischi più piccoli formati con derivati MSP come MSP1 potrebbero non ospitare MP o complessi MP più grandi. I nanodischi MSP1E3D1 possono essere assemblati in vitro con una grande varietà di lipidi o miscele lipidiche diverse. I nanodischi preformati sono generalmente stabili per > 1 anno a -80 °C, mentre la stabilità può variare per diversi componenti lipidici. Per lo screening degli effetti lipidici sul ripiegamento e sulla stabilità di un MP, è necessario preparare un set completo di nanodischi assemblati con una varietà rappresentativa di miscele lipidiche / lipidiche. I seguenti lipidi possono dare una buona selezione di partenza: 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolo) (DMPG), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1,2 dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerolo) (DOPG), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolo) (POPG) e 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC).

Viene descritto un protocollo per la preparazione di una reazione CECF da 3 ml. È possibile un ulteriore ridimensionamento verso l'alto o verso il basso in un rapporto 1:1. Per la configurazione CECF a due compartimenti, devono essere preparati un RM contenente tutti i composti e un FM contenente solo i composti a basso peso molecolare. I dispositivi commerciali per dialisi da 3 mL con MWCO da 10-14 kDa possono essere utilizzati come contenitori RM, che vengono poi collocati in contenitori in plexiglass personalizzati contenenti FM (Figura 1D)30. Il rapporto RM:FM è 1:20, quindi 60 mL di FM devono essere preparati per 3 mL RM. La qualità, la concentrazione o il tipo di diversi componenti possono essere critici per la resa finale e/o la qualità del MP sintetizzato (Tabella 1). I modelli di DNA devono essere preparati secondo le linee guida pubblicate e l'ottimizzazione del codone del frame di lettura del bersaglio può migliorare ulteriormente significativamente la resa del prodotto26. Per la reazione CECF su scala preparativa, viene descritto un protocollo stabilito per la produzione di PR. Per stabilire protocolli di espressione per i nuovi MP, di solito è necessario eseguire schermate di ottimizzazione di alcuni composti (Tabella 1) per migliorare la resa e la qualità. Per gli ioni Mg2+ , esiste un ottimale di concentrazione ben focalizzato che spesso mostra variazioni significative per diversi modelli di DNA. Altri composti di reazione CF come nuovi lotti di lisati T7RNAP o S30 possono spostare ulteriormente la concentrazione ottimale di Mg2+ . Ad esempio, viene descritto un tipico schermo Mg 2+ nell'intervallo di concentrazione di14-24 mM e in incrementi di 2 mM. Ogni concentrazione viene sottoposta a screening in duplicati e in reazioni CECF su scala analitica. Come contenitore di reazione CECF, i contenitori in plexiglas Mini-CECF su misura30 che contengono l'RM vengono utilizzati in combinazione con micropiastre standard a 24 pozzetti che contengono l'FM (Figura 1B). In alternativa, possono essere utilizzate cartucce per dialisi commerciali in combinazione con micropiastre a pozzetti profondi 96 o altri dispositivi dializzatori commerciali in configurazioni appropriate (Figura 1C).

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Protocol

1. Preparazione del lisato S30

  1. Giorno 1: Striare le cellule dalle scorte di glicerolo su una piastra di agar LB e incubare a 37 °C durante la notte.
  2. Giorno 2: Inoculare 200 mL di terreno LB con le cellule della piastra di agar e incubare a 37 °C per 12-14 ore.
  3. Giorno 3: Inoculare 10 L di terreno YPTG sterile (10 g/L di estratto di lievito, 16 g/L di triptone, 5 g/L di NaCl, 19,8 g/L di glucosio, 4,4 mM KH 2 PO 4, 8 mM K2HPO4) temperato a 37 °C in un reattore a serbatoio agitato da 15 L con 100 mL di precoltura (1:100). Coltivare a 37 °C, 500 giri/min e alta aerazione (~ 3 volumi d'aria al minuto). Per evitare un'eccessiva formazione di schiuma, aggiungere antischiuma sterile.
  4. Misurare la densità ottica (OD) a 600 nm a intervalli di tempo regolari. Dopo circa 2 ore la coltura entrerà nella fase logaritmica.
  5. Modifica per HS30 lisato: Quando le cellule sono in fase intermedia (OD600 ≈ 3,6-4,2) aggiungere 300 ml di etanolo al terreno di coltura e procedere alla coltivazione a 42 °C, 500 giri/min e alta aerazione (circa 3 volumi d'aria al minuto) per altri 45 minuti. Quindi procedere con il raffreddamento e la raccolta della coltura cellulare come descritto al punto 1.6. Per la produzione di lisato S30 standard, saltare questo passaggio e procedere con il passaggio 1.6.
  6. Quando le celle sono in fase intermedia (OD600 ≈ 3,6-4,2), raffreddare il fermentatore sotto i 20 °C entro < 30 minuti. L'OD600 finale dovrebbe essere di circa 4,5-5,5. Raccogliere le celle a 4.500 x g per 20 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Mantenere le celle a 4 °C durante i passaggi successivi.
    NOTA: Durante il raffreddamento, può verificarsi un'eccessiva formazione di schiuma. In questo caso, aggiungere antischiuma o ridurre la velocità di agitazione e / o diminuire il flusso d'aria nel bioreattore.
  7. Sospendere completamente le celle in 300 mL di tampone S30-A (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-mercaptoetanolo) utilizzando una spatola seguita da pipettare la sospensione su e giù fino all'omogeneità. Centrifugare a 8.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Ripetere questo passaggio due volte.
    ATTENZIONE: il 2-mercaptoetanolo è tossico. Evitare il contatto con la pelle o il tratto respiratorio. Se possibile, lavora sotto un cofano. Pesare il becher della centrifuga vuoto prima dell'ultima fase di lavaggio. Dopo la centrifugazione, pesare il pellet a celle umide e procedere con il punto 1.8 o conservare il pellet fino a un ulteriore utilizzo.
    NOTA: Il peso del pellet a cellule umide è di 5-7 g per coltura di bioreattore da 1 L. A questo punto il protocollo può essere messo in pausa e il pellet può essere congelato in azoto liquido e conservato a -80 °C per 4-8 settimane.
  8. Sospendere accuratamente le cellule in 1,1 volumi (1 g = 1 mL) di tampone S30-B (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 compressa di inibitore della proteasi cOmplete). Riempire la sospensione in una cella di pressione francese pre-raffreddata e interrompere le celle a 1.000 psig. Passare le celle attraverso la stampa francese una volta.
  9. Centrifugare il lisato a 30.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo e ripetere la fase di centrifugazione.
    NOTA: Dopo la prima centrifugazione può essere presente uno strato sciolto e viscido sulla parte superiore del pellet, che non deve essere trasferito con il surnatante.
  10. Applicare un alto livello di sale e calore per rimuovere i componenti di lisato instabili e rilasciare l'mRNA dai ribosomi. Regolare il lisato a 0,4 M NaCl e incubare a 42 °C per 45 minuti a bagnomaria.
    NOTA: questo passaggio causerà una significativa formazione di precipitati. Capovolgere o capovolgere il tubo durante l'incubazione di volta in volta.
  11. Trasferire la sospensione torbida (di solito 50-80 ml) in tubi di dialisi con un cutoff di 10-14 kDa e dializzarli contro tampone S30-C da 5 L (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 0,5 mM DTT). Sostituire il tampone di dialisi S30-C dopo 2-3 ore e dializzarlo per altre 12-14 ore.
  12. Giorno 4: Trasferire la sospensione dializzata in provette da centrifuga e centrifugare a 30.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante (lisato S30) in provette fresche da 50 mL e mescolare delicatamente. La concentrazione proteica del lisato deve essere di circa 30-40 mg/ml. Aliquote di surgelazione (ad es. 0,5 ml, 1 ml) in azoto liquido e conservare a -80 °C. Le aliquote sono stabili per > 1 anno.

2. Espressione e purificazione della T7 RNA polimerasi

  1. Giorno 1: Inoculare 200 mL di terreno LB contenente 100 μg/mL di ampicillina con cellule BL21(DE3) Star x pAR1219 appena placcate e incubare a 37 °C e 180 rpm per 12-16 ore.
  2. Giorno 2: Inoculare 1 L di brodo formidabile (12 g/L di triptone, 24 g/L di estratto di lievito, 4 mL/L di glicerolo) in un matraccio da 2 L con 10 mL di precoltura e incubare a 37 °C e agitare a 180 giri/min. L'OD600 iniziale dovrebbe essere intorno a 0,1.
  3. Quando l'OD600 raggiunge 0,6-0,9, aggiungere IPTG a una concentrazione finale di 1 mM per indurre l'espressione di T7RNAP e continuare la coltivazione per altre 5 ore.
  4. Raccogliere le celle mediante centrifugazione a 4.500 x g per 20 minuti a 4 °C. Congelare le celle in azoto liquido e conservare a -80 °C.
    NOTA: il protocollo potrebbe essere messo in pausa qui.
  5. Giorno 3: Aggiungere 30 mL di tampone di sospensione ghiacciato (30 mM Tris-HCl, pH 8,0 con una compressa di inibitore della proteasi cOmple) al pellet cellulare congelato e scongelare il pellet a bagnomaria a temperatura ambiente. Quindi, sospendere il pellet pipettando su e giù fino all'omogeneità.
  6. Eseguire l'interruzione delle cellule utilizzando una pressa francese come descritto nella sezione precedente o utilizzare un dispositivo di sonicazione secondo le raccomandazioni del produttore. Successivamente, centrifugare a 20.000 x g per 30 minuti a 4 °C e trasferire il surnatante in una provetta fresca.
  7. Per precipitare il DNA genomico, aggiungere streptomicina solfato lentamente e sotto delicata agitazione al surnatante fino a raggiungere una concentrazione finale del 3% (p/v). Incubare a 4 °C per 5-10 minuti agitando delicatamente. Centrifugare a 20.000 x g per 30 minuti a 4 °C.
  8. Filtrare il surnatante con un filtro da 0,45 μm e caricarlo su una colonna Q-Sepharose con un volume di colonna (CV) di 40 mL equilibrato con tampone di equilibrio 2 CV (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% glicerolo e 10 mM 2-mercaptoetanolo) utilizzando una pompa peristaltica ad una portata di 4 mL/min. Quindi, collegare la colonna a un rilevatore UV e continuare l'eluizione con buffer di equilibrio fino a quando il segnale UV a 280 nm raggiunge una linea di base stabile.
  9. Eluire T7RNAP con un gradiente da 50 mM a 500 mM NaCl per CV ad una portata di 3 mL/min. Raccogliere 1 mL di frazioni e preparare i campioni per l'analisi SDS-PAGE miscelando 10 μL di ciascuna frazione con 2 x tampone campione SDS. Eseguire SDS-PAGE e colorare il gel con Coomassie Blue R. T7RNAP dovrebbe apparire come una banda prominente a circa 90 kDa insieme a numerose bande aggiuntive di impurità.
  10. Frazioni di pool contenenti T7RNAP e dializzazione utilizzando membrane con un MWCO di 12-14 kDa per 12-16 h in tampone di dialisi (10 mM K 2 HPO 4/KH2PO4, pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, glicerolo 5% (p/v).
  11. Giorno 4: Raccogliere la soluzione di T7RNAP e concentrare utilizzando unità filtranti con 12-14 MWCO fino a una concentrazione finale di 3-10 mg/ml. T7RNAP può iniziare a precipitare durante la concentrazione. Arrestare immediatamente la concentrazione non appena si verifica torbidità nel campione. Aggiungere il glicerolo ad una concentrazione finale del 50% (p/v) e mescolare delicatamente. Congelare 0,5-1 mL aliquote e conservare a -80 °C. Le aliquote T7RNAP funzionanti possono essere conservate a -20 °C.
    NOTA: Circa 20-40 ml di T7RNAP parzialmente purificato da 5 mg/ml con 20.000-40.000 unità devono essere ottenuti da una fermentazione di 1 L. Per testare la quantità ottimale di ciascun lotto di T7RNAP, devono essere eseguite reazioni di espressione CF della proteina fluorescente verde (GFP) contenente 0,02 mg/mL-0,1 mg/ml del campione T7RNAP preparato.

3. Espressione e purificazione di MSP1E3D1

  1. Giorno 1: Trasformare le cellule stellari di E. coli BL21 (DE3) con il vettore pET28(a)-MSP1E3D131 utilizzando protocolli standard di trasformazione da shock termico o elettroporazione. Striare o trasformare le cellule su agar LB contenente 30 μg/mL di kanamicina e incubare a 37 °C per 12-16 ore.
  2. Giorno 2: Inoculare 200 mL di terreno LB integrato con glucosio allo 0,5% (p/v) e 30 μg/mL di kanamicina con una singola colonia prelevata dalla piastra di agar e incubare a 37 °C a 180 giri/min per 12-16 ore.
  3. Giorno 3: Inoculare 10 L LB terreno integrato con 0,5% (p/v) di glucosio e 30 μg/mL di kanamicina con 100 mL di pre-coltura in un bioreattore a serbatoio agitato. Condurre la fermentazione a 37 °C, 500 rpm e aerazione di circa 3 volumi di bioreattore al minuto. In caso di formazione eccessiva di schiuma, aggiungere antischiuma.
    NOTA: Al posto del fermentatore possono essere utilizzati palloni agitatori sconcertati.
  4. A OD600 di 6,5-7,5, aggiungere IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM e continuare l'incubazione a 37 °C per 1 ora. Raccogliere le celle mediante centrifugazione a 4.500 x g per 20 minuti a 4 °C. Lavare i pellet con 200 mL di NaCl allo 0,9% (p/v) e centrifugare nuovamente a 8.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e trasferire le cellule in provette da 50 mL usando una spatola. Il peso previsto del pellet umido è di 8-12 g per L di coltura di bioreattori. Congelare i pellet in azoto liquido e conservare a -80 °C fino a ulteriore utilizzo.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
  5. Giorno 4: Per la purificazione, scongelare i pellet cellulari a bagnomaria a RT. Sospendere le cellule in tampone MSP-A (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (p/v) Triton X-100, 1 compressa di cocktail di inibitori della proteasi c0mplete per 50 mL di sospensione cellulare) per ottenere una sospensione cellulare del 30-40% (p/v).
  6. Interrompere le cellule mediante sonicazione o utilizzando una pressa francese e centrifuga a 30.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in un tubo fresco e filtrare attraverso un filtro da 0,45 μm. Applicare il filtrato su una colonna di acido nitrilotriacetico caricata con Ni2+ (CV > 15 mL) equilibrata con 5 CV di tampone MSP-B (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (p/v) Triton X-100) utilizzando una pompa peristaltica.
    NOTA: Per facilitare la filtrazione, il surnatante può essere sonicato per un altro minuto per abbattere grandi frammenti di DNA.
  7. Dopo il caricamento del campione, lavare la colonna con 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl, 50 mM acido colico), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl) e 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 50 mM imidazolo).
    NOTA: L'acido colico nel tampone MSP-C è importante per rimuovere i lipidi attaccati all'MSP. L'acido colico non è completamente solubile a bassi valori di pH. Il valore del pH deve quindi essere regolato a 8,9 in MSP-C e MSP-D. È importante lavare la colonna con tampone MSP-D, poiché un pH più basso potrebbe causare la precipitazione dell'acido colico residuo e bloccare o danneggiare la colonna.
  8. Eluire MSP con MSP-G (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazolo). Raccogliere frazioni di 1 mL e monitorare l'assorbimento UV a 280 nm. Raccogliere e raggruppare le frazioni del picco di eluizione.
  9. Trasferire frazioni MSP aggregate in tubi a membrana per dialisi MWCO da 12-14 kDa e dializzarli contro 5 L di MSP-H (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, glicerolo 10% (p/v) per 2-3 ore a 4 °C. Passare a tampone MSP-H fresco da 5 L e dializzare per altre 12-16 ore a 4 °C.
  10. Giorno 5: Trasferire la soluzione di MSP in provette da centrifuga e centrifugare a 18.000 x g per 30 minuti a 4 °C per rimuovere il precipitato. Trasferire il surnatante in un tubo fresco e concentrarsi a 200-800 μM utilizzando dispositivi di ultrafiltrazione con MWCO da 12-14 kDa a 4 °C. Misurare la concentrazione utilizzando un dispositivo di misurazione UV/VIS. Utilizzare il coefficiente di estinzione di 27,31 M-1 cm-1 e la massa molecolare di 31,96 kDa per il calcolo della concentrazione.
    NOTA: L'espressione in un bioreattore di solito produce 15-30 mg di coltura MSP1E3D1 per L.
  11. Aliquote di surge-congelamento della soluzione concentrata di MSP in azoto liquido e conservare a -80 °C.

4. Assemblaggio di nanodischi MSP1E3D1

  1. Giorno 1: Preparare 1-2 mL di 50 mM di scorte lipidiche (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC o POPC) in 100 mM di colato di sodio. Conservare a -20 °C se non utilizzato lo stesso giorno.
    NOTA: La soluzione lipidica deve essere limpida. Se la soluzione non è limpida, la concentrazione di colato di sodio può essere aumentata a 150 mM.
  2. Mescolare la soluzione MSP1E3D1 con la soluzione lipidica. Aggiungere dodecilfosfocolina (DPC) ad una concentrazione finale di 0,1% (p/v). Le reazioni di assemblaggio possono essere regolate a volumi finali di 3 mL (Tabella 2) o 12 mL corrispondenti a volumi tipici di cassette di dialisi (10 kDa MWCO). Incubare le reazioni di assemblaggio per 1 ora a 21 °C sotto delicata agitazione.
    NOTA: Per ogni lipide, è necessario utilizzare uno specifico rapporto MSP1E3D1:lipidi per garantire una preparazione omogenea del nanodisco (Tabella 2). Per i nuovi lipidi o miscele lipidiche, il rapporto ottimale deve essere determinato con un esperimento pilota e un'analisi cromatografica di esclusione dimensionale14.
  3. Pre-bagnare la membrana di una cassetta di dialisi con tampone per formazione del disco (DF) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl). Trasferire la miscela di assemblaggio nella cassetta di dialisi con una siringa. Le potenziali bolle d'aria possono essere rimosse mediante aspirazione utilizzando la siringa.
  4. Giorni 1-4: Dialisi contro 3 tampone DF da 5 L per 10-20 ore a RT sotto agitazione usando una barra di agitazione. Quindi trasferire la miscela di assemblaggio dalla cassetta di dialisi in unità filtranti centrifughe con MWCO da 10 kDa equilibrati con tampone DF. Concentrato a 4.000 x g a 4 °C.
    NOTA: Una miscela di dialisi torbida potrebbe indicare un rapporto stechiometrico errato di MSP:lipid. Il precipitato deve essere rimosso a 18.000 x g per 20 minuti a 4 °C prima della concentrazione del campione. Per evitare precipitazioni durante la concentrazione del campione, utilizzare unità di ultrafiltrazione con un grande deadstop.
  5. Concentrare i nanodischi assemblati ad una concentrazione di almeno 300 μM. Misurare la concentrazione utilizzando un lettore UV/VIS. Si consideri che un nanodisco è formato da due molecole MSP1E3D1 e quindi, la concentrazione di MSP deve essere divisa per 2 per determinare la corretta quantità di nanodischi.
    NOTA: La configurazione descritta (Tabella 2) produrrà 0,6-1 mL di una soluzione di nanodisco da 300 μM.
  6. Centrifugare la preparazione concentrata di nanodischi a 18.000 x g per 20 minuti a 4 °C per rimuovere il precipitato. Quindi, aspirare il surnatante e congelare 50 μL aliquote in azoto liquido e conservare a -80 °C.
    NOTA: Si consiglia di valutare il successo della formazione di nanodischi utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale. Il campione deve essere monodisperso e deve contenere solo una bassa quantità di aggregati. Gli aggregati indicano che la quantità di lipidi nella configurazione è troppo alta. Come riferimento, è possibile utilizzare MSP1E3D1 purificato. Se la preparazione del nanodisco mostra un picco all'altezza del picco di riferimento MSP1E3D1, il rapporto lipidico/MSP1E3D1 scelto era troppo basso.

5. Scala preparativa 3 mL CECF impostazione della reazione

  1. Giorno 1: Preparare tutte le soluzioni madre necessarie come indicato (Tabella 3). Le scorte vengono conservate a -20 °C e scongelate a temperatura ambiente. Assicurati di miscelare accuratamente tutti i materiali dopo lo scongelamento e prima del pipettaggio. Calcolare i volumi richiesti per tutti gli stock e creare uno schema di pipettaggio (tabella 4). I composti ad alto peso molecolare saranno aggiunti solo nella RM. Per i composti a basso peso molecolare, è possibile preparare un mastermix combinato 3 x per RM e FM.
    NOTA: i volumi finali delle miscele composte potrebbero essere inferiori a quelli calcolati a causa della perdita di volume durante la miscelazione. Questo può essere evitato aggiungendo un volume in eccesso del 2-5% per compensare la perdita di volume.
  2. Equilibrare la membrana di una cassetta di dialisi da 3 mL in 100 mM di tris-acetato, pH 8,0. Assicurarsi di rimuovere il buffer in eccesso.
  3. Usare una siringa per trasferire la RM nella cassetta di dialisi. Rimuovere l'aria in eccesso nello scomparto RM mediante aspirazione con la siringa. Posizionare la cassetta di dialisi nella camera di dialisi.
  4. Riempire la camera di dialisi con 60 ml di FM. Posizionare il coperchio sulla camera e stringere le viti per fissarlo. Incubare la camera per 12-16 h a 30 °C a 200 giri/min.
    NOTA: Assicurarsi che la camera rimanga in posizione verticale durante l'agitazione, altrimenti lo scambio di composti a basso peso molecolare sarà ostacolato.
  5. Giorno 2: Utilizzando una siringa, aspirare la RM dalla camera di dialisi. Trasferire l'RM in provette fresche e centrifugare a 16.000 x g a 4 °C per 10 minuti per rimuovere il precipitato. Trasferire il surnatante in provette fresche. La proteina nel surnatante può ora essere ulteriormente analizzata.
    NOTA: In alcuni casi, un pellet sarà presente dopo la centrifugazione. Questo può fornire importanti informazioni sull'idoneità dei nanodischi analizzati o dei composti di reazione per mantenere solubile l'MP sintetizzato. Si consiglia quindi di analizzare la quantità di target potenzialmente presente nel precipitato utilizzando SDS-PAGE, Western Blot, o mediante valutazione visiva della dimensione del pellet.

6. Scala analitica 60 μL CECF impostazione della reazione per lo screening ionico Mg2+

  1. Giorno 1: Mescolare tutti i componenti del rispettivo master mix 3x e distribuire 60 μL all'RM e 825 μL all'FM. Riempire FM con H2O e mescolare FM mediante vortexing. Trasferire FM in 3 pozzetti della micropiastra da 24 pozzetti (Tabella 5).
    NOTA: Poiché il contenitore Mini-CECF personalizzato potrebbe non essere accessibile, i volumi nella Tabella 5 sono calcolati per una reazione effettuata in cartucce di dialisi (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) con un volume FM di 1,7 mL in 96 piastre a pozzetto profondo (2 ml) (Figura 1).
  2. Tagliare i tubi di dialisi di cellulosa rigenerata con un MWCO da 10-14 kDa in pezzi di dimensioni circa 25 x 20 mm e conservare in H2O con azide di sodio allo 0,05% (p/v).
    ATTENZIONE: L'azoturo di sodio è molto tossico. Evitare qualsiasi contatto con la pelle o le mucose. Non utilizzare contenitori metallici poiché l'azoturo di sodio può reagire con i metalli per formare azoturi metallici esplosivi.
  3. Prima dell'assemblaggio del contenitore Mini-CECF, rimuovere l'H2O eccessivo dalle membrane di dialisi con un tessuto. Posizionare un pezzo di membrana su ciascun contenitore e fissare le membrane con un anello di politetrafluoretilene.
  4. Trasferire il contenitore Mini-CECF nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti con 825 μL di FM. Evitare bolle d'aria sotto la membrana di dialisi del contenitore Mini-CECF.
  5. Aggiungere componenti ad alto peso molecolare alla RM come descritto (Tabella 5) e mescolare mediante pipettaggio su e giù. Aggiungere 60 μL al contenitore di reazione. Evitare bolle d'aria durante il trasferimento della soluzione viscosa.
  6. Tagliare 2 fogli di 8 x 10 cm di un film termoplastico sigillante e avvolgerli attorno alla piastra a 24 pozzetti con all'interno i contenitori di reazione. Ciò ridurrà l'evaporazione dalla miscela di reazione. Ora posiziona il coperchio della piastra di coltura cellulare sulla piastra e fissalo con del nastro adesivo. Incubare la piastra a 30 °C e agitare 200 giri/min per 12-16 h.
  7. Giorno 2: Raccogliere la miscela di reazione perforando la membrana di dialisi con la punta del pipet nel contenitore Mini-CECF e aspirare la RM. Trasferire RM in tubi freschi e centrifugare a 16.000 x g a 4 °C per 10 minuti per rimuovere i precipitati. Trasferire il surnatante in provette fresche. La proteina nel surnatante può ora essere ulteriormente analizzata.
    NOTA: In alcuni casi, dopo la centrifugazione sarà presente un pellet. Ciò può fornire importanti informazioni sull'idoneità dei nanodischi analizzati o di altri composti di reazione per mantenere solubile l'MP sintetizzato. Si consiglia quindi di analizzare la quantità di target potenzialmente presente nel precipitato mediante SDS-PAGE, Western Blot, o valutazione visiva della dimensione del pellet.

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Representative Results

L'impatto dei composti di reazione di messa a punto sulla resa finale o sulla qualità dei MP sintetizzati è esemplificato. Un approccio di routine frequente è quello di regolare la concentrazione ottimale di Mg2+ nelle reazioni CF mediante l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) come un comodo monitor dell'efficienza del sistema. Ad esempio, la GFP è stata sintetizzata da un vettore pET-21a (+) a concentrazioni di Mg 2+ comprese tra 14 e24 mM (Figura 2). L'analisi SDS-PAGE ha identificato la concentrazione ottimale di Mg 2+ a 20 mM (Figura 2A), che è in buona conformità con le misure complementari di fluorescenza (eccitazione a 485 nm, misurazione dell'emissione a 535 nm) del surnatante di reazione CF (Figura 2B). Per l'espressione della FC del PR batterico espresso dal vettore pIVEX 2.3 e del recettore adrenergico β 1 del tacchino (Tβ1AR) espresso dal vettore pET-21a(+), la concentrazione ottimale di Mg 2+ è stata identificata a 20-22 mM.

Come ulteriore esempio, viene mostrato il perfezionamento della qualità dei parlamentari sintetizzati con la strategia descritta. I parametri regolabili per l'inserimento co-traduttivo di MP in nanodischi preformati sono (i) la composizione lipidica della membrana del nanodisco e (ii) la concentrazione finale di nanodischi nella reazione. È noto che l'ambiente idrofobico è un parametro importante per il corretto ripiegamento, l'assemblaggio oligomerico e la stabilità dei MP. Poiché la composizione lipidica nei nanodischi può essere modulata, l'approccio descritto consente uno screening sistematico diretto degli effetti lipidici sulla struttura e sulla funzione di un MP. Negli esperimenti iniziali, si raccomanda di esaminare i lipidi con gruppi di testa fosfatidilcolina (PC) e fosfatidilglicerolo (PG) e di testare diverse lunghezze e saturazioni della catena. Viene mostrato l'impatto della composizione della membrana e della concentrazione di nanodischi sull'efficienza e sulla qualità della solubilizzazione di due diversi MP. PR è una pompa protonica attivata dalla luce e un MP molto stabile e altamente sintetizzato che raggiunge concentrazioni finali di > 100 μM nella RM. Pertanto, si raccomanda di utilizzarlo come controllo positivo per garantire la corretta impostazione della reazione poiché la concentrazione di PR può essere facilmente valutata misurando l'assorbimento a 530 nm nel supernatante RM. Al contrario, Tβ1AR è un esempio della grande famiglia dei recettori accoppiati a proteine G eucariotiche (GPCR) ed è un MP complesso e instabile. Per un comodo monitoraggio, è stato sintetizzato un costrutto di fusione Tβ1AR-GFP e la concentrazione totale del recettore solubilizzato a nanodisco nelle reazioni CF è stata determinata tramite fluorescenza GFP (Figura 3A). La frazione del recettore attivo funzionalmente ripiegato e legante il ligando è stata ulteriormente determinata utilizzando un saggio di legame del filtro e il ligando marcato [3H]-diidroalprenololo (Figura 3B). Il test di legame del filtro è stato eseguito come descritto in precedenza14. In breve, la concentrazione di Tβ1AR-GFP nella RM è stata determinata attraverso la sua fluorescenza. Il GPCR è stato incubato con il ligando radiomarcato per 1 ora a 20 °C, applicato a un filtro e il ligando non legato è stato lavato via. Per la determinazione del legame aspecifico [3H]-diidroalprenololo, il recettore è stato saturato con alprenololo non marcato in una reazione di controllo. I conteggi del ligando radioattivo nei filtri sono stati misurati in un contatore di scintillazione e la quantità di ligando legato è stata determinata tramite la sua specifica attività di etichettatura. L'attività di legame GPCR percentuale è stata quindi calcolata dalla quantità di ligando legato, dalla concentrazione di Tβ1AR-GFP e dal volume del test. La sintesi complessiva e la solubilizzazione dei nanodischi di Tβ1AR-GFP sono simili con tutte le composizioni di membrana analizzate e nell'intervallo di 8-13 μM (Figura 3A). Al contrario, una variazione molto più elevata è rilevabile nella qualità del GPCR sintetizzato. L'attività più bassa con meno del 10% di frazione attiva si ottiene con i lipidi DMPC e POPC. Con DOPG e POPG, la frazione attiva di Tβ1AR-GFP potrebbe essere aumentata a circa il 30% (Figura 3B). I risultati indicano che la carica del gruppo lipidico e la flessibilità della catena degli acidi grassi sono importanti modulatori per il ripiegamento e l'attività di questo GPCR.

Oltre alla composizione dei nanodischi, la loro concentrazione finale nella reazione CF può essere un fattore importante per la qualità MP. Una volta identificata una composizione di membrana adatta di un nanodisco, la sua concentrazione durante la sintesi di MP deve essere sottoposta a screening. È ovvio che la concentrazione del nanodisco deve essere regolata in base all'efficienza di espressione di un MP. La sintesi CF del recettore Tβ1AR-GFP e PR determina concentrazioni finali di circa 10 μM e 100 μM nella RM, rispettivamente. Se la concentrazione del nanodisco viene sottoposta a screening entro un intervallo di 3,75-60 μM, si ottiene una solubilizzazione completa del GPCR a circa 30 μM nanodisc, dando un rapporto di Tβ 1 AR:nanodisc di1:3 (Figura 4A). Al contrario, la solubilizzazione completa del PR è già stata raggiunta con circa 10 μM nanodischi e fornisce un rapporto PR:nanodisco di 10:1 (Figura 4B). Un eccesso di nanodischi è quindi necessario per ottenere una solubilizzazione quasi completa di Tβ1AR-GFP, mentre un rapporto invertito nel caso di PR indica l'inserimento di più copie PR in un nanodisco. Studi successivi di complessi PR/nanodischi purificati con spettrometria di massa nativa hanno confermato questa osservazione e hanno trovato una prevalenza di forme oligomeriche più elevate di PR se sintetizzate a concentrazioni di nanodischi più basse15,18. La titolazione di MP sintetizzati in CF con nanodischi può quindi essere utilizzata come strumento per innescare assemblaggi oligomerici e per studiare i loro effetti sulla funzione MP.

Figure 1
Figura 1: Strategia di espressione del CECF per l'inserimento di proteine di membrana in nanodischi. (A) Flusso di lavoro di base che illustra le fasi principali del processo. (B) Recipienti di reazione su scala analitica personalizzati per l'espressione di CECF. (C) Cartucce per dialisi disponibili in commercio per la configurazione CECF su scala analitica. (D) Configurazione della bilancia preparativa (3 mL RM) inclusa una cassetta di dialisi da 3 mL e un contenitore FM in plexiglass personalizzato. (E) Inserimento co-traduzionale di MP in nanodischi preformati e screening lipidico nella configurazione CECF. L'RM contiene i macchinari di trascrizione/traduzione necessari e i nanodischi mentre composti a basso peso molecolare sono presenti in entrambi i compartimenti. Le applicazioni biochimiche e strutturali dei campioni MP/nanodisc prodotti sono ulteriormente illustrate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Effetto di diverse concentrazioni di Mg2+ sulla sintesi della GFP CF. La GFP è stata sintetizzata in reazioni CF con concentrazioni di Mg 2+ entro un intervallo di14-24 mM. (A) L'analisi SDS-PAGE mostra la banda più forte di GFP a 20 mM Mg2+. M: Marcatore. (B) Fluorescenza della GFP dopo espressione di FC con diverse concentrazioni di Mg2+ . La fluorescenza massima della GFP a 20 mM Mg2+ corrisponde a 4,6 mg/ml. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di una misurazione duplicata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Effetto della composizione della membrana del nanodisco sulla solubilizzazione e sulla qualità di un GPCR sintetizzato con CF. Resa e attività di Tβ1AR-GFP sintetizzata in presenza di nanodischi da 30 μM contenenti diverse composizioni di membrana. La proteina sintetizzata totale ( A ) e la frazione del recettore attivo legante il ligando (B) sono indicate in μM. La concentrazione totale è stata determinata mediante misurazione della fluorescenza della fusione GFP. L'attività è stata misurata mediante saggio di legame del filtro con il ligando radiomarcato [3H]-diidroalprenololo. Le barre di errore rappresentano deviazioni standard di triplicati indipendenti. Dati tratti dal manoscritto pubblicato in precedenza14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Schermo di solubilizzazione di MP sintetizzati con CF con concentrazioni crescenti di nanodischi. Gli MP sono stati sintetizzati in presenza di nanodischi forniti entro un intervallo di 3,75-60 μM. (A) Espressione di Tβ1AR-GFP con nanodischi (DMPC) nella reazione CF. La concentrazione totale è stata determinata mediante misurazione della fluorescenza della fusione GFP. Dati tratti dal manoscritto pubblicato in precedenza14. I campioni purificati con tag di affinità sono stati analizzati da SDS-PAGE e la colorazione Coomassie-Blue mostra due bande prominenti corrispondenti a Tβ1AR-GFP a circa 50 kDa e MSP1E3D1 sopra 25 kDa (B) Espressione di PR con nanodischi (DOPG) nella reazione CF. La concentrazione totale di PR è stata determinata mediante misurazione dell'assorbimento a 530 nm. Dati tratti dal manoscritto precedentemente pubblicato10,18. Le foto mostrano il colore rosso delle reazioni finali a causa della presenza di PR piegati. I pittogrammi illustrano l'assemblaggio PR modulato verso conformazioni oligomeriche più basse su concentrazioni aumentate di nanodischi, come rivelato dalla successiva spettrometria di massa nativa18. I campioni purificati con tag di affinità sono stati analizzati da SDS-PAGE e la colorazione Coomassie-Blue mostra due bande prominenti corrispondenti a PR a circa 20 kDa e MSP1E3D1 superiore a 25 kDa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Composto Intervallo di concentrazione finale Effetto sul campione MP
mg2+ 10 - 30 mM cedere
DTT 1 - 20 mM Formazione di ponti disolfuro, pieghevoli
20 Miscela di aminoacidi1 0,2 – 2 mM cedere
GSSG : GSH2 (1-10 μM) : (1-10 μM) Formazione di ponti disolfuro, pieghevoli
Nanodischi 10 - 100 μM solubilizzazione, assemblaggio oligomerico, piegatura
Tipo lipidico solubilizzazione, assemblaggio oligomerico, piegatura
S30 : HS30 lisato3 (50-100 %) : (50-100 %) piegamento
S12 - S100 20 – 50 % resa, background MP nei saggi di canale
Modello DNA 0,5 – 30 ng/μL RM resa, assemblaggio oligomerico, piegatura
Progettazione di modelli di DNA cedere
1, la miscela può essere variata in base alla composizione individuale di un MP per migliorare ad esempio la resa o ottimizzare gli schemi di etichettatura NMR.
2, GSH dovrebbe sempre essere preparato fresco.
3, la concentrazione totale di lisato di CF nella RM deve essere almeno del 35 % con un tenore di S30 di almeno il 50 % al fine di garantire elevati livelli di espressione.

Tabella 1: Componenti critiche di screening delle reazioni FC.

MSP1E3D1 Lipide DPC
Rapporto (410 μM di stock) (50 000 μM di stock) (10 % (p/v) stock)
Lipide Lipidi : MSP V(MSP) c(MSPfinale) V(lipidi) C(lipide finale) V(DPC) c(DPCfinale) Buffer DF
[μL] [μM] [μL] [μM] [μL] [%] [μL]
telescrivente 115 : 1 1500.0 205.0 1415.0 23 575 30.0 0.1 55.5
DOPC 80 :1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPC 85 : 1 1500.0 205.0 1046.0 17 425 30.0 0.1 425.0
DMPG 110 : 1 1500.0 205.0 1353.0 22 550 30.0 0.1 117.0
DOPG 80 : 1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPG 90 : 1 1500.0 205.0 1107.0 18 450 30.0 0.1 363.0

Tabella 2: Rapporti lipidi/MSP1E3D1 per configurazioni di assemblaggio in vitro da 3 ml .

Composto Concentrazione Preparazione
Modello di plasmide del DNA1 > 400 μg/mL in 10 mM Tris-HCl pH 8,0 Preparazione kit Midi/Maxi (es. Qiagen)2
Miscela di 20 aminoacidi3 25 mM ciascuno in H2O precipitare rimane4
Miscela di 4 NTP (75 x) c(CTP) 240 mM, c(ATP) 360 mM, c(UTP) 240 mM, c(GTP) 240 mM
in H2O. Regolare il pH a 7-8 con KOH		 Un po 'di precipitato rimane4
Acetil fosfato 1 M in H2O, regolare pH 7-8 con KOH precipitare rimane4
Acido fosfo(enolo)piruvico (K+) 1 M in H2O, regolare pH 7-8 con KOH
Acido folinico 10 mg/ml in H2O precipitare rimane4
DTT 0,5 m in H2O
C0mplete cocktail inibitore della proteasi 1 compressa per 1 mL in H2O
Tris-acetato, pH 8.0 2,4 m in H2O
Mg(OAc)2 1 m in H2O
KOAc 10 m in H2O
Ribolock RNasi-inibitore 40 U/mL Thermo Fisher Scientific
tRNA (E. coli) 40 mg/ml in H2O Roche (Germania)
T7RNAP 3-7 mg/mL5 Vedi protocollo sezione 2
Piruvato chinasi 10 mg/ml Roche (Germania)
Nanodischi (DMPG) 0,2-1,0 mM6 in 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 100 mM NaCl Vedere le sezioni 3 e 4 del protocollo
1, il modello PCR potrebbe essere utilizzato a concentrazioni simili.
2, la qualità del DNA preparato con il kit "Mini" non è soddisfacente.
3, la cisteina tende ad essere instabile e può essere aggiunta separatamente.
4, la soluzione è sovrasatura, è necessaria una miscelazione accurata immediatamente prima di rimuovere le aliquote.
5, per ogni nuovo lotto di T7RNAP, si raccomanda una schermata iniziale per identificare la migliore concentrazione finale.
6, la solubilità dei nanodischi può dipendere dalla loro composizione lipidica.

Tabella 3: Preparazione delle soluzioni madre CF.

Composto
Per Mastermix (3.0 x) C(finale) V [μL]
Miscela di 20 aminoacidi 1 mM 2520.0
Miscela di 4 NTP (75 x) 1x 840.0
Acetil fosfato 20 mM 1260.0
Fosfo(enolo)
acido piruvico		 20 mM 1260.0
Acido folinico 0,1 mg/ml 630.0
Tris-acetato, pH 8.0 100 mM 2625.0
c0mplete 50 x 1x 1260.0
Mg(OAc)2 19,8 (= 20)1 mM 1260.0
KOAc 180 (= 270)2 mM 1140.0
DTT 2 mM 252.0
H2O 7953.0
Totale 21 000
Per RM C(finale) V [μL]
3x Mastermix 1 x 1000.0
Inibitore della RNasi 0,3 U/μL 22.5
tRNA (E. coli) 0,5 mg/ml 37.5
Nanodischi (DMPG)3 10 μM 75.0
Modello DNA4 0,015 ng/μL 112.5
Piruvato chinasi 0,04 mg/ml 12.0
T7RNAP5 0,03 mg/ml 15.0
S30 lisato 0.35 % 1050.0
Retina All-trans6 0,6 mM 9.0
H2O - 666.5
Totale 3000.0
Per FM C(finale) V [μL]
Mastermix (3 x) 1 x 20 000
H2O - 40 000
Totale 60 000
1, 0,2 mM Mg2+ sono forniti dal lisato S30.
2, 90 mM K+ sono forniti dall'acetilfosfato e dall'acido fosfo(enolo) piruvico.
3, la soluzione madre calcolata è 400 μM.
4, la soluzione madre calcolata è 400 μg/ml.
5, la soluzione madre calcolata è 6 mg/ml.
6, cofattore specifico per PR, la soluzione madre è 200 mM in DMSO.

Tabella 4: Schema di pipettaggio per una reazione CECF con 3 ml di RM e 60 mL di FM

Composto
Per Mastermix (3.0 x) C(finale) V [μL]
Miscela di 20 aminoacidi 1 mM 864.0
Miscela di 4 NTP 1x 288.0
Acetil fosfato 20 mM 432.0
Acido fosfo(enolo)piruvico 20 mM 432.0
Acido folinico 0,1 mg/ml 216.0
Tris-acetato, pH 8.0 100 mM 900.0
c0mplete 1x 432.0
Mg(OAc)2 13,8 (= 14) mM1 298.0
KOAc 180 (= 270) mM2 389.0
DTT 2 mM 86.4
H2O - 2862.6
Totale [μL]1 - 7200.0
Mg2+ concentrazione
14 mM 16 mM 18 mM 20 mM 22 mM 24 mM
Per RM C(finale) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0
0,1 M mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0
Inibitore della RNasi 0,3 U/μL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
tRNA (E. coli) 0,5 mg/ml 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
Modello DNA3 0,015 ng/μL 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5
Piruvato chinasi 0,04 mg/ml 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
T7RNAP4 0,03 mg/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
S30 lisato 35 % 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0
H2O - 49.7 45.7 41.7 37.7 33.7 29.7
Totale [μL]5 - 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0
Mg2+ concentrazione
14 mM 16 mM 18 mM 20 mM 22 mM 24 mM
Per RM C(finale) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0
0,1 M mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 68.0 136.0 204.0 272.0 340.0
H2O - 2267.0 2199.0 2131.0 2064.0 1995.0 1927.0
Totale [μL]5 - 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0
1, 0,2 mM Mg2+ sono forniti dal lisato S30. Il mastermix viene regolato alla più bassa concentrazione di screening.
2, 90 mM K+ sono forniti dall'aceto fosfato e dall'acido fosfo(enolo) piruvico.
3, la soluzione madre calcolata è 400 μg/ml.
4, la soluzione madre calcolata è 6 mg/ml.
5, le reazioni vengono eseguite in duplicati.

Tabella 5: Schema di pipettaggio per vaglio di concentrazione Mg2+ con 100 μL di RM e 1,7 mL di FM.

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Discussion

Vengono descritti il setup e le strategie per ottimizzare l'espressione CF e l'inserimento co-traduttivo di MP funzionali nei nanodischi. L'attrezzatura necessaria comprende un bioreattore, un dispositivo di pressatura francese o simile, un lettore UV / VIS e fluorescenza, recipienti di reazione CF adatti per una configurazione a due compartimenti e un incubatore a temperatura controllata. Ulteriori attrezzature standard sono centrifughe per la raccolta di cellule di E. coli e centrifughe da tavolo che raggiungono almeno 30.000 x g per la preparazione di lisati S30. Se devono essere preparati lisati S80-S100, sono necessarie ultracentrifughe. Le apparecchiature elencate sono regolarmente disponibili nei laboratori biochimici e non sono necessari investimenti iniziali più grandi per iniziare con l'espressione CF. Inoltre, la fermentazione e la manipolazione delle cellule di E. coli per il lisato CF e i preparati T7RNAP sono tecniche comuni e robuste. I composti più costosi sono il lisato CF, il T7RNAP e i nanodischi. Possono essere preparati con protocolli affidabili ed efficienti e le aliquote sono stabili per anni a -80 °C. I protocolli richiedono tre giorni ciascuno per la preparazione del lisato CF e del T7RNAP e circa una settimana per l'espressione e la purificazione della MSP e la preformatura dei nanodischi. Il DNA modello target può essere fornito utilizzando pET-21, pIVEX o sistemi vettoriali simili. Per l'impostazione e l'ottimizzazione dei sistemi di espressione CF, la produzione di varianti GFP come GFP spostato (GFP+) o superfolderGFP può essere utilizzata come monitor20,32. Per le condizioni di produzione MP, l'espressione di PR è un buon sistema modello o controllo positivo in quanto si piega in molte condizioni diverse e può essere facilmente monitorato mediante assorbanza a 530 nm10,15,18. Per stabilire un protocollo di espressione CF efficiente per un nuovo MP, si raccomanda l'ottimizzazione del codone del frame di lettura target e l'utilizzo di fusioni con GFP collegata C-terminalmente25,26. Ulteriori materiali richiesti includono sostanze chimiche ed enzimi che sono tutti disponibili in commercio. Questi componenti devono essere ottenuti in alta qualità e un calcolo del costo complessivo per la reazione CF descritta con 3 mL di RM e 60 mL di FM ammonterebbe a circa 150-200 €. Un'applicazione primaria per i sistemi di espressione CF è quindi la produzione di proteine difficili da ottenere nei classici sistemi di espressione basati su cellule come molti MP o tossine. I sistemi CF sono inoltre piattaforme fondamentali nella biologia sintetica e campi di applicazione in continua crescita li rendono sempre più indispensabili come strumento nella ricerca molecolare. Tra le altre applicazioni, di routine sono l'etichettatura delle proteine, i processi ad alto rendimento o la progettazione di cellule sintetiche.

La strategia dimostrata consente la produzione senza detergenti di MP puri già inseriti negli ambienti lipidici desiderati di nanodischi altamente solubili. Una volta stabilito e ottimizzato il protocollo di espressione CF per un MP, la produzione è molto veloce e campioni puri possono essere ottenuti in meno di 24 ore anche in scala preparativa. I complessi MP/nanodisco vengono purificati direttamente dalla reazione CF tramite streptavidina II o tag poliistidinici attaccati all'MP. Il processo consente l'analisi funzionale e strutturale parallela di campioni MP identici mediante una serie di tecniche diverse33. La rapidità e l'efficienza della strategia sono quindi competitive rispetto agli approcci convenzionali che impiegano sistemi di espressione basati su cellule e l'estrazione detergente di MP dalle membrane cellulari seguita da ricostituzione in vitro di routine 5,34. L'accessibilità aperta delle reazioni CF facilita ulteriormente numerosi studi meccanicistici unici di ripiegamento MP e inserimento di membrana 15,16,18, assemblaggio complesso MP15,18,24 o regolazione funzionale 23.

Un'importante differenza tra l'espressione della CF e l'espressione basata sulle cellule è l'assenza di sistemi di controllo della qualità per il prodotto proteico sintetizzato. Qualsiasi polipeptide tradotto indipendente dal suo ripiegamento funzionale finirà nel campione finale del prodotto. Inoltre, il processo di inserimento nelle membrane dei nanodischi è artificiale e indipendente dal translocon e può comportare un'integrazione incompleta o potrebbe non funzionare affatto con un certo numero di bersagli MP. La frazione di prodotto infine solubilizzata in una reazione CF potrebbe quindi essere abbastanza eterogenea contenente MP completamente inseriti ma anche solo parzialmente integrati o associati alla membrana. Di conseguenza, solo una piccola frazione di un campione purificato di complessi MP/nanodischi potrebbe essere ripiegata funzionalmente. La modifica della composizione della membrana e l'attenta messa a punto dei rapporti MP/nanodischi modulando le concentrazioni di nanodischi e modelli di DNA sono strumenti adatti per l'ottimizzazione. Tuttavia, gli approcci di controllo della qualità a valle, come il profilo di esclusione dimensionale e i saggi funzionali quantitativi specifici per il target, sono sempre necessari per l'ottimizzazione dei protocolli di espressione della CF. La disponibilità di tali saggi può quindi limitare le applicazioni, in particolare nei progetti che includono MP che richiedono ambienti liposomici per funzioni come trasportatori, canali o pompe. Inoltre, le limitazioni delle dimensioni dei nanodischi potrebbero limitare l'inserimento di grandi gruppi MP.

Negli esempi documentati, la variazione della frazione funzionalmente piegata del GPCR Tβ1AR-GFP è compresa nell'intervallo di pochi punti percentuali, fino a circa il 30%. Il folding funzionale richiede un'attenta regolazione di un certo numero di parametri14 e un simile processo di ottimizzazione individuale e noioso potrebbe essere necessario anche per altri GPCR22. Tuttavia, la resa finale del GPCR funzionalmente ripiegato è competitiva con altri sistemi di produzione e consente la messa a punto di > 1.000 saggi radio per studi di legame del ligando da una singola reazione da 60 μL in un reattore Mini-CECF su scala analitica. Vale la pena ricordare che gli studi di legame del ligando dei costrutti di fusione GPCR-GFP non richiedono alcuna fase di purificazione. Se necessario, la purificazione può essere ottenuta sfruttando i tag di affinità attaccati al MP sintetizzato, come His-tags o Strep-tag II. L'RM viene quindi diluito nel tampone desiderato e caricato sulla corrispondente colonna cromatografica di affinità che è stata pre-equilibrata di conseguenza. La valutazione strutturale di PR e di altri MP sintetizzati con CF mediante spettroscopia NMR o cristallizzazione hanno già contribuito a stabilire i sistemi di espressione CF come piattaforme fondamentali nella ricerca MP. La strategia descritta per la produzione di complessi MP/nanodischi potrebbe diventare particolarmente interessante per futuri studi strutturali mediante microscopia elettronica.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare la sovvenzione BE1911/8-1 della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), il progetto LOEWE GLUE e il centro di ricerca collaborativa Transport and Communication across Membranes (SFB807) per il sostegno finanziario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) Carl Roth (Germany) 4855
2-Mercaptoethanol Carl Roth (Germany) 4227
2-Propanol Carl Roth (Germany) 9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride American Radiolabeled Chemicals (USA) ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) Merck (Germany) 1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) Sigma Aldrich (Germany) A9251
Alprenolol hydrochloride Merck (Germany) A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® Sigma-Aldrich (Germany) Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1 Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1 B.Braun (Germany)
Centrifuge Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid Carl Roth (Germany) 8137
Coomassie Brilliant Blue R250 Carl Roth (Germany) 3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt Sigma-Aldrich (Germany) C1506
D-glucose monohydrate Carl Roth (Germany) 6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate Carl Roth (Germany) 6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing Fisher Scientific (Germany) 8700152
Dithiothreit Carl Roth (Germany) 6908
Ethanol Carl Roth (Germany) K928
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma-Aldrich (Germany) 47612
French pressure cell disruptor SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol Carl Roth (Germany) 3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) Sigma-Aldrich (Germany) G8877
Hydrochloric Acid Carl Roth (Germany) K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL GE Life Sciences (Germany) GE17-5248
Imidazole Carl Roth (Germany) 3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Carl Roth (Germany) 2316
Kanamycin Carl Roth (Germany) T832
L-Alanine Carl Roth (Germany) 3076.1
L-Arginine Carl Roth (Germany) 6908
L-Asparagine Carl Roth (Germany) HN23
L-Aspartic Acid Carl Roth (Germany) T202
L-Cysteine Carl Roth (Germany) T203
L-Glutamic Acid Carl Roth (Germany) 3774
L-Glutamine Carl Roth (Germany) 3772
L-Glycine Carl Roth (Germany) 3187
L-Histidine Carl Roth (Germany) 3852
L-Isoleucine Carl Roth (Germany) 3922
L-Leucine Carl Roth (Germany) 1699
L-Lysine Carl Roth (Germany) 4207
L-Methionine Carl Roth (Germany) 9359
L-Proline Carl Roth (Germany) 1713
L-Phenylalanine Carl Roth (Germany) 1709
L-Serine Carl Roth (Germany) 4682
L-Threonine Carl Roth (Germany) 1738
L-Tryptophane Carl Roth (Germany) 7700
L-Tyrosine Carl Roth (Germany) T207
MD100 dialysis units Scienova (Germany) 40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) Carl Roth (Germany) 6763
n-dodecylphosphocholine Antrace (USA) F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000 Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine Carl Roth (Germany) 6681
Peristaltic pump: ip-12 Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt Sigma Aldrich (Germany) 860077
Potassium dihydrogen phosphate Carl Roth (Germany) P018
Potassium acetate Carl Roth (Germany) 4986
Potassium chloride Carl Roth (Germany) 6781
Pyruvate Kinase Roche (Germany) 10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL Hidex (Finland)
SDS pellets Carl Roth (Germany) 8029
Sodium azide Sigma-Aldrich (Germany) K305
Sodium chloride Carl Roth (Germany) P029
Spectrophotometer Nanodrop Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli) Roche (Germany) 10109550001
Ultra sonificator Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) Sigma-Aldrich (Germany) U6625
Y-30 antifoam Sigma-Aldrich (Germany) A6457
Yeast extract Carl Roth (Germany) 2904

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References

  1. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  2. Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
  3. Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  4. Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
  5. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  6. Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
  7. Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
  8. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  9. Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
  10. Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
  11. Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
  12. Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
  14. Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
  15. Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
  16. Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  17. Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
  18. Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
  19. Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
  20. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  21. Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
  22. Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
  23. Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
  24. Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
  25. Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
  26. Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
  27. Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
  28. Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
  29. Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
  30. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  31. Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
  32. Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
  33. Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
  34. Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).

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Inserimento co-traduzionale di proteine di membrana in nanodischi preformati
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Levin, R., Koeck, Z., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs. J. Vis. Exp. (165), e61844, doi:10.3791/61844 (2020).

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