Summary
予め形成されたナノディスクへの共翻訳挿入により、界面活性剤と接触することなく、定義された脂質環境で無細胞合成膜タンパク質を研究することが可能になります。このプロトコルでは、必須のシステムコンポーネントの調製と、発現効率とサンプル品質を改善するための重要なパラメーターについて説明します。
Abstract
無細胞発現システムにより、膜タンパク質などの複雑なタンパク質の機能的フォールディングをサポートするために、反応環境を調整して設計することができます。ナノディスクとして供給される事前に形成され定義された膜への膜タンパク質の共翻訳挿入および折り畳みの実験手順が実証されています。このプロトコルは完全に洗剤を含まず、1日以内にミリグラムの精製サンプルを生成できます。得られた膜タンパク質/ナノディスクサンプルは、結晶化、核磁気共鳴、電子顕微鏡などのさまざまな機能研究や構造応用に使用できます。無細胞溶解物、設計されたメンブレンを備えたナノディスク、重要なストック溶液、および2コンパートメント無細胞発現反応の組み立てなどの基本的な主要コンポーネントの調製について説明します。膜タンパク質のフォールディング要件は非常に多様であるため、このプロトコルの主な焦点は、重要な塩基性反応化合物、ナノディスクの膜組成、酸化還元およびシャペロン環境、DNAテンプレート設計など、サンプル品質にとって重要なパラメーターと反応ステップの調節です。全過程は、プロテオロドプシンおよびGタンパク質共役受容体の合成によって実証される。
Introduction
膜タンパク質(MP)は、水性環境に不溶であるため、タンパク質生産研究において困難な標的です。従来のMP生産プラットフォームは、 大腸菌、酵母、真核細胞などの細胞ベースのシステムで構成されています。合成された組換えMPは、細胞膜から抽出されるか、封入体1からリフォールディングされます。界面活性剤の可溶化後、MPは、確立されたin vitro再構成プロトコルによって適切な膜環境に移すことができます。小胞およびリポソームに加えて、MPはナノディスク2 またはサリプロ3 粒子の形態の平面膜に再構成され、最近では日常的な技術となっている。ただし、これらの戦略はすべて、MPとの界面活性剤の接触を意味し、不安定化、オリゴマーの解離、さらにはタンパク質の構造と活性の喪失を引き起こす可能性があります4。したがって、最適な洗剤の可溶化および再構成条件のスクリーニングは、面倒で時間がかかる場合があります5。
無細胞(CF)系の開放性により、発現反応は、定義された脂質組成を有する予め形成された膜で直接供給される。この脂質ベースの発現モード(L-CF)では、合成されたMPは、提供された二重層6,7に共翻訳的に挿入する機会を有する(図1)。平面脂質二重層ディスク8を取り囲む膜足場タンパク質(MSP)からなるナノディスクは、この戦略に特に適していると思われる9、10。ナノディスクは、さまざまな脂質を使用してin vitroで日常的に組み立てることができ、非常に安定しており、ストックは最大1 mMまで濃縮できます。しかしながら、大腸菌におけるMSP発現およびその精製は必要である。代替戦略として、MSPは、リポソーム11、12、13と共に供給されるCF反応において標的MPと共に共発現され得る。MSPとMPの両方のDNAテンプレートが反応に添加され、発現時にMP/ナノディスクが形成されます。MSP産生は回避されますが、共発現戦略では最終的なDNAテンプレート濃度の慎重な微調整が必要であり、サンプル産生効率のより高い変動が予想されます。
予め形成されたナノディスクの膜へのMPの共翻訳挿入は、トランスロコン機構およびシグナル配列から独立した非生理学的でまだほとんど知られていないメカニズムである13,14,15,16。挿入効率の主な決定要因は、膜タンパク質の種類と提供された膜の脂質組成であり、負に帯電した脂質が頻繁に好まれます15,17。ナノディスク膜はサイズが比較的限られているため、MP挿入時にかなりの量の脂質が放出されます18。ナノディスクサイズの変動は、より高いオリゴマーMP複合体の挿入および調整を可能にする15,18。とりわけ、ホモオリゴマー複合体の正しい集合は、イオンチャネルKcsA、イオンポンププロテオロドプシン(PR)、および多剤トランスポーターEmrE15,18について示されました。MPは、対称ナノディスク膜に両側から比較的等しい周波数で入る可能性があります。したがって、1つのナノディスクに挿入された異なるモノマーまたはオリゴマーは、反対の配向を有する可能性があることを考慮する必要があります。しかし、配向の偏りは、PR六量体およびKcsA四量体の形成について報告されているように、協同的な挿入機構によって引き起こされる可能性があります18。MP配向のさらなるバイアスは、おそらくナノディスク膜の縁に挿入されたMPの配向スイッチに起因する可能性があります。
大腸菌株からのCFライセートの製造は、信頼できるルーチン技術であり、ほぼすべての生化学実験室で実施することができる19,20。ジスルフィド架橋形成に加えて、MPが大腸菌溶解物を用いて合成される場合、他のほとんどの翻訳後修飾は存在しないと考えられるべきである。これにより、構造研究のためにより均質なサンプルが生成される可能性がありますが、個々のMPターゲットの機能に対する潜在的な影響を排除する必要がある場合があります。しかし、大腸菌CFライセート中のGタンパク質共役受容体(GPCR)14,21,22、真核生物トランスポーター23、または大型ヘテロマーアセンブリ24の高品質サンプルを効率的に生産することは、複雑な標的にも適していることを示しています。サンプルの分取スケール量(≈ 1 mg/mL)は、反応混合物(RM)と供給混合物(FM)コンパートメントで構成される2コンパートメント連続交換セルフリー(CECF)構成で得ることができます。FM体積はRM体積を15〜20倍超え、低分子量エネルギー化合物および前駆体19のリザーバを提供する。したがって、発現反応は数時間延長され、MPターゲットの最終収率が増加します。RMコンパートメントとFMコンパートメントは、10〜14 kDaのカットオフを備えた透析膜によって分離されています。2つのコンパートメントには、CECF反応容器の特別な設計が必要です(図1)。FMを保持するテーラードプレキシガラス容器と組み合わせたRM容器としての市販の透析カセットが好適な例である。MP収量は、RM:FM比を変更するか、一定期間のインキュベーション後にFMを交換することによってさらに操作できます。
MPの収率と品質には、反応パラメータの徹底的な最適化が求められることがよくあります。CF発現の重要な利点は、MPの個々の要件に応じてほぼすべての化合物を修正および微調整できることです。簡単な戦略は、最初に基本的な生産プロトコルを確立してMPの歩留まりを向上させることに焦点を当て、次に反応と折り畳み条件を微調整することによってMPの品質を最適化することです。CFライセートに生理学的プロセスがなく、複雑さが軽減されているため、MP25の効率的な生産の成功率が高くなっています。DNAテンプレートの設計およびMg2+イオン濃度の最適化に関する日常的な考慮事項は、ほとんどの場合、満足のいく収率を得るのに十分である26。発現モードによっては、より多様なパラメータをスクリーニングする必要があるため、MP品質の最適化に時間がかかる場合があります14、17、22。
記載されたCF発現プラットフォームを確立するには、 大腸菌 CFライセート(i)、T7 RNAポリメラーゼ(ii)、ナノディスク(iii)、および塩基性CECF反応化合物(iv)の生産にプロトコルが必要です(図1)。 大腸菌 K12株A1927 またはBL21誘導体は、効率的なS30(30,000 x gでの遠心分離)溶解物の調製に頻繁に使用されます。S30溶解物に加えて、他の g力で遠心分離された対応する溶解物(例えばS12)が使用され得る。ライセートは、発現効率とプロテオームの複雑さが異なります。記載されたプロトコルによって調製されたS30ライセートのプロテオームは、詳細に研究されている28。S30プロテオームには、イオンチャネルの発現および分析時にバックグラウンドの問題を引き起こす可能性のある残留外膜タンパク質がまだ含まれています。このようなターゲットには、S80-S100ライセートの使用が推奨されます。ライセート調製中の貴重な変更は、細胞の対数増殖期半ばでの熱ショックとエタノール供給の組み合わせによるSOS応答の誘導です。得られたHS30ライセートはシャペロンに富んでおり、MPフォールディングを改善するためにS30ライセートとのブレンドで使用することができる22。 大腸菌 ライセートにおけるCF発現は、T7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)によって制御されるプロモーターを含むDNAテンプレートとの共役転写/翻訳プロセスとして操作されます。この酵素は、pAR1219プラスミド29を保有するBL21(DE3)スター細胞で効率的に生産することができます。
MSP1E3D1の2つのコピーは、直径10〜12nmの1つのナノディスクに集合するが、以下に説明するプロトコルは、他のMSP誘導体に対しても機能する可能性がある。ただし、MSP1E3D1で形成されたナノディスクよりも大きいナノディスクは安定性が低下する傾向があり、MSP1などのMSP誘導体で形成された小さなナノディスクは、より大きなMPまたはMP複合体に対応できない可能性があります。MSP1E3D1ナノディスクは、多種多様な異なる脂質または脂質混合物を用いてin vitroで組み立てることができます。予め形成されたナノディスクは通常、-80°Cで>1年間安定ですが、安定性は脂質成分によって異なる場合があります。MPの折り畳みと安定性に対する脂質効果のスクリーニングのためには、代表的な種類の脂質/脂質混合物で組み立てられたナノディスクの包括的なセットを準備する必要があります。1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール)(DMPG)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール)(DOPG)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール)(POPG)および1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)。
3 mL CECF反応を調製するためのプロトコルについて説明します。1:1の比率でさらに拡大または縮小することが可能です。2コンパートメントCECF構成の場合、すべての化合物を含むRMと低分子量化合物のみを含むFMを準備する必要があります。10〜14 kDa MWCOの市販の3 mL透析装置はRM容器として使用でき、RM容器はFMを保持するカスタムメイドのプレキシガラス容器に入れられます(図1D)30。RM:FMの比率は1:20であるため、3 mL RMに対して60 mLのFMを準備する必要があります。 いくつかの成分の品質、濃度、または種類は、合成されたMPの最終的な収率および/または品質にとって重要な場合があります(表1)。DNAテンプレートは、公表されたガイドラインに従って調製されるべきであり、ターゲットのリーディングフレームのコドン最適化は、生成物収率をさらに有意に改善することができる26。分取スケールCECF反応について、PRの産生のための確立されたプロトコルが記載されている。新しいMPの発現プロトコルを確立するには、通常、収率と品質を向上させるために、特定の化合物の最適化スクリーニングを実行する必要があります(表1)。Mg2+ イオンについては、異なるDNAテンプレートに対して有意な変動を頻繁に示す、焦点を絞った最適な濃度が存在する。T7RNAPまたはS30ライセートの新しいバッチなどの他のCF反応化合物は、最適なMg2+ 濃度をさらにシフトさせる可能性があります。一例として、14〜24mMの濃度の範囲内でかつ2mMのステップで典型的なMg2+ スクリーンが説明される。各濃度は、二重および分析スケールのCECF反応でスクリーニングされます。CECF反応容器として、RMを保持するカスタムメイドのMini−CECFプレキシグラス容器30 が、FMを保持する標準的な24ウェルマイクロプレートと組み合わせて使用される(図1B)。あるいは、96深さウェルマイクロプレートまたは他の市販の透析装置と組み合わせた市販の透析カートリッジを適切なセットアップで使用してもよい(図1C)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. S30ライセートの調製
- 1日目: LB寒天プレート上のグリセロールストックから細胞をストリークアウトし、37°Cで一晩インキュベートします。
- 2日目: 200 mLのLB培地に寒天プレートからの細胞を接種し、37°Cで12〜14時間インキュベートします。
- 3日目:10 Lの滅菌YPTG培地(10 g/L酵母エキス、16 g/Lトリプトン、5 g/L NaCl、19.8 g/Lグルコース、4.4 mM KH 2 PO 4、8 mM K2HPO4)を100 mLの前培養(1:100)で15 L攪拌タンク反応器で37°Cに焼き戻します。37°C、500rpm、高通気(~毎分3風量)で培養します。過度の泡立ちを防ぐために、滅菌消泡剤を追加します。
- 600 nmの光学密度(OD)を一定の時間間隔で測定します。約2時間後、培養は対数段階に入ります。
- HS30ライセートの修飾: 細胞が中期対数期(OD600 ≈ 3.6-4.2)になったら、300 mLのエタノールを培地に加え、42°C、500 rpm、高通気(毎分約3空気量)でさらに45分間培養を進めます。次に、ステップ1.6で説明されているように、細胞培養物の冷却と回収を進めます。標準S30ライセートの製造については、このステップをスキップしてステップ1.6に進みます。
- 細胞が中期対数段階(OD600 ≈ 3.6-4.2)にある場合、30分以内に発酵槽<20°C未満に 冷却 します。最終的なOD600は約4.5〜5.5である必要があります。細胞 を 4,500 x g で4°Cで20分間回収し、上清を廃棄します。以下のステップを通して細胞を4°Cに保ちます。
注意: 冷却中に、過度の発泡が発生する可能性があります。この場合、消泡剤を追加するか、攪拌速度を下げるか、バイオリアクター内の空気流を減らします。 - スパチュラを使用して、300 mLのS30-Aバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.2、14 mM Mg(OAc)2、60 mM KCl、6 mM 2-メルカプトエタノール)に細胞を完全に懸濁し、その後、均一になるまで懸濁液を上下にピペッティングします。8,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 この手順を 2 回繰り返します。
注意:2-メルカプトエタノールは有毒です。皮膚や気道との接触を避けてください。可能であれば、フードの下で作業してください。最後の洗浄ステップの前に、空の遠心分離機ビーカーの重量を量ります。遠心分離後、湿潤気泡ペレットを秤量し、ステップ1.8に進むか、さらに使用するまでペレットを保管します。
注:湿電池ペレットの重量は、1 Lバイオリアクター培養あたり5〜7 gです。この時点で、プロトコルを一時停止し、ペレットを液体窒素で凍結し、-80°Cで4〜8週間保存できます。 - 細胞を1.1容量(1 g = 1 mL)のS30-Bバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.2、14 mM Mg(OAc)2、60 mM KOAc、1 mM DTT、1錠のcOmpleteプロテアーゼ阻害剤)に完全に懸濁します。懸濁液を予冷したフレンチプレス圧力セルに充填し、1,000 psigでセルを破壊します。セルをフレンチプレスに一度通します。
- ライセートを30,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。 上清を新しいチューブに移し、遠心分離ステップを繰り返します。
注:最初の遠心分離後、ペレットの上に緩くてぬるぬるした層が存在する可能性があり、上清と一緒に移すべきではありません。 - 高塩分と熱のステップを適用して、不安定なライセート成分を除去し、リボソームからmRNAを放出します。ライセートを0.4 M NaClに調整し、水浴中で42°Cで45分間インキュベートします。
注意: このステップは、重大な沈殿物の形成を引き起こします。インキュベーション中にチューブを時々反転または反転させます。 - 濁った懸濁液(通常50〜80 mL)を10〜14 kDaカットオフの透析チューブに移し、5 L S30-Cバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.2、14 mM Mg(OAc)2、60 mM KOAc、0.5 mM DTT)に対して透析します。2〜3時間後にS30-C透析バッファーを交換し、さらに12〜14時間透析します。
- 4日目: 透析した懸濁液を遠心チューブに移し、30,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。 上清(S30ライセート)を新鮮な50 mLチューブに移し、穏やかに混合します。ライセートのタンパク質濃度は約30〜40 mg / mLである必要があります。.液体窒素中でアリコート(0.5 mL、1 mLなど)を衝撃凍結し、-80°Cで保存します。 アリコートは>1年間安定しています。
2. T7 RNAポリメラーゼの発現と精製
- 1日目: 100 μg/mLアンピシリンを含む200 mL LB培地に、新たに播種したBL21(DE3)Star x pAR1219細胞を接種し、37°Cおよび180 rpmで12〜16時間インキュベートします。
- 2日目: 1 Lの素晴らしいブロス(12 g / Lトリプトン、24 g / L酵母エキス、4 mL / Lグリセロール)を10 mLの前培養を含む2 Lバッフルフラスコに接種し、37°Cおよび180 rpm攪拌でインキュベートします。開始時のOD600は約0.1である必要があります。
- OD600が0.6〜0.9に達したら、IPTGを最終濃度1 mMまで添加してT7RNAP発現を誘導し、さらに5時間培養を続けます。
- 4,500 x g で4°Cで20分間遠心分離することにより、細胞を回収します。 細胞を液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。
注: プロトコルはここで一時停止される場合があります。 - 3日目: 凍結細胞ペレットに30 mLの氷冷懸濁液バッファー(30 mM Tris-HCl、1錠のcOmpleteプロテアーゼ阻害剤を含むpH 8.0)を加え、室温の水浴中でペレットを解凍します。次いで、均質になるまで上下にピペッティングしてペレットを懸濁させる。
- 前のセクションで説明したようにフレンチプレスを使用して細胞破壊を実行するか、メーカーの推奨に従って超音波処理装置を使用します。続いて、20,000 x g で4°Cで30分間遠心分離し、上清を新鮮なチューブに移します。
- ゲノムDNAを沈殿させるには、硫酸ストレプトマイシンをゆっくりと穏やかに攪拌しながら、最終濃度3%(w / v)に達するまで上清に加えます。穏やかな攪拌下で4°Cで5〜10分間インキュベートします。20,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。
- 上清を0.45 μmフィルターでろ過し、蠕動ポンプを用いて4 mL/minの流量で蠕動ポンプを用いて、2 CV平衡化バッファー(30 mM Tris-HCl、pH 8.0、10 mM EDTA、50 mM NaCl、5%グリセロール、10 mM 2-メルカプトエタノール)で平衡化したカラム容量(CV)のQ-Sepharoseカラムにロードします。次に、カラムをUV検出器に接続し、280 nmのUV信号が安定したベースラインに達するまで平衡化バッファーで溶出を続けます。
- CVあたり50 mMから500 mM NaClのグラジエントでT7RNAPを3 mL/分の流速で溶出します。1 mL フラクションを収集し、各フラクションの 10 μL を 2 x SDS サンプルバッファーと混合して、SDS-PAGE 分析用のサンプルを調製します。SDS-PAGEを実行し、クマシーブルーRでゲルを染色します。 T7RNAPは、不純物の多数の追加バンドとともに、約90 kDaの顕著なバンドとして現れるはずです。
- T7RNAPを含むプール画分と透析バッファー(10 mM K 2 HPO 4 / KH2PO4、pH 8.0、10 mM NaCl、0.5 mM EDTA、1 mM DTT、5%(w / v)グリセロール)で12〜16時間、12〜14 kDa MWCOのメンブレンを使用して透析します。
- 4日目: T7RNAP溶液を収集し、12〜14 MWCOのフィルターユニットを使用して最終濃度3〜10 mg / mLまで濃縮します。T7RNAPは濃縮中に沈殿し始めることがあります。サンプルに濁りが発生するとすぐに濃縮を停止します。グリセロールを最終濃度50%(w / v)まで加え、穏やかに混合します。0.5〜1 mLアリコートを衝撃凍結し、-80°Cで保存します。 作業用T7RNAPアリコートは-20°Cで保存できます。
注:1 L発酵から、20,000〜40,000ユニットの5 mg / mLの部分的に精製されたT7RNAPを約20〜40 mL取得する必要があります。各T7RNAPバッチの最適量を試験するには、調製したT7RNAPサンプルの0.02 mg/mL-0.1 mg/mLを含む緑色蛍光タンパク質(GFP)のCF発現反応を行う必要があります。
3. MSP1E3D1の発現と精製
- 1日目: 標準的なヒートショック変換またはエレクトロポレーションプロトコルを使用して、 大腸菌 BL21(DE3)スター細胞をpET28(a)-MSP1E3D1ベクター31 で形質転換します。形質転換細胞を30 μg/mLカナマイシンを含むLB寒天培地でストリークアウトまたはプレート化し、37°Cで12〜16時間インキュベートします。
- 2日目: 0.5%(w / v)グルコースと30 μg/mLカナマイシンを添加した200 mLのLB培地に寒天プレートからピックした単一コロニーを接種し、37°Cで180 rpmで12〜16時間インキュベートします。
- 3日目: 0.5%(w / v)グルコースと30 μg/mLカナマイシンを添加した10 L LB培地に、100 mLの前培養液を攪拌タンクバイオリアクターに接種します。37°C、500rpmで発酵を行い、毎分約3つのバイオリアクター容量の曝気を行います。過度の泡立ちの場合は、消泡剤を追加します。
注:発酵槽の代わりにバッフルされた振とうフラスコを使用できます。 - OD600が6.5〜7.5の場合、IPTGを最終濃度1 mMまで添加し、37°Cで1時間インキュベーションを続けます。4,500 x g で4°Cで20分間遠心分離することにより、細胞を回収します。 細胞ペレットを200 mLの0.9%(w/v)NaClで洗浄し、8,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を捨て、スパチュラを使用して細胞を50 mLチューブに移します。予想される湿潤ペレット重量は、バイオリアクター培養液1L当たり8〜12gである。セルペレットを液体窒素中で衝撃凍結し、さらに使用するまで-80°Cで保存します。
注: プロトコルはここで一時停止できます。 - 4日目: 精製のために、細胞ペレットをRTの水浴中で解凍し、細胞をMSP-Aバッファー(40 mM Tris-HCl、pH 8.0、300 mM NaCl、1%(w/v)Triton X-100、50 mL細胞懸濁液あたり1錠のc0mpleteプロテアーゼ阻害剤カクテル)に懸濁して、30-40%(w/v)の細胞懸濁液を得ます。
- 超音波処理またはフレンチプレスを使用して細胞を破壊し、4°Cで30分間30,000 x g で遠心分離します。 上清を新しいチューブに移し、0.45 μmのフィルターでろ過します。蠕動ポンプを使用して、5 CVのMSP-Bバッファー(40 mM Tris-HCl、pH 8.0、300 mM NaCl、1%(w/v)Triton X-100)で平衡化したNi2+ 負荷ニトリロ三酢酸カラム(CV > 15 mL)にろ液を塗布します。
注:ろ過を容易にするために、上清は大きなDNA断片を分解するために別の分間超音波処理することができます。 - サンプルローディング後、5 CV MSP-B、5 CV MSP-C (40 mM トリス塩酸塩、pH 8.9、300 mM NaCl、50 mM コール酸)、5 CV MSP-D (40 mM トリス塩酸塩、pH 8.9、300 mM NaCl)、5 CV MSP-E (40 mM トリス塩酸塩、pH 8.0、300 mM NaCl) および 5 CV MSP-F (40 mM トリス塩酸塩、pH 8.0、 300 mM NaCl, 50 mM イミダゾール)。
注:MSP-Cバッファー中のコール酸は、MSPに付着した脂質を除去するために重要です。コール酸は低いpH値では完全には溶解しません。したがって、pH値はMSP-CおよびMSP-Dで8.9に調整する必要があります。pHが低いと残留コール酸が沈殿し、カラムがブロックまたは損傷する可能性があるため、MSP-Dバッファーでカラムを洗浄することが重要です。 - MSP-G(40 mM トリス塩酸塩、pH 8.0、300 mM NaCl、300 mM イミダゾール)でMSPを溶出します。1 mLの画分を収集し、280 nmでのUV吸収を監視します。溶出ピークの画分を収集してプールします。
- プールしたMSP画分を12-14 kDa MWCO透析メンブレンチューブに移し、5 LのMSP-H(40 mM Tris-HCl、pH 8.0、300 mM NaCl、10%(w/v)グリセロール)に対して4°Cで2-3時間透析します。 新鮮な5 L MSP-Hバッファーに変更し、4°Cでさらに12〜16時間透析します。
- 5日目:MSP溶液を遠沈管に移し、18,000 x gで4°Cで30分間遠心分離して沈殿物を除去します。上清を新鮮なチューブに移し、4°Cで12-14 kDa MWCOの限外ろ過装置を使用して200-800 μMに濃縮します。 UV/VIS測定装置を使用して濃度を測定します。濃度の計算には、吸光係数27.31 M-1 cm-1、分子量31.96 kDaを使用します。
注:バイオリアクターでの発現は、通常、L培養あたり15〜30 mgのMSP1E3D1を生成します。 - 濃縮MSP溶液を液体窒素中でショック凍結し、-80°Cで保存します。
4. MSP1E3D1ナノディスクの組み立て
- 1日目: 100 mMコール酸ナトリウム中に1〜2 mLの50 mM脂質ストック(DMPG、DOPG、POPG DMPC、DOPC、またはPOPC)を調製します。同日に使用しない場合は-20°Cで保管してください。
注:脂質溶液は透明でなければなりません。溶液が透明でない場合は、コール酸ナトリウム濃度を150mMに増加させてもよい。 - MSP1E3D1溶液を脂質溶液と混合します。ドデシルホスホコリン(DPC)を最終濃度0.1%(w / v)で添加します。.アセンブリ反応は、透析カセットの典型的な容量(10 kDa MWCO)に対応する3 mL(表2)または12 mLの最終容量に調整できます。アセンブリ反応を穏やかな攪拌下で21°Cで1時間インキュベートします。
注:各脂質について、特定のMSP1E3D1:脂質比を使用して、均一なナノディスク調製を確保する必要があります(表2)。新規脂質または脂質混合物の場合、最適な比率は、パイロット実験およびサイズ排除クロマトグラフィー分析14を用いて決定されるべきである。 - 透析カセットの膜をディスク形成(DF)バッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、100 mM NaCl)で事前に湿らせます。アセンブリ混合物をシリンジで透析カセットに移します。潜在的な気泡は、シリンジを使用した吸引によって除去できます。
- 1〜4日目: 3 x 5 L DFバッファーに対して、攪拌バーを使用して攪拌しながらRTで10〜20時間透析します。次に、アセンブリ混合物を透析カセットから、DFバッファーと平衡化した10 kDa MWCOの遠心フィルターユニットに移します。4°Cで4,000 x g で濃縮します。
注:濁った透析ミックスは、MSP:脂質の化学量論比が間違っていることを示している可能性があります。沈殿物は、サンプルを濃縮する前に、18,000 x g で4°Cで20分間除去する必要があります。サンプル濃縮中の沈殿を避けるために、大きなデッドストップを備えた限外ろ過ユニットを使用してください。 - 組み立てたナノディスクを少なくとも300μMの濃度に濃縮し、UV/VISリーダーを使用して濃度を測定します。1つのナノディスクが2つのMSP1E3D1分子によって形成されるため、ナノディスクの正しい量を決定するには、MSPの濃度を2で割る必要があると考えてください。
注:説明されているセットアップ(表2)では、0.6〜1 mLの300 μMナノディスク溶液が得られます。 - 濃縮したナノディスク調製物を18,000 x g で4°Cで20分間遠心分離し、沈殿物を除去します。その後、上清を吸引し、液体窒素中で50 μLアリコートを衝撃凍結し、-80°Cで保存した。
注:サイズ排除クロマトグラフィーを使用してナノディスク形成の成功を評価することをお勧めします。サンプルは単分散で、少量の凝集体のみを含む必要があります。凝集体は、セットアップ中の脂質の量が高すぎることを示しています。参考として、精製されたMSP1E3D1を用いることができる。ナノディスク調製物が参照MSP1E3D1ピークの高さにピークを示す場合、選択された脂質対MSP1E3D1比は低すぎた。
5. 分取スケール 3 mL CECF 反応のセットアップ
- 1日目: リストされているように、必要なすべてのストック溶液を準備します(表3)。ストックは-20°Cで保存され、室温で解凍されます。解凍後、ピペッティングする前に、必ずすべてのストックを完全に混合してください。すべてのストックに必要な量を計算し、ピペッティングスキームを作成します(表4)。高分子量化合物はRMにのみ追加されます。低分子量化合物については、RMとFM用の3 xマスターミックスを組み合わせて調製することができます。
注:混合中の体積損失により、化合物混合物の最終体積は計算よりも少なくなる可能性があります。これは、体積損失を補うために2〜5%の過剰体積を追加することで回避できます。 - 3 mL透析カセットのメンブレンを100 mMトリスアセテート、pH 8.0で平衡化します。余分なバッファを必ず削除してください。
- シリンジを使用してRMを透析カセットに移します。シリンジで吸引することにより、RMコンパートメント内の余分な空気を取り除きます。透析カセットを透析チャンバーに入れます。
- 透析チャンバーに60 mLのFMを満たし、チャンバーに蓋を置き、ネジを締めて固定します。チャンバーを30°C、200rpmで12〜16時間インキュベートします。
注:攪拌中はチャンバーが直立したままであることを確認してください, そうしないと、低分子化合物の交換が妨げられます. - 2日目: 注射器を使用して、透析室からRMを吸引します。RMを新しいチューブに移し、16,000 x g で4°Cで10分間遠心分離して沈殿物を除去します。上清を新鮮なチューブに移します。これで、上清中のタンパク質をさらに分析できます。
注:場合によっては、遠心分離後にペレットが存在します。これにより、分析されたナノディスクまたは合成されたMPを可溶性に保つための反応化合物の適合性に関する重要な情報を提供できます。したがって、沈殿物中に存在する可能性のあるターゲットの量を、SDS-PAGE、ウェスタンブロットを使用するか、ペレットサイズの目視評価によって分析することをお勧めします。
6. Mg2+ イオンスクリーニング用の分析スケール60 μL CECF反応セットアップ
- 1日目: それぞれの3xマスターミックスのすべての成分を混合し、60μLをRMに、825μLをFMに分配します。 FMをH2Oで満たし、ボルテックスによってFMを混合します。FMを24ウェルマイクロプレートの3ウェルに移す(表5)。
注:カスタマイズされたMini-CECF容器にアクセスできない可能性があるため、 表5 の容量は、96ディープウェル(2 mL)プレートでFM容量が1.7 mLの透析カートリッジ(10-14 kDa MWCO、RM:100 μL)で実行された反応について計算されています(図1)。 - 再生セルロース透析チューブを10-14 kDa MWCOで約25 x 20 mmサイズに切断し、0.05%(w / v)アジ化ナトリウムを含むH2Oで保存します。
注意:アジ化ナトリウムは非常に有毒です。皮膚や粘膜との接触を避けてください。アジ化ナトリウムは金属と反応して爆発性の金属アジドを形成する可能性があるため、金属製の容器を使用しないでください。 - Mini-CECF容器アセンブリの前に、組織で透析膜から過剰なH2Oを除去します。各容器に1つのメンブレンピースを置き、メンブレンをポリテトラフルオロエチレンリングで固定します。
- Mini-CECF容器を825 μLのFMを含む24ウェルプレートのウェルに移します。 Mini-CECF容器の透析膜の下に気泡が入らないようにしてください。
- 説明されているようにRMに高分子成分を加え(表5)、上下にピペッティングして混合します。反応容器に60 μLを加えます。粘性溶液の移動中に気泡を避けてください。
- シーリング熱可塑性フィルムの8 x 10 cmシート2枚を切り取り、反応容器を中に入れて24ウェルプレートに巻き付けます。これにより、反応混合物からの蒸発が減少します。次に、細胞培養プレートの蓋をプレートの上に置き、テープで固定します。プレートを30°Cで200rpmで12〜16時間撹拌します。
- 2日目: Mini-CECF容器のピペットチップで透析膜に穴を開けて反応混合物を回収し、RMを吸引します。 RMを新しいチューブに移し、16,000 x g で4°Cで10分間遠心分離して沈殿物を除去します。上清を新鮮なチューブに移します。これで、上清中のタンパク質をさらに分析できます。
注:場合によっては、遠心分離後にペレットが存在します。これにより、分析されたナノディスクまたは他の反応化合物が合成されたMPを可溶性に保つための適合性に関する重要な情報を提供できます。したがって、沈殿物中に存在する可能性のあるターゲットの量を、SDS-PAGE、ウェスタンブロット、またはペレットサイズの目視評価によって分析することをお勧めします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
合成されたMPの最終的な収率または品質に対する微調整反応化合物の影響が例示されます。頻繁に日常的なアプローチは、システム効率の便利なモニターとして、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現によってCF反応における最適なMg2+濃度を調整することです。一例として、GFPはpET-21a(+)ベクターから14〜24 mMのMg2+濃度で合成されました(図2)。SDS-PAGE分析により、CF反応上清の相補的な蛍光測定(485 nmでの励起、535 nmでの発光測定)とよく一致する20 mMでの最適なMg2+濃度が特定されました(図2A)。pIVEX 2.3ベクターから発現した細菌PRおよびpET-21a(+)ベクターから発現するシチメンチョウβ 1アドレナリン受容体(Tβ1AR)のCF発現について、最適なMg2+濃度を20〜22 mMで同定した。
さらなる例として、記載された戦略による合成MPの品質改良が示されている。予め形成されたナノディスクへのMPの共翻訳挿入のための調整可能なパラメータは、(i)ナノディスク膜の脂質組成および(ii)反応における最終ナノディスク濃度である。疎水性環境が、MPの正しい折り畳み、オリゴマーアセンブリ、および安定性にとって重要なパラメータであることはよく知られています。ナノディスク中の脂質組成を調節することができるので、記載されたアプローチは、MPの構造および機能に対する脂質効果の容易な系統的スクリーニングを可能にする。最初の実験では、ホスファチジルコリン(PC)およびホスファチジルグリセロール(PG)ヘッドグループで脂質をスクリーニングし、さまざまな鎖長と飽和度をテストすることをお勧めします。膜組成とナノディスク濃度が2つの異なるMPの可溶化効率と品質に与える影響が示されています。PRは光活性化プロトンポンプであり、RMで>100μMの最終濃度に達する非常に安定した高度に合成されたMPです。したがって、RM上清中の530 nmでの吸収を測定することでPR濃度を簡単に評価できるため、正しい反応セットアップを確保するためのポジティブコントロールとして使用することをお勧めします。対照的に、Tβ1ARは真核生物のGタンパク質共役受容体(GPCR)の大きなファミリーの一例であり、複雑で不安定なMPである。便利なモニタリングのために、Tβ1AR-GFP融合構築物を合成し、CF反応におけるナノディスク可溶化受容体の総濃度をGFP蛍光を介して決定しました(図3A)。機能的に折り畳まれたリガンド結合活性受容体の画分を、フィルター結合アッセイおよび標識リガンド[3H]-ジヒドロアルプレノロールを用いてさらに決定した(図3B)。フィルター結合アッセイは、前述の14に記載のように実施した。簡単に説明すると、RM中のTβ1AR−GFP濃度は、その蛍光を介して決定した。GPCRを放射性標識リガンドと共に20°Cで1時間インキュベートし、フィルターに適用し、未結合リガンドを洗い流した。非特異的な[3H]-ジヒドロアルプレノロール結合を決定するために、受容体を対照反応中の非標識アルプレノロールで飽和させた。フィルター内の放射性リガンドの数をシンチレーションカウンターで測定し、結合したリガンドの量をその特異的標識活性によって決定しました。次いで、GPCR結合活性パーセントを、結合リガンドの量、Tβ1AR−GFP濃度、およびアッセイ体積から計算した。Tβ1AR-GFPの全体的な合成およびナノディスク可溶化は、分析されたすべての膜組成物と同様であり、8〜13μMの範囲内である(図3A)。対照的に、合成されたGPCRの品質にははるかに高い変動が検出されます。10%未満の活性画分を有する最も低い活性は、脂質DMPCおよびPOPCを用いて得られる。DOPGおよびPOPGでは、Tβ1AR-GFPの活性画分を約30%に増加させることができた(図3B)。この結果は、脂質ヘッドグループの電荷と脂肪酸鎖の柔軟性が、このGPCRのフォールディングと活性にとって重要なモジュレーターであることを示しています。
ナノディスク組成に加えて、CF反応におけるそれらの最終濃度は、MP品質の重要な要素となり得る。ナノディスクの適切な膜組成が特定されたら、MP合成中のその濃度をスクリーニングする必要があります。ナノディスク濃度はMPの発現効率に応じて調整する必要があることは明らかです。Tβ1AR-GFP受容体およびPRのCF合成は、RMにおいてそれぞれ約10μMおよび100μMの最終濃度をもたらす。ナノディスク濃度が3.75〜60μMの範囲でスクリーニングされると、GPCRの完全な可溶化が約30μMのナノディスクで得られ、Tβ 1 AR:ナノディスクの比率が1:3になります(図4A)。対照的に、PRの完全な可溶化は、約10 μMのナノディスクですでに達成されており、PR:ナノディスクの比率は10:1です(図4B)。したがって、Tβ1AR-GFPのほぼ完全な可溶化を達成するためには過剰なナノディスクが必要であり、PRの場合の反転比は、1つのナノディスクに複数のPRコピーを挿入することを示す。天然質量分析による精製PR/ナノディスク複合体のその後の研究により、この観察が確認され、より低いナノディスク濃度で合成された場合、より高いオリゴマー型のPRの有病率が見出されました15,18。したがって、CF合成MPをナノディスクで滴定することは、オリゴマーアセンブリをトリガーし、MP機能への影響を研究するためのツールとして使用できます。
図1:膜タンパク質をナノディスクに挿入するためのCECF発現戦略。 (A) プロセスの主要なステップを示す基本的なワークフロー。 (B) CECF発現用にカスタマイズされた分析スケール反応容器。 (C) 分析スケールCECFセットアップ用の市販の透析カートリッジ。( D) 3 mL透析カセットとカスタマイズされたプレキシガラスFM容器を含む分取スケールセットアップ(3 mL RM)。 (E) 予め形成されたナノディスクへのMPの共翻訳挿入とCECF配置における脂質スクリーニング。RMには、必要な転写/翻訳装置とナノディスクが含まれており、低分子量化合物は両方のコンパートメントに存在します。生成されたMP/ナノディスクサンプルの生化学的および構造的応用がさらに示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:CF GFP合成に対する異なるMg2+ 濃度の影響。GFPは、14〜24mMの範囲内のMg2+ 濃度を有するCF反応において合成された。 (A) SDS-PAGE分析は、20 mMMg2+でGFPの最も強いバンドを示しています。M:マーカー。 (B) 異なるMg2+ 濃度でのCF発現後のGFP蛍光。20 mM Mg2+ での最大GFP蛍光は4.6 mg/mLに相当します。エラーバーは、重複する測定値の標準偏差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CF合成GPCRの可溶化と品質に及ぼすナノディスク膜組成の影響。 異なる膜組成を含む30 μMナノディスクの存在下で合成されたTβ1AR-GFPの収率と活性。合成されたタンパク質( A )およびリガンド結合活性受容体 (B) の画分の合計はμMで与えられる。 総濃度は、GFP融合の蛍光測定を介して決定した。活性は、放射性標識リガンド[3H]-ジヒドロアルプレノロールを用いたフィルター結合アッセイを介して測定した。エラーバーは、独立した三重の標準偏差を表します。以前に出版された原稿から取られたデータ14. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ナノディスク濃度の増加に伴うCF合成MPの可溶化スクリーニング。 MPは、供給されたナノディスクの存在下で3.75〜60μMの範囲で合成された。 (a)CF反応におけるナノディスク(DMPC)によるTβ1AR-GFPの発現。総濃度は、GFP融合の蛍光測定を介して決定した。以前に出版された原稿から取られたデータ14.SDS−PAGEおよびCoomassie−Blue染色により分析されたアフィニティタグ精製サンプルは、約50kDaにおけるTβ1AR−GFPおよび25kDaを超えるMSP1E3D1に対応する2つの顕著なバンドを示す(B)CF反応におけるナノディスク(DOPG)によるPRの発現。PRの総濃度は、530nmでの吸収測定により決定した。以前に公開された原稿10,18から取得したデータ。写真は、折り畳まれたPRの存在による最終反応の赤い色を示しています。ピクトグラムは、その後のネイティブ質量分析18によって明らかにされるように、ナノディスク濃度の増加時により低いオリゴマー立体配座に向かって変調されたPRアセンブリを示しています。SDS-PAGEおよびCoomassie-Blue染色によって分析されたアフィニティタグ精製サンプルは、約20 kDaおよび25 kDaを超えるMSP1E3D1でのPRに対応する2つの顕著なバンドを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 化合物 | 最終濃度範囲 | MPサンプルへの影響 |
| マグネシウム2+ | 10 - 30 mM | 歩留まり |
| ティッカー | 1 - 20 mM | ジスルフィドブリッジ形成, 折り畳み式 |
| 20 アミノ酸混合物1 | 0.2 – 2 ミリメートル | 歩留まり |
| GSSG : GSH2 | (1-10 μM) : (1-10 μM) | ジスルフィドブリッジ形成, 折り畳み式 |
| ナノディスク | 10 - 100 μM | 可溶化, オリゴマー集合, 折り畳み |
| 脂質の種類 | 可溶化, オリゴマー集合, 折り畳み | |
| S30 : HS30溶解液3 | (50-100 %) : (50-100 %) | 折りたたみ |
| S12 - S100 | 20 – 50 % | チャンネルアッセイにおける収率、MPバックグラウンド |
| DNAテンプレート | 0.5 – 30 ng/μL RM | 収量, オリゴマーアセンブリ, 折り畳み |
| DNAテンプレートデザイン | 歩留まり | |
| 1、混合物は、例えば収率を改善したりNMR標識スキームを最適化したりするために、MPの個々の組成に応じて変化させてもよい。 2、GSHは常に作りたてにする必要があります。 3、RM中の総CFライセート濃度は、高い発現レベルを確保するために、少なくとも35%のS30含有量で少なくとも50%でなければなりません。 |
||
表1:CF反応の重要なスクリーニング成分。
| MSP1E3D1 | 脂質 | ティッカー | ||||||
| 比 | (410 μM在庫) | (50 000 μM株) | (10%(在庫あり) | |||||
| 脂質 | 脂質 : MSP | V(MSP) | c(MSPファイナル) | V(脂質) | C(脂質最終) | V(DPC) | c(DPCファイナル) | DF バッファ |
| [μL] | [μM] | [μL] | [μM] | [μL] | [%] | [μL] | ||
| ティッカー | 115 : 1 | 1500.0 | 205.0 | 1415.0 | 23 575 | 30.0 | 0.1 | 55.5 |
| ドプシー | 80 :1 | 1500.0 | 205.0 | 984.0 | 16 400 | 30.0 | 0.1 | 486.0 |
| ポップ | 85 : 1 | 1500.0 | 205.0 | 1046.0 | 17 425 | 30.0 | 0.1 | 425.0 |
| ティッカー | 110 : 1 | 1500.0 | 205.0 | 1353.0 | 22 550 | 30.0 | 0.1 | 117.0 |
| ティッカー | 80 : 1 | 1500.0 | 205.0 | 984.0 | 16 400 | 30.0 | 0.1 | 486.0 |
| ポップ | 90 : 1 | 1500.0 | 205.0 | 1107.0 | 18 450 | 30.0 | 0.1 | 363.0 |
表2:3 mLのin vitroアセンブリセットアップにおける脂質とMSP1E3D1の比率。
| 化合物 | 濃度 | 準備 |
| DNAプラスミドテンプレート1 | > 400 μg/mL 10 mM トリス塩酸塩 pH 8.0 | ミディ/マキシキット(例:キアゲン)の準備2 |
| 20アミノ酸の混合物3 | H2O中でそれぞれ25 mM | 沈殿物は4のまま |
| 4 つの NTP の混合(75 x) | c(CTP) 240 mM, c(ATP) 360 mM, c(UTP) 240 mM, c(GTP) 240 mM H2O.でpHを7〜8に調整します KOHで |
少し沈殿物が残る4 |
| アセチルホスフェート | H2Oで1 M、KOHでpH 7〜8を調整します | 沈殿物は4のまま |
| ホスホ(エノール)ピルビン酸(K+) | H2Oで1 M、KOHでpH 7〜8を調整します | |
| フォリン酸 | 10 mg/mL の H2O 溶液 | 沈殿物は4のまま |
| ティッカー | 0.5 M H2O | |
| C0MPLETEプロテアーゼ阻害剤カクテル | H2O中の1mLあたり1錠 | |
| 酢酸トリス、pH 8.0 | 2.4 M H2O | |
| マグネシウム(OAc)2 | 1 M H2O | |
| コアック | H2O 中の 10 M | |
| リボロックRNase阻害剤 | 40 U/mL | サーモフィッシャーサイエンティフィック |
| tRNA (大腸菌) | 40 mg/mL の H2O 溶液 | ロシュ(ドイツ) |
| T7RNAP | 3-7 ミリグラム/ミリリットル5 | プロトコルのセクション 2 を参照してください。 |
| ピルビン酸キナーゼ | 10ミリグラム/ミリリットル | ロシュ(ドイツ) |
| ナノディスク | 0.2-1.0 mM6 in 10 mM トリス-Cl, pH 8.0, 100 mM NaCl | プロトコルのセクション 3 および 4 を参照してください。 |
| 1、PCRテンプレートは同様の濃度で使用できます。 2、「ミニ」キットで調製されたDNAの品質は満足のいくものではありません。 3、システインは不安定になりやすく、別途添加してもよい。 4、溶液は過飽和であり、アリコートを除去する前に即座に完全に混合する必要があります。 図5において、新しいT7RNAPバッチごとに、最良の最終濃度を特定するために初期スクリーニングが推奨される。 図6において、ナノディスクの溶解度は、それらの脂質組成に依存し得る。 |
||
表3:CFストック溶液の調製。
| 化合物 | ||
| マスターミックス用 (3.0 x) | C(最終) | V [μL] |
| 20アミノ酸の混合物 | 1ミリリットル | 2520.0 |
| 4 つの NTP の混合(75 x) | 1倍速 | 840.0 |
| アセチルホスフェート | 20ミリメートル | 1260.0 |
| ホスホ(エノール) ピルビン酸 |
20ミリメートル | 1260.0 |
| フォリン酸 | 0.1 ミリグラム/ミリリットル | 630.0 |
| 酢酸トリス、pH 8.0 | 100ミリメートル | 2625.0 |
| c0mplete 50 x | 1倍速 | 1260.0 |
| マグネシウム(OAc)2 | 19.8 (= 20)1 mM | 1260.0 |
| コアック | 180 (= 270)2 mM | 1140.0 |
| ティッカー | 2ミリメートル | 252.0 |
| H2O | 7953.0 | |
| トータル | 21 000 | |
| RMの場合 | C(最終) | V [μL] |
| 3x マスターミックス | 1×1 | 1000.0 |
| RNase阻害剤 | 0.3 U/μL | 22.5 |
| tRNA (大腸菌) | 0.5 ミリグラム/ミリリットル | 37.5 |
| ナノディスク (DMPG)3 | 10 μM | 75.0 |
| DNAテンプレート4 | 0.015 ng/μL | 112.5 |
| ピルビン酸キナーゼ | 0.04 ミリグラム/ミリリットル | 12.0 |
| T7RNAP5 | 0.03 ミリグラム/ミリリットル | 15.0 |
| S30ライセート | 0.35 % | 1050.0 |
| オールトランス網膜6 | 0.6ミリメートル | 9.0 |
| H2O | - | 666.5 |
| トータル | 3000.0 | |
| FM用 | C(最終) | V [μL] |
| マスターミックス (3 x) | 1×1 | 20 000 |
| H2O | - | 40 000 |
| トータル | 60 000 | |
| 1において、0.2mMMg2+ はS30ライセートから寄与される。 2, 90 mM K+ は、アセチルリン酸とホスホ(エノール)ピルビン酸から寄与されます。 図3において、計算原液は400μMである。 4、計算された原液は400μg/mLである。 5、計算された原液は6 mg / mLです。 6、PR用の特定の補因子、ストック溶液はDMSOで200mMです。 |
||
表4:3 mL RMおよび60 mL FMを用いたCECF反応のピペッティングスキーム
| 化合物 | ||||||||
| マスターミックス用 (3.0 x) | C(最終) | V [μL] | ||||||
| 20アミノ酸の混合物 | 1ミリリットル | 864.0 | ||||||
| 4 つの NTP の混合 | 1倍速 | 288.0 | ||||||
| アセチルホスフェート | 20ミリメートル | 432.0 | ||||||
| ホスホ(エノール)ピルビン酸 | 20ミリメートル | 432.0 | ||||||
| フォリン酸 | 0.1 ミリグラム/ミリリットル | 216.0 | ||||||
| 酢酸トリス、pH 8.0 | 100ミリメートル | 900.0 | ||||||
| c0mplete | 1倍速 | 432.0 | ||||||
| マグネシウム(OAc)2 | 13,8 (= 14) mM1 | 298.0 | ||||||
| コアック | 180(=270)mM2 | 389.0 | ||||||
| ティッカー | 2ミリメートル | 86.4 | ||||||
| H2O | - | 2862.6 | ||||||
| 合計 [μL]1 | - | 7200.0 | ||||||
| Mg2+ 濃度 | ||||||||
| 14ミリメートル | 16ミリメートル | 18ミリメートル | 20ミリメートル | 22ミリメートル | 24ミリリットル | |||
| RMの場合 | C(最終) | V [μL] | V [μL] | V [μL] | V [μL] | V [μL] | V [μL] | |
| 3x マスターミックス | 1×1 | 67.0 | 67.0 | 67.0 | 67.0 | 67.0 | 67.0 | |
| 0.1 M Mg(OAc)2 | 14-24 ミリグラム | 0.0 | 4.0 | 8.0 | 12.0 | 16.0 | 20.0 | |
| RNase阻害剤 | 0.3 U/μL | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | |
| tRNA (大腸菌) | 0.5 ミリグラム/ミリリットル | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | |
| DNAテンプレート3 | 0.015 ng/μL | 7.5 | 7.5 | 7.5 | 7.5 | 7.5 | 7.5 | |
| ピルビン酸キナーゼ | 0.04 ミリグラム/ミリリットル | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | |
| T7RNAP4 | 0.03 ミリグラム/ミリリットル | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | |
| S30ライセート | 35 % | 70.0 | 70.0 | 70.0 | 70.0 | 70.0 | 70.0 | |
| H2O | - | 49.7 | 45.7 | 41.7 | 37.7 | 33.7 | 29.7 | |
| 合計 [μL] 5 | - | 200.0 | 200.0 | 200.0 | 200.0 | 200.0 | 200.0 | |
| Mg2+ 濃度 | ||||||||
| 14ミリメートル | 16ミリメートル | 18ミリメートル | 20ミリメートル | 22ミリメートル | 24ミリリットル | |||
| RMの場合 | C(最終) | V [μL] | V [μL] | V [μL] | V [μL] | V [μL] | V [μL] | |
| 3x マスターミックス | 1×1 | 1133.0 | 1133.0 | 1133.0 | 1133.0 | 1133.0 | 1133.0 | |
| 0.1 M Mg(OAc)2 | 14-24 ミリグラム | 0.0 | 68.0 | 136.0 | 204.0 | 272.0 | 340.0 | |
| H2O | - | 2267.0 | 2199.0 | 2131.0 | 2064.0 | 1995.0 | 1927.0 | |
| 合計 [μL] 5 | - | 3400.0 | 3400.0 | 3400.0 | 3400.0 | 3400.0 | 3400.0 | |
| 1において、0.2mMMg2+ はS30ライセートから寄与される。マスターミックスは、最低のスクリーニング濃度に調整されます。 2, 90 mM K+ は、酢酸リン酸とホスホ(エノール)ピルビン酸から供給されます。 3、計算された原液は400μg/mLである。 4、計算された原液は6 mg / mLです。 図5において、反応は重複して行われる。 |
||||||||
表5:100 μLのRMおよび1.7 mLのFMを使用したMg2+ 濃度スクリーンのピペッティングスキーム。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CF発現とナノディスクへの機能性MPの共翻訳挿入を最適化するためのセットアップと戦略について説明します。必要な機器は、バイオリアクター、フレンチプレス装置など、UV/VISおよび蛍光リーダー、2コンパートメント構成のセットアップに適したCF反応容器、および温度制御されたインキュベーターで構成されます。さらに標準的な装置は、大腸菌細胞を回収するための遠心分離機と、S30溶解物を調製するための少なくとも30,000 x gに達する卓上遠心分離機です。S80-S100ライセートを調製する必要がある場合は、超遠心分離機が必要です。記載されている機器は生化学ラボで定期的に入手可能であり、CF発現を開始するために大きな初期投資は必要ありません。さらに、CFライセートおよびT7RNAP調製物のための大腸菌細胞の発酵および取り扱いは、一般的で堅牢な技術である。最も高価な化合物は、CFライセート、T7RNAP、およびナノディスクです。信頼性が高く効率的なプロトコルで調製でき、アリコートは-80°Cで何年も安定しています。 このプロトコルは、CFライセートとT7RNAPの調製にそれぞれ3日、MSPの発現と精製、およびナノディスクの予備形成に約1週間かかります。ターゲットテンプレートDNAは、pET-21、pIVEX、または同様のベクターシステムを使用して供給できます。CF発現システムのセットアップおよび最適化のために、シフトGFP(GFP+)またはスーパーフォルダーGFPなどのGFPバリアントの産生をモニター20、32として使用することができる。MP産生条件の場合、PRの発現は、多くの異なる条件下で折り畳まれ、530 nm10、15、18の吸光度によって容易にモニターできるため、優れたモデルシステムまたはポジティブコントロールです。新しいMPのための効率的なCF発現プロトコルを確立するために、ターゲット読み取りフレームのコドン最適化と、C末端に結合したGFPとの融合を使用することが推奨されます25,26。さらに必要な材料には、全て市販されている化学物質および酵素が含まれる。これらの成分は高品質で入手する必要があり、3mLのRMおよび60mLのFMによる記載されたCF反応の全体的なコスト計算は約150〜200€になります。したがって、CF発現システムの主な用途は、多くのMPや毒素などの古典的な細胞ベースの発現システムでは入手が困難なタンパク質の生産です。CFシステムはさらに合成生物学のコアプラットフォームであり、継続的に成長しているアプリケーション分野により、分子研究のツールとしてますます不可欠になっています。とりわけ、日常的な用途は、タンパク質の標識、ハイスループットプロセス、または合成細胞設計です。
実証された戦略により、溶解性の高いナノディスクの目的の脂質環境にすでに挿入されている純粋なMPを無洗剤で製造できます。MPのCF発現プロトコルが確立され最適化されると、生産は非常に速くなり、分取スケールでも24時間未満で純粋なサンプルを取得できます。MP/ナノディスク複合体は、MPに結合したストレプトアビジンIIまたはポリヒスチジンタグを介してCF反応から直接精製されます。このプロセスは、異なる技術の配列による同一のMPサンプルの並行機能的および構造的分析を可能にする33。したがって、戦略の迅速性と効率性は、細胞ベースの発現システムと細胞膜からのMPの界面活性剤抽出とそれに続くルーチンのin vitro再構成を採用する従来のアプローチと競合します5,34。CF反応のオープンなアクセス可能性は、MPフォールディングおよび膜挿入15、16、18、MP複合体アセンブリ15、18、24、または機能制御23に関する多数のユニークな機構研究をさらに促進します。
細胞ベースの発現に対するCF発現の重要な違いは、合成されたタンパク質産物の品質管理システムがないことです。その機能的折り畳みとは無関係に翻訳されたポリペプチドは、最終生成物サンプルに最終的に入ります。さらに、ナノディスク膜への挿入プロセスは人工的でトランスロコンに依存しないため、不完全な統合をもたらすか、多くのMPターゲットでまったく機能しない可能性があります。したがって、CF反応における最終的に可溶化された生成物画分は、完全に挿入されたMPを含むが、部分的に統合されたMPまたは膜関連MPのみを含む非常に不均一である可能性があります。その結果、MP/ナノディスク複合体の精製サンプルのごく一部のみが機能的に折りたたまれる可能性があります。ナノディスクとDNAテンプレートの濃度を調節することにより、膜組成を変更し、MPとナノディスクの比率を注意深く微調整することは、最適化に適したツールです。それにもかかわらず、CF発現プロトコルの最適化には、サイズ排除プロファイリングやターゲット特異的定量機能アッセイなどのダウンストリーム品質管理アプローチが常に必要です。したがって、このようなアッセイの利用可能性は、特にトランスポーター、チャネル、またはポンプなどの機能のためにリポソーム環境を必要とするMPを含むプロジェクトにおいて、アプリケーションを制限する可能性があります。さらに、ナノディスクのサイズ制限により、大きなMPアセンブリの挿入が制限される可能性があります。
文書化された実施例において、GPCRTβ1AR−GFPの機能的に折り畳まれた画分の変動は、数パーセントの範囲内で、約30%までである。機能的折り畳みには、いくつかのパラメータの慎重な調整が必要であり14 、他のGPCRについても同様の個別で退屈な最適化プロセスが必要になる可能性があります22。しかし、機能的に折り畳まれたGPCRの最終的に達成された収率は、他の生産システムと競合し、分析スケールのMini-CECFリアクターでの単一の60 μL反応からリガンド結合研究用に>1,000のラジオアッセイをセットアップすることができます。GPCR-GFP融合コンストラクトのリガンド結合研究は、精製ステップを必要としないことは言及する価値があります。必要に応じて、HisタグやStrepタグIIなどの合成MPに付着したアフィニティタグを利用することで精製を実現できます。次に、RMを目的のバッファーで希釈し、それに応じて事前に平衡化された対応するアフィニティークロマトグラフィーカラムにロードします。PRをはじめとするCF合成MPのNMR分光法や結晶化による構造評価は、すでにMP研究の中核プラットフォームとしてのCF発現系の確立に役立っています。MP/ナノディスク複合体の製造のための記述された戦略は、電子顕微鏡による将来の構造研究にとって特に興味深いものになる可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
ドイツ科学研究センター(DFG)助成金BE1911/8-1、ロエベプロジェクトGLUE、および膜を越えた輸送と通信共同研究センター(SFB807)の財政支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840445P | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850345C | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850375C | |
| 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840475C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850457C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840034C | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) | Carl Roth (Germany) | 4855 | |
| 2-Mercaptoethanol | Carl Roth (Germany) | 4227 | |
| 2-Propanol | Carl Roth (Germany) | 9781 | |
| [3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride | American Radiolabeled Chemicals (USA) | ART0134 | |
| Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) | Merck (Germany) | 1409 | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich (Germany) | A9251 | |
| Alprenolol hydrochloride | Merck (Germany) | A0360000 | |
| Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® | Sigma-Aldrich (Germany) | Q1126 | |
| Autoclave Type GE 446EC-1 | Gettinge (Germany) | ||
| Bioreactor Type 884 124/1 | B.Braun (Germany) | ||
| Centrifuge | Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany) | ||
| Cholic acid | Carl Roth (Germany) | 8137 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Carl Roth (Germany) | 3862 | |
| Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks | Schott Duran (Germany) | ||
| Cytidine 5'-triphosphate disodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | C1506 | |
| D-glucose monohydrate | Carl Roth (Germany) | 6780 | |
| Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate | Carl Roth (Germany) | 6878 | |
| Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing | Fisher Scientific (Germany) | 8700152 | |
| Dithiothreit | Carl Roth (Germany) | 6908 | |
| Ethanol | Carl Roth (Germany) | K928 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma-Aldrich (Germany) | 47612 | |
| French pressure cell disruptor | SLM; Amico Instruments (USA) | ||
| Glycerol | Carl Roth (Germany) | 3783 | |
| Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) | Sigma-Aldrich (Germany) | G8877 | |
| Hydrochloric Acid | Carl Roth (Germany) | K025 | |
| IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL | GE Life Sciences (Germany) | GE17-5248 | |
| Imidazole | Carl Roth (Germany) | 3899 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth (Germany) | 2316 | |
| Kanamycin | Carl Roth (Germany) | T832 | |
| L-Alanine | Carl Roth (Germany) | 3076.1 | |
| L-Arginine | Carl Roth (Germany) | 6908 | |
| L-Asparagine | Carl Roth (Germany) | HN23 | |
| L-Aspartic Acid | Carl Roth (Germany) | T202 | |
| L-Cysteine | Carl Roth (Germany) | T203 | |
| L-Glutamic Acid | Carl Roth (Germany) | 3774 | |
| L-Glutamine | Carl Roth (Germany) | 3772 | |
| L-Glycine | Carl Roth (Germany) | 3187 | |
| L-Histidine | Carl Roth (Germany) | 3852 | |
| L-Isoleucine | Carl Roth (Germany) | 3922 | |
| L-Leucine | Carl Roth (Germany) | 1699 | |
| L-Lysine | Carl Roth (Germany) | 4207 | |
| L-Methionine | Carl Roth (Germany) | 9359 | |
| L-Proline | Carl Roth (Germany) | 1713 | |
| L-Phenylalanine | Carl Roth (Germany) | 1709 | |
| L-Serine | Carl Roth (Germany) | 4682 | |
| L-Threonine | Carl Roth (Germany) | 1738 | |
| L-Tryptophane | Carl Roth (Germany) | 7700 | |
| L-Tyrosine | Carl Roth (Germany) | T207 | |
| MD100 dialysis units | Scienova (Germany) | 40077 | |
| N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) | Carl Roth (Germany) | 6763 | |
| n-dodecylphosphocholine | Antrace (USA) | F308S | |
| PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell | Biorad (Germany) | ||
| PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems | Biorad (Germany) | ||
| PAGE gel power supply: Power Pac 3000 | Biorad (Germany) | ||
| Tryptone/peptone from caseine | Carl Roth (Germany) | 6681 | |
| Peristaltic pump: ip-12 | Ismatec (Germany) | ||
| Phosphoenol pyruvate monopotassium salt | Sigma Aldrich (Germany) | 860077 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth (Germany) | P018 | |
| Potassium acetate | Carl Roth (Germany) | 4986 | |
| Potassium chloride | Carl Roth (Germany) | 6781 | |
| Pyruvate Kinase | Roche (Germany) | 10109045001 | |
| Scintillation counter: Hidex 300 SL | Hidex (Finland) | ||
| SDS pellets | Carl Roth (Germany) | 8029 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich (Germany) | K305 | |
| Sodium chloride | Carl Roth (Germany) | P029 | |
| Spectrophotometer Nanodrop | Peqlab (Germany) | ||
| Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® | Tecan (Switzerland) | ||
| tRNA (E. coli) | Roche (Germany) | 10109550001 | |
| Ultra sonificator | Labsonic U, B. Braun (Germany) | ||
| Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) | Sigma-Aldrich (Germany) | U6625 | |
| Y-30 antifoam | Sigma-Aldrich (Germany) | A6457 | |
| Yeast extract | Carl Roth (Germany) | 2904 |
References
- Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
- Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
- Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
- Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
- Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
- Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
- Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
- Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
- Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
- Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
- Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
- Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
- Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
- Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
- Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
- Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
- Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
- Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
- Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
- Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
- Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
- Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
- Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
- Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
- Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
- Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
- Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
- Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
- Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
- Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).
