Summary
사전 형성된 나노디스크에 공동 번역하여 삽입하면 세제와의 접촉 없이 정의된 지질 환경에서 무세포 합성된 막 단백질을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 필수 시스템 구성 요소의 준비와 발현 효율성 및 샘플 품질을 개선하기 위한 중요한 파라미터를 설명합니다.
Abstract
무세포 발현 시스템을 사용하면 반응 환경을 맞춤 설계하여 막 단백질과 같은 복잡한 단백질의 기능적 접힘도 지원할 수 있습니다. 막 단백질을 나노 디스크로 공급되는 미리 형성되고 정의된 막으로 공동 번역 삽입 및 접는 실험 절차가 시연됩니다. 이 프로토콜은 세제가 전혀 없으며 하루 이내에 밀리그램의 정제된 샘플을 생성할 수 있습니다. 생성된 멤브레인 단백질/나노디스크 샘플은 결정화, 핵자기 공명 또는 전자 현미경과 같은 다양한 기능 연구 및 구조 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 무세포 용해물, 설계된 멤브레인이 있는 나노디스크, 중요 스톡 용액 및 2구획 무세포 발현 반응의 조립과 같은 기본 핵심 구성 요소의 준비에 대해 설명합니다. 막 단백질의 접힘 요구 사항은 매우 다양할 수 있으므로 이 프로토콜의 주요 초점은 중요한 염기성 반응 화합물, 나노디스크의 막 조성, 산화 환원 및 샤페론 환경 또는 DNA 주형 설계와 같은 샘플 품질에 중요한 파라미터 및 반응 단계의 조절입니다. 전체 과정은 프로테오르호돕신과 G-단백질 결합 수용체의 합성으로 입증됩니다.
Introduction
막 단백질(MPs)은 수성 환경에서의 불용성으로 인해 단백질 생산 연구에서 도전적인 표적입니다. 기존의 MP 생산 플랫폼은 대장균, 효모 또는 진핵 세포와 같은 세포 기반 시스템으로 구성됩니다. 합성된 재조합 MP는 세포막으로부터 추출되거나 봉입체로부터 재접힌다1. 세제 가용화 후, MP는 체외 재구성 프로토콜을 확립하여 적절한 막 환경으로 옮겨질 수 있습니다. 소포 및 리포좀 외에도 MP는 나노 디스크2 또는 살리 프로3 입자 형태의 평면 막으로 재구성되어 최근에 일상적인 기술이되었습니다. 그러나 이러한 모든 전략은 불안정화, 올리고머의 해리, 심지어 단백질 구조및 활성의 손실을 초래할 수 있는 MP와의 세제 접촉을 의미합니다4. 따라서 최적의 세제 가용화 및 재구성 조건을 위한 스크리닝은 지루하고 시간이 많이 소요될 수 있습니다5.
무세포(CF) 시스템의 개방 특성으로 인해 발현 반응이 정의된 지질 조성으로 미리 형성된 멤브레인에 직접 공급될 수 있습니다. 이 지질 기반 발현 모드(L-CF)에서, 합성된 MP는 제공된 이중층(6,7)에 공동 병진적으로 삽입할 기회를 갖는다(도 1). 평면 지질 이중층 디스크(8)를 둘러싸는 막 스캐폴드 단백질(MSP)로 구성된 나노디스크는 이러한 전략9, 10에 특히 적합한 것으로 보인다. 나노디스크는 다양한 지질로 시험관 내에서 일상적으로 조립할 수 있고, 매우 안정적이며, 스톡은 최대 1mM까지 농축될 수 있다. 그러나 대장균에서의 MSP 발현 및 정제가 필요합니다. 대안적인 전략으로서, MSP는 리포좀11,12,13과 함께 공급된 CF 반응에서 표적 MP와 함께 발현될 수 있다. MSP와 MP 모두에 대한 DNA 템플릿이 반응에 추가되고 발현 시 MP/나노디스크가 형성될 수 있습니다. MSP 생산은 피할 수 있지만 공동 발현 전략은 최종 DNA 주형 농도를 신중하게 미세 조정해야 하며 샘플 생산 효율성의 더 높은 변동을 기대할 수 있습니다.
미리 형성된 나노 디스크의 막에 MP의 공동 번역 삽입은 트랜스 로콘 기계 및 신호 서열13,14,15,16과 독립적 인 비 생리 학적 및 여전히 크게 알려지지 않은 메커니즘입니다. 삽입 효율의 주요 결정 인자는 막 단백질의 유형뿐만 아니라 제공된 막의 지질 조성이며, 음전하를 띤 지질에 대한 빈번한 선호15,17. 나노디스크 막이 크기가 상대적으로 제한되어 있기 때문에, MP 삽입시 상당한 양의 지질이 방출된다(18). 나노디스크 크기의 변화는 더 높은 올리고머 MP 복합체(15,18)의 삽입 및 튜닝을 가능하게 한다. 그 중에서도 이온 채널 KcsA, 이온 펌프 프로테오르호돕신(PR) 및 다제 수송체 EmrE15,18에 대해 호모올리고머 복합체의 올바른 조립이 나타났습니다. MP는 상대적으로 동일한 주파수로 양쪽에서 대칭 나노 디스크 막으로 들어갈 가능성이 높습니다. 따라서 하나의 나노 디스크에 삽입 된 상이한 단량체 또는 올리고머는 반대 배향을 가질 수 있음을 고려해야한다. 그러나, 배향의 편향은 PR 헥사머 및 KcsA 사량체18의 형성에 대해 보고된 바와 같은 협력적 삽입 메커니즘에 의해 야기될 수 있다. MP 방향의 추가 편향은 아마도 나노 디스크 멤브레인의 가장자리에 삽입 된 MP의 방향 스위치로 인해 발생할 수 있습니다.
E. coli 균주로부터 CF 용해물의 생산은 신뢰할 수 있는 일상적인 기술이며 거의 모든 생화학 실험실(19,20)에서 수행될 수 있습니다. 이황화 다리 형성 외에도 MP가 대장균 용해물을 사용하여 합성되는 경우 대부분의 다른 번역 후 변형이 없다는 점을 고려해야합니다. 이것은 구조 연구를 위해 더 균질한 샘플을 생성할 수 있지만 개별 MP 표적의 기능에 대한 잠재적 영향을 배제해야 할 수도 있습니다. 그러나, E. coli CF 용해물에서 G- 단백질 결합 수용체 (GPCR) 14,21,22, 진핵 수송 체 23 또는 큰 이종 이성질체 어셈블리 24의 고품질 샘플의 효율적인 생산은 복잡한 표적에 대한 적합성을 나타냅니다. 시료의 분취 스케일 양(≈ 1 mg/mL)은 반응 혼합물(RM)과 공급 혼합물(FM) 구획으로 구성된 2구획 연속 교환 무세포(CECF) 구성으로 얻을 수 있습니다. FM 부피는 RM 부피의 15 내지 20배를 초과하고, 저분자량 에너지 화합물 및 전구체(19)의 저장소를 제공한다. 따라서 발현 반응은 수 시간 동안 연장되고 MP 표적의 최종 수율이 증가합니다. RM 및 FM 구획은 10-14kDa 컷오프가있는 투석막으로 분리됩니다. 두 구획에는 CECF 반응 용기의 특수 설계가 필요합니다(그림 1). RM 용기로서의 상업용 투석 카세트와 FM을 보유하는 맞춤형 플렉시 유리 용기가 적합한 예입니다. MP 수율은 RM:FM 비율을 수정하거나 일정 기간 배양 후 FM을 교환하여 추가로 조작할 수 있습니다.
MP의 수율과 품질은 종종 반응 파라미터의 집중적인 최적화를 필요로 합니다. CF 발현의 중요한 장점은 MP의 개별 요구 사항에 따라 거의 모든 화합물을 수정하고 미세 조정할 수 있다는 것입니다. 간단한 전략은 먼저 기본 생산 프로토콜을 수립하여 MP의 수율을 개선하는 데 집중한 다음 반응 및 접힘 조건을 미세 조정하여 MP 품질을 최적화하는 것입니다. CF 용해물에 생리학적 과정이 없고 복잡성이 감소하면MP25의 효율적인 생산을 위한 높은 성공률이 발생합니다. DNA 주형 설계 및Mg2+ 이온 농도의 최적화를 위한 통상적인 고려사항은 대부분의 경우 만족스러운 수율(26)을 얻기에 충분하다. 발현 모드에 따라, MP 품질의 최적화는 더 다양한 파라미터가 스크리닝될 필요가 있기 때문에(14,17,22) 시간이 많이 소요될 수 있다.
설명된 CF 발현 플랫폼을 확립하려면 대장균 CF 용해물(i), T7 RNA 중합효소(ii), 나노디스크(iii) 및 염기성 CECF 반응 화합물(iv)의 생산에 프로토콜이 필요합니다(그림 1). E. coli K12 균주 A1927 또는 BL21 유도체는 효율적인 S30(30,000 x g에서 원심분리) 용해물의 제조에 자주 사용됩니다. S30 용해물 외에, 다른 g-force(예: S12)에서 원심분리된 상응하는 용해물이 사용될 수 있다. 용해물은 발현 효율과 프로테옴 복잡성이 다릅니다. 기재된 프로토콜에 의해 제조된 S30 용해물의 프로테옴은도 28에서 상세히 연구되었다. S30 프로테옴에는 여전히 이온 채널의 발현 및 분석시 배경 문제를 일으킬 수있는 일부 잔류 외막 단백질이 포함되어 있습니다. 이러한 표적의 경우 S80-S100 용해물을 사용하는 것이 좋습니다. 용해물 준비 중 유용한 변형은 세포의 중간 로그 성장 단계에서 열 충격과 에탄올 공급을 결합하여 SOS 반응을 유도하는 것입니다. 생성된 HS30 용해물은 샤페론이 풍부하고, 개선된 MP 폴딩(22)을 위해 S30 용해물과의 블렌드에 사용될 수 있다. 대장균 용해물에서의 CF 발현은 T7 RNA 중합효소(T7RNAP)에 의해 제어되는 프로모터를 포함하는 DNA 주형과의 결합된 전사/번역 과정으로 작동됩니다. 효소는 pAR1219 플라스미드29를 운반하는 BL21(DE3) 스타 세포에서 효율적으로 생산될 수 있습니다.
MSP1E3D1의 두 사본은 직경이 10-12 nm 인 하나의 나노 디스크로 조립되지만 아래에 설명 된 프로토콜은 다른 MSP 유도체에도 작동 할 수 있습니다. 그러나, MSP1E3D1로 형성된 것보다 큰 나노디스크는 덜 안정한 경향이 있는 반면, MSP1과 같은 MSP 유도체로 형성된 더 작은 나노디스크는 더 큰 MPs 또는 MP 복합체를 수용하지 못할 수 있다. MSP1E3D1 나노디스크는 매우 다양한 지질 또는 지질 혼합물로 시험관내에서 조립할 수 있습니다. 예비 성형 된 나노 디스크는 일반적으로 -80 ° C에서 > 1 년 동안 안정하지만 안정성은 지질 성분에 따라 다를 수 있습니다. MP의 접힘 및 안정성에 대한 지질 효과를 스크리닝하려면 대표적인 다양한 지질/지질 혼합물로 조립된 포괄적인 나노디스크 세트를 준비해야 합니다. 다음의 지질은 좋은 출발 선택을 제공할 수 있다: 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-락-글리세롤) (DMPG), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-락-(1-글리세롤) (DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-glycerol) (POPG) 및 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포콜린 (POPC).
3mL CECF 반응의 제조를 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 1:1 비율로 추가 확장 또는 축소가 가능합니다. 2구획 CECF 구성의 경우 모든 화합물을 포함하는 RM과 저분자량 화합물만 포함하는 FM을 준비해야 합니다. 10-14kDa MWCO의 상업용 3mL 투석 장치를 RM 용기로 사용할 수 있으며, 이를 FM을 고정하는 맞춤형 플렉시 유리 용기에 넣을 수 있습니다(그림 1D)30. RM:FM의 비율은 1:20이므로 3mL RM에 대해 60mL의 FM을 준비해야 합니다. 여러 성분의 품질, 농도 또는 유형은 합성된 MP의 최종 수율 및/또는 품질에 중요할 수 있습니다(표 1). DNA 주형은 공개된 가이드라인에 따라 제조되어야 하며, 표적의 판독 프레임의 코돈 최적화는 생성물 수율을 더욱 크게 향상시킬 수 있다(26). 분취 규모 CECF 반응의 경우, PR 생산을 위한 확립된 프로토콜이 기재되어 있다. 새로운 MP에 대한 발현 프로토콜을 확립하려면 일반적으로 수율과 품질을 개선하기 위해 특정 화합물(표 1)의 최적화 스크린을 수행해야 합니다. Mg2+ 이온의 경우, 상이한 DNA 주형에 대해 유의한 변화를 자주 보여주는 잘 집중된 최적 농도가 존재한다. T7RNAP 또는 S30 용해물의 새로운 배치와 같은 다른 CF 반응 화합물은 최적의Mg2+ 농도를 추가로 이동시킬 수 있습니다. 예로서, 14-24 mM 농도의 범위 내에서 및 2 mM의 단계에서의 전형적인Mg2+ 화가 설명된다. 각 농도는 중복 및 분석 규모 CECF 반응으로 스크리닝됩니다. CECF 반응 용기로서, RM을 보유하는 맞춤형 Mini-CECF 플렉시글라스 용기(30 )가 FM을 보유하는 표준 24웰 마이크로플레이트와 조합하여 사용된다(도 1B). 대안적으로, 96-딥 웰 마이크로플레이트 또는 적절한 셋업의 다른 상용 투석기 장치와 조합된 상업용 투석 카트리지가 사용될 수 있다(도 1C).
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Protocol
1. S30 용해물의 제조
- 1일차: LB 한천 플레이트의 글리세롤 스톡에서 세포를 추출하고 37 ° C에서 밤새 배양합니다.
- 2일차: 한천 플레이트의 세포에 LB 배지 200mL를 접종하고 37°C에서 12-14시간 동안 배양합니다.
- 3 일째 : 100 mL의 사전 배양 (1 : 100 mL의 15 L 교반 탱크 반응기에서 37 °C로 템퍼링 된 멸균 YPTG 배지 (10 g / L 효모 추출물, 16 g / L 트립톤, 5 g / L NaCl, 19.8 g / L 포도당, 4.4 mM KH2PO4, 8 mM K2HPO4)를 접종한다. 37 ° C, 500 rpm 및 높은 통기 (분당 ~ 3 풍량)에서 배양하십시오. 과도한 거품을 방지하려면 멸균 소포제를 첨가하십시오.
- 일정한 시간 간격으로 600nm에서 광학 밀도(OD)를 측정합니다. 약 2시간 후에 배양은 로그 단계에 들어갑니다.
- HS30 용해물에 대한 수정 : 세포가 중간 로그 단계 (OD600 ≈ 3.6-4.2)에있을 때 배양 배지에 에탄올 300mL를 넣고 42 ° C, 500rpm 및 높은 통기 (분당 약 3 풍량)에서 45 분 동안 배양을 진행합니다. 이어서, 단계 1.6에 기재된 바와 같이 세포 배양물의 냉각 및 수확을 진행한다. 표준 S30 용해물 생산의 경우이 단계를 건너 뛰고 1.6 단계로 진행하십시오.
- 셀이 중간 로그 단계 (OD600 ≈ 3.6-4.2)에있을 때 발효기를 < 30 분 이내에 20 ° C 이하로 냉각시킵니다. 최종 OD600은 약 4.5-5.5여야 합니다. 세포를 4°C에서 20분 동안 4,500 x g에서 수확하고 상청액을 버린다. 다음 단계 동안 세포를 4°C로 유지하십시오.
알림: 냉각 중에 과도한 거품이 발생할 수 있습니다. 이 경우 소포제를 추가하거나 교반 속도를 줄이거 나 생물 반응기의 공기 흐름을 줄이십시오. - 주걱을 사용하여 300mL의 S30-A 완충액(10mM Tris-HCl, pH 8.2, 14mM Mg(OAc)2, 60mM KCl, 6mM 2-메르캅토에탄올)에 세포를 완전히 현탁시킨 후 균질해질 때까지 현탁액을 위아래로 피펫팅합니다. 4°C에서 10분 동안 8,000 x g 로 원심분리합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
주의 : 2- 메르 캅토 에탄올은 독성이 있습니다. 피부 나 호흡기와의 접촉을 피하십시오. 가능하면 후드 아래에서 작업하십시오. 마지막 세척 단계 전에 빈 원심분리기 비커의 무게를 잰다. 원심분리 후 습식 셀 펠릿의 무게를 측정하고 1.8단계를 진행하거나 추가 사용이 있을 때까지 펠릿을 보관하십시오.
참고: 습식 세포 펠릿의 무게는 1L 생물반응기 배양물당 5-7g입니다. 이 시점에서 프로토콜은 일시 중지될 수 있고 펠릿은 액체 질소에서 동결되고 -80°C에서 4-8주 동안 저장될 수 있습니다. - S30-B 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, cOmplete 프로테아제 억제제 1정 1정)의 1.1 부피(1 g = 1 mL)에 세포를 완전히 현탁시킵니다. 현탁액을 사전 냉각된 프렌치 프레스 압력 셀에 채우고 1,000psig에서 세포를 파쇄합니다. 프랑스 언론을 통해 세포를 한 번 통과시킵니다.
- 용해물을 30,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 원심분리 단계를 반복합니다.
알림: 첫 번째 원심분리 후 펠릿 위에 느슨하고 끈적끈적한 층이 존재할 수 있으며, 이는 상청액과 함께 옮겨져서는 안 됩니다. - 불안정한 용해물 성분을 제거하고 리보솜에서 mRNA를 방출하기 위해 높은 염분 및 열 단계를 적용합니다. 용해물을 0.4 M NaCl로 조정하고 수조에서 45분 동안 42°C에서 배양한다.
알림: 이 단계는 상당한 침전물 형성을 유발합니다. 때때로 배양하는 동안 튜브를 뒤집거나 뒤집습니다. - 탁한 현탁액(보통 50-80mL)을 10-14kDa 컷오프가 있는 투석관으로 옮기고 5L S30-C 완충액(10mM Tris-HCl, pH 8.2, 14mM Mg(OAc)2, 60mM KOAc, 0.5mM DTT)에 대해 투석합니다. 2-3 시간 후에 S30-C 투석 완충액을 교환하고 12-14 시간 동안 투석하십시오.
- 4 일째 : 투석된 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고 30,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 상청액(S30 용해물)을 신선한 50mL 튜브에 옮기고 부드럽게 혼합합니다. 용해물의 단백질 농도는 약 30-40 mg / mL이어야합니다. 분취량(예: 0.5mL, 1mL)을 액체 질소에 충격 동결하고 -80°C에서 보관합니다. 분취량은 > 1년 동안 안정적입니다.
2. T7 RNA 중합효소의 발현 및 정제
- 1일차: 100μg/mL 암피실린이 포함된 200mL LB 배지에 새로 플레이팅된 BL21(DE3) Star x pAR1219 세포를 접종하고 37°C 및 180rpm에서 12-16시간 동안 배양합니다.
- 2일차: 2L 배플 플라스크에 1L 훌륭한 국물(12g/L 트립톤, 24g/L 효모 추출물, 4mL/L 글리세롤)을 10mL의 전배양액과 함께 접종하고 37°C 및 180rpm 교반에서 배양합니다. 시작 OD600은 약 0.1이어야 합니다.
- OD600이 0.6-0.9에 도달하면 IPTG를 최종 농도 1mM에 추가하여 T7RNAP 발현을 유도하고 5시간 동안 배양을 계속합니다.
- 4°C에서 20분 동안 4,500 x g 에서 원심분리하여 세포를 수확합니다. 액체 질소에 세포를 동결시키고 -80 °C에서 보관하십시오.
참고: 여기에서 프로토콜이 일시 중지될 수 있습니다. - 3 일째 : 동결된 세포 펠릿에 30mL의 얼음처럼 차가운 현탁액 완충액(30mM Tris-HCl, cOmplete 프로테아제 억제제 1정 포함 pH 8.0)을 추가하고 펠릿을 실온의 수조에서 해동합니다. 그런 다음 균질해질 때까지 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 현탁시킵니다.
- 이전 섹션에서 설명한 대로 프렌치 프레스를 사용하여 세포 파괴를 수행하거나 제조업체의 권장 사항에 따라 초음파 처리 장치를 사용하십시오. 이어서, 4°C에서 30분 동안 20,000 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮긴다.
- 게놈 DNA를 침전시키려면 최종 농도가 3%(w/v)에 도달할 때까지 상청액에 스트렙토마이신 설페이트를 천천히 부드럽게 교반하여 추가합니다. 부드러운 교반하에 4 ° C에서 5-10 분 동안 배양하십시오. 20,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
- 0.45μm 필터로 상청액을 여과하고 4mL/분의 유속으로 연동 펌프를 사용하여 2CV 평형 완충액(30mM Tris-HCl, pH 8.0, 10mM EDTA, 50mM NaCl, 5% 글리세롤 및 10mM 2-메르캅토에탄올)으로 평형화된 컬럼 부피(CV)가 40mL인 Q-세파로즈 컬럼에 로드합니다. 그런 다음 컬럼을 UV 검출기에 연결하고 280nm의 UV 신호가 안정적인 기준선에 도달할 때까지 평형 버퍼로 용리를 계속합니다.
- 3mL/분의 유속에서 CV당 50mM에서 500mM NaCl까지의 구배로 T7RNAP를 용리합니다. 1mL 분획을 수집하고 각 분획의 10μL를 2 x SDS 시료 완충액과 혼합하여 SDS-PAGE 분석용 시료를 준비합니다. SDS-PAGE를 실행하고 쿠마시 블루 R로 겔을 염색합니다. T7RNAP는 수많은 추가 불순물 밴드와 함께 약 90kDa에서 두드러진 밴드로 나타나야 합니다.
- T7RNAP를 함유하는 풀 분획을 투석 완충액 (10 mM K2HPO4/KH2PO4, pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% (w/v) 글리세롤) 중에서 12-14 kDa MWCO를 갖는 막을 사용하여 투석한다.
- 4 일째 : T7RNAP 용액을 수집하고 12-14 MWCO의 필터 장치를 사용하여 최종 농도 3-10 mg / mL까지 농축합니다. T7RNAP는 농축 중에 침전되기 시작할 수 있습니다. 샘플의 탁도가 발생하는 즉시 농축을 중지하십시오. 글리세롤을 최종 농도 50%(w/v)까지 넣고 부드럽게 섞습니다. 0.5-1 mL 분취량을 충격 동결하고 -80 °C에서 보관합니다. 작동 T7RNAP 분취량은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
알림: 20L 발효에서 20,000-40,000 단위의 5mg/mL 부분 정제 T7RNAP의 약 40-40mL를 얻어야 합니다. 각 T7RNAP 배치의 최적량을 테스트하려면 준비된 T7RNAP 샘플 0.02mg/mL-0.1mg/mL를 포함하는 녹색 형광 단백질(GFP)의 CF 발현 반응을 수행해야 합니다.
3. MSP1E3D1의 발현 및 정제
- 1일차: 표준 열 충격 변환 또는 전기 천공 프로토콜을 사용하여 pET28(a)-MSP1E3D1 벡터31로 대장균 BL21(DE3) 스타 셀을 변환합니다. 30μg/mL 카나마이신을 함유한 LB 한천에서 형질전환된 세포를 줄무늬 또는 플레이트에 넣고 37°C에서 12-16시간 동안 배양합니다.
- 2일차: 한천 플레이트에서 선택한 단일 콜로니와 함께 0.5%(w/v) 포도당과 30μg/mL 카나마이신이 보충된 LB 배지 200mL를 접종하고 37°C에서 180rpm으로 12-16시간 동안 배양합니다.
- 3 일째 : 교반 탱크 생물 반응기에서 0.5 % (w / v) 포도당과 30μg / mL 카나마이신이 보충 된 100 L LB 배지에 100 mL의 사전 배양물을 접종합니다. 37 °C, 500 rpm에서 발효를 수행하고 분당 약 3 개의 생물 반응기 부피를 폭기합니다. 과도한 거품이 발생하는 경우 소포제를 첨가하십시오.
알림: 발효기 대신 배플 쉐이킹 플라스크를 사용할 수 있습니다. - 6.5-7.5의 OD600에서, IPTG를 1 mM의 최종 농도로 첨가하고, 37°C에서 1 h 동안 인큐베이션을 계속한다. 4°C에서 20분 동안 4,500 x g 에서 원심분리하여 세포를 수확합니다. 200mL의 0.9%(w/v) NaCl로 셀 펠릿을 세척하고 8,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 상청액을 버리고 주걱을 사용하여 세포를 50mL 튜브로 옮깁니다. 예상되는 습식 펠렛 중량은 생물 반응기 배양 L 당 8-12g입니다. 액체 질소에 충격 동결 세포 펠릿을 넣고 추가 사용이 될 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.
참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. - 4 일째 : 정제를 위해, 세포 펠릿을 RT의 수조에서 해동시킨다. 세포를 MSP-A 완충액(40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 1%(w/v) Triton X-100, 50 mL 세포 현탁액당 c0mplete 프로테아제 억제제 칵테일 1정)에 현탁시켜 30-40%(w/v) 세포 현탁액을 수득한다.
- 초음파 처리 또는 프렌치 프레스 및 원심분리기를 사용하여 4°C에서 30분 동안 30,000 x g 로 세포를 파쇄합니다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 0.45μm 필터를 통해 여과합니다. 연동 펌프를 사용하여 5CV의 MSP-B 완충액(40mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 1%(w/v) Triton X-100)으로 평형화된Ni2+ 로딩된 니트릴로트리아세트산 컬럼(CV > 15mL) 상에 여과액을 도포한다.
알림: 여과를 용이하게하기 위해 상청액을 1 분 더 초음파 처리하여 큰 DNA 단편을 분해 할 수 있습니다. - 샘플 로딩 후, 컬럼을 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM 트리스-HCl, pH 8.9, 300 mM NaCl, 50 mM 콜산), 5 CV MSP-D (40 mM 트리스-HCl, pH 8.9, 300 mM NaCl), 5 CV msp-E (40 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl) 및 5 CV MSP-F (40 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 50 mM 이미다졸).
참고: MSP-C 완충액의 콜산은 MSP에 부착된 지질을 제거하는 데 중요합니다. 콜산은 낮은 pH 값에서 완전히 용해되지 않습니다. 따라서 MSP-C 및 MSP-D에서 pH 값을 8.9로 조정해야 합니다. pH가 낮으면 잔류 콜산이 침전되어 컬럼이 막히거나 손상될 수 있으므로 MSP-D 완충액으로 컬럼을 세척하는 것이 중요합니다. - MSP-G (40 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM 이미다졸)로 MSP를 용리시킨다. 1mL의 분획을 수집하고 280nm에서 UV 흡수를 모니터링합니다. 용리 피크의 분획을 수집하고 풀링합니다.
- 풀링된 MSP 분획을 12-14kDa MWCO 투석막 튜브로 옮기고 5L의 MSP-H(40mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 10%(w/v) 글리세롤)에 대해 4°C에서 2-3시간 동안 투석합니다. 새로운 5L MSP-H 완충액으로 변경하고 4°C에서 12-16시간 더 투석합니다.
- 5 일째 : MSP 용액을 원심분리 튜브에 옮기고 18,000 x g에서 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 침전물을 제거합니다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 4 ° C에서 12-14 kDa MWCO의 한외 여과 장치를 사용하여 200-800 μM으로 농축합니다. UV/VIS 측정 장치를 사용하여 농도를 측정합니다. 농도 계산을 위해 27.31 M-1 cm-1의 흡광 계수와 31.96 kDa의 분자량을 사용하십시오.
참고: 바이오리액터에서의 발현은 일반적으로 L 배양물당 15-30mg의 MSP1E3D1을 산출합니다. - 농축된 MSP 용액의 분취량을 액체 질소에 충격-동결시키고 -80°C에서 저장한다.
4. MSP1E3D1 나노 디스크의 조립
- 1일차: 100mM 콜레이트 나트륨에 50mM 지질 스톡 (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC 또는 POPC) 1-2mL를 준비합니다. 당일 사용하지 않을 경우 -20°C에서 보관하십시오.
알림: 지질 용액은 깨끗해야합니다. 용액이 투명하지 않으면 나트륨 콜레이트 농도가 150mM로 증가 할 수 있습니다. - MSP1E3D1 용액을 지질 용액과 혼합합니다. 도데실 포스포콜린(DPC)을 최종 농도 0.1%(w/v)로 추가합니다. 조립 반응은 투석 카세트(10kDa MWCO)의 전형적인 부피에 해당하는 3mL(표 2) 또는 12mL의 최종 부피로 조정될 수 있다. 부드러운 교반 하에 21°C에서 1시간 동안 조립체 반응을 배양합니다.
참고: 각 지질에 대해 균일한 나노디스크 준비를 보장하기 위해 특정 MSP1E3D1:지질 비율을 사용해야 합니다(표 2). 새로운 지질 또는 지질 혼합물의 경우, 최적의 비율은 파일럿 실험 및 크기 배제 크로마토그래피 분석(14)으로 결정되어야 한다. - 투석 카세트의 막을 디스크 형성(DF) 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl)으로 미리 습윤시켰다. 조립 혼합물을 주사기로 투석 카세트로 옮깁니다. 잠재적 인 기포는 주사기를 사용하여 흡인하여 제거 할 수 있습니다.
- 1-4 일 : 교반 막대를 사용하여 교반 하에 RT에서 10-20시간 동안 3 x 5 L DF 완충액에 대해 투석합니다. 그런 다음 조립 혼합물을 투석 카세트에서 DF 버퍼로 평형화된 10kDa MWCO의 원심 필터 장치로 옮깁니다. 4 °C에서 4,000 x g 으로 농축합니다.
알림: 탁한 투석 혼합물은 MSP:지질의 잘못된 화학량론적 비율을 나타낼 수 있습니다. 침전물은 샘플을 농축하기 전에 4 ° C에서 20 분 동안 18,000 x g 에서 제거해야합니다. 시료 농축 중 침전을 방지하려면 데드스톱이 큰 한외여과 장치를 사용하십시오. - 조립된 나노디스크를 최소 300μM의 농도로 농축합니다. UV/VIS 리더를 사용하여 농도를 측정합니다. 하나의 나노디스크가 두 개의 MSP1E3D1 분자에 의해 형성되므로 정확한 양의 나노디스크를 결정하기 위해 MSP의 농도를 2로 나누어야 한다고 가정하십시오.
참고: 설명된 설정(표 2)은 0.6-1mL의 300μM 나노디스크 용액을 생성합니다. - 농축된 나노디스크 제제를 18,000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 이어서, 상청액 50 μL 분취량을 액체 질소에서 충격 동결하고 -80°C에서 저장한다.
참고: 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 나노디스크 형성의 성공을 평가하는 것이 좋습니다. 샘플은 단분산이어야 하며 적은 양의 응집체만 포함해야 합니다. 응집체는 설정에서 지질의 양이 너무 높다는 것을 나타냅니다. 참고로 정제된 MSP1E3D1을 사용할 수 있습니다. 나노디스크 제제가 기준 MSP1E3D1 피크의 높이에서 피크를 나타내는 경우, 선택된 지질 대 MSP1E3D1 비율이 너무 낮았다.
5. 분취 저울 3mL CECF 반응 설정
- 1일차: 나열된 대로 필요한 모든 스톡 솔루션을 준비합니다(표 3). 주식은 -20°C에서 보관하고 실온에서 해동한다. 해동 후와 피펫팅 전에 모든 스톡을 철저히 혼합하십시오. 모든 주식에 필요한 부피를 계산하고 피펫팅 계획을 세웁니다(표 4). 고분자량 화합물은 RM에만 첨가됩니다. 저분자량 화합물의 경우 RM 및 FM을 위한 결합된 3 x 마스터믹스를 제조할 수 있습니다.
알림: 혼합 혼합물의 최종 부피는 혼합 중 부피 손실로 인해 계산된 것보다 적을 수 있습니다. 이는 체적 손실을 보상하기 위해 2-5%의 초과 부피를 추가하여 피할 수 있습니다. - 3 mL 투석 카세트의 막을 100 mM 트리스-아세테이트, pH 8.0에서 평형화시킨다. 초과 버퍼를 제거하십시오.
- 주사기를 사용하여 RM을 투석 카세트로 옮깁니다. 주사기로 흡인하여 RM 구획의 과도한 공기를 제거하십시오. 투석 카세트를 투석실에 넣습니다.
- 투석실에 FM 60mL를 채웁니다. 챔버에 뚜껑을 덮고 나사를 조여 고정합니다. 챔버를 200 rpm에서 30°C에서 12-16 h 동안 인큐베이션한다.
알림: 교반하는 동안 챔버가 수직 위치에 있는지 확인하십시오., 그렇지 않으면 저분자 화합물의 교환이 방해받을 것입니다. - 2일차: 주사기를 사용하여 투석실에서 RM을 흡인합니다. RM을 새로운 튜브로 옮기고 4°C에서 16,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 침전물을 제거합니다. 상청액을 신선한 튜브로 옮깁니다. 이제 상청액의 단백질을 추가로 분석할 수 있습니다.
알림: 어떤 경우에는 원심분리 후 펠릿이 존재합니다. 이는 합성된 MP를 용해성으로 유지하기 위해 분석된 나노디스크 또는 반응 화합물의 적합성에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. 따라서 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯을 사용하거나 펠릿 크기의 육안 평가를 통해 침전물에 잠재적으로 존재하는 표적의 양을 분석하는 것이 좋습니다.
6. Mg2+ 이온 스크리닝을 위한 분석 스케일 60 μL CECF 반응 설정
- 1일차: 각각의 3x 마스터 믹스의 모든 성분을 혼합하고 RM에 60μL, FM에 825μL를 분배합니다. FM을 H2O로 채우고 와동으로 FM을 혼합합니다. FM을 24웰 마이크로플레이트의 3웰로 옮깁니다(표 5).
참고: 맞춤형 Mini-CECF 용기에 접근할 수 없기 때문에 표 5 의 부피는 96개의 딥웰(2mL) 플레이트에서 FM 부피가 1.7mL인 투석 카트리지(10-14kDa MWCO, RM: 100μL)에서 수행된 반응에 대해 계산됩니다(그림 1). - 10-14 kDa MWCO의 재생 셀룰로오스 투석관을 약 25 x 20 mm 크기의 조각으로 자르고 0.05 % (w / v) 나트륨 아 지드화물로 H2O에 보관하십시오.
주의 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이 있습니다. 피부 나 점막과의 접촉을 피하십시오. 아지드화 나트륨은 금속과 반응하여 폭발성 금속 아자이드를 형성할 수 있으므로 금속 용기를 사용하지 마십시오. - Mini-CECF 용기 조립 전에, 티슈로 투석막으로부터 과도한H2O를 제거한다. 각 용기에 하나의 멤브레인 조각을 놓고 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 링으로 멤브레인을 고정하십시오.
- Mini-CECF 용기를 825μL의 FM이 있는 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. Mini-CECF 용기의 투석막 아래에 기포가 생기지 않도록 합니다.
- 설명된 대로 RM에 고분자 성분을 추가하고(표 5) 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 반응 용기에 60 μL를 첨가한다. 점성 용액을 옮기는 동안 기포를 피하십시오.
- 밀봉 열가소성 필름 2 장의 8 x 10cm 시트를 자르고 반응 용기가 들어있는 24 웰 플레이트 주위를 감 쌉니다. 이것은 반응 혼합물로부터의 증발을 감소시킬 것이다. 이제 세포 배양 접시의 뚜껑을 접시에 놓고 테이프로 고정하십시오. 플레이트를 30°C 및 200rpm 교반에서 12-16시간 동안 인큐베이션한다.
- 2일차: Mini-CECF 용기의 피펫 팁으로 투석막을 관통하여 반응 혼합물을 수확하고 RM을 흡인합니다. RM을 새 튜브로 옮기고 4°C에서 16,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 침전물을 제거합니다. 상청액을 신선한 튜브로 옮깁니다. 이제 상청액의 단백질을 추가로 분석할 수 있습니다.
알림: 어떤 경우에는 원심분리 후 펠릿이 존재합니다. 이는 합성된 MP를 용해성으로 유지하기 위해 분석된 나노디스크 또는 다른 반응 화합물의 적합성에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. 따라서 침전물에 잠재적으로 존재하는 표적의 양을 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, 또는 펠릿 크기의 육안 평가에 의해 분석하는 것이 바람직하다.
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Representative Results
미세 조정 반응 화합물이 합성된 MP의 최종 수율 또는 품질에 미치는 영향이 예시됩니다. 빈번한 일상적인 접근법은 시스템 효율의 편리한 모니터로서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현에 의해 CF 반응에서 최적의 Mg2+ 농도를 조정하는 것입니다. 예를 들어, GFP는 14와 24 mM 사이의 Mg 2+ 농도에서pET-21a(+) 벡터로부터 합성되었습니다(그림 2). SDS-PAGE 분석은 20 mM에서 최적의Mg2+ 농도를 확인하였고 (도 2A), 이는 CF 반응 상청액의 상보적 형광 측정(485 nm에서의 여기, 535 nm에서의 방출 측정)에 양호하게 일치한다(도 2B). pIVEX 2.3 벡터로부터 발현된 박테리아 PR의 CF 발현 및 pET-21a(+) 벡터로부터 발현된 칠면조 β1 아드레날린성 수용체(Tβ1AR)의 CF 발현에 대해, 최적Mg2+ 농도는 20-22 mM에서 확인되었다.
추가의 예로서, 설명된 전략을 갖는 합성된 MP들의 품질 개선이 도시된다. 미리 형성된 나노디스크에 MP의 공번역 삽입을 위한 조정 가능한 파라미터는 (i) 나노디스크 막의 지질 조성 및 (ii) 반응에서의 최종 나노디스크 농도이다. 소수성 환경은 MP의 올바른 폴딩, 올리고머 조립 및 안정성을 위한 중요한 파라미터라는 것은 잘 알려져 있습니다. 나노디스크에서의 지질 조성이 조절될 수 있기 때문에, 기술된 접근법은 MP의 구조 및 기능에 대한 지질 효과의 직접적인 체계적인 스크리닝을 가능하게 한다. 초기 실험에서는 포스파티딜콜린(PC) 및 포스파티딜글리세롤(PG) 헤드그룹으로 지질을 스크리닝하고 다양한 사슬 길이와 포화도를 테스트하는 것이 좋습니다. 막 조성과 나노 디스크 농도가 두 개의 다른 MP의 가용화 효율 및 품질에 미치는 영향이 표시됩니다. PR은 광 활성화 양성자 펌프이며 RM에서 > 100 μM의 최종 농도에 도달하는 매우 안정적이고 고도로 합성 된 MP입니다. 따라서 RM 상청액의 530nm에서의 흡수 측정으로 PR 농도를 쉽게 평가할 수 있으므로 올바른 반응 설정을 보장하기 위해 양성 대조군으로 사용하는 것이 좋습니다. 대조적으로,Tβ1AR은 진핵 G-단백질 커플링 수용체 (GPCRs)의 큰 패밀리의 예이고, 복잡하고 불안정한 MP이다. 편리한 모니터링을 위해Tβ1AR-GFP 융합 구조체를 합성하고 GFP 형광을 통해 CF 반응에서 나노디스크 가용화 수용체의 총 농도를 측정했습니다(그림 3A). 기능적으로 접히고 리간드 결합 활성 수용체의 분획을 필터 결합 분석 및 표지된 리간드 [3H]-디히드로알프레놀롤을 사용하여 추가로 결정하였다(도 3B). 필터 결합 분석은 앞서도 14에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, RM 중의 Tβ1AR-GFP 농도는 그의 형광을 통해 결정하였다. GPCR을 20°C에서 1시간 동안 방사성 표지된 리간드와 함께 인큐베이션하고, 필터에 적용하고, 결합되지 않은 리간드를 세척하였다. 비특이적 [3H]-디히드로알프레놀롤 결합의 측정을 위해, 수용체는 대조군 반응에서 표지되지 않은 알프레놀롤로 포화되었다. 필터의 방사성 리간드 계수는 섬광 계수기에서 측정되었으며 결합된 리간드의 양은 특정 라벨 활성을 통해 결정되었습니다. 이어서, GPCR 결합 활성의 퍼센트는 결합된 리간드의 양, Tβ1AR-GFP 농도, 및 분석 부피로부터 계산하였다. Tβ1AR-GFP의 전체 합성 및 나노디스크 가용화는 분석된 모든 막 조성물과 유사하며 8-13μM 범위 내에 있습니다(그림 3A). 대조적으로, 훨씬 더 높은 변화는 합성 된 GPCR의 품질에서 감지 할 수 있습니다. 10% 미만의 활성 분획을 갖는 가장 낮은 활성은 지질 DMPC 및 POPC와 함께 수득된다. DOPG 및 POPG를 사용하면 Tβ1AR-GFP의 활성분획을 약 30%까지 증가시킬 수 있습니다(그림 3B). 결과는 지방산 사슬의 유연성뿐만 아니라 지질 헤드 그룹의 전하가이 GPCR의 접힘 및 활성에 중요한 조절제임을 나타냅니다.
나노 디스크 조성 외에도 CF 반응에서의 최종 농도는 MP 품질에 중요한 요소가 될 수 있습니다. 나노 디스크의 적절한 막 조성이 확인되면 MP 합성 중 농도를 스크리닝해야합니다. 나노 디스크 농도는 MP의 발현 효율에 따라 조정되어야한다는 것은 명백합니다. Tβ1AR-GFP수용체 및 PR의 CF 합성은 RM에서 각각 대략 10 μM 및 100 μM의 최종 농도를 초래한다. 나노 디스크 농도가 3.75-60 μM의 범위 내에서 스크리닝되는 경우, 약 30 μM 나노 디스크에서 GPCR의 완전한 가용화가 얻어지며,Tβ1AR : 나노 디스크의 비율이 1 : 3 (그림 4A). 대조적으로, PR의 완전한 가용화는 이미 약 10μM 나노디스크로 달성되었으며 PR:나노디스크 비율은 10:1입니다(그림 4B). 따라서, Tβ1AR-GFP의 거의 완전한 가용화를 달성하기 위해서는 과량의 나노디스크가필요하며, PR의 경우 반전된 비율은 하나의 나노디스크에 다수의 PR 카피의 삽입을 나타낸다. 네이티브 질량 분석법을 사용한 정제된 PR/나노디스크 복합체에 대한 후속 연구는 이러한 관찰을 확인했으며 더 낮은 나노디스크 농도에서 합성될 경우 더 높은 올리고머 형태의 PR의 유병률을 발견했습니다15,18. 따라서 나노디스크를 사용한 CF 합성 MP의 적정은 올리고머 어셈블리를 트리거하고 MP 기능에 미치는 영향을 연구하는 도구로 사용할 수 있습니다.
그림 1: 멤브레인 단백질을 나노디스크에 삽입하기 위한 CECF 발현 전략. (A) 프로세스의 주요 단계를 보여주는 기본 워크 플로우. (B) CECF 발현을 위한 맞춤형 분석 스케일 반응 용기. (C) 분석 규모 CECF 설정을 위한 시판되는 투석 카트리지. (D) 3mL 투석 카세트 및 맞춤형 플렉시 유리 FM 용기를 포함한 분취용 스케일 설정 (3mL RM). (E) 미리 형성된 나노디스크에 MP의 공동 번역 삽입 및 CECF 구성에서 지질 스크리닝. RM에는 필요한 전사/번역 기계와 나노디스크가 포함되어 있으며 저분자량 화합물이 두 구획에 모두 존재합니다. 생산 된 MP / 나노 디스크 샘플의 생화학 적 및 구조적 응용이 추가로 설명됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: CF GFP 합성에 대한 다양한 Mg2+ 농도의 영향. GFP는 14-24 mM 범위 내의Mg2+ 농도를 갖는 CF 반응에서 합성되었다. (A) SDS-PAGE 분석은 20 mMMg2+에서 GFP의 가장 강한 밴드를 나타낸다. M : 마커. (B) 상이한Mg2+ 농도를 갖는 CF 발현 후의 GFP 형광. 20 mM Mg2+ 에서의 최대 GFP 형광은 4.6 mg/mL에 상응한다. 오차 막대는 중복 측정의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 나노 디스크 막 조성물이 CF 합성 GPCR의 가용화 및 품질에 미치는 영향. 상이한 막 조성을 함유하는 30 μM 나노디스크의 존재 하에 합성된 Tβ1AR-GFP의 수율 및 활성. 합성된 총 단백질(A)과 리간드 결합 활성 수용체의 분획(B)은 μM로 주어진다. 총 농도는 GFP 융합체의 형광 측정을 통해 결정하였다. 활성은 방사성 표지된 리간드[3H]-디히드로알프레놀롤을 사용한 필터 결합 분석을 통해 측정하였다. 오차 막대는 독립 삼중대의 표준 편차를 나타냅니다. 이전에 출판된 원고에서 발췌한 자료14. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 나노디스크 농도가 증가한 CF 합성 MP의 가용화 스크린. MP는 3.75-60 μM의 범위 내에서 공급된 나노디스크의 존재 하에 합성되었다. (A) CF 반응에서 나노디스크(DMPC)를 사용한 Tβ1AR-GFP의 발현. 총 농도는 GFP 융합체의 형광 측정을 통해 결정하였다. 이전에 출판된 원고에서 발췌한 자료14. 친화성-태그 정제된 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 쿠마시-블루 염색은 대략 50 kDa 및 MSP1E3D1에서Tβ1AR-GFP에 상응하는 2개의 두드러진 밴드를 25 kDa 이상으로 나타낸다 (B) CF 반응에서 나노디스크를 사용한 PR (DOPG)의 발현. PR의 총 농도는 530 nm에서의 흡수 측정을 통해 결정하였다. 이전에 출판된 원고10,18에서 가져온 데이터. 사진은 접힌 PR의 존재로 인한 최종 반응의 붉은 색을 보여줍니다. 픽토그램은 후속 네이티브 질량 분석법(18)에 의해 밝혀진 바와 같이, 증가된 나노디스크 농도에 따라 더 낮은 올리고머 형태를 향한 변조된 PR 어셈블리를 보여줍니다. 친화성-태그 정제된 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 쿠마시-블루 염색은 25 kDa 이상의 MSP1E3D1 및 대략 20 kDa에서 PR에 상응하는 2개의 두드러진 밴드를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 화합물 | 최종 농도 범위 | MP 샘플에 미치는 영향 |
| 마그네슘2+ | 10 - 30 밀리미터 | 양도하다 |
| 증권 시세 표시기 | 1 - 20 밀리미터 | 이황화 다리 형성, 접힘 |
| 20 아미노산 혼합물1 | 0.2 – 2 밀리미터 | 양도하다 |
| GSSG : GSH2 | (1-10 μM) : (1-10 μM) | 이황화 다리 형성, 접힘 |
| 나노디스크 | 10 - 100 마이크로미터 | 가용화, 올리고머 조립, 접힘 |
| 지질 유형 | 가용화, 올리고머 조립, 접힘 | |
| S30 : HS30 용해물3 | (50-100 %) : (50-100 %) | 접는 |
| 시즌 12 - 시즌 100 | 20 – 50 % | 수율, 채널 분석의 MP 배경 |
| DNA 주형 | 0.5 - 30 ng / μL RM | 수율, 올리고머 조립, 접힘 |
| DNA 템플릿 디자인 | 양도하다 | |
| 도 1에 나타낸 바와 같이, 혼합물은 예를 들어 수율을 개선하거나 NMR 라벨링 방식을 최적화하기 위해 MP의 개별 조성에 따라 변화될 수 있다. 2, GSH는 항상 신선하게 준비해야합니다. 도 3에 도시된 바와 같이, RM 내의 총 CF 용해물 농도는 높은 발현 수준을 보장하기 위해 적어도 50%의 S30 함량과 함께 적어도 35%이어야 한다. |
||
표 1: CF 반응의 중요한 스크리닝 구성 요소.
| MSP1E3D1 | 지질 | 증권 시세 표시기 | ||||||
| 비율 | (410 μM 스톡) | (50 000 μM 주식) | (10% (w/v) 주식) | |||||
| 지질 | 지질 : MSP | V(MSP) | c(MSP최종) | V (지질) | C (지질최종) | V(DPC) | c (DPC결승) | DF 버퍼 |
| [μL] | [μM] | [μL] | [μM] | [μL] | [%] | [μL] | ||
| 디엠피씨 | 115 : 1 | 1500.0 | 205.0 | 1415.0 | 23 575 | 30.0 | 0.1 | 55.5 |
| 도피 | 80 :1 | 1500.0 | 205.0 | 984.0 | 16 400 | 30.0 | 0.1 | 486.0 |
| 팝 | 85 : 1 | 1500.0 | 205.0 | 1046.0 | 17 425 | 30.0 | 0.1 | 425.0 |
| 증권 시세 표시기 | 110 : 1 | 1500.0 | 205.0 | 1353.0 | 22 550 | 30.0 | 0.1 | 117.0 |
| 독 | 80 : 1 | 1500.0 | 205.0 | 984.0 | 16 400 | 30.0 | 0.1 | 486.0 |
| 팝 | 90 : 1 | 1500.0 | 205.0 | 1107.0 | 18 450 | 30.0 | 0.1 | 363.0 |
표 2: 3mL 체외 조립 설정에 대한 지질 대 MSP1E3D1 비율.
| 화합물 | 농도 | 준비 |
| DNA 플라스미드 템플릿1 | > 10 mM 트리스-HCl pH 8.0에서 400 μg / mL | 미디/맥시 키트(예: 키아젠) 준비2 |
| 20 아미노산의 혼합물3 | H2O에서 각각 25mM | 침전물잔류 4 |
| 4 NTP (75 x)의 혼합물 | c(CTP) 240 mM, c(ATP) 360 mM, c(UTP) 240 mM, c(GTP) 240 mM H2O. KOH로 pH를 7-8로 조정하십시오. |
약간의 침전물이 남아 있습니다4 |
| 아세틸 포스페이트 | H2O에서 1 M, KOH로 pH 7-8 조정 | 침전물잔류 4 |
| 포스포(에놀)피루브산(K+) | H2O에서 1 M, KOH로 pH 7-8 조정 | |
| 폴린산 | H2O에서 10 mg / mL | 침전물잔류 4 |
| 증권 시세 표시기 | H2O에서 0.5 M | |
| C0MPLETE 프로테아제 억제제 칵테일 | H2O에서 1 mL 당 1 정 | |
| 트리스-아세테이트, pH 8.0 | H 2 O에서2.4M | |
| Mg(OAc)2 | H2O에서 1 M | |
| 코에이크 | H2O에서 10M | |
| 리볼록 RNase-억제제 | 40 U / mL | 써모 피셔 사이언티픽 |
| tRNA (대장균) | H2O에서 40 mg / mL | 로슈 (독일) |
| T7RNAP | 3-7 밀리그램 / 밀리람베르트5 | 프로토콜 섹션 2 참조 |
| 피루브산 키나아제 | 10 밀리그램 / 밀리리터 | 로슈 (독일) |
| 나노 디스크 (DMPG) | 10 mM 트리스-Cl, pH 8.0, 100 mM NaCl에서 0.2-1.0 mM6 | 프로토콜 섹션 3 및 4 참조 |
| 1, PCR 주형은 유사한 농도에서 사용될 수 있었다. 2, "미니"키트 준비 DNA의 품질이 만족스럽지 않습니다. 도 3에 도시된 바와 같이, 시스테인은 불안정한 경향이 있으며, 별도로 첨가될 수 있다. 4, 용액이 과포화되면 분취량을 제거하기 전에 즉시 철저한 혼합이 필요합니다. 도 5에 도시된 바와 같이, 각각의 새로운 T7RNAP 배치에 대해, 최상의 최종 농도를 확인하기 위해 초기 스크린이 권장된다. 6, 나노 디스크의 용해도는 지질 조성에 의존 할 수있다. |
||
표 3 : CF 스톡 용액의 준비.
| 화합물 | ||
| 마스터믹스 (3.0 x) | C(최종) | V [μL] |
| 20 아미노산의 혼합물 | 1 밀리미터 | 2520.0 |
| 4 NTP (75 x)의 혼합물 | 1배 | 840.0 |
| 아세틸 포스페이트 | 20 밀리미터 | 1260.0 |
| 포스포(에놀) 피루브산 |
20 밀리미터 | 1260.0 |
| 폴린산 | 0.1 밀리그램 / 밀리람베르트 | 630.0 |
| 트리스-아세테이트, pH 8.0 | 100 밀리미터 | 2625.0 |
| C0엠플레테 50 x | 1배 | 1260.0 |
| Mg(OAc)2 | 19.8 (= 20)1 제곱미터 | 1260.0 |
| 코에이크 | 180 (= 270)2 밀리미터 | 1140.0 |
| 증권 시세 표시기 | 2 밀리미터 | 252.0 |
| H2O | 7953.0 | |
| 합계 | 21 000 | |
| RM의 경우 | C(최종) | V [μL] |
| 3x 마스터믹스 | 1 x | 1000.0 |
| RNase 억제제 | 0.3 U/μL | 22.5 |
| tRNA (대장균) | 0.5 밀리그램 / 밀리람베르트 | 37.5 |
| 나노디스크(DMPG)3 | 10 마이크로미터 | 75.0 |
| DNA 템플릿4 | 0.015 응헬스 / μL | 112.5 |
| 피루브산 키나아제 | 0.04 밀리그램 / 밀리람베르트 | 12.0 |
| T7RNAP5 | 0.03 밀리그램 / 밀리람베르트 | 15.0 |
| S30 용해물 | 0.35 % | 1050.0 |
| 모든 트랜스 망막6 | 0.6 밀리미터 | 9.0 |
| H2O | - | 666.5 |
| 합계 | 3000.0 | |
| FM의 경우 | C(최종) | V [μL] |
| 마스터 믹스 (3 x) | 1 x | 20 000 |
| H2O | - | 40 000 |
| 합계 | 60 000 | |
| 도 1에 나타낸 바와 같이, 0.2 mMMg2+ 는 S30 용해물로부터 기여된다. 2, 90 mM K + 는 아세틸 포스페이트와 포스 포 (에놀) 피루브산에서 기여합니다. 도 3을 참조하면, 계산된 원액은 400μM이다. 4, 계산 된 원액은 400 μg / mL입니다. 5, 계산 된 저장 용액은 6 mg / mL입니다. 도 6에 도시된 바와 같이, PR, 저장 용액에 대한 특정 보조인자는 DMSO에서 200 mM이다. |
||
표 4: 3mL의 RM 및 60mL의 FM을 사용한 CECF 반응을 위한 피펫팅 방식
| 화합물 | ||||||||
| 마스터믹스 (3.0 x) | C(최종) | V [μL] | ||||||
| 20 아미노산의 혼합물 | 1 밀리미터 | 864.0 | ||||||
| 4 NTP의 혼합물 | 1배 | 288.0 | ||||||
| 아세틸 포스페이트 | 20 밀리미터 | 432.0 | ||||||
| 포스포(에놀)피루브산 | 20 밀리미터 | 432.0 | ||||||
| 폴린산 | 0.1 밀리그램 / 밀리람베르트 | 216.0 | ||||||
| 트리스-아세테이트, pH 8.0 | 100 밀리미터 | 900.0 | ||||||
| c0mplete | 1배 | 432.0 | ||||||
| Mg(OAc)2 | 13,8 (= 14) mM1 | 298.0 | ||||||
| 코에이크 | 180 (= 270) mM2 | 389.0 | ||||||
| 증권 시세 표시기 | 2 밀리미터 | 86.4 | ||||||
| H2O | - | 2862.6 | ||||||
| 합계 [μL]1 | - | 7200.0 | ||||||
| Mg2+ 농도 | ||||||||
| 14 밀리미터 | 16 밀리미터 | 18 밀리미터 | 20 밀리미터 | 22 제곱미터 | 24 밀리미터 | |||
| RM의 경우 | C(최종) | V [μL] | V [μL] | V [μL] | V [μL] | V [μL] | V [μL] | |
| 3x 마스터믹스 | 1 x | 67.0 | 67.0 | 67.0 | 67.0 | 67.0 | 67.0 | |
| 0.1 M 마그네슘 (OAc) 2 | 14-24 밀리미터 | 0.0 | 4.0 | 8.0 | 12.0 | 16.0 | 20.0 | |
| RNase 억제제 | 0.3 U/μL | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | |
| tRNA (대장균) | 0.5 밀리그램 / 밀리람베르트 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | |
| DNA 템플릿3 | 0.015 응헬스 / μL | 7.5 | 7.5 | 7.5 | 7.5 | 7.5 | 7.5 | |
| 피루브산 키나아제 | 0.04 밀리그램 / 밀리람베르트 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | |
| T7RNAP4 | 0.03 밀리그램 / 밀리람베르트 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | |
| S30 용해물 | 35 % | 70.0 | 70.0 | 70.0 | 70.0 | 70.0 | 70.0 | |
| H2O | - | 49.7 | 45.7 | 41.7 | 37.7 | 33.7 | 29.7 | |
| 합계 [μL]5 | - | 200.0 | 200.0 | 200.0 | 200.0 | 200.0 | 200.0 | |
| Mg2+ 농도 | ||||||||
| 14 밀리미터 | 16 밀리미터 | 18 밀리미터 | 20 밀리미터 | 22 제곱미터 | 24 밀리미터 | |||
| RM의 경우 | C(최종) | V [μL] | V [μL] | V [μL] | V [μL] | V [μL] | V [μL] | |
| 3x 마스터믹스 | 1 x | 1133.0 | 1133.0 | 1133.0 | 1133.0 | 1133.0 | 1133.0 | |
| 0.1 M 마그네슘 (OAc) 2 | 14-24 밀리미터 | 0.0 | 68.0 | 136.0 | 204.0 | 272.0 | 340.0 | |
| H2O | - | 2267.0 | 2199.0 | 2131.0 | 2064.0 | 1995.0 | 1927.0 | |
| 합계 [μL]5 | - | 3400.0 | 3400.0 | 3400.0 | 3400.0 | 3400.0 | 3400.0 | |
| 도 1에 나타낸 바와 같이, 0.2 mMMg2+ 는 S30 용해물로부터 기여된다. 마스터믹스는 가장 낮은 스크리닝 농도로 조정됩니다. 2, 90 mM K + 는 아세트 인산염과 포스 포 (에놀) 피루브산으로부터 기여합니다. 3, 계산 된 원액은 400 μg / mL입니다. 4, 계산 된 저장 용액은 6 mg / mL입니다. 도 5를 참조하면, 반응은 중복으로 수행된다. |
||||||||
표 5: 100μL의 RM 및 1.7mL의 FM을 사용한 Mg2+ 농도 스크린에 대한 피펫팅 방식.
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Discussion
CF 발현을 최적화하기 위한 설정 및 전략과 기능성 MP를 나노디스크에 공동 번역하여 삽입하는 방법이 설명되어 있습니다. 필요한 장비는 바이오리액터, 프렌치 프레스 장치 또는 이와 유사한 장치, UV/VIS 및 형광 판독기, 2구획 구성 설정에 적합한 CF 반응 용기 및 온도 제어 인큐베이터로 구성됩니다. 추가 표준 장비로는 대장균 세포 수확을 위한 원심분리기와 S30 용해물 준비를 위해 최소 30,000 x g에 도달하는 탁상용 원심분리기가 있습니다. S80-S100 용해물을 준비해야하는 경우 초 원심 분리기가 필요합니다. 나열된 장비는 생화학 실험실에서 정기적으로 사용할 수 있으며 CF 발현을 시작하기 위해 더 큰 초기 투자가 필요하지 않습니다. 또한 CF 용해물 및 T7RNAP 제제를 위한 대장균 세포의 발효 및 취급은 일반적이고 강력한 기술입니다. 가장 비싼 화합물은 CF 용해물, T7RNA 및 나노 디스크입니다. 신뢰할 수 있고 효율적인 프로토콜로 제조할 수 있으며 분취량은 -80°C에서 수년간 안정적입니다. 프로토콜은 CF 용해물 및 T7RNAP 준비에 각각 3일이 필요하고 MSP의 발현 및 정제 및 나노디스크의 예비형성에 약 1주일이 소요됩니다. 표적 주형 DNA는 pET-21, pIVEX 또는 유사한 벡터 시스템을 사용하여 공급할 수 있습니다. CF 발현 시스템의 설정 및 최적화를 위해, 시프트 GFP(GFP+) 또는 슈퍼폴더GFP와 같은 GFP 변이체의 생산을 모니터(20,32)로 사용할 수 있다. MP 생산 조건의 경우, PR의 발현은 다양한 조건에서 접히고 530nm10,15,18에서의 흡광도에 의해 쉽게 모니터링 될 수 있기 때문에 좋은 모델 시스템 또는 양성 대조군입니다. 새로운 MP에 대한 효율적인 CF 발현 프로토콜을 확립하기 위해, 표적 판독 프레임의 코돈 최적화 및 C-말단 부착 GFP와의 융합을 사용하는 것이 권장된다25,26. 추가로 필요한 물질에는 모두 상업적으로 입수가능한 화학물질 및 효소가 포함된다. 이러한 구성 요소는 고품질로 얻어야 하며 3mL의 RM 및 60mL의 FM을 사용한 설명된 CF 반응에 대한 전체 비용 계산은 약 150-200€에 달합니다. 따라서 CF 발현 시스템의 주요 응용 분야는 많은 MPs 또는 독소와 같은 고전적인 세포 기반 발현 시스템에서 얻기 어려운 단백질의 생산입니다. CF 시스템은 또한 합성 생물학의 핵심 플랫폼이며 지속적으로 성장하는 응용 분야로 인해 분자 연구의 도구로서 점점 더 필수 불가결 해지고 있습니다. 무엇보다도 일상적인 응용 분야는 단백질 라벨링, 고처리량 공정 또는 합성 세포 설계입니다.
입증된 전략은 수용성이 높은 나노디스크의 원하는 지질 환경에 이미 삽입된 순수 MP의 무세제 생산을 가능하게 합니다. MP에 대한 CF 발현 프로토콜이 설정되고 최적화되면 생산이 매우 빠르며 분취 규모에서도 24시간 이내에 순수 샘플을 얻을 수 있습니다. MP / 나노 디스크 복합체는 스트렙타비딘 II 또는 MP에 부착 된 폴리 히스티딘 태그를 통해 CF 반응에서 직접 정제됩니다. 이 공정은 상이한 기술(33)의 어레이에 의해 동일한 MP 샘플의 병렬 기능 및 구조 분석을 허용한다. 따라서 전략의 신속성과 효율성은 세포 기반 발현 시스템 및 세포막에서 MP의 세제 추출에 이어 일상적인 체외 재구성 5,34를 사용하는 기존 접근 방식에 비해 경쟁력이 있습니다. CF 반응의 개방 접근성은 MP 폴딩 및 멤브레인 삽입 15,16,18, MP 복합 어셈블리15,18,24 또는 기능 조절 23에 대한 수많은 고유 한 기계 론적 연구를 더욱 용이하게합니다.
세포 기반 발현에 비해 CF 발현의 중요한 차이점은 합성된 단백질 제품에 대한 품질 관리 시스템이 없다는 것입니다. 기능적 접힘과 무관하게 번역된 모든 폴리펩티드는 최종 제품 샘플에서 끝날 것입니다. 또한, 나노 디스크 막으로의 삽입 과정은 인공적이고 트랜스 로콘 독립적이며 불완전한 통합을 초래하거나 다수의 MP 표적과 전혀 작동하지 않을 수 있습니다. 따라서 CF 반응에서 최종적으로 가용화된 생성물 분획은 완전히 삽입되었지만 부분적으로만 통합되거나 막 연결된 MP를 포함하는 매우 이질적일 수 있습니다. 결과적으로, MP / 나노 디스크 복합체의 정제 된 샘플 중 작은 부분 만이 기능적으로 접힐 수 있습니다. 멤브레인 구성을 수정하고 나노 디스크 및 DNA 템플릿의 농도를 조절하여 MP 대 나노 디스크 비율을 신중하게 미세 조정하는 것은 최적화에 적합한 도구입니다. 그럼에도 불구하고 크기 배제 프로파일링 및 표적 특이적 정량적 기능 분석과 같은 다운스트림 품질 관리 접근 방식은 CF 발현 프로토콜의 최적화에 항상 필요합니다. 따라서 이러한 분석의 가용성은 특히 수송기, 채널 또는 펌프와 같은 기능을 위해 리포좀 환경이 필요한 MP를 포함한 프로젝트에서 응용 분야를 제한할 수 있습니다. 또한 나노 디스크의 크기 제한으로 인해 대형 MP 어셈블리의 삽입이 제한 될 수 있습니다.
문서화된 실시예에서, GPCR Tβ1AR-GFP의 기능적으로 접힌 분획의 변동은수 퍼센트의 범위 내, 최대 대략 30%이다. 기능적 폴딩은 다수의 파라미터(14)의 신중한 조정을 필요로 하며, 유사한 개별적이고 지루한 최적화 프로세스가 다른 GPCR들에 대해서도 필요할 수 있다(22). 그러나 최종적으로 달성된 기능적으로 접힌 GPCR의 수율은 다른 생산 시스템과 경쟁하며 분석 규모의 Mini-CECF 반응기에서 단일 60μL 반응에서 리간드 결합 연구를 위한 > 1,000개의 방사성 분석을 설정할 수 있습니다. GPCR-GFP 융합 구축물의 리간드 결합 연구에는 정제 단계가 필요하지 않다는 점을 언급할 가치가 있습니다. 필요한 경우, 정제는 His-태그 또는 스트렙-태그 II와 같은 합성된 MP에 부착된 친화성 태그를 활용하여 달성할 수 있습니다. 그런 다음 RM을 원하는 완충액에 희석하고 그에 따라 사전 평형화된 해당 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로드합니다. NMR 분광법 또는 결정화에 의한 PR 및 기타 CF 합성 MP의 구조적 평가는 이미 CF 발현 시스템을 MP 연구의 핵심 플랫폼으로 확립하는 데 도움이 되었습니다. MP / 나노 디스크 복합체의 생산에 대한 설명 된 전략은 전자 현미경에 의한 미래의 구조 연구에서 특히 흥미로울 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
DFG(Deutsche Forschungsgemeinschaft) 보조금 BE1911/8-1, LOEWE 프로젝트 GLUE 및 협업 연구 센터인 Transport and Communication across Membranes(SFB807)에 재정 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840445P | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850345C | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850375C | |
| 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840475C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids (USA) | 850457C | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) | Avanti Polar Lipids (USA) | 840034C | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) | Carl Roth (Germany) | 4855 | |
| 2-Mercaptoethanol | Carl Roth (Germany) | 4227 | |
| 2-Propanol | Carl Roth (Germany) | 9781 | |
| [3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride | American Radiolabeled Chemicals (USA) | ART0134 | |
| Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) | Merck (Germany) | 1409 | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich (Germany) | A9251 | |
| Alprenolol hydrochloride | Merck (Germany) | A0360000 | |
| Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® | Sigma-Aldrich (Germany) | Q1126 | |
| Autoclave Type GE 446EC-1 | Gettinge (Germany) | ||
| Bioreactor Type 884 124/1 | B.Braun (Germany) | ||
| Centrifuge | Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany) | ||
| Cholic acid | Carl Roth (Germany) | 8137 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Carl Roth (Germany) | 3862 | |
| Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks | Schott Duran (Germany) | ||
| Cytidine 5'-triphosphate disodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | C1506 | |
| D-glucose monohydrate | Carl Roth (Germany) | 6780 | |
| Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate | Carl Roth (Germany) | 6878 | |
| Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing | Fisher Scientific (Germany) | 8700152 | |
| Dithiothreit | Carl Roth (Germany) | 6908 | |
| Ethanol | Carl Roth (Germany) | K928 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Sigma-Aldrich (Germany) | 47612 | |
| French pressure cell disruptor | SLM; Amico Instruments (USA) | ||
| Glycerol | Carl Roth (Germany) | 3783 | |
| Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) | Sigma-Aldrich (Germany) | G8877 | |
| Hydrochloric Acid | Carl Roth (Germany) | K025 | |
| IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL | GE Life Sciences (Germany) | GE17-5248 | |
| Imidazole | Carl Roth (Germany) | 3899 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth (Germany) | 2316 | |
| Kanamycin | Carl Roth (Germany) | T832 | |
| L-Alanine | Carl Roth (Germany) | 3076.1 | |
| L-Arginine | Carl Roth (Germany) | 6908 | |
| L-Asparagine | Carl Roth (Germany) | HN23 | |
| L-Aspartic Acid | Carl Roth (Germany) | T202 | |
| L-Cysteine | Carl Roth (Germany) | T203 | |
| L-Glutamic Acid | Carl Roth (Germany) | 3774 | |
| L-Glutamine | Carl Roth (Germany) | 3772 | |
| L-Glycine | Carl Roth (Germany) | 3187 | |
| L-Histidine | Carl Roth (Germany) | 3852 | |
| L-Isoleucine | Carl Roth (Germany) | 3922 | |
| L-Leucine | Carl Roth (Germany) | 1699 | |
| L-Lysine | Carl Roth (Germany) | 4207 | |
| L-Methionine | Carl Roth (Germany) | 9359 | |
| L-Proline | Carl Roth (Germany) | 1713 | |
| L-Phenylalanine | Carl Roth (Germany) | 1709 | |
| L-Serine | Carl Roth (Germany) | 4682 | |
| L-Threonine | Carl Roth (Germany) | 1738 | |
| L-Tryptophane | Carl Roth (Germany) | 7700 | |
| L-Tyrosine | Carl Roth (Germany) | T207 | |
| MD100 dialysis units | Scienova (Germany) | 40077 | |
| N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) | Carl Roth (Germany) | 6763 | |
| n-dodecylphosphocholine | Antrace (USA) | F308S | |
| PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell | Biorad (Germany) | ||
| PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems | Biorad (Germany) | ||
| PAGE gel power supply: Power Pac 3000 | Biorad (Germany) | ||
| Tryptone/peptone from caseine | Carl Roth (Germany) | 6681 | |
| Peristaltic pump: ip-12 | Ismatec (Germany) | ||
| Phosphoenol pyruvate monopotassium salt | Sigma Aldrich (Germany) | 860077 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth (Germany) | P018 | |
| Potassium acetate | Carl Roth (Germany) | 4986 | |
| Potassium chloride | Carl Roth (Germany) | 6781 | |
| Pyruvate Kinase | Roche (Germany) | 10109045001 | |
| Scintillation counter: Hidex 300 SL | Hidex (Finland) | ||
| SDS pellets | Carl Roth (Germany) | 8029 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich (Germany) | K305 | |
| Sodium chloride | Carl Roth (Germany) | P029 | |
| Spectrophotometer Nanodrop | Peqlab (Germany) | ||
| Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® | Tecan (Switzerland) | ||
| tRNA (E. coli) | Roche (Germany) | 10109550001 | |
| Ultra sonificator | Labsonic U, B. Braun (Germany) | ||
| Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) | Sigma-Aldrich (Germany) | U6625 | |
| Y-30 antifoam | Sigma-Aldrich (Germany) | A6457 | |
| Yeast extract | Carl Roth (Germany) | 2904 |
References
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