Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Co-translasjonell innsetting av membranproteiner i preformerte nanodiscs

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61844
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biophysical Chemistry, Goethe University Frankfurt

Summary

Co-translasjonell innsetting i pre-formede nanodiscs gjør det mulig å studere cellefrie syntetiserte membranproteiner i definerte lipidmiljøer uten kontakt med vaskemidler. Denne protokollen beskriver utarbeidelsen av viktige systemkomponenter og de kritiske parametrene for å forbedre uttrykkseffektiviteten og prøvekvaliteten.

Abstract

Cellefrie ekspresjonssystemer tillater skreddersydd design av reaksjonsmiljøer for å støtte funksjonell folding av selv komplekse proteiner som membranproteiner. De eksperimentelle prosedyrene for co-translasjonell innsetting og folding av membranproteiner i preformerte og definerte membraner levert som nanodiscs er demonstrert. Protokollen er helt vaskemiddelfri og kan generere milligram rensede prøver i løpet av en dag. De resulterende membranprotein- / nanodiscprøvene kan brukes til en rekke funksjonelle studier og strukturelle anvendelser som krystallisering, kjernemagnetisk resonans eller elektronmikroskopi. Fremstilling av grunnleggende nøkkelkomponenter som cellefrie lysater, nanoplater med designede membraner, kritiske lagerløsninger samt montering av to-roms cellefrie uttrykksreaksjoner er beskrevet. Siden foldekrav til membranproteiner kan være svært varierte, er et hovedfokus i denne protokollen modulering av parametere og reaksjonstrinn som er viktige for prøvekvalitet, for eksempel kritiske grunnleggende reaksjonsforbindelser, membransammensetning av nanoplater, redoks- og chaperonmiljø eller DNA-maldesign. Hele prosessen er demonstrert med syntese av proteorhodopsin og en G-proteinkoblet reseptor.

Introduction

Membranproteiner (MP) er utfordrende mål i proteinproduksjonsstudier på grunn av deres uoppløselighet i vandige miljøer. Konvensjonelle MP-produksjonsplattformer består av cellebaserte systemer som E. coli, gjær eller eukaryote celler. De syntetiserte rekombinante parlamentsmedlemmene blir enten ekstrahert fra cellemembraner eller foldet på nytt fra inkluderingsorganer1. Etter oppløselig oppløsning av vaskemiddel kan MP-er overføres til egnede membranmiljøer ved hjelp av etablerte in vitro-rekonstitueringsprotokoller. Foruten vesikler og liposomer har MP-rekonstituering i plane membraner i form av nanoskiver2 eller salipro3-partikler blitt rutinemessige teknikker i nyere tid. Imidlertid innebærer alle disse strategiene vaskemiddelkontakt med parlamentsmedlemmer som kan resultere i destabilisering, dissosiasjon av oligomerer og til og med tap av proteinstruktur og aktivitet4. Screening for optimale løsemiddel- og rekonstitueringsforhold kan derfor være kjedelig og tidkrevende5.

Den åpne naturen til cellefrie (CF) systemer gjør at ekspresjonsreaksjonen kan tilføres direkte med preformerte membraner med en definert lipidsammensetning. I denne lipidbaserte ekspresjonsmodusen (L-CF) har de syntetiserte parlamentsmedlemmene muligheten til å sette inn 6,7 (figur 1) i de medfølgendedobbeltlagene (figur 1). Nanodiscs bestående av et membranstillasprotein (MSP) som omgir en plan lipid dobbeltlagsskive8 ser ut til å være spesielt egnet for denne strategien 9,10. Nanodiscs kan rutinemessig settes sammen in vitro med en rekke forskjellige lipider, de er svært stabile, og lagrene kan konsentreres opp til 1 mM. Imidlertid er MSP-uttrykk i E. coli og dets rensing nødvendig. Som en alternativ strategi kan MSP uttrykkes sammen med mål-MP i CF-reaksjoner levert med liposomer11,12,13. DNA-maler for både MSP og MP legges inn i reaksjonen og MP/nanodiscs kan dannes ved uttrykk. Mens MSP-produksjon unngås, krever samuttrykksstrategien nøye finjustering av de endelige DNA-malkonsentrasjonene, og høyere variasjoner i effektiviteten av prøveproduksjonen kan forventes.

Den ko-translasjonelle innsettingen av MP-er i membraner av preformerte nanoskiver er en ikke-fysiologisk og fortsatt stort sett ukjent mekanisme uavhengig av translokonmaskiner og signalsekvenser13,14,15,16. Hoveddeterminanter for innsettingseffektiviteten er typen membranprotein samt lipidsammensetningen av den medfølgende membranen, med hyppig preferanse for negativt ladede lipider15,17. Siden nanodiscmembranene er relativt begrenset i størrelse, frigjøres en betydelig mengde lipider ved MP-innsetting18. Variasjon av nanodiscstørrelse muliggjør innsetting og justering av høyere oligomere MP-komplekser15,18. Blant annet ble riktig montering av homooligomere komplekser vist for ionkanalen KcsA, for ionpumpeproteorhodopsin (PR) og for multidrugtransportøren EmrE15,18. Parlamentsmedlemmer vil sannsynligvis komme inn i den symmetriske nanodiscmembranen fra begge sider med relativt lik frekvens. Det bør derfor tas i betraktning at forskjellige monomerer eller oligomerer satt inn i en nanoskive kan ha motsatte retninger. Imidlertid kan en skjevhet i orientering være forårsaket av kooperative innsettingsmekanismer som rapportert for dannelsen av PR-heksamerer og KcsA-tetramerer18. En ytterligere skjevhet i MP-orientering kan skyldes orienteringsbrytere av innsatte parlamentsmedlemmer sannsynligvis ved kanten av nanodiscmembranene.

Produksjonen av CF-lysater fra E. coli-stammer er en pålitelig rutineteknikk og kan utføres i nesten alle biokjemiske laboratorier19,20. Det bør vurderes at i tillegg til disulfidbroformasjon, er de fleste andre posttranslasjonelle modifikasjoner fraværende hvis en MP syntetiseres ved bruk av E. coli-lysater. Selv om dette kan generere mer homogene utvalg for strukturelle studier, kan det være nødvendig å utelukke potensielle effekter på funksjonen til individuelle MP-mål. Imidlertid indikerer effektiv produksjon av høykvalitetsprøver av G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) 14,21,22, eukaryote transportører 23 eller store heteromere samlinger 24 i E. coli CF-lysater deres egnethet for selv komplekse mål. Forberedende skalamengder (≈ 1 mg / ml) av en prøve kan oppnås med den to-roms kontinuerlige utvekslingscellefrie (CECF) konfigurasjonen, sammensatt av en reaksjonsblanding (RM) og en matblanding (FM) rom. FM-volumet overstiger RM-volumet 15 til 20 ganger og gir et reservoar av lavmolekylære energiforbindelser og forløpere19. Uttrykksreaksjonen forlenges dermed i flere timer, og det endelige utbyttet av MP-målet økes. RM- og FM-rommene er adskilt av en dialysemembran med en 10-14 kDa cutoff. De to rommene krever en spesiell utforming av CECF-reaksjonsbeholderen (figur 1). Kommersielle dialysekassetter som RM-beholdere i kombinasjon med skreddersydde plexiglassbeholdere som holder FM er egnede eksempler. MP-utbytter kan videre manipuleres ved å endre RM: FM-forholdene eller ved å bytte FM etter en viss inkubasjonsperiode.

Utbytte og kvalitet på en MP krever ofte intens optimalisering av reaksjonsparametere. En viktig fordel med CF-uttrykk er muligheten til å modifisere og finjustere nesten hvilken som helst forbindelse i henhold til de individuelle kravene til en MP. En enkel strategi er å fokusere først på å forbedre utbyttet av en MP ved å etablere en grunnleggende produksjonsprotokoll og deretter å optimalisere MP-kvaliteten ved å finjustere reaksjons- og foldeforhold. Fraværet av fysiologiske prosesser i CF-lysater og deres reduserte kompleksitet resulterer i høye suksessrater for effektiv produksjon av parlamentsmedlemmer25. Rutinemessige hensyn for DNA-maldesign og optimalisering av Mg 2+ ionkonsentrasjon er i de fleste tilfeller tilstrekkelig for å oppnå tilfredsstillende utbytte26. Avhengig av uttrykksmodus kan optimalisering av MP-kvalitet bli tidkrevende, ettersom et større utvalg av parametere må screenes14,17,22.

For å etablere den beskrevne CF-ekspresjonsplattformen er protokoller nødvendige for produksjon av E. coli CF-lysat (i), T7 RNA-polymerase (ii), nanodiscs (iii) og de grunnleggende CECF-reaksjonsforbindelsene (iv) (figur 1). E. coli K12-stammen A1927 eller BL21-derivater brukes ofte til fremstilling av effektive S30 (sentrifugering ved 30 000 x g) lysater. Foruten S30-lysater kan tilsvarende lysater sentrifugert ved andre g-krefter (f.eks. S12) benyttes. Lysatene varierer i ekspresjonseffektivitet og i proteomkompleksitet. Proteomet til S30-lysatet utarbeidet ved den beskrevne protokollen er studert i detalj28. Proteomet S30 inneholder fortsatt noen gjenværende ytre membranproteiner som kan gi bakgrunnsproblemer ved ekspresjon og analyse av ionekanaler. For slike mål anbefales bruk av S80-S100 lysater. En verdifull modifikasjon under lysatpreparasjon er induksjonen av SOS-responsen ved kombinert varmesjokk og etanolforsyning ved midten av cellens vekstfase. De resulterende HS30-lysatene er beriket i chaperones og kan brukes i blandinger med S30-lysater for forbedret MP-folding22. CF-ekspresjon i E. coli-lysater drives som en koblet transkripsjons-/oversettelsesprosess med DNA-maler som inneholder promotorer kontrollert av T7 RNA-polymerase (T7RNAP). Enzymet kan produseres effektivt i BL21 (DE3) Stjerneceller som bærer pAR1219 plasmid29.

To kopier av MSP1E3D1 monteres i en nanodisc med en diameter på 10-12 nm, men protokollen beskrevet nedenfor kan også fungere for andre MSP-derivater. Imidlertid har nanodiscs større enn de som er dannet med MSP1E3D1 en tendens til å være mindre stabile, mens mindre nanodiscs dannet med MSP-derivater som MSP1 kanskje ikke rommer større parlamentsmedlemmer eller MP-komplekser. MSP1E3D1 nanodiscs kan monteres in vitro med et stort utvalg av forskjellige lipider eller lipidblandinger. Preformerte nanoplater er vanligvis stabile i > 1 år ved -80 °C, mens stabiliteten kan variere for ulike lipidkomponenter. For screening av lipideffekter på folding og stabilitet av en MP, er det nødvendig å utarbeide et omfattende sett med nanodiscs satt sammen med et representativt utvalg av lipider / lipidblandinger. Følgende lipider kan gi et godt startvalg: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glyserol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-rac-(1-glyserol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glyserol) (POPG) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin (POPC).

En protokoll for fremstilling av en 3 ml CECF-reaksjon er beskrevet. Videre opp- eller nedskalering i forholdet 1:1 er mulig. For den to-roms CECF-konfigurasjonen må en RM som inneholder alle forbindelser og en FM som bare inneholder forbindelsene med lav molekylvekt fremstilles. Kommersielle 3 ml dialyseenheter med 10-14 kDa MWCO kan brukes som RM-beholdere, som deretter plasseres i skreddersydde pleksiglassbeholdere som holder FM (figur 1D) 30. Forholdet mellom RM: FM er 1:20, så 60 ml FM må være forberedt på 3 ml RM. Kvalitet, konsentrasjon eller type av flere komponenter kan være kritisk for det endelige utbyttet og / eller kvaliteten på den syntetiserte MP (tabell 1). DNA-maler bør utarbeides i henhold til publiserte retningslinjer, og kodonoptimalisering av leserammen til målet kan ytterligere forbedre produktutbyttet26. For forberedende skala CECF-reaksjon beskrives en etablert protokoll for produksjon av PR. For å etablere uttrykksprotokoller for nye parlamentsmedlemmer, er det vanligvis nødvendig å utføre optimaliseringsskjermbilder av visse forbindelser (tabell 1) for å forbedre utbyttet og kvaliteten. For Mg2+ -ioner finnes det et godt fokusert konsentrasjonsoptimum som ofte viser betydelig variasjon for ulike DNA-maler. Andre CF-reaksjonsforbindelser som nye batcher av T7RNAP eller S30 lysater kan ytterligere forskyve den optimale Mg2+ konsentrasjonen. Som et eksempel beskrives en typisk Mg 2+ skjerm innenfor området 14-24 mM konsentrasjon og i trinn på 2 mM. Hver konsentrasjon screenes i duplikater og i analytisk skala CECF-reaksjoner. Som CECF-reaksjonsbeholder brukes skreddersydde Mini-CECF pleksiglassbeholdere30 som holder RM i kombinasjon med standard 24-brønns mikroplater som holder FM (figur 1B). Alternativt kan kommersielle dialysepatroner i kombinasjon med 96-dype brønnmikroplater eller andre kommersielle dialysatorenheter i passende oppsett brukes (figur 1C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tilberedning av S30 lysat

  1. Dag 1: Strek ut celler fra glyserollagre på en LB-agarplate og inkuber ved 37 ° C over natten.
  2. Dag 2: Inokuler 200 ml LB-medium med cellene fra agarplaten og inkuber ved 37 ° C i 12-14 timer.
  3. Dag 3: Inokulere 10 L sterilt YPTG-medium (10 g / L gjærekstrakt, 16 g / L trypton, 5 g / L NaCl, 19,8 g / L glukose, 4,4 mM KH 2 PO 4, 8 mM K2HPO4) herdet til 37 ° C i en 15 L omrørt tankreaktor med 100 ml av prekulturen (1:100). Dyrk ved 37 ° C, 500 o / min og høy lufting (~ 3 luftvolumer per minutt). For å forhindre overdreven skumdannelse, tilsett sterilt antiskum.
  4. Mål optisk tetthet (OD) ved 600 nm i vanlige tidsintervaller. Etter ca. 2 timer vil kulturen gå inn i log-fasen.
  5. Modifikasjon for HS30 lysat: Når cellene er i midten av loggfasen (OD600 ≈ 3,6-4,2), tilsett 300 ml etanol til kulturmediet og fortsett dyrking ved 42 ° C, 500 o / min og høy lufting (ca. 3 luftvolumer per minutt) i ytterligere 45 minutter. Fortsett deretter med kjøling og høsting av cellekulturen som beskrevet i trinn 1.6. For produksjon av standard S30 lysat, hopp over dette trinnet og fortsett med trinn 1.6.
  6. Når cellene er i midten av loggfasen (OD600 ≈ 3,6-4,2), avkjøl gjæreren under 20 °C innen < 30 minutter. Den endelige OD600 skal være rundt 4,5-5,5. Høst celler ved 4 500 x g i 20 minutter ved 4 °C og kast supernatanten. Hold cellene på 4 °C gjennom de følgende trinnene.
    MERK: Under kjøling kan overdreven skumdannelse forekomme. I dette tilfellet må du enten tilsette antiskum eller redusere omrøringshastigheten og/eller redusere luftstrømmen i bioreaktoren.
  7. Suspender celler helt i 300 ml S30-A buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg (OAc) 2, 60 mM KCl, 6 mM 2-merkaptoetanol) ved hjelp av en slikkepott etterfulgt av pipettering av suspensjonen opp og ned til homogenitet. Sentrifuge ved 8 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Gjenta dette trinnet to ganger.
    FORSIKTIG: 2-merkaptoetanol er giftig. Unngå kontakt med hud eller luftveier. Hvis mulig, arbeid under en hette. Vei det tomme sentrifugebegeret før siste vasketrinn. Etter sentrifugering, vei våtcellepelleten og fortsett med trinn 1.8 eller oppbevar pelleten til videre bruk.
    MERK: Vekten av våtcellepelletsen er 5-7 g per 1 L bioreaktorkultur. På dette tidspunktet kan protokollen settes på pause og pelleten kan fryses ned i flytende nitrogen og lagres ved -80 °C i 4-8 uker.
  8. Suspender celler grundig i 1,1 volumer (1 g = 1 ml) S30-B buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg (OAc)2, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 tablett cOmplete proteasehemmer). Fyll suspensjonen i en forkjølt trykkcelle og forstyrre celler ved 1000 psig. Pass celler gjennom den franske pressen en gang.
  9. Sentrifuge lysatet ved 30 000 x g i 30 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et nytt rør og gjenta sentrifugeringstrinnet.
    MERK: Et løst og slimete lag kan være tilstede på toppen av pelleten etter den første sentrifugeringen, som ikke skal overføres med supernatanten.
  10. Påfør et høyt salt- og varmetrinn for å fjerne ustabile lysatkomponenter og for å frigjøre mRNA fra ribosomer. Juster lysatet til 0,4 M NaCl og inkuber ved 42 °C i 45 minutter i et vannbad.
    MERK: Dette trinnet vil forårsake betydelig bunnfalldannelse. Vend eller inverter røret under inkubasjon fra tid til annen.
  11. Overfør den uklare suspensjonen (vanligvis 50-80 ml) til dialyserør med en 10-14 kDa cutoff og dialyse mot 5 L S30-C buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg (OAc) 2, 60 mM KOAc, 0,5 mM DTT). Bytt S30-C dialysebufferen etter 2-3 timer og dialyse i ytterligere 12-14 timer.
  12. Dag 4: Overfør den dialyserte suspensjonen til sentrifugerrør og sentrifuger ved 30 000 x g i 30 minutter ved 4 °C. Overfør supernatant (S30 lysat) til friske 50 ml rør og bland forsiktig. Proteinkonsentrasjonen av lysat bør være ca. 30-40 mg / ml. Sjokkfrysing (f.eks. 0,5 ml, 1 ml) i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 °C. Aliquots er stabile i > 1 år.

2. Ekspresjon og rensing av T7 RNA-polymerase

  1. Dag 1: Inokulere 200 ml LB medium som inneholder 100 μg / ml ampicillin med nybelagt BL21 (DE3) Star x pAR1219 celler og inkubere ved 37 ° C og 180 rpm i 12-16 timer.
  2. Dag 2: Inokulere 1 L veldig bra buljong (12 g / L trypton, 24 g / L gjærekstrakt, 4 ml / L glyserol) i en 2 L forvirret kolbe med 10 ml prekultur og inkubere ved 37 ° C og 180 rpm agitasjon. Start-OD600 bør være rundt 0,1.
  3. Når OD600 når 0,6-0,9, tilsett IPTG til en endelig konsentrasjon på 1 mM for å indusere T7RNAP-uttrykk og fortsett dyrking i ytterligere 5 timer.
  4. Høst celler ved sentrifugering ved 4 500 x g i 20 minutter ved 4 °C. Frys cellene ned i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her.
  5. Dag 3: Tilsett 30 ml iskald suspensjonsbuffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0 med en tablett cOmplete proteasehemmer) til den frosne cellepelleten og tine pelleten i et vannbad ved romtemperatur. Stopp deretter pelleten ved pipettering opp og ned til homogenitet.
  6. Utfør celleforstyrrelser ved hjelp av en fransk presse som beskrevet i forrige avsnitt, eller bruk en sonikeringsenhet i henhold til produsentens anbefalinger. Deretter sentrifuger du ved 20 000 x g i 30 minutter ved 4 °C og overfører supernatant til et nytt rør.
  7. For å utfelle genomisk DNA, tilsett streptomycinsulfat sakte og under mild omrøring til supernatanten til en endelig konsentrasjon på 3% (w / v) er nådd. Inkuber ved 4 °C i 5-10 minutter under forsiktig omrøring. Sentrifuge ved 20 000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
  8. Filtrer supernatanten med et 0,45 μm filter og legg den på en Q-Sepharose-kolonne med et kolonnevolum (CV) på 40 ml likevektet med 2 CV-likevektsbuffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% glyserol og 10 mM 2-merkaptoetanol) ved hjelp av en peristaltisk pumpe med en strømningshastighet på 4 ml / min. Koble deretter kolonnen til en UV-detektor og fortsett eluering med likevektsbuffer til UV-signalet ved 280 nm når en stabil grunnlinje.
  9. Elute T7RNAP med en gradient fra 50 mM til 500 mM NaCl per CV ved en strømningshastighet på 3 ml / min. Samle 1 ml fraksjoner og klargjør prøver for SDS-PAGE analyse ved å blande 10 μL av hver fraksjon med 2 x SDS prøvebuffer. Kjør SDS-PAGE og flekker gelen med Coomassie Blue R. T7RNAP skal vises som et fremtredende bånd på omtrent 90 kDa sammen med mange ekstra bånd av urenheter.
  10. Bassengfraksjoner som inneholder T7RNAP og dialyse ved bruk av membraner med en 12-14 kDa MWCO for 12-16 timer i dialysebuffer (10 mM K 2 HPO 4 /KH2PO4, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% (w / v) glyserol).
  11. Dag 4: Samle T7RNAP-løsning og konsentrat ved hjelp av filterenheter med 12-14 MWCO til en endelig konsentrasjon på 3-10 mg / ml. T7RNAP kan begynne å utfelle under konsentrasjonen. Stopp konsentrasjonen umiddelbart så snart turbiditet i prøven oppstår. Tilsett glyserol til en endelig konsentrasjon på 50% (w / v) og bland forsiktig. Støtfrys 0,5-1 ml aliquots og oppbevares ved -80 °C. Arbeidende T7RNAP aliquots kan lagres ved -20 °C.
    MERK: Omtrent 20-40 ml 5 mg / ml delvis renset T7RNAP med 20.000-40.000 enheter skal oppnås fra en 1 L gjæring. For å teste den optimale mengden av hver T7RNAP-batch, bør CF-ekspresjonsreaksjoner av grønt fluorescerende protein (GFP) som inneholder 0,02 mg / ml / ml-0,1 mg / ml av den forberedte T7RNAP-prøven utføres.

3. Uttrykk og rensing av MSP1E3D1

  1. Dag 1: Transformer E. coli BL21 (DE3) stjerneceller med pET28(a)-MSP1E3D1 vektor31 ved hjelp av standard varmesjokktransformasjon eller elektroporeringsprotokoller. Strek ut eller platetransformerte celler på LB-agar som inneholder 30 μg / ml kanamycin og inkuber ved 37 ° C i 12-16 timer.
  2. Dag 2: Inokulere 200 ml LB medium supplert med 0,5% (w / v) glukose og 30 μg / ml kanamycin med en enkelt koloni plukket fra agarplaten og inkubere ved 37 ° C ved 180 o / min i 12-16 timer.
  3. Dag 3: Inokulere 10 L LB medium supplert med 0,5% (w / v) glukose og 30 μg / ml kanamycin med 100 ml av prekulturen i en omrørt tank bioreaktor. Utfør gjæring ved 37 °C, 500 o / min og lufting av ca. 3 bioreaktorvolumer per minutt. Ved overdreven skumdannelse, tilsett antiskum.
    MERK: Forvirrende risteflasker kan brukes i stedet for en gjærer.
  4. Ved OD600 på 6,5-7,5, tilsett IPTG til en endelig konsentrasjon på 1 mM og fortsett inkubasjonen ved 37 °C i 1 time. Høst celler ved sentrifugering ved 4 500 x g i 20 minutter ved 4 °C. Vask cellepellets med 200 ml 0,9 % (w/v) NaCl og sentrifuger igjen ved 8 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kast supernatant og overfør celler til 50 ml rør ved hjelp av en slikkepott. Forventet våtpelletsvekt er 8-12 g per liter bioreaktorkultur. Sjokkfrys cellepellets i flytende nitrogen og lagres ved -80 °C til videre bruk.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her.
  5. Dag 4: For rensing, tine cellepellets i et vannbad ved RT. Suspendere cellene i MSP-A buffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w / v) Triton X-100, 1 tablett c0mplete proteaseinhibitor cocktail per 50 ml celle suspensjon) for å gi en 30-40% (w / v) celle suspensjon.
  6. Forstyrr celler ved sonikering eller bruk av fransk presse og sentrifuge ved 30.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C. Overfør supernatanten til et friskt rør og filtrer gjennom et 0,45 μm filter. Påfør filtratet på en Ni2+ lastet nitrilotrieddiksyrekolonne (CV > 15 ml) likevektet med 5 CV MSP-B-buffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 % (w/v) Triton X-100) ved hjelp av en peristaltisk pumpe.
    MERK: For å lette filtrering kan supernatanten sonikeres i et minutt for å bryte ned store DNA-fragmenter.
  7. Etter prøvebelastning, vask kolonnen med 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl, 50 mM kolinsyre), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl) og 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol).
    MERK: Kolinsyre i MSP-C-bufferen er viktig for å fjerne lipider festet til MSP. Kolinsyre er ikke fullstendig løselig ved lave pH-verdier. pH-verdien må derfor justeres til 8,9 i MSP-C og MSP-D. Det er viktig å vaske kolonnen med MSP-D-buffer, da en lavere pH kan føre til at gjenværende kolinsyre utfelles og blokkerer eller skader kolonnen.
  8. Eluter MSP med MSP-G (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol). Samle fraksjoner på 1 ml og overvåk UV-absorpsjon ved 280 nm. Samle og samle brøkdelene av elueringstoppen.
  9. Overfør samlede MSP-fraksjoner til 12-14 kDa MWCO dialysemembranrør og dialyse mot 5 L MSP-H (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% (w / v) glyserol) i 2-3 timer ved 4 ° C. Bytt til fersk 5 L MSP-H buffer og dialyse for ytterligere 12-16 timer ved 4 ° C.
  10. Dag 5: Overfør MSP-oppløsning til sentrifugerør og sentrifuge ved 18 000 x g i 30 minutter ved 4 °C for å fjerne bunnfall. Overfør supernatant til et nytt rør og konsentrer deg til 200-800 μM ved hjelp av ultrafiltreringsanordninger med 12-14 kDa MWCO ved 4 °C. Mål konsentrasjonen ved hjelp av et UV/VIS-måleapparat. Bruk utryddelseskoeffisient på 27, 31 M-1 cm-1 og molekylmassen på 31, 96 kDa for beregning av konsentrasjon.
    MERK: Ekspresjon i en bioreaktor gir vanligvis 15-30 mg MSP1E3D1 per L-kultur.
  11. Støtfrys aliquots av den konsentrerte MSP-løsningen i flytende nitrogen og lagre ved -80 °C.

4. Montering av MSP1E3D1 nanodiscs

  1. Dag1: Forbered 1-2 ml 50 mM lipidlagre (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC eller POPC) i 100 mM natriumkolat. Oppbevares ved -20 °C hvis det ikke brukes samme dag.
    MERK: Lipidoppløsningen må være klar. Hvis oppløsningen ikke er klar, kan natriumkolatkonsentrasjonen økes til 150 mM.
  2. Bland MSP1E3D1-løsningen med lipidoppløsningen. Tilsett dodecylfosfokolin (DPC) i en endelig konsentrasjon på 0,1 % (w/v). Monteringsreaksjoner kan justeres til sluttvolumer på 3 ml (tabell 2) eller 12 ml tilsvarende typiske volumer av dialysekassetter (10 kDa MWCO). Inkuber monteringsreaksjoner i 1 time ved 21 °C under forsiktig omrøring.
    MERK: For hvert lipid må et spesifikt MSP1E3D1: lipidforhold brukes for å sikre homogent nanodiscpreparat (tabell 2). For nye lipider eller lipidblandinger bør det optimale forholdet bestemmes med et piloteksperiment og størrelseseksklusjonskromatografianalyse14.
  3. Forvåt membranen til en dialysekassett med skivedannelsesbuffer (DF) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl). Overfør monteringsblandingen til dialysekassetten med en sprøyte. Potensielle luftbobler kan fjernes ved aspirasjon ved hjelp av sprøyten.
  4. Dag 1-4: Dialyse mot 3 x 5 L DF-buffer i 10-20 timer ved RT under omrøring ved hjelp av en omrøringsstang. Overfør deretter monteringsblandingen fra dialysekassetten til sentrifugalfilterenheter med 10 kDa MWCO likevektet med DF-buffer. Konsentrat ved 4000 x g ved 4 °C.
    MERK: En uklar dialyseblanding kan indikere et feil støkiometrisk forhold mellom MSP: lipid. Utfelling må fjernes ved 18 000 x g i 20 minutter ved 4 °C før prøvekonsentrasjon. For å unngå utfelling under prøvekonsentrasjon, bruk ultrafiltreringsenheter med en stor deadstop.
  5. Konsentrer de monterte nanoskivene til en konsentrasjon på minst 300 μM. Mål konsentrasjonen ved hjelp av en UV/VIS-leser. Tenk på at en nanodisc dannes av to MSP1E3D1-molekyler, og dermed må konsentrasjonen av MSP deles med 2 for å bestemme riktig mengde nanodiscs.
    MERK: Det beskrevne oppsettet (tabell 2) vil gi 0,6-1 ml av en 300 μM nanodisc-løsning.
  6. Sentrifuge det konsentrerte nanodiscpreparatet ved 18 000 x g i 20 minutter ved 4 °C for å fjerne bunnfall. Deretter aspirerer du supernatanten og sjokkfryser 50 μL aliquots i flytende nitrogen og lagrer ved -80 °C.
    MERK: Det anbefales å evaluere suksessen til nanodiscdannelse ved bruk av størrelseseksklusjonskromatografi. Prøven skal være monodispers og skal bare inneholde en lav mengde aggregater. Aggregater indikerer at mengden lipid i oppsettet er for høy. Som referanse kan renset MSP1E3D1 brukes. Hvis nanodiscpreparatet viser en topp på høyden av referanse-MSP1E3D1-toppen, var det valgte lipid til MSP1E3D1-forholdet for lavt.

5. Forberedende skala 3 ml CECF reaksjonsoppsett

  1. Dag 1: Forbered alle nødvendige lagerløsninger som listet opp (tabell 3). Lagrene lagres ved -20 °C og tines ved romtemperatur. Sørg for å blande alle lagrene grundig etter tining og før pipettering. Beregn de nødvendige volumene for alle lagre og lag et pipetteringsskjema (tabell 4). Høymolekylære forbindelser vil bare bli tilsatt i RM. For lavmolekylære forbindelser kan en kombinert 3 x mastermix for RM og FM fremstilles.
    MERK: Endelige volumer av sammensatte blandinger kan være mindre enn beregnet på grunn av volumtap under blanding. Dette kan unngås ved å legge til et overskytende volum på 2-5% for å kompensere for volumtap.
  2. Balansere membranen til en 3 ml dialysekassett i 100 mM Tris-acetat, pH 8,0. Sørg for å fjerne overflødig buffer.
  3. Bruk en sprøyte for å overføre RM til dialysekassetten. Fjern overflødig luft i RM-rommet ved aspirasjon med sprøyten. Plasser dialysekassetten i dialysekammeret.
  4. Fyll opp dialysekammeret med 60 ml FM. Plasser lokket på kammeret og stram skruene for å fikse det. Inkuber kammeret i 12-16 timer ved 30 ° C ved 200 o / min.
    MERK: Forsikre deg om at kammeret forblir i oppreist stilling under omrøring, ellers vil utveksling av lavmolekylære forbindelser bli hindret.
  5. Dag 2: Bruk en sprøyte til å aspirere RM fra dialysekammeret. Overfør RM til friske rør og sentrifuger ved 16 000 x g ved 4 °C i 10 minutter for å fjerne bunnfall. Overfør supernatanten til friske rør. Proteinet i supernatanten kan nå analyseres videre.
    MERK: I noen tilfeller vil en pellet være til stede etter sentrifugering. Dette kan gi viktig informasjon om egnetheten til de analyserte nanodiscene eller reaksjonsforbindelsene for å holde den syntetiserte MP løselig. Det anbefales derfor å analysere mengden mål som potensielt er tilstede i bunnfallet ved å bruke SDS-PAGE, Western Blot, eller ved visuell evaluering av pelletsstørrelsen.

6. Analytisk skala 60 μL CECF reaksjonsoppsett for Mg2+ ion screening

  1. Dag 1: Bland alle komponentene i den respektive 3x masterblandingen og fordel 60 μL til RM og 825 μL til FM. Fyll opp FM med H2O og bland FM ved vortexing. Overfør FM til 3 brønner av mikroplaten på 24 brønner (tabell 5).
    MERK: Siden den tilpassede Mini-CECF-beholderen kanskje ikke er tilgjengelig, beregnes volumene i tabell 5 for en reaksjon utført i dialysepatroner (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) med et FM-volum på 1,7 ml i 96 dypbrønnsplater (2 ml) (figur 1).
  2. Skjær regenererte cellulosedialyserør med en 10-14 kDa MWCO i ca. 25 x 20 mm store stykker og oppbevar i H2O med 0,05% (w / v) natriumazid.
    FORSIKTIG: Natriumazid er svært giftig. Unngå kontakt med hud eller slimhinner. Ikke bruk metallbeholdere som natriumazid kan reagere med metaller for å danne eksplosive metall azider.
  3. Før Mini-CECF beholdermontering, fjern overdreven H2O fra dialysemembranene med et vev. Plasser ett membranstykke på hver beholder og fest membranene med en polytetrafluoretylenring.
  4. Overfør Mini-CECF-beholderen til brønnene på en 24-brønnplate med 825 μL FM. Unngå luftbobler under dialysemembranen til Mini-CECF-beholderen.
  5. Tilsett høymolekylære komponenter til RM som beskrevet (tabell 5) og bland ved pipettering opp og ned. Tilsett 60 μL i reaksjonsbeholderen. Unngå luftbobler under overføring av den viskøse løsningen.
  6. Klipp 2 8 x 10 cm ark av en forseglende termoplastfilm og pakk dem rundt 24-brønnsplaten med reaksjonsbeholderne inni. Dette vil redusere fordampning fra reaksjonsblandingen. Legg nå lokket på cellekulturplaten på platen og fest det med tape. Inkuber platen ved 30 °C og 200 o / min agitasjon i 12-16 timer.
  7. Dag 2: Høst reaksjonsblandingen ved å stikke gjennom dialysemembranen med pipetspissen i Mini-CECF-beholderen og aspirer RM. Overfør RM til friske rør og sentrifuger ved 16 000 x g ved 4 °C i 10 minutter for å fjerne bunnfall. Overfør supernatanten til friske rør. Proteinet i supernatanten kan nå analyseres videre.
    MERK: I noen tilfeller, etter sentrifugering vil en pellet være til stede. Dette kan gi viktig informasjon om egnetheten til de analyserte nanodiscene eller andre reaksjonsforbindelser for å holde den syntetiserte MP løselig. Det anbefales derfor å analysere mengden mål som potensielt er tilstede i bunnfallet ved SDS-PAGE, Western Blot eller visuell evaluering av pelletsstørrelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Virkningen av finjustering av reaksjonsforbindelser på det endelige utbyttet eller kvaliteten på syntetiserte parlamentsmedlemmer er eksemplifisert. En hyppig rutinemessig tilnærming er å justere den optimale Mg2+-konsentrasjonen i CF-reaksjoner ved å uttrykke grønt fluorescerende protein (GFP) som en praktisk overvåking av systemets effektivitet. Som et eksempel ble GFP syntetisert fra en pET-21a (+) vektor ved Mg 2+ konsentrasjoner mellom 14 og 24 mM (figur 2). SDS-PAGE-analyse identifiserte den optimale Mg 2+-konsentrasjonen ved 20 mM (figur 2A), som er i god samsvar med komplementære fluorescensmålinger (eksitasjon ved 485 nm, utslippsmåling ved 535 nm) av CF-reaksjonssupernatanten (figur 2B). For CF-ekspresjonen av bakteriell PR uttrykt fra pIVEX 2.3-vektoren og kalkunen β 1 adrenerge reseptoren (Tβ1 AR) uttrykt frapET-21a(+)-vektoren, ble den optimale Mg 2+-konsentrasjonen identifisert ved 20-22 mM.

Som et ytterligere eksempel vises kvalitetsforbedring av syntetiserte parlamentsmedlemmer med den beskrevne strategien. Tunable parametere for co-translasjonell innsetting av MP-er i preformerte nanoplater er (i) lipidsammensetningen av nanodiscmembranen og (ii) den endelige nanodisckonsentrasjonen i reaksjonen. Det er velkjent at det hydrofobe miljøet er en viktig parameter for riktig folding, oligomer montering og stabilitet av parlamentsmedlemmer. Siden lipidsammensetningen i nanoplater kan moduleres, muliggjør den beskrevne tilnærmingen en enkel systematisk screening av lipideffekter på struktur og funksjon av en MP. I innledende eksperimenter anbefales det å skjerme lipider med fosfatidylkolin (PC) og fosfatidylglycerol (PG) hodegrupper og å teste forskjellige kjedelengder og metninger. Virkningen av membransammensetning og nanodisckonsentrasjon på oppløsningseffektiviteten og kvaliteten på to forskjellige parlamentsmedlemmer er vist. PR er en lysaktivert protonpumpe og en meget stabil og svært syntetisert MP som når endelige konsentrasjoner på > 100 μM i RM. Det anbefales derfor å bruke det som en positiv kontroll for å sikre riktig reaksjonsoppsett, da PR-konsentrasjon enkelt kan vurderes ved måling av absorpsjon ved 530 nm i RM-supernatanten. I motsetning til dette er Tβ1AR et eksempel på den store familien av eukaryote G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) og er et komplekst og ustabilt MP. For praktisk overvåking ble en Tβ1AR-GFP-fusjonskonstruksjon syntetisert og den totale konsentrasjonen av nanodisc-oppløselig reseptor i CF-reaksjonene ble bestemt via GFP-fluorescens (figur 3A). Fraksjonen av funksjonelt foldet og ligandbindende aktiv reseptor ble videre bestemt ved hjelp av en filterbindingsanalyse og den merkede liganden [3H] -dihydroalprenolol (figur 3B). Filterbindingsanalysen ble utført som beskrevet tidligere14. Kort fortalt ble Tβ1AR-GFP-konsentrasjonen i RM bestemt via fluorescensen. GPCR ble inkubert med den radiomerkede liganden i 1 time ved 20 °C, påført et filter og ubundet ligand ble vasket av. For bestemmelse av uspesifikk [3H]-dihydroalprenololbinding ble reseptoren mettet med umerket alprenolol i en kontrollreaksjon. Tellingene av den radioaktive liganden i filtrene ble målt i en scintillasjonsteller og mengden bundet ligand ble bestemt via dens spesifikke etikettaktivitet. Prosent GPCR-bindingsaktivitet ble deretter beregnet ut fra mengden bundet ligand, Tβ1AR-GFP-konsentrasjonen og analysevolumet. Den samlede syntesen og nanodisc-oppløseliggjøringen av Tβ1AR-GFP er lik med alle analyserte membransammensetninger og innenfor området 8-13 μM (figur 3A). I motsetning til dette er en mye høyere variasjon detekterbar i kvaliteten på den syntetiserte GPCR. Laveste aktivitet med mindre enn 10% aktiv fraksjon oppnås med lipidene DMPC og POPC. Med DOPG og POPG kunne den aktive fraksjonen av Tβ1AR-GFP økes til ca. 30 % (figur 3B). Resultatene indikerer at ladning av lipidhodegruppen samt fleksibilitet i fettsyrekjeden er viktige modulatorer for folding og aktivitet av denne GPCR.

Foruten nanodisc-sammensetning, kan deres endelige konsentrasjon i CF-reaksjonen være en viktig faktor for MP-kvalitet. Når en egnet membransammensetning av en nanodisc er identifisert, bør konsentrasjonen under MP-syntese screenes. Det er åpenbart at nanodisckonsentrasjonen må justeres i henhold til uttrykkseffektiviteten til en MP. CF-syntese av Tβ1AR-GFP-reseptor og PR resulterer i endelige konsentrasjoner på henholdsvis ca. 10 μM og 100 μM i RM. Hvis nanodisckonsentrasjonen screenes innenfor et område på 3,75-60 μM, oppnås en fullstendig oppløsning av GPCR ved ca. 30 μM nanodiscs, noe som gir et forhold på Tβ 1 AR: nanodisc på1: 3 (figur 4A). I motsetning til dette er fullstendig oppløsning av PR allerede oppnådd med ca. 10 μM nanodiscs og gir et PR: nanodisc-forhold på 10: 1 (figur 4B). Et overskudd av nanodiscs er derfor nødvendig for å oppnå nesten fullstendig oppløsning av Tβ1AR-GFP, mens et invertert forhold i tilfelle PR indikerer innsetting av flere PR-kopier i en nanodisc. Senere studier av rensede PR / nanodisc-komplekser med innfødt massespektrometri bekreftet denne observasjonen og fant en prevalens av høyere oligomere former for PR hvis de syntetiseres ved lavere nanodisckonsentrasjoner15,18. Titrering av CF-syntetiserte MP-er med nanoplater kan derfor brukes som et verktøy for å utløse oligomere sammenstillinger og for å studere deres effekter på MP-funksjonen.

Figure 1
Figur 1: CECF-ekspresjonsstrategi for innsetting av membranproteiner i nanodiscs. (A) Grunnleggende arbeidsflyt som illustrerer de viktigste trinnene i prosessen. (B) Tilpassede analytiske skala reaksjonsbeholdere for CECF-uttrykk. (C) Kommersielt tilgjengelige dialysekassetter for oppsett av analytisk CECF. (D) Forberedende skalaoppsett (3 ml RM) inkludert en 3 ml dialysekassett og en tilpasset plexiglass FM-beholder. (E) Co-translasjonell innsetting av parlamentsmedlemmer i preformerte nanodiscs og lipidscreening i CECF-konfigurasjonen. RM inneholder de nødvendige transkripsjons- / oversettelsesmaskiner og nanodiscs mens forbindelser med lav molekylvekt er tilstede i begge rom. Biokjemiske og strukturelle anvendelser av de produserte MP / nanodisc-prøvene er ytterligere illustrert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Effekt av forskjellige Mg2+ -konsentrasjoner på CF GFP-syntese. GFP ble syntetisert i CF-reaksjoner med Mg 2+ konsentrasjoner innenfor et område på14-24 mM. (A) SDS-PAGE-analyse viser det sterkeste båndet av GFP ved 20 mM Mg2+. M: Markør. (B) GFP-fluorescens etter CF-uttrykk med forskjellige Mg2+ -konsentrasjoner. Maksimal GFP-fluorescens ved 20 mM Mg2+ tilsvarer 4,6 mg / ml. Feilfelt representerer standardavviket for en duplikatmåling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Effekt av nanodiscmembransammensetning på oppløsning og kvalitet på en CF-syntetisert GPCR. Utbytte og aktivitet av Tβ1AR-GFP syntetisert i nærvær av 30 μM nanodiscs som inneholder forskjellige membransammensetninger. Det totale syntetiserte proteinet ( A ) og fraksjonen av ligandbindende aktiv reseptor (B) er gitt i μM. Total konsentrasjon ble bestemt via fluorescensmåling av GFP-fusjonen. Aktiviteten ble målt via filterbindingsanalyse med den radiomerkede liganden [3H]-dihydroalprenolol. Feilfelt representerer standardavvik for uavhengige triplikater. Data hentet fra tidligere publisert manuskript14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Solubiliseringsskjerm av CF-syntetiserte parlamentsmedlemmer med økende nanodisckonsentrasjoner. Parlamentsmedlemmene ble syntetisert i nærvær av leverte nanodiscs innenfor et område på 3,75-60 μM. (A) Ekspresjon av Tβ1AR-GFP med nanodiscs (DMPC) i CF-reaksjonen. Total konsentrasjon ble bestemt ved fluorescensmåling av GFP-fusjonen. Data hentet fra tidligere publisert manuskript14. Affinity-tag rensede prøver ble analysert av SDS-PAGE og Coomassie-Blue-farging viser to fremtredende bånd tilsvarende Tβ1AR-GFP ved omtrent 50 kDa og MSP1E3D1 over 25 kDa (B) Uttrykk for PR med nanodiscs (DOPG) i CF-reaksjonen. Total PR-konsentrasjon ble bestemt via absorpsjonsmåling ved 530 nm. Data hentet fra tidligere publisert manuskript10,18. Bildene viser den røde fargen på de endelige reaksjonene på grunn av tilstedeværelsen av brettet PR. Piktogrammene illustrerer den modulerte PR-samlingen mot lavere oligomere konformasjoner ved økte nanodisckonsentrasjoner, som avslørt av påfølgende innfødt massespektrometri18. Affinity-tag rensede prøver ble analysert av SDS-PAGE og Coomassie-Blue-farging viser to fremtredende bånd som tilsvarer PR på omtrent 20 kDa og MSP1E3D1 over 25 kDa. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Sammensatt Endelig konsentrasjonsområde Effekt på MP-prøve
Mg2+ 10 - 30 mM utbytte
DTT 1 - 20 mM disulfid broformasjon, folding
20 Aminosyre blanding1 0,2 – 2 mM utbytte
GSSG: GSH2 (1-10 μM) : (1-10 μM) disulfid broformasjon, folding
Nanodiscs 10-100 μM solubilisering, oligomer montering, folding
Lipid type solubilisering, oligomer montering, folding
S30 : HS30 lysat3 (50-100 %) : (50-100 %) Folding
S12 - S100 20 – 50 % yield, MP-bakgrunn i kanalanalyser
DNA-mal 0,5 – 30 ng/μL RM utbytte, oligomer montering, folding
DNA-mal design utbytte
1, kan blandingen varieres i henhold til den individuelle sammensetningen av en MP for å f.eks. forbedre utbyttet eller optimalisere NMR-merkeordninger.
2, GSH bør alltid tilberedes ferskt.
3, bør total CF-lysatkonsentrasjon i RM være minst 35 % med et S30-innhold på minst 50 % for å sikre høye ekspresjonsnivåer.

Tabell 1: Kritiske screeningkomponenter ved CF-reaksjoner.

MSP1E3D1 Lipid DPC
Forhold (410 μM lager) (50 000 μM aksjer) (10 % (m/v) lager)
Lipid Lipid: MSP V(MSP) c(MSPendelig) V(lipid) c(lipidendelig) V(DPC) c(DPC-finale) DF-buffer
[μL] [μM] [μL] [μM] [μL] [%] [μL]
DMPC 115 : 1 1500.0 205.0 1415.0 23 575 30.0 0.1 55.5
DOPC 80 :1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPC 85 : 1 1500.0 205.0 1046.0 17 425 30.0 0.1 425.0
DMPG 110 : 1 1500.0 205.0 1353.0 22 550 30.0 0.1 117.0
DOPG 80 : 1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPG 90 : 1 1500.0 205.0 1107.0 18 450 30.0 0.1 363.0

Tabell 2: Lipid til MSP1E3D1-forhold for 3 ml in vitro monteringsoppsett.

Sammensatt Konsentrasjon Forberedelse
DNA plasmid mal1 > 400 μg/ml i 10 mM Tris-HCl pH 8,0 Midi/Maxi sett (f.eks Qiagen) forberedelse2
Blanding av 20 aminosyrer3 25 mM hver i H2O utfellingsrester4
Blanding av 4 NTP (75 x) c(CTP) 240 mM, c(ATP) 360 mM, c(UTP) 240 mM, c(GTP) 240 mM
i H2O. Juster pH til 7-8 med KOH		 Et lite bunnfall gjenstår4
Acetylfosfat 1 M i H2O, juster pH 7-8 med KOH utfellingsrester4
Fosfo(enol)pyruvsyre (K+) 1 M i H2O, juster pH 7-8 med KOH
Folsyre 10 mg/ml i H2O utfellingsrester4
DTT 0,5 m i H2O
c0mplete proteasehemmer cocktail 1 tablett per 1 ml i H2O
Tris-acetat, pH 8,0 2,4 m i H2O
Mg(OAc)2 1 m i h2o
KOAc 10 m i h2o
Ribolock RNase-hemmer 40 U/ml Thermo Fisher Vitenskapelig
tRNA (E. coli) 40 mg / ml i H2O Roche (Tyskland)
T7RNAP 3-7 mg/ml5 se protokoll avsnitt 2
Pyruvat kinase 10 mg/ml Roche (Tyskland)
Nanodiscs (DMPG) 0,2-1,0 mM6 i 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 100 mM NaCl se protokollavsnitt 3 og 4
1, PCR-mal kan brukes ved lignende konsentrasjoner.
2, kvaliteten på "Mini"-kit forberedt DNA er ikke tilfredsstillende.
3, cystein har en tendens til å være ustabil og kan tilsettes separat.
4, løsningen er overmettet, grundig blanding umiddelbart før fjerning av aliquots er nødvendig.
5, for hver nye T7RNAP-batch anbefales en startskjerm for å identifisere den beste endelige konsentrasjonen.
6, løselighet av nanoplater kan avhenge av deres lipidsammensetning.

Tabell 3: Klargjøring av CF-lagerløsninger.

Sammensatt
For Mastermix (3,0 x) c(endelig) V [μL]
Blanding av 20 aminosyrer 1 mM 2520.0
Blanding av 4 NTP (75 x) 1x 840.0
Acetylfosfat 20 mM 1260.0
Fosfo(enol)
pyruvsyre		 20 mM 1260.0
Folsyre 0,1 mg/ml 630.0
Tris-acetat, pH 8,0 100 mM 2625.0
C0mplete 50 x 1x 1260.0
Mg(OAc)2 19,8 (= 20)1 mM 1260.0
KOAc 180 (= 270)2 mM 1140.0
DTT 2 mM 252.0
H2O 7953.0
Total 21 000
For RM c(endelig) V [μL]
3x Mastermix 1 x 1000.0
RNase-hemmer 0,3 U/μL 22.5
tRNA (E. coli) 0,5 mg/ml 37.5
Nanoskiver (DMPG)3 10 μM 75.0
DNA-mal4 0,015 ng/μL 112.5
Pyruvat kinase 0,04 mg/ml 12.0
T7RNAP5 0,03 mg/ml 15.0
S30 lysat 0.35 % 1050.0
All-trans retinal6 0,6 mM 9.0
H2O - 666.5
Total 3000.0
For FM c(endelig) V [μL]
Mastermix (3 x) 1 x 20 000
H2O - 40 000
Total 60 000
1, 0,2 mM Mg2+ er bidratt fra S30 lysat.
2, 90 mM K + er bidratt fra acetylfosfat og fosfo (enol) pyruvsyre.
3, beregnet lagerløsning er 400 μM.
4, beregnet lagerløsning er 400 μg/ml.
5, beregnet stamløsning er 6 mg/ml.
6, spesifikk kofaktor for PR, lagerløsning er 200 mM i DMSO.

Tabell 4: Pipetteringsskjema for en CECF-reaksjon med 3 ml RM og 60 ml FM

Sammensatt
For Mastermix (3,0 x) c(endelig) V [μL]
Blanding av 20 aminosyrer 1 mM 864.0
Blanding av 4 NTP 1x 288.0
Acetylfosfat 20 mM 432.0
Fosfo(enol)pyruvsyre 20 mM 432.0
Folsyre 0,1 mg/ml 216.0
Tris-acetat, pH 8,0 100 mM 900.0
C0mplete 1x 432.0
Mg(OAc)2 13,8 (= 14) mM1 298.0
KOAc 180 (= 270) mM2 389.0
DTT 2 mM 86.4
H2O - 2862.6
Totalt [μL]1 - 7200.0
Mg2+ konsentrasjon
14 mM 16 mM 18 mM 20 mM 22 mM 24 mM
For RM c(endelig) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0
0,1 m mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0
RNase-hemmer 0,3 U/μL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
tRNA (E. coli) 0,5 mg/ml 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
DNA-mal3 0,015 ng/μL 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5
Pyruvat kinase 0,04 mg/ml 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
T7RNAP4 0,03 mg/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
S30 lysat 35 % 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0
H2O - 49.7 45.7 41.7 37.7 33.7 29.7
Totalt [μL]5 - 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0
Mg2+ konsentrasjon
14 mM 16 mM 18 mM 20 mM 22 mM 24 mM
For RM c(endelig) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0
0,1 m mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 68.0 136.0 204.0 272.0 340.0
H2O - 2267.0 2199.0 2131.0 2064.0 1995.0 1927.0
Totalt [μL]5 - 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0
1, 0,2 mM Mg2+ er bidratt fra S30 lysat. Mastermiksen justeres til laveste screeningkonsentrasjon.
2, 90 mM K + er bidratt fra acetly fosfat og fosfo (enol) pyruvic syre.
3, beregnet lagerløsning er 400 μg/ml.
4, beregnet stamløsning er 6 mg/ml.
5, reaksjoner utføres i duplikater.

Tabell 5: Pipetteringsskjema for Mg2+ konsentrasjonsskjerm med 100 μL RM og 1,7 ml FM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oppsettet og strategiene for å optimalisere CF-uttrykket og co-translasjonell innsetting av funksjonelle parlamentsmedlemmer i nanodiscs er beskrevet. Det nødvendige utstyret består av en bioreaktor, en trykkanordning eller lignende, en UV/VIS- og fluorescensleser, CF-reaksjonsbeholdere egnet for et to-roms konfigurasjonsoppsett og en temperaturkontrollert inkubator. Ytterligere standardutstyr er sentrifuger for høsting av E. coli-celler samt sentrifuger på bordplaten som når minst 30 000 x g for fremstilling av S30-lysater. Hvis S80-S100 lysater skal tilberedes, er ultracentrifuger nødvendige. Det oppførte utstyret er regelmessig tilgjengelig i biokjemiske laboratorier, og det kreves ingen større innledende investeringer for å komme i gang med CF-uttrykk. Videre er fermentering og håndtering av E. coli-celler for CF-lysat og T7RNAP-preparater vanlige og robuste teknikker. De dyreste forbindelsene er CF-lysat, T7RNAP og nanodiscs. De kan fremstilles ved pålitelige og effektive protokoller, og aliquots er stabile i årevis ved -80 ° C. Protokollene krever tre dager hver for CF-lysat og T7RNAP-forberedelse og omtrent en uke for ekspresjon og rensing av MSP og preforming av nanodiscs. Målmal-DNA kan leveres ved hjelp av pET-21, pIVEX eller lignende vektorsystemer. For oppsett og optimalisering av CF-uttrykkssystemer kan produksjonen av GFP-varianter som shifted GFP (GFP+) eller superfolderGFP brukes som monitor20,32. For MP-produksjonsforhold er uttrykket PR et godt modellsystem eller positiv kontroll, da det brettes under mange forskjellige forhold og lett kan overvåkes ved absorbans ved 530 nm10,15,18. For å etablere en effektiv CF-uttrykksprotokoll for et nytt MP, anbefales kodonoptimalisering av målleserammen og bruk av fusjoner med C-terminalt festet GFP25,26. Ytterligere nødvendige materialer inkluderer kjemikalier og enzymer som alle er kommersielt tilgjengelige. Disse komponentene må oppnås i høy kvalitet, og en samlet kostnadsberegning for den beskrevne CF-reaksjonen med 3 ml RM og 60 ml FM vil utgjøre ca. 150-200 €. En viktig applikasjon for CF-ekspresjonssystemer er derfor produksjon av proteiner som er vanskelige å oppnå i klassiske cellebaserte ekspresjonssystemer som mange parlamentsmedlemmer eller toksiner. CF-systemer er dessuten kjerneplattformer i syntetisk biologi, og stadig voksende bruksområder gjør dem stadig mer uunnværlige som et verktøy i molekylær forskning. Blant annet er rutinemessige applikasjoner merking av proteiner, prosesser med høy gjennomstrømning eller syntetisk celledesign.

Den demonstrerte strategien muliggjør vaskemiddelfri produksjon av rene parlamentsmedlemmer som allerede er satt inn i ønskede lipidmiljøer av høyoppløselige nanoplater. Når CF-ekspresjonsprotokollen for en MP er etablert og optimalisert, er produksjonen veldig rask og rene prøver kan oppnås på mindre enn 24 timer selv i forberedende skala. MP/nanodisc-kompleksene renses direkte fra CF-reaksjonen via streptavidin II- eller polyhistidin-tagger festet til MP. Prosessen tillater parallell funksjonell og strukturell analyse av identiske MP-prøver ved en rekke forskjellige teknikker33. Hurtighet og effektivitet i strategien er derfor konkurransedyktig for konvensjonelle tilnærminger ved bruk av cellebaserte ekspresjonssystemer og vaskemiddelutvinning av parlamentsmedlemmer fra cellemembraner etterfulgt av rutinemessig in vitro-rekonstituering 5,34. Den åpne tilgjengeligheten av CF-reaksjoner muliggjør ytterligere mange unike mekanistiske studier av MP-folding og membraninnsetting 15,16,18, MP-kompleks montering15,18,24 eller funksjonell regulering 23.

En viktig forskjell på CF-uttrykk over cellebasert uttrykk er fraværet av kvalitetskontrollsystemer for det syntetiserte proteinproduktet. Ethvert oversatt polypeptid uavhengig av funksjonell folding vil ende opp i den endelige produktprøven. Videre er innsettingsprosessen i nanodiscmembraner kunstig og translokonuavhengig og kan resultere enten i ufullstendig integrasjon eller kanskje ikke fungere i det hele tatt med en rekke MP-mål. Den endelig oppløselige produktfraksjonen i en CF-reaksjon kan dermed være ganske heterogen som inneholder fullt innsatt, men også bare delvis integrerte eller membranassosierte MP-er. Følgelig kan bare en liten brøkdel av en renset prøve av MP / nanodisc-komplekser være funksjonelt brettet. Modifisering av membransammensetning og nøye finjustering av MP til nanodisc-forhold ved å modulere konsentrasjonene av nanodiscs og DNA-maler er egnede verktøy for optimalisering. Likevel er nedstrøms kvalitetskontrolltilnærminger som profilering av størrelsesekskludering og målspesifikke kvantitative funksjonelle analyser alltid nødvendige for optimalisering av CF-uttrykksprotokoller. Tilgjengeligheten av slike analyser kan derfor begrense applikasjoner, spesielt i prosjekter, inkludert parlamentsmedlemmer som krever liposommiljøer for funksjon som transportører, kanaler eller pumper. Videre kan størrelsesbegrensningene til nanoplater begrense innsettingen av store MP-enheter.

I de dokumenterte eksemplene er variasjonen i den funksjonelt foldede fraksjonen av GPCR Tβ1AR-GFP innenfor området noen få prosent, opp til ca. 30%. Funksjonell folding krever nøye justering av en rekke parametere14 , og en lignende individuell og kjedelig optimaliseringsprosess kan være nødvendig for andre GPCR-er også22. Imidlertid er det endelig oppnådde utbyttet av funksjonelt foldet GPCR konkurransedyktig med andre produksjonssystemer og tillater oppsett av > 1000 radioassays for ligandbindingsstudier fra en enkelt 60 μL reaksjon i en analytisk skala Mini-CECF-reaktor. Det er verdt å nevne at ligandbindende studier av GPCR-GFP-fusjonskonstruksjoner ikke krever noen rensetrinn. Om nødvendig kan rensing oppnås ved å dra nytte av affinitetskoder festet til det syntetiserte MP-et, for eksempel His-tags eller Strep-tag II. RM fortynnes deretter i ønsket buffer og lastes på den tilsvarende affinitetskromatografikolonnen som er forhåndslikevektet tilsvarende. Den strukturelle evalueringen av PR og andre CF-syntetiserte parlamentsmedlemmer ved NMR-spektroskopi eller krystallisering har allerede bidratt til å etablere CF-uttrykkssystemer som kjerneplattformer i MP-forskning. Den beskrevne strategien for produksjon av MP/nanodisc-komplekser kan bli spesielt interessant for fremtidige strukturstudier ved elektronmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BE1911/8-1, LOEWE-prosjektet LIM og forskningssenteret Transport and Communication across Membranes (SFB807) for økonomisk støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) Carl Roth (Germany) 4855
2-Mercaptoethanol Carl Roth (Germany) 4227
2-Propanol Carl Roth (Germany) 9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride American Radiolabeled Chemicals (USA) ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) Merck (Germany) 1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) Sigma Aldrich (Germany) A9251
Alprenolol hydrochloride Merck (Germany) A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® Sigma-Aldrich (Germany) Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1 Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1 B.Braun (Germany)
Centrifuge Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid Carl Roth (Germany) 8137
Coomassie Brilliant Blue R250 Carl Roth (Germany) 3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt Sigma-Aldrich (Germany) C1506
D-glucose monohydrate Carl Roth (Germany) 6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate Carl Roth (Germany) 6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing Fisher Scientific (Germany) 8700152
Dithiothreit Carl Roth (Germany) 6908
Ethanol Carl Roth (Germany) K928
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma-Aldrich (Germany) 47612
French pressure cell disruptor SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol Carl Roth (Germany) 3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) Sigma-Aldrich (Germany) G8877
Hydrochloric Acid Carl Roth (Germany) K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL GE Life Sciences (Germany) GE17-5248
Imidazole Carl Roth (Germany) 3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Carl Roth (Germany) 2316
Kanamycin Carl Roth (Germany) T832
L-Alanine Carl Roth (Germany) 3076.1
L-Arginine Carl Roth (Germany) 6908
L-Asparagine Carl Roth (Germany) HN23
L-Aspartic Acid Carl Roth (Germany) T202
L-Cysteine Carl Roth (Germany) T203
L-Glutamic Acid Carl Roth (Germany) 3774
L-Glutamine Carl Roth (Germany) 3772
L-Glycine Carl Roth (Germany) 3187
L-Histidine Carl Roth (Germany) 3852
L-Isoleucine Carl Roth (Germany) 3922
L-Leucine Carl Roth (Germany) 1699
L-Lysine Carl Roth (Germany) 4207
L-Methionine Carl Roth (Germany) 9359
L-Proline Carl Roth (Germany) 1713
L-Phenylalanine Carl Roth (Germany) 1709
L-Serine Carl Roth (Germany) 4682
L-Threonine Carl Roth (Germany) 1738
L-Tryptophane Carl Roth (Germany) 7700
L-Tyrosine Carl Roth (Germany) T207
MD100 dialysis units Scienova (Germany) 40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) Carl Roth (Germany) 6763
n-dodecylphosphocholine Antrace (USA) F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000 Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine Carl Roth (Germany) 6681
Peristaltic pump: ip-12 Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt Sigma Aldrich (Germany) 860077
Potassium dihydrogen phosphate Carl Roth (Germany) P018
Potassium acetate Carl Roth (Germany) 4986
Potassium chloride Carl Roth (Germany) 6781
Pyruvate Kinase Roche (Germany) 10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL Hidex (Finland)
SDS pellets Carl Roth (Germany) 8029
Sodium azide Sigma-Aldrich (Germany) K305
Sodium chloride Carl Roth (Germany) P029
Spectrophotometer Nanodrop Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli) Roche (Germany) 10109550001
Ultra sonificator Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) Sigma-Aldrich (Germany) U6625
Y-30 antifoam Sigma-Aldrich (Germany) A6457
Yeast extract Carl Roth (Germany) 2904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  2. Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
  3. Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  4. Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
  5. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  6. Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
  7. Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
  8. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  9. Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
  10. Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
  11. Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
  12. Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
  14. Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
  15. Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
  16. Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  17. Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
  18. Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
  19. Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
  20. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  21. Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
  22. Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
  23. Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
  24. Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
  25. Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
  26. Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
  27. Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
  28. Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
  29. Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
  30. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  31. Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
  32. Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
  33. Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
  34. Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).

Tags

Biokjemi utgave 165 In vitro ekspresjon cellefri L-CF vaskemiddelfri nanodiscs membranproteiner G-proteinkoblede reseptorer proteorhodopsin membrandesign co-translasjonell membraninnsetting
Co-translasjonell innsetting av membranproteiner i preformerte nanodiscs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levin, R., Koeck, Z., Dötsch,… More

Levin, R., Koeck, Z., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs. J. Vis. Exp. (165), e61844, doi:10.3791/61844 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter