Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61844
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biophysical Chemistry, Goethe University Frankfurt

Summary

Önceden oluşturulmuş nanodisklere birlikte translasyonel yerleştirme, tanımlanmış lipit ortamlarında deterjanlarla temas etmeden hücresiz sentezlenmiş membran proteinlerinin incelenmesini mümkün kılar. Bu protokol, temel sistem bileşenlerinin hazırlanmasını ve ifade verimliliğini ve numune kalitesini artırmak için kritik parametreleri açıklar.

Abstract

Hücresiz ekspresyon sistemleri, membran proteinleri gibi karmaşık proteinlerin bile işlevsel katlanmasını desteklemek için reaksiyon ortamlarının özel tasarımına izin verir. Membran proteinlerinin nanodiskler olarak tedarik edilen önceden oluşturulmuş ve tanımlanmış membranlara ko-translasyonel olarak yerleştirilmesi ve katlanması için deneysel prosedürler gösterilmiştir. Protokol tamamen deterjansızdır ve bir gün içinde miligram saflaştırılmış numune üretebilir. Elde edilen membran proteini / nanodisk örnekleri, çeşitli fonksiyonel çalışmalar ve kristalizasyon, nükleer manyetik rezonans veya elektron mikroskobu gibi yapısal uygulamalar için kullanılabilir. Hücresiz lizatlar, tasarlanmış membranlı nanodiskler, kritik stok çözeltileri ve iki bölmeli hücresiz ekspresyon reaksiyonlarının montajı gibi temel anahtar bileşenlerin hazırlanması açıklanmaktadır. Membran proteinlerinin katlanma gereksinimleri çok çeşitli olabileceğinden, bu protokolün ana odak noktası, kritik temel reaksiyon bileşikleri, nanodisklerin membran bileşimi, redoks ve şaperon ortamı veya DNA şablon tasarımı gibi numune kalitesi için önemli olan parametrelerin ve reaksiyon adımlarının modülasyonudur. Tüm süreç proteorhodopsin ve bir G-protein eşleşmiş reseptör sentezi ile gösterilmiştir.

Introduction

Membran proteinleri (MPS), sulu ortamlarda çözünmemeleri nedeniyle protein üretim çalışmalarında zorlu hedeflerdir. Geleneksel MP üretim platformları, E. coli, maya veya ökaryotik hücreler gibi hücre tabanlı sistemlerden oluşur. Sentezlenen rekombinant milletvekilleri ya hücre zarlarından ekstrakte edilir ya da inklüzyon cisimciklerinden yeniden katlanır1. Deterjan çözünürlüğünden sonra milletvekilleri, in vitro sulandırma protokolleri oluşturularak uygun membran ortamlarına aktarılabilir. Veziküller ve lipozomların yanı sıra, nanodiskler2 veya salipro3 parçacıkları şeklinde düzlemsel membranlara MP resuentasyonu son zamanlarda rutin teknikler haline gelmiştir. Bununla birlikte, tüm bu stratejiler, milletvekilleriyle deterjan temasının istikrarsızlaşmaya, oligomerlerin ayrışmasına ve hatta protein yapısının ve aktivitesinin kaybına neden olabileceği anlamınagelir 4. Bu nedenle optimum deterjan çözünürlüğü ve sulandırma koşullarının taranması sıkıcı ve zaman alıcı olabilir5.

Hücresiz (CF) sistemlerin açık doğası, ekspresyon reaksiyonunun, tanımlanmış bir lipit bileşimine sahip önceden oluşturulmuş membranlarla doğrudan sağlanmasını sağlar. Bu lipit bazlı ekspresyon modunda (L-CF), sentezlenmiş milletvekilleri, sağlanan çift katmanlı 6,7'ye birlikte translasyonel olarak ekleme fırsatına sahiptir (Şekil 1). Düzlemsel lipid çift katmanlı disk8'i çevreleyen bir membran iskele proteininden (MSP) oluşan nanodiskler, bu strateji 9,10 için özellikle uygun görünmektedir. Nanodiskler rutin olarak çeşitli farklı lipitlerle in vitro olarak monte edilebilir, çok kararlıdırlar ve stoklar 1 mM'ye kadar konsantre edilebilir. Bununla birlikte, E. coli'de MSP ekspresyonu ve saflaştırılması gereklidir. Alternatif bir strateji olarak MSP, lipozomlarla beslenen KF reaksiyonlarında hedef MP ile birlikte eksprese edilebilir11,12,13. Hem MSP hem de MP için DNA şablonları reaksiyona eklenir ve ifade üzerine MP / nanodiskler oluşabilir. MSP üretiminden kaçınılırken, birlikte ekspresyon stratejisi, nihai DNA şablon konsantrasyonlarının dikkatli bir şekilde ince ayarlanmasını gerektirir ve numune üretiminin verimliliğinde daha yüksek varyasyonlar beklenebilir.

Milletvekillerinin önceden oluşturulmuş nanodisklerin zarlarına ko-translasyonel olarak eklenmesi, translokon makinelerinden ve sinyal dizileri13,14,15,16'dan bağımsız, fizyolojik olmayan ve hala büyük ölçüde bilinmeyen bir mekanizmadır. Yerleştirme etkinliğinin başlıca belirleyicileri, membran proteininin tipi ve sağlanan membranın lipit bileşimidir ve negatif yüklü lipitler için sıklıkla tercih edilir15,17. Nanodisk membranları nispeten sınırlı boyuttadır, MP yerleştirme18 üzerine önemli miktarda lipit salınır. Nanodisk boyutunun değişimi, daha yüksek oligomerik MP komplekslerinin 15,18'in yerleştirilmesini ve ayarlanmasını sağlar. Diğerlerinin yanı sıra, iyon kanalı KcsA, iyon pompası proteorhodopsin (PR) ve çoklu ilaç taşıyıcı EmrE15,18 için homooligomerik komplekslerin doğru montajı gösterilmiştir. Milletvekillerinin simetrik nanodisk membranına her iki taraftan da nispeten eşit frekansta girmeleri muhtemeldir. Bu nedenle, bir nanodiske yerleştirilen farklı monomerlerin veya oligomerlerin zıt yönelimlere sahip olabileceği düşünülmelidir. Bununla birlikte, oryantasyondaki bir önyargı, PR hexamers ve KcsA tetramerlerinin oluşumu için bildirilen işbirlikçi yerleştirme mekanizmalarından kaynaklanabilir18. MP oryantasyonundaki başka bir önyargı, muhtemelen nanodisk membranlarının kenarına yerleştirilmiş MP'lerin oryantasyon anahtarlarından kaynaklanabilir.

E. coli suşlarından CF lizat üretimi güvenilir bir rutin tekniktir ve hemen hemen her biyokimyasal laboratuvarda gerçekleştirilebilir19,20. Disülfit köprü oluşumunun yanı sıra, bir MP'nin E. coli lizatları kullanılarak sentezlenmesi durumunda, diğer birçok çeviri sonrası modifikasyonun bulunmadığı düşünülmelidir. Bu, yapısal çalışmalar için daha homojen örnekler üretebilirken, bireysel MP hedeflerinin işlevi üzerindeki potansiyel etkileri dışlamak gerekebilir. Bununla birlikte, E. coli CF lizatlarında G-protein kuplajlı reseptörlerin (GPCR) 14,21,22, ökaryotik taşıyıcıların 23 veya büyük heteromerik montajların 24'ünün yüksek kaliteli örneklerinin verimli bir şekilde üretilmesi, karmaşık hedefler için bile uygunluklarını göstermektedir. Bir numunenin hazırlık ölçeği miktarları (≈ 1 mg/mL), bir reaksiyon karışımı (RM) ve bir besleme karışımı (FM) bölmesinden oluşan iki bölmeli sürekli değişim hücresiz (CECF) konfigürasyonu ile elde edilebilir. FM hacmi, RM hacmini 15 ila 20 kat aşıyor ve düşük moleküler ağırlıklı enerji bileşikleri ve öncülleri19'dan oluşan bir rezervuar sağlıyor. Böylece reaksiyon ifadesi birkaç saat uzatılır ve MP hedefinin nihai verimi artırılır. RM ve FM bölmeleri, 10-14 kDa kesimli bir diyaliz membranı ile ayrılır. İki bölme, CECF reaksiyon kabının özel bir tasarımını gerektirir (Şekil 1). FM'i tutan özel pleksiglas kaplar ile birlikte RM kapları olarak ticari diyaliz kasetleri uygun örneklerdir. MP verimleri, RM: FM oranlarını değiştirerek veya belirli bir inkübasyon süresinden sonra FM'yi değiştirerek daha da manipüle edilebilir.

Bir MP'nin verimi ve kalitesi sıklıkla reaksiyon parametrelerinin yoğun optimizasyonunu gerektirir. CF ifadesinin önemli bir avantajı, bir MP'nin bireysel gereksinimlerine göre hemen hemen her bileşiği değiştirme ve ince ayar yapma olasılığıdır. Basit bir strateji, önce temel bir üretim protokolü oluşturarak bir MP'nin verimini artırmaya odaklanmak ve daha sonra reaksiyon ve katlama koşullarına ince ayar yaparak MP kalitesini optimize etmektir. KF lizatlarında fizyolojik süreçlerin olmaması ve karmaşıklığının azalması, milletvekillerinin verimli üretimi için yüksek başarı oranlarına neden olmaktadır25. DNA şablon tasarımı ve Mg2 + iyon konsantrasyonunun optimizasyonu için rutin hususlar çoğu durumda tatmin edici verimler elde etmek için yeterlidir26. İfade moduna bağlı olarak, MP kalitesinin optimizasyonu zaman alıcı olabilir, çünkü daha çeşitli parametrelerintaranması gerekir 14,17,22.

Tanımlanan CF ekspresyon platformunu oluşturmak için, E. coli CF lizat (i), T7 RNA polimeraz (ii), nanodiskler (iii) ve temel CECF reaksiyon bileşiklerinin (iv) üretimi için protokoller gereklidir (Şekil 1). E. coli K12 suşu A1927 veya BL21 türevleri, verimli S30 (30.000 x g'de santrifüjleme) lizatlarının hazırlanmasında sıklıkla kullanılır. S30 lizatlarının yanı sıra, diğer g-kuvvetlerinde (örneğin S12) santrifüj edilmiş karşılık gelen lizatlar da kullanılabilir. Lisatlar ekspresyon verimliliği ve proteom karmaşıklığı bakımından farklılık gösterir. Tanımlanan protokol ile hazırlanan S30 lizatının proteomu28 ayrıntılı olarak incelenmiştir. S30 proteomu hala iyon kanallarının ekspresyonu ve analizi üzerine arka plan problemleri verebilecek bazı artık dış zar proteinleri içerir. Bu tür hedefler için S80-S100 lizat kullanılması önerilir. Lisat hazırlama sırasında değerli bir modifikasyon, hücrelerin orta log büyüme fazında kombine ısı şoku ve etanol beslemesi ile SOS yanıtının indüklenmesidir. Elde edilen HS30 lizatları şaperonlar bakımından zenginleştirilmiştir ve gelişmiş MP katlama22 için S30 lizatlarla karışımlarda kullanılabilir. E. coli lizatlarındaki CF ekspresyonu, T7 RNA polimeraz (T7RNAP) tarafından kontrol edilen promotörler içeren DNA şablonları ile birleştirilmiş bir transkripsiyon / translasyon işlemi olarak çalıştırılır. Enzim, pAR1219 plazmid29'u taşıyan BL21 (DE3) Yıldız hücrelerinde verimli bir şekilde üretilebilir.

MSP1E3D1'in iki kopyası, 10-12 nm çapında bir nanodiskte toplanır, ancak aşağıda açıklanan protokol diğer MSP türevleri için de çalışabilir. Bununla birlikte, MSP1E3D1 ile oluşturulanlardan daha büyük nanodiskler daha az kararlı olma eğilimindeyken, MSP1 gibi MSP türevleriyle oluşturulan daha küçük nanodiskler daha büyük MP'leri veya MP komplekslerini barındırmayabilir. MSP1E3D1 nanodiskleri, çok çeşitli farklı lipitler veya lipit karışımları ile in vitro olarak monte edilebilir. Önceden oluşturulmuş nanodiskler genellikle -80 ° C'de 1 yıl > stabildir, stabilite ise farklı lipit bileşenleri için değişebilir. Bir MP'nin katlanması ve stabilitesi üzerindeki lipit etkilerinin taranması için, temsili çeşitli lipitler / lipit karışımları ile monte edilmiş kapsamlı bir nanodisk seti hazırlamak gerekir. Aşağıdaki lipitler iyi bir başlangıç seçimi sağlayabilir: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) ve 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC).

3 mL CECF reaksiyonunun hazırlanması için bir protokol tanımlanmıştır. 1: 1 oranında daha fazla yukarı veya aşağı ölçeklendirme mümkündür. İki bölmeli CECF konfigürasyonu için, tüm bileşikleri içeren bir RM ve sadece düşük moleküler ağırlıklı bileşikleri içeren bir FM hazırlanmalıdır. 10-14 kDa MWCO'lu ticari 3 mL diyaliz cihazları RM konteyner olarak kullanılabilir ve daha sonra FM'i tutan özel yapım pleksiglas kaplara yerleştirilir (Şekil 1D)30. RM: FM oranı 1: 20'dir, bu nedenle 3 mL RM için 60 mL FM hazırlanmalıdır. DNA şablonları yayınlanan kılavuzlara göre hazırlanmalıdır ve hedefin okuma çerçevesinin kodon optimizasyonu ürün verimini daha da artırabilir26. Hazırlık ölçeği CECF reaksiyonu için, PR üretimi için belirlenmiş bir protokol tanımlanmıştır. Yeni milletvekilleri için ifade protokolleri oluşturmak için, verimi ve kaliteyi artırmak için genellikle belirli bileşiklerin optimizasyon ekranlarını (Tablo 1) gerçekleştirmek gerekir. Mg2 + iyonları için, farklı DNA şablonları için sıklıkla önemli varyasyonlar gösteren iyi odaklanmış bir konsantrasyon optimumluğu vardır. Yeni T7RNAP veya S30 lizat partileri gibi diğer CF reaksiyon bileşikleri, optimal Mg2 + konsantrasyonunu daha da değiştirebilir. Örnek olarak, 14-24 mM konsantrasyon aralığında ve 2 mM'lik adımlar halinde tipik bir Mg2+ ekran tanımlanmıştır. Her konsantrasyon kopyalar halinde ve analitik ölçekte CECF reaksiyonlarında taranır. CECF reaksiyon kabı olarak, RM'yi tutan özel yapım Mini-CECF Pleksiglas kaplar30, FM'yi tutan standart 24 delikli mikro plakalarla birlikte kullanılır (Şekil 1B). Alternatif olarak, uygun kurulumlarda 96 derin kuyucuklu mikroplakalar veya diğer ticari diyalizör cihazları ile birlikte ticari diyaliz kartuşları kullanılabilir (Şekil 1C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. S30 lizat hazırlanması

  1. 1. Gün: Bir LB agar plakasındaki gliserol stoklarından hücreleri dışarı çıkarın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. 2. Gün: Agar plakasındaki hücrelerle 200 mL LB ortamını aşılayın ve 12-14 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. 3. Gün: 10 L steril YPTG ortamını (10 g / L maya ekstresi, 16 g / L tripton, 5 g / L NaCl, 19.8 g / L glikoz, 4.4 mM KH 2 PO 4, 8 mM K2HPO4) 100 mL ön kültür (1:100) ile 15 L karıştırılmış bir tank reaktöründe 37 ° C'ye temperlenmiş olarak aşılayın. 37 ° C, 500 rpm ve yüksek havalandırmada (~ dakikada 3 hava hacmi) yetiştirin. Aşırı köpüklenmeyi önlemek için steril köpük önleyici ekleyin.
  4. Optik yoğunluğu (OD) düzenli zaman aralıklarında 600 nm'de ölçün. Yaklaşık 2 saat sonra kültür log fazına girecektir.
  5. HS30 lizat için değişiklik: Hücreler orta log fazındayken (OD600 ≈ 3.6-4.2) kültür ortamına 300 mL etanol ekleyin ve 45 dakika daha 42 ° C, 500 rpm ve yüksek havalandırmada (dakikada yaklaşık 3 hava hacmi) ekime devam edin. Ardından, adım 1.6'da açıklandığı gibi hücre kültürünün soğutulması ve toplanmasına devam edin. Standart S30 lizat üretimi için bu adımı atlayın ve adım 1.6 ile devam edin.
  6. Hücreler orta log fazında olduğunda (OD600 ≈ 3.6-4.2), fermentörü < 30 dakika içinde 20 ° C'nin altında soğutun. Son OD600 4.5-5.5 civarında olmalıdır. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 4.500 x g'deki hücreleri toplayın ve süpernatanı atın. Aşağıdaki adımlar boyunca hücreleri 4 ° C'de tutun.
    NOT: Soğutma sırasında aşırı köpüklenme meydana gelebilir. Bu durumda, köpük önleyici ekleyin veya karıştırma hızını azaltın ve / veya biyoreaktördeki hava akışını azaltın.
  7. Bir spatula kullanarak hücreleri 300 mL S30-A tamponunda (10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 14 mM Mg (OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-merkaptoetanol) tamamen askıya alın ve ardından homojenliğe kadar süspansiyonu yukarı ve aşağı pipetleyin. 4 °C'de 10 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
    DİKKAT: 2-merkaptoetanol toksiktir. Cilt veya solunum yolu ile temasından kaçının. Mümkünse, bir kaputun altında çalışın. Son yıkama adımından önce boş santrifüj kabını tartın. Santrifüjlemeden sonra, ıslak hücre peletini tartın ve adım 1.8 ile devam edin veya peleti daha fazla kullanıma kadar saklayın.
    NOT: Islak hücre peletinin ağırlığı 1 L biyoreaktör kültürü başına 5-7 g'dır. Bu noktada protokol duraklatılabilir ve pelet sıvı azotta dondurulabilir ve 4-8 hafta boyunca -80 ° C'de saklanabilir.
  8. Hücreleri 1.1 hacim (1 g = 1 mL) S30-B tamponunda (10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 14 mM Mg (OAc)2, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 tablet cOmplete proteaz inhibitörü) iyice askıya alın. Süspansiyonu önceden soğutulmuş bir Fransız pres basınç hücresine doldurun ve hücreleri 1.000 psig'de bozun. Hücreleri Fransız basınından bir kez geçirin.
  9. Lisatı 4 °C'de 30 dakika boyunca 30.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze bir tüpe aktarın ve santrifüjleme adımını tekrarlayın.
    NOT: İlk santrifüjlemeden sonra peletin üstünde gevşek ve sümüksü bir tabaka bulunabilir ve bu tabaka süpernatant ile aktarılmamalıdır.
  10. Kararsız lizat bileşenlerini çıkarmak ve ribozomlardan mRNA'yı serbest bırakmak için yüksek bir tuz ve ısı adımı uygulayın. Lisatı 0,4 M NaCl'ye ayarlayın ve bir su banyosunda 45 dakika boyunca 42 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Bu adım önemli çökelti oluşumuna neden olur. Zaman zaman inkübasyon sırasında tüpü çevirin veya ters çevirin.
  11. Bulanık süspansiyonu (genellikle 50-80 mL) 10-14 kDa kesme ve 5 L S30-C tamponuna (10 mM Tris-HCl, pH 8.2, 14 mM Mg (OAc)2, 60 mM KOAc, 0.5 mM DTT) karşı diyaliz tüplerine aktarın. S30-C diyaliz tamponunu 2-3 saat sonra değiştirin ve 12-14 saat daha diyaliz yapın.
  12. 4. Gün: Diyalizli süspansiyonu santrifüj tüplerine aktarın ve 4 °C'de 30 dakika boyunca 30.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı (S30 lizat) taze 50 mL tüplere aktarın ve yavaşça karıştırın. Lisatın protein konsantrasyonu yaklaşık 30-40 mg/mL olmalıdır. Alikotları (örneğin 0,5 mL, 1 mL) sıvı azotta şok dondurma ve -80 °C'de saklayın. Aliquots > 1 yıl boyunca stabildir.

2. T7 RNA polimerazın ekspresyonu ve saflaştırılması

  1. 1. Gün: 100 μg/mL ampisilin içeren 200 mL LB besiyerini, taze kaplanmış BL21(DE3) Star x pAR1219 hücrelerle aşılayın ve 12-16 saat boyunca 37 °C ve 180 rpm'de inkübe edin.
  2. 2. Gün: 1 L müthiş et suyunu (12 g / L tripton, 24 g / L maya özü, 4 mL / L gliserol) 10 mL ön kültür ile 2 L şaşkın bir şişeye aşılayın ve 37 ° C ve 180 rpm ajitasyonda inkübe edin. Başlangıç OD600 0.1 civarında olmalıdır.
  3. OD600 0.6-0.9'a ulaştığında, T7RNAP ekspresyonunu indüklemek ve 5 saat daha ekime devam etmek için 1 mM'lik son konsantrasyona IPTG ekleyin.
  4. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 4.500 x g'de santrifüjleme ile hücreleri hasat edin. Hücreleri sıvı azotta dondurun ve -80 °C'de saklayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
  5. 3. Gün: Dondurulmuş hücre peletine 30 mL buz gibi soğuk süspansiyon tamponu (30 mM Tris-HCl, bir tablet cOmplete proteaz inhibitörü ile pH 8.0) ekleyin ve peleti oda sıcaklığında bir su banyosunda çözün. Ardından, homojenliğe kadar yukarı ve aşağı pipetleyerek, peleti askıya alın.
  6. Önceki bölümde açıklandığı gibi bir Fransız basını kullanarak hücre bozulması gerçekleştirin veya üreticinin tavsiyelerine göre bir sonikasyon cihazı kullanın. Daha sonra, 4 ° C'de 30 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı taze bir tüpe aktarın.
  7. Genomik DNA'yı çökeltmek için, streptomisin sülfatı yavaşça ve süpernatantına% 3'lük (w / v) nihai konsantrasyona ulaşana kadar yumuşak ajitasyon altında ekleyin. Nazik ajitasyon altında 5-10 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. 4 °C'de 30 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüj.
  8. Süpernatantı 0,45 μm'lik bir filtre ile filtreleyin ve 4 mL/dak akış hızında peristaltik bir pompa kullanarak 2 CV denge tamponu (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl,% 5 gliserol ve 10 mM 2-merkaptoetanol) ile dengelenmiş 40 mL'lik bir sütun hacmine (CV) sahip bir Q-Sefarose kolonuna yükleyin. Ardından, kolonu bir UV dedektörüne bağlayın ve 280 nm'deki UV sinyali sabit bir taban çizgisine ulaşana kadar denge tamponu ile elüsyona devam edin.
  9. 3 mL/dak akış hızında CV başına 50 mM'den 500 mM'ye kadar NaCl gradyanı olan Elute T7RNAP. 1 mL fraksiyon toplayın ve her fraksiyonun 10 μL'sini 2 x SDS numune tamponu ile karıştırarak SDS-PAGE analizi için numuneler hazırlayın. SDS-PAGE'i çalıştırın ve jeli Coomassie Blue R. T7RNAP ile lekeleyin, çok sayıda ek safsızlık bandı ile birlikte yaklaşık 90 kDa'da belirgin bir bant olarak görünmelidir.
  10. Diyaliz tamponunda 12-16 saat boyunca 12-14 kDa MWCO'lu membranlar kullanılarak T7RNAP ve diyaliz içeren havuz fraksiyonları (10 mM K 2 HPO 4/KH2PO4, pH 8.0,10 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, %5 (w/v) gliserol).
  11. 4. Gün: T7RNAP çözeltisini toplayın ve 12-14 MWCO'lu filtre ünitelerini kullanarak 3-10 mg/mL'lik nihai konsantrasyona konsantre olun. T7RNAP konsantrasyon sırasında çökelmeye başlayabilir. Numunede bulanıklık oluşur oluşmaz konsantrasyonu anında durdurun. Gliserol % 50'lik (w / v) son konsantrasyona ekleyin ve yavaşça karıştırın. 0.5-1 mL alikotları şok dondurma ve -80 ° C'de saklayın. Çalışan T7RNAP alikotları -20 °C'de saklanabilir.
    NOT: 1 L'lik bir fermantasyondan 20.000-40.000 ünite ile yaklaşık 20-40 mL 5 mg/mL kısmen saflaştırılmış T7RNAP elde edilmelidir. Her T7RNAP partisinin optimum miktarını test etmek için, hazırlanan T7RNAP örneğinin 0.02 mg / mL-0.1 mg / mL'sini içeren yeşil floresan proteinin (GFP) CF ekspresyon reaksiyonları gerçekleştirilmelidir.

3. MSP1E3D1'in ifadesi ve saflaştırılması

  1. 1. Gün: Standart ısı şoku dönüşümü veya elektroporasyon protokollerini kullanarak E. coli BL21 (DE3) Yıldız hücrelerini pET28(a)-MSP1E3D1 vektör 31 ile dönüştürün. 30 μg / mL kanamisin içeren LB agar üzerindeki hücreleri çizgilendirin veya plakaya dönüştürün ve 12-16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. 2. Gün: Agar plakasından toplanan tek bir koloni ile% 0.5 (w / v) glikoz ve 30 μg / mL kanamisin ile desteklenmiş 200 mL LB ortamını aşılayın ve 12-16 saat boyunca 180 rpm'de 37 ° C'de inkübe edin.
  3. 3. Gün: Karıştırılmış tank biyoreaktöründe 100 mL ön kültür ile% 0.5 (w / v) glikoz ve 30 μg / mL kanamisin ile desteklenmiş 10 L LB ortamını aşılayın. 37 °C, 500 rpm'de fermantasyon ve dakikada yaklaşık 3 biyoreaktör hacminde havalandırma yapın. Aşırı köpüklenme durumunda, köpük önleyici ekleyin.
    NOT: Fermentör yerine şaşkın sallama şişeleri kullanılabilir.
  4. 6.5-7.5 OD600'de, 1 mM'lik son konsantrasyona IPTG ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübasyona devam edin. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 4.500 x g'de santrifüjleme ile hücreleri hasat edin. Hücre peletlerini 200 mL% 0,9 (w/v) NaCl ile yıkayın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 8.000 x g'de tekrar santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücreleri bir spatula kullanarak 50 mL tüplere aktarın. Beklenen ıslak pelet ağırlığı, L biyoreaktör kültürü başına 8-12 g'dır. Sıvı azotta şok dondurma hücre peletleri ve daha fazla kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
  5. 4. Gün: Saflaştırma için, RT'deki bir su banyosunda hücre peletlerini çözün. % 30-40 (w / v) hücre süspansiyonu elde etmek için MSP-A tamponundaki hücreleri askıya alın (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl,% 1 (w / v) Triton X-100, 50 mL hücre süspansiyonu başına 1 tablet c0mplete proteaz inhibitörü kokteyli).
  6. Sonikasyon yoluyla veya bir Fransız presi kullanarak hücreleri bozun ve 30,000 ° C'de 30 dakika boyunca 4 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze bir tüpe aktarın ve 0,45 μm'lik bir filtreden süzün. Filtratın, peristaltik bir pompa kullanarak 5 CV MSP-B tamponu (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl,% 1 (w / v) Triton X-100) ile dengelenmiş bir Ni2+ yüklü nitrilotriasetik asit kolonuna (CV > 15 mL) uygulayın.
    NOT: Filtrasyonu kolaylaştırmak için, süpernatant büyük DNA parçalarını parçalamak için bir dakika daha sonikleştirilebilir.
  7. Numune yüklendikten sonra, kolonu 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8.9, 300 mM NaCl, 50 mM kolik asit), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8.9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl) ve 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8.0) ile yıkayın. 300 mM NaCl, 50 mM imidazol).
    NOT: MSP-C tamponundaki kolik asit, MSP'ye bağlı lipitleri çıkarmak için önemlidir. Kolik asit düşük pH değerlerinde tamamen çözünmez. Bu nedenle pH değeri MSP-C ve MSP-D'de 8.9'a ayarlanmalıdır. Kolonu MSP-D tamponu ile yıkamak önemlidir, çünkü daha düşük bir pH, artık kolik asidin çökelmesine ve kolonu bloke etmesine veya zarar vermesine neden olabilir.
  8. MSP-G ile Elute MSP (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol). 1 mL'lik fraksiyonları toplayın ve 280 nm'de UV emilimini izleyin. Elüsyon zirvesinin fraksiyonlarını toplayın ve bir araya getirin.
  9. Havuzlanmış MSP fraksiyonlarını 12-14 kDa MWCO diyaliz membran tüplerine aktarın ve 4 °C'de 2-3 saat boyunca 5 L MSP-H'ye (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl,% 10 (w / v) gliserol karşı) diyaliz yapın. Yeni 5 L MSP-H arabelleğe geçin ve 4 °C'de 12-16 saat daha diyaliz yapın.
  10. 5. Gün: MSP çözeltisini santrifüj tüplerine aktarın ve çökeltiyi gidermek için 4 °C'de 30 dakika boyunca 18.000 x g'de santrifüj yapın. Supernatant'ı taze bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 12-14 kDa MWCO ile ultrafiltrasyon cihazlarını kullanarak 200-800 μM'ye konsantre olun. Bir UV/VIS ölçüm cihazı kullanarak konsantrasyonu ölçün. Konsantrasyonun hesaplanması için 27.31 M-1 cm-1 yok olma katsayısını ve 31.96 kDa'lık moleküler kütleyi kullanın.
    NOT: Bir biyoreaktördeki ekspresyon genellikle L kültürü başına 15-30 mg MSP1E3D1 verir.
  11. Konsantre MSP çözeltisinin alikotlarını sıvı azotta şok dondurma ve -80 °C'de saklayın.

4. MSP1E3D1 nanodisklerin montajı

  1. 1. Gün: 100 mM sodyum kolatta 1-2 mL 50 mM lipit stokları (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC veya POPC) hazırlayın. Aynı gün kullanılmadığı takdirde -20 °C'de saklayın.
    NOT: Lipid çözeltisi berrak olmalıdır. Çözelti net değilse, sodyum kolat konsantrasyonu 150 mM'ye yükseltilebilir.
  2. MSP1E3D1 çözeltisini lipit çözeltisiyle karıştırın. Dodesil fosfokolin (DPC) % 0.1'lik (w / v) son konsantrasyonda ekleyin. Montaj reaksiyonları, diyaliz kasetlerinin tipik hacimlerine (10 kDa MWCO) karşılık gelen 3 mL (Tablo 2) veya 12 mL'lik nihai hacimlere ayarlanabilir. Nazik ajitasyon altında 21 ° C'de 1 saat boyunca montaj reaksiyonlarını inkübe edin.
    NOT: Her lipit için, homojen nanodisk preparasyonunu sağlamak için belirli bir MSP1E3D1: lipit oranı kullanılmalıdır (Tablo 2). Yeni lipitler veya lipit karışımları için, optimal oran bir pilot deney ve boyut dışlama kromatografisi analizi14 ile belirlenmelidir.
  3. Disk oluşumu (DF) tamponlu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl) diyaliz kasetinin zarını önceden ıslatın. Montaj karışımını bir şırınga ile diyaliz kasetine aktarın. Potansiyel hava kabarcıkları şırınga kullanılarak aspirasyon ile giderilebilir.
  4. 1-4. Günler: Bir karıştırma çubuğu kullanarak karıştırma altında RT'de 10-20 saat boyunca 3 x 5 L DF tamponuna karşı diyaliz yapın. Daha sonra montaj karışımını diyaliz kasetinden DF tamponu ile dengelenmiş 10 kDa MWCO ile santrifüj filtre ünitelerine aktarın. 4 °C'de 4.000 x g'de konsantre olun.
    NOT: Bulanık bir diyaliz karışımı, MSP:lipid'in yanlış stokiyometrik oranını gösterebilir. Çökeltiniz, numune konsantrasyonundan önce 4 °C'de 20 dakika boyunca 18.000 x g'de uzaklaştırılmalıdır. Numune konsantrasyonu sırasında çökelmeyi önlemek için, büyük bir çıkmaza sahip ultrafiltrasyon üniteleri kullanın.
  5. Birleştirilen nanodiskleri en az 300 μM'lik bir konsantrasyona konsantre edin. Bir nanodiskin iki MSP1E3D1 molekülü tarafından oluşturulduğunu ve bu nedenle doğru nanodisk miktarını belirlemek için MSP konsantrasyonunun 2'ye bölünmesi gerektiğini düşünün.
    NOT: Açıklanan kurulum (Tablo 2), 300 μM nanodisk çözeltisinin 0,6-1 mL'sini verecektir.
  6. Çökeltiyi gidermek için konsantre nanodisk preparatını 18.000 x g'da 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin. Daha sonra, süpernatantı aspire edin ve sıvı azotta 50 μL alikotları şok dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
    NOT: Boyut dışlama kromatografisi kullanarak nanodisk oluşumunun başarısını değerlendirmeniz önerilir. Numune monodispers olmalı ve sadece düşük miktarda agrega içermelidir. Agregalar, kurulumdaki lipit miktarının çok yüksek olduğunu gösterir. Referans olarak, saflaştırılmış MSP1E3D1 kullanılabilir. Nanodisk preparatı referans MSP1E3D1 zirvesinin yüksekliğinde bir tepe gösteriyorsa, seçilen lipitin MSP1E3D1 oranı çok düşüktü.

5. Hazırlık ölçeği 3 mL CECF reaksiyon kurulumu

  1. 1. Gün: Gerekli tüm stok çözümlerini listelendiği gibi hazırlar (Tablo 3). Stoklar -20 °C'de depolanır ve oda sıcaklığında çözülür. Çözdükten sonra ve pipetlemeden önce tüm stokları iyice karıştırdığınızdan emin olun. Tüm stoklar için gerekli hacimleri hesaplayın ve pipetleme şeması yapın (Tablo 4). Yüksek moleküler ağırlıklı bileşikler sadece RM'ye eklenecektir. Düşük moleküler ağırlıklı bileşikler için, RM ve FM için kombine 3 x mastermix hazırlanabilir.
    NOT: Bileşik karışımların nihai hacimleri, karıştırma sırasındaki hacim kaybı nedeniyle hesaplanandan daha az olabilir. Bu, hacim kaybını telafi etmek için% 2-5'lik bir fazla hacim eklenerek önlenebilir.
  2. 3 mL'lik bir diyaliz kasetinin zarını 100 mM Tris-asetat, pH 8.0'da dengeleyin. Fazla arabelleği çıkardığınızdan emin olun.
  3. RM'yi diyaliz kasetine aktarmak için bir şırınga kullanmak. RM bölmesindeki aşırı havayı şırınga ile aspirasyon yaparak çıkarın. Diyaliz kasetini diyaliz odasına yerleştirin.
  4. Diyaliz odasını 60 mL FM ile doldurun. kapağı hazneye yerleştirin ve sabitlemek için vidaları sıkın. Odayı 200 rpm'de 30 °C'de 12-16 saat boyunca inkübe edin.
    NOT: Karıştırma sırasında odanın dik konumda kaldığından emin olun, aksi takdirde düşük moleküler bileşiklerin değişimi engellenecektir.
  5. 2. Gün: Bir şırınga kullanarak, RM'yi diyaliz odasından aspire edin. RM'yi taze tüplere aktarın ve çökeltiyi gidermek için 10 dakika boyunca 4 ° C'de 16.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze tüplere aktarın. Süpernatanttaki protein şimdi daha fazla analiz edilebilir.
    NOT: Bazı durumlarda, santrifüjlemeden sonra bir pelet mevcut olacaktır. Bu, analiz edilen nanodisklerin veya sentezlenen MP'yi çözünür tutmak için reaksiyon bileşiklerinin uygunluğu hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Bu nedenle, çökelti içinde potansiyel olarak bulunan hedef miktarının SDS-PAGE, Western Blot kullanılarak veya pelet boyutunun görsel olarak değerlendirilmesi ile analiz edilmesi önerilir.

6. Mg2+ iyon taraması için analitik ölçek 60 μL CECF reaksiyon kurulumu

  1. 1. Gün: İlgili 3x ana karışımın tüm bileşenlerini karıştırın ve RM'ye 60 μL ve FM'ye825μL dağıtın. FM'yi H2 O ile doldurun ve FM'i vorteks yaparak karıştırın. FM'i 24 kuyucuklu mikro plakanın 3 kuyucuğuna aktarın (Tablo 5).
    NOT: Özelleştirilmiş Mini-CECF kabına erişilemeyebileceğinden, Tablo 5'teki hacimler, 96 derin kuyucuklu (2 mL) plakada FM hacmi 1,7 mL'lik bir FM hacmine sahip diyaliz kartuşlarında (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) gerçekleştirilen bir reaksiyon için hesaplanmıştır (Şekil 1).
  2. 10-14 kDa MWCO ile rejenere selüloz diyaliz tüplerini yaklaşık 25 x 20 mm boyutlarında parçalara bölün ve% 0,05 (w / v) sodyum azid ile H2O'da saklayın.
    DİKKAT: Sodyum azid çok toksiktir. Cilt veya mukoza zarı ile herhangi bir temastan kaçının. Metal kapları kullanmayın, çünkü sodyum azid patlayıcı metal azidler oluşturmak için metallerle reaksiyona girebilir.
  3. Mini-CECF konteyner montajından önce, diyaliz zarlarından aşırıH2O'yu bir doku ile çıkarın. Her kaba bir membran parçası yerleştirin ve membranları bir politetrafloretilen halka ile sabitleyin.
  4. Mini-CECF kabını, 825 μL FM içeren 24 delikli bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Mini-CECF kabının diyaliz zarının altındaki hava kabarcıklarından kaçının.
  5. RM'ye açıklandığı gibi yüksek moleküler bileşenler ekleyin (Tablo 5) ve yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın. Reaksiyon kabına 60 μL ekleyin. Viskoz çözeltinin transferi sırasında hava kabarcıklarından kaçının.
  6. Sızdırmazlık termoplastik filminden 2 adet 8 x 10 cm'lik tabaka kesin ve içindeki reaksiyon kapları ile 24 delikli plakanın etrafına sarın. Bu, reaksiyon karışımından buharlaşmayı azaltacaktır. Şimdi hücre kültürü plakasının kapağını plakaya yerleştirin ve bantla sabitleyin. Plakayı 30 ° C'de ve 12-16 saat boyunca 200 rpm ajitasyonda inkübe edin.
  7. 2. Gün: Mini-CECF kabındaki pipet ucu ile diyaliz membranını delerek reaksiyon karışımını toplayın ve RM'yi aspire edin. RM'yi taze tüplere aktarın ve çökeltileri çıkarmak için 10 dakika boyunca 4 ° C'de 16.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze tüplere aktarın. Süpernatanttaki protein şimdi daha fazla analiz edilebilir.
    NOT: Bazı durumlarda, santrifüjlemeden sonra bir pelet mevcut olacaktır. Bu, sentezlenen MP'yi çözünür tutmak için analiz edilen nanodisklerin veya diğer reaksiyon bileşiklerinin uygunluğu hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Bu nedenle, çökelti içinde potansiyel olarak bulunan hedef miktarının SDS-PAGE, Western Blot veya pelet boyutunun görsel değerlendirmesi ile analiz edilmesi önerilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İnce ayar reaksiyon bileşiklerinin, sentezlenmiş milletvekillerinin nihai verimi veya kalitesi üzerindeki etkisi örneklendirilmiştir. Sık kullanılan rutin bir yaklaşım, CF reaksiyonlarında optimal Mg2+ konsantrasyonunu, sistem verimliliğinin uygun bir monitörü olarak yeşil floresan proteini (GFP) ekspresyonu ile ayarlamaktır. Örnek olarak, GFP, 14 ila 24 mM arasındaki Mg 2+ konsantrasyonlarında bir pET-21a (+) vektöründen sentezlendi (Şekil 2). SDS-PAGE analizi, CF reaksiyon süpernatanının tamamlayıcı floresan ölçümlerine (485 nm'de uyarılma, 535 nm'de emisyon ölçümü) iyi uyum sağlayan 20 mM'de optimal Mg 2+ konsantrasyonunu tanımlamıştır (Şekil 2A). pIVEX 2.3 vektöründen eksprese edilen bakteriyel PR'nin ve pET-21a (+) vektöründen eksprese edilen hindi β1 adrenerjik reseptörün (Tβ1AR) CF ekspresyonu için, optimal Mg 2+ konsantrasyonu 20-22 mM'de tanımlanmıştır.

Başka bir örnek olarak, sentezlenmiş milletvekillerinin açıklanan strateji ile kalite iyileştirmesi gösterilmiştir. Milletvekillerinin önceden oluşturulmuş nanodisklere birlikte translasyonel olarak yerleştirilmesi için ayarlanabilir parametreler (i) nanodisk zarının lipit bileşimi ve (ii) reaksiyondaki son nanodisk konsantrasyonudur. Hidrofobik ortamın doğru katlanma, oligomerik montaj ve milletvekillerinin stabilitesi için önemli bir parametre olduğu iyi bilinmektedir. Nanodisklerdeki lipit bileşimi modüle edilebildiğinden, açıklanan yaklaşım, bir MP'nin yapısı ve işlevi üzerindeki lipit etkilerinin basit bir sistematik taramasını sağlar. İlk deneylerde, lipidlerin fosfatidilkolin (PC) ve fosfatidilgliserol (PG) kafa gruplarıyla taranması ve farklı zincir uzunluklarının ve doygunluklarının test edilmesi önerilir. Membran bileşiminin ve nanodisk konsantrasyonunun iki farklı milletvekilinin çözünürlük verimliliği ve kalitesi üzerindeki etkisi gösterilmiştir. PR, hafif aktive edilmiş bir proton pompasıdır ve RM'de 100 μM'> nihai konsantrasyonlarına ulaşan çok kararlı ve yüksek oranda sentezlenmiş bir MP'dir. Bu nedenle, PR konsantrasyonu, RM süpernatanında 530 nm'de absorpsiyon ölçümü ile kolayca değerlendirilebildiğinden, doğru reaksiyon kurulumunu sağlamak için pozitif bir kontrol olarak kullanılması önerilir. Buna karşılık, Tβ1AR, ökaryotik G-protein eşleşmiş reseptörlerinin (GPCR'ler) geniş ailesinin bir örneğidir ve karmaşık ve kararsız bir MP'dir. Uygun izleme için, bir Tβ1AR-GFP füzyon yapısı sentezlendi ve CF reaksiyonlarındaki nanodisk çözünür reseptörün toplam konsantrasyonu GFP floresansı ile belirlendi (Şekil 3A). İşlevsel olarak katlanmış ve ligand bağlayıcı aktif reseptörün fraksiyonu, bir filtre bağlama testi ve etiketli ligand [3H]-dihidroalprenolol kullanılarak daha da belirlendi (Şekil 3B). Filtre bağlama testi daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirilmiştir14. Kısaca, RM'deki Tβ1AR-GFP konsantrasyonu, floresansı aracılığıyla belirlendi. GPCR, radyoaktif etiketli ligand ile 20 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edildi, bir filtreye uygulandı ve bağlanmamış ligand yıkandı. Spesifik olmayan [3H]-dihidroalprenolol bağlanmasının belirlenmesi için, reseptör bir kontrol reaksiyonunda etiketlenmemiş alprenolol ile doyuruldu. Filtrelerdeki radyoaktif ligandın sayıları bir parıltı sayacında ölçüldü ve bağlı ligand miktarı spesifik etiket aktivitesi ile belirlendi. Yüzde GPCR bağlanma aktivitesi daha sonra bağlı ligand miktarından, Tβ1AR-GFP konsantrasyonundan ve tahlil hacminden hesaplandı. Tβ1AR-GFP'nin genel sentezi ve nanodisk çözünürlüğü, analiz edilen tüm membran bileşimlerine benzer ve 8-13 μM aralığındadır (Şekil 3A). Buna karşılık, sentezlenen GPCR'nin kalitesinde çok daha yüksek bir varyasyon tespit edilebilir. %10'dan az aktif fraksiyon ile en düşük aktivite DMPC ve POPC lipidleri ile elde edilir. DOPG ve POPG ile Tβ1AR-GFP'nin aktif fraksiyonu yaklaşık %30'a çıkarılabilir (Şekil 3B). Sonuçlar, lipid kafa grubunun yükünün yanı sıra yağ asidi zincirinin esnekliğinin, bu GPCR'nin katlanması ve aktivitesi için önemli modülatörler olduğunu göstermektedir.

Nanodisk bileşiminin yanı sıra, CF reaksiyonundaki son konsantrasyonları MP kalitesi için önemli bir faktör olabilir. Bir nanodiskin uygun bir membran bileşimi belirlendikten sonra, MP sentezi sırasındaki konsantrasyonu taranmalıdır. Nanodisk konsantrasyonunun bir MP'nin ifade verimliliğine göre ayarlanması gerektiği açıktır. Tβ1AR-GFP reseptörü ve PR'nin CF sentezi, RM'de sırasıyla yaklaşık 10 μM ve 100 μM'lik nihai konsantrasyonlarla sonuçlanır. Nanodisk konsantrasyonu 3.75-60 μM'lik bir aralıkta taranırsa, GPCR'nin tam bir çözünürlüğü yaklaşık 30 μM nanodiskte elde edilir ve Tβ 1 AR: nanodisk1: 3'lük bir oran verilir (Şekil 4A). Buna karşılık, PR'ın tam çözünürlüğü yaklaşık 10 μM nanodisk ile zaten elde edilmiştir ve 10: 1'lik bir PR: nanodisk oranı verir (Şekil 4B). Bu nedenle, Tβ1AR-GFP'nin neredeyse tamamen çözünmesini sağlamak için fazla miktarda nanodisk gereklidir, PR durumunda ters çevrilmiş bir oran, birden fazla PR kopyasının bir nanodiske yerleştirildiğini gösterir. Doğal kütle spektrometresi ile saflaştırılmış PR / nanodisk komplekslerinin daha sonraki çalışmaları bu gözlemi doğruladı ve daha düşük nanodisk konsantrasyonlarında sentezlenirse PR'nin daha yüksek oligomerik formlarının prevalansını buldu15,18. CF sentezlenmiş MP'lerin nanodisklerle titrasyonlanması, oligomerik düzenekleri tetiklemek ve MP fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için bir araç olarak kullanılabilir.

Figure 1
Şekil 1: Membran proteinlerinin nanodisklere yerleştirilmesi için CECF ekspresyon stratejisi. (A) Sürecin ana adımlarını gösteren temel iş akışı. (B) CECF ifadesi için özelleştirilmiş analitik ölçek reaksiyon kapları. (C) Analitik terazi CECF kurulumu için piyasada satılan diyaliz kartuşları. (D) 3 mL diyaliz kaseti ve özelleştirilmiş pleksiglas FM kabı içeren hazırlık terazisi kurulumu (3 mL RM). (E) Milletvekillerinin önceden oluşturulmuş nanodisklere birlikte translasyonel olarak yerleştirilmesi ve CECF konfigürasyonunda lipit taraması. RM, gerekli transkripsiyon / çeviri makinelerini ve nanodiskleri içerirken, her iki bölmede de düşük moleküler ağırlıklı bileşikler bulunur. Üretilen MP/nanodisk örneklerinin biyokimyasal ve yapısal uygulamaları daha ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Farklı Mg2+ konsantrasyonlarının CF GFP sentezi üzerine etkisi. GFP, 14-24 mM aralığında Mg2+ konsantrasyonları ile CF reaksiyonlarında sentezlendi. (A) SDS-PAGE analizi, GFP'nin en güçlü bandını 20 mM Mg2+'da gösterir. M: İşaretleyici. (B) Farklı Mg2+ konsantrasyonları ile CF ekspresyonundan sonra GFP floresansı. 20 mM Mg2 + 'daki maksimum GFP floresansı 4.6 mg / mL'ye karşılık gelir. Hata çubukları, yinelenen bir ölçümün standart sapmasını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Nanodisk membran bileşiminin CF sentezlenmiş GPCR'nin çözünürlüğü ve kalitesi üzerine etkisi. Farklı membran bileşimleri içeren 30 μM nanodisklerin varlığında sentezlenen Tβ1AR-GFP'nin verimi ve aktivitesi. Toplam sentezlenmiş protein ( A ) ve ligand bağlayıcı aktif reseptörün (B) fraksiyonu μM cinsinden verilir. Aktivite, radyoaktif etiketli ligand [3H]-dihidroalprenorol ile filtre bağlama testi ile ölçüldü. Hata çubukları, bağımsız üçlülerin standart sapmalarını temsil eder. Daha önce yayınlanmış makaleden alınan veriler14. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: CF sentezlenmiş milletvekillerinin artan nanodisk konsantrasyonlarına sahip çözünürlük ekranı. Milletvekilleri, 3.75-60 μM. aralığında tedarik edilen nanodisklerin varlığında sentezlendi. (A) CF reaksiyonunda nanodisklerle (DMPC) Tβ1AR-GFP'nin ekspresyonu. Toplam konsantrasyon GFP füzyonunun floresan ölçümü ile belirlendi. Daha önce yayınlanmış makaleden alınan veriler14. Afinite etiketi saflaştırılmış örnekler SDS-PAGE ile analiz edildi ve Coomassie-Blue boyaması, yaklaşık 50 kDa'da Tβ1AR-GFP'ye karşılık gelen iki belirgin bandı ve 25 kDa'nın üzerinde MSP1E3D1'i (B) gösterir CF reaksiyonunda nanodisklerle PR ekspresyonu (DOPG). Toplam PR konsantrasyonu 530 nm'de absorpsiyon ölçümü ile belirlendi. Daha önce yayınlanmış makaleden alınan veriler10,18. Fotoğraflar, katlanmış PR'ın varlığı nedeniyle son reaksiyonların kırmızı rengini göstermektedir. Piktogramlar, sonraki doğal kütle spektrometrisi18 tarafından ortaya konduğu gibi, artan nanodisk konsantrasyonları üzerine daha düşük oligomerik konformasyonlara doğru modüle edilmiş PR düzeneğini göstermektedir. Afinite etiketi saflaştırılmış örnekler SDS-PAGE ile analiz edildi ve Coomassie-Blue boyaması, yaklaşık 20 kDa'da PR'ye karşılık gelen iki belirgin bant ve 25 kDa'nın üzerindeki MSP1E3D1'i göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bileşik Son konsantrasyon aralığı MP örneği üzerindeki etkisi
Mg2+ 10 - 30 mM rekolte
cesaret 1 - 20 mM disülfür köprü oluşumu, katlanır
20 Amino asit karışımı1 0,2 – 2 mM rekolte
GSSG : GSH2 (1-10 μM) : (1-10 μM) disülfür köprü oluşumu, katlanır
Nanodiskler 10 - 100 μM çözünürleştirme, oligomerik montaj, katlama
Lipid tipi çözünürleştirme, oligomerik montaj, katlama
S30 : HS30 lizat3 (50-100 %) : (50-100 %) Katlanır
S12 - S100 20 – 50 % verim, kanal tahlillerinde MP arka planı
DNA şablonu 0,5 – 30 ng/μL RM verim, oligomerik montaj, katlama
DNA şablon tasarımı rekolte
1, karışım, örneğin verimi artırmak veya NMR etiketleme şemalarını optimize etmek için bir MP'nin bireysel bileşimine göre değiştirilebilir.
2, GSH her zaman taze hazırlanmalıdır.
3, RM'deki toplam CF lizat konsantrasyonu, yüksek ekspresyon seviyelerini sağlamak için en az% 50'lik bir S30 içeriği ile en az% 35 olmalıdır.

Tablo 1: KF reaksiyonlarının kritik tarama bileşenleri.

MSP1E3D1 Lipid DPC
Oran (410 μM stok) (50.000 μM stok) (% 10 (w/v) stok)
Lipid Lipid : MSP V(MSP) c(MSPfinali) V (lipit) c(lipidfinal) V(DPC) c(DPCfinali) DF arabelleği
[μL] [μM] [μL] [μM] [μL] [%] [μL]
cesaret 115 : 1 1500.0 205.0 1415.0 23 575 30.0 0.1 55.5
cesaret 80 :1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPC (İngilizce) 85 : 1 1500.0 205.0 1046.0 17 425 30.0 0.1 425.0
cesaret 110 : 1 1500.0 205.0 1353.0 22 550 30.0 0.1 117.0
DOPG (Boya Kurumu) 80 : 1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
ARJANTIN 90 : 1 1500.0 205.0 1107.0 18 450 30.0 0.1 363.0

Tablo 2: 3 mL in vitro montaj kurulumları için lipid / MSP1E3D1 oranları.

Bileşik Konsantrasyon Hazırlık
DNA plazmid şablonu1 10 mM Tris-HCl pH 8,0'da > 400 μg/mL Midi/Maxi kiti (örneğin Qiagen) hazırlığı2
20 amino asit karışımı3 Her biri H 2 O'da25mM çökelti kalır4
4 NTP karışımı (75 x) c(CTP) 240 mM, c(ATP) 360 mM, c(UTP) 240 mM, c(GTP) 240 mM
içinde H2O. KOH ile pH'ı 7-8'e ayarlayın		 Küçük bir çökelti kalır4
Asetil fosfat H2O'da 1 M, KOH ile pH 7-8'i ayarlayın çökelti kalır4
Fosfo (enol) piruvik asit (K +) H2O'da 1 M, KOH ile pH 7-8'i ayarlayın
Folinik asit H2O'da 10 mg/mL çökelti kalır4
cesaret H2O'da 0,5 m
c0mplete proteaz inhibitörü kokteyli H2O'da 1 mL başına 1 tablet
Tris-asetat, pH 8.0 Y 2 O'da2,4m
Mg(OAc)2 H2O'da 1 M
KOAc H2O ile 10 M
Ribolock RNaz İnhibitörü 40 U/mL Thermo Fisher Bilimsel
tRNA (E. coli) H2O'da 40 mg/mL Roche (Almanya)
T7RNAP 3-7 mg/mL5 protokol bölüm 2'ye bakın
Piruvat kinaz 10 mg/mL Roche (Almanya)
Nanodiskler (DMPG) 0,2-1,0 mM6 inç 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 100 mM NaCl protokol bölüm 3 ve 4'e bakın
1, PCR şablonu benzer konsantrasyonlarda kullanılabilir.
2, hazırlanan "Mini" kitinin DNA'sının kalitesi tatmin edici değildir.
3, sistein kararsız olma eğilimindedir ve ayrı olarak eklenebilir.
4, çözelti aşırı doymuş, alikotları çıkarmadan hemen önce iyice karıştırmak gerekir.
5, her yeni T7RNAP partisi için, en iyi nihai konsantrasyonu belirlemek için bir başlangıç ekranı önerilir.
6, nanodisklerin çözünürlüğü lipit bileşimlerine bağlı olabilir.

Tablo 3: CF stok çözümlerinin hazırlanması.

Bileşik
Mastermix için (3.0 x) c(final) V [μL]
20 amino asit karışımı 1 mM 2520.0
4 NTP karışımı (75 x) 1 adet 840.0
Asetil fosfat 20 mM 1260.0
Fosfo(enol)
piruvik asit		 20 mM 1260.0
Folinik asit 0.1 mg/mL 630.0
Tris-asetat, pH 8.0 100 mM 2625.0
c0mplete 50 x 1 adet 1260.0
Mg(OAc)2 19,8 (= 20)1 mM 1260.0
KOAc 180 (= 270)2 mM 1140.0
cesaret 2 mM 252.0
H2O 7953.0
Toplam 21 000
RM için c(final) V [μL]
3x Mastermix 1 x 1000.0
RNaz inhibitörü 0,3 U/μL 22.5
tRNA (E. coli) 0.5 mg/mL 37.5
Nanodiskler (DMPG)3 10 μM 75.0
DNA şablonu4 0,015 ng/μL 112.5
Piruvat kinaz 0.04 mg/mL 12.0
T7RNAP5 0.03 mg/mL 15.0
S30 lizat 0.35 % 1050.0
Tüm trans retinal6 0,6 mM 9.0
H2O - 666.5
Toplam 3000.0
FM için c(final) V [μL]
Mastermix (3 x) 1 x 20 000
H2O - 40 000
Toplam 60 000
1, 0.2 mM Mg2+, S30 lizatından katkıda bulunur.
2, 90 mM K + asetil fosfat ve fosfo (enol) piruvik asitten katkıda bulunur.
3, hesaplanan stok çözeltisi 400 μM'dir.
4, hesaplanan stok çözeltisi 400 μg / mL'dir.
5, hesaplanan stok çözeltisi 6 mg / mL'dir.
6, PR için spesifik kofaktör, stok çözümü DMSO'da 200 mM'dir.

Tablo 4: 3 mL RM ve 60 mL FM içeren bir CECF reaksiyonu için pipetleme şeması

Bileşik
Mastermix için (3.0 x) c(final) V [μL]
20 amino asit karışımı 1 mM 864.0
4 NTP karışımı 1 adet 288.0
Asetil fosfat 20 mM 432.0
Fosfo (enol) piruvik asit 20 mM 432.0
Folinik asit 0.1 mg/mL 216.0
Tris-asetat, pH 8.0 100 mM 900.0
c0mplete 1 adet 432.0
Mg(OAc)2 13,8 (= 14) mM1 298.0
KOAc 180 (= 270) mM2 389.0
cesaret 2 mM 86.4
H2O - 2862.6
Toplam [μL]1 - 7200.0
Mg2+ konsantrasyonu
14 mM 16 mM 18 mM 20 mM 22 mM 24 mM
RM için c(final) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0
0,1 M Mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0
RNaz inhibitörü 0,3 U/μL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
tRNA (E. coli) 0.5 mg/mL 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
DNA şablonu3 0,015 ng/μL 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5
Piruvat kinaz 0.04 mg/mL 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
T7RNAP4 0.03 mg/mL 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
S30 lizat 35 % 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0
H2O - 49.7 45.7 41.7 37.7 33.7 29.7
Toplam [μL]5 - 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0
Mg2+ konsantrasyonu
14 mM 16 mM 18 mM 20 mM 22 mM 24 mM
RM için c(final) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0
0,1 M Mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 68.0 136.0 204.0 272.0 340.0
H2O - 2267.0 2199.0 2131.0 2064.0 1995.0 1927.0
Toplam [μL]5 - 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0
1, 0.2 mM Mg2+, S30 lizatından katkıda bulunur. Mastermix, en düşük eleme konsantrasyonuna ayarlanır.
2, 90 mM K + asetli fosfat ve fosfo (enol) piruvik asitten katkıda bulunur.
3, hesaplanan stok çözeltisi 400 μg / mL'dir.
4, hesaplanan stok çözeltisi 6 mg / mL'dir.
5, reaksiyonlar kopyalar halinde gerçekleştirilir.

Tablo 5: 100 μL RM ve 1,7 mL FM içeren Mg2+ konsantrasyon eleği için pipetleme şeması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CF ekspresyonunu optimize etmek için kurulum ve stratejiler ve fonksiyonel milletvekillerinin nanodisklere birlikte translasyonel olarak yerleştirilmesi açıklanmaktadır. Gerekli ekipman bir biyoreaktör, bir Fransız pres cihazı veya benzeri, bir UV / VIS ve floresan okuyucu, iki bölmeli bir konfigürasyon kurulumu için uygun CF reaksiyon kapları ve sıcaklık kontrollü bir inkübatörden oluşur. Diğer standart ekipmanlar, E. coli hücrelerinin toplanması için santrifüjlerin yanı sıra S30 lizatlarının hazırlanması için en az 30.000 x g'a ulaşan masa üstü santrifüjlerdir. S80-S100 lizatları hazırlanacaksa, ultrasantrifüjler gereklidir. Listelenen ekipman biyokimya laboratuvarlarında düzenli olarak mevcuttur ve CF ifadesine başlamak için daha büyük bir ilk yatırım yapılması gerekmez. Ayrıca, CF lizat ve T7RNAP preparatları için E. coli hücrelerinin fermantasyonu ve işlenmesi yaygın ve sağlam tekniklerdir. En pahalı bileşikler CF lizat, T7RNAP ve nanodisklerdir. Güvenilir ve verimli protokollerle hazırlanabilirler ve alikotlar -80 ° C'de yıllarca stabildir. Protokoller, CF lizat ve T7RNAP preparasyonu için her biri üç gün ve MSP'nin ekspresyonu ve saflaştırılması ve nanodisklerin preformu için yaklaşık bir hafta gerektirir. Hedef şablon DNA, pET-21, pIVEX veya benzeri vektör sistemleri kullanılarak sağlanabilir. CF ekspresyon sistemlerinin kurulumu ve optimizasyonu için, kaydırılmış GFP (GFP +) veya superfolderGFP gibi GFP varyantlarının üretimi monitör20,32 olarak kullanılabilir. MP üretim koşulları için PR ifadesi, birçok farklı koşulda katlandığı ve 530 nm 10,15,18'de absorbans ile kolayca izlenebileceği için iyi bir model sistem veya pozitif kontroldür. Yeni bir MP için verimli bir CF ekspresyon protokolü oluşturmak için, hedef okuma çerçevesinin kodon optimizasyonu ve C-terminal olarak bağlı GFP ile füzyonların kullanılması önerilir25,26. Diğer gerekli malzemeler, hepsi ticari olarak temin edilebilen kimyasalları ve enzimleri içerir. Bu bileşenlerin yüksek kalitede elde edilmesi gerekir ve 3 mL RM ve 60 mL FM ile tanımlanan CF reaksiyonu için genel bir maliyet hesaplaması yaklaşık 150-200 € tutarında olacaktır. Bu nedenle, CF ekspresyon sistemleri için birincil uygulama, birçok milletvekili veya toksin gibi klasik hücre bazlı ekspresyon sistemlerinde elde edilmesi zor proteinlerin üretilmesidir. CF sistemleri ayrıca sentetik biyolojide temel platformlardır ve sürekli büyüyen uygulama alanları, moleküler araştırmalarda bir araç olarak giderek daha vazgeçilmez hale getirmektedir. Diğerlerinin yanı sıra, rutin uygulamalar proteinlerin etiketlenmesi, yüksek verimli süreçler veya sentetik hücre tasarımıdır.

Gösterilen strateji, yüksek oranda çözünür nanodisklerin istenen lipit ortamlarına yerleştirilmiş saf milletvekillerinin deterjansız üretimini sağlar. Bir MP için CF ekspresyon protokolü kurulduktan ve optimize edildikten sonra, üretim çok hızlıdır ve hazırlık ölçeğinde bile 24 saatten daha kısa sürede saf numuneler elde edilebilir. MP/nanodisk kompleksleri, MP'ye bağlı streptavidin II veya polihistidin etiketleri aracılığıyla doğrudan CF reaksiyonundan arındırılır. Proses, aynı MP numunelerinin bir dizi farklı teknikle paralel fonksiyonel ve yapısal analizine olanak tanır33. Bu nedenle, stratejinin hızı ve verimliliği, hücre bazlı ekspresyon sistemlerini kullanan geleneksel yaklaşımlarla ve milletvekillerinin hücre zarlarından deterjanla ekstraksiyonunu takiben rutin in vitro sulandırma 5,34 ile rekabet edebilir. CF reaksiyonlarının açık erişilebilirliği, MP katlama ve membran yerleştirme 15,16,18, MP karmaşık montaj 15,18,24 veya fonksiyonel düzenleme 23 ile ilgili çok sayıda benzersiz mekanik çalışmayı daha da kolaylaştırır.

CF ekspresyonunun hücre bazlı ekspresyona göre önemli bir farkı, sentezlenmiş protein ürünü için kalite kontrol sistemlerinin olmamasıdır. İşlevsel katlanmasından bağımsız olarak çevrilmiş herhangi bir polipeptit, nihai ürün örneğinde sona erecektir. Ayrıca, nanodisk membranlara yerleştirme işlemi yapay ve translokozdan bağımsızdır ve eksik entegrasyona neden olabilir veya bir dizi MP hedefiyle hiç çalışmayabilir. Bir CF reaksiyonunda nihai olarak çözünür ürün fraksiyonu, bu nedenle, tamamen yerleştirilmiş ancak aynı zamanda sadece kısmen entegre edilmiş veya membranla ilişkili milletvekilleri içeren oldukça heterojen olabilir. Sonuç olarak, MP/nanodisk komplekslerinin saflaştırılmış bir örneğinin sadece küçük bir kısmı işlevsel olarak katlanabilir. Membran bileşiminin değiştirilmesi ve nanodisklerin ve DNA şablonlarının konsantrasyonlarını modüle ederek MP-nanodisk oranlarının dikkatli bir şekilde ayarlanması, optimizasyon için uygun araçlardır. Bununla birlikte, boyut dışlama profillemesi ve hedefe özgü nicel fonksiyonel testler gibi aşağı akış kalite kontrol yaklaşımları, CF ekspresyon protokollerinin optimizasyonu için her zaman gereklidir. Bu nedenle, bu tür testlerin mevcudiyeti, özellikle taşıyıcılar, kanallar veya pompalar gibi işlevler için lipozom ortamları gerektiren milletvekilleri de dahil olmak üzere projelerdeki uygulamaları sınırlayabilir. Ayrıca, nanodisklerin boyut sınırlamaları, büyük MP montajlarının yerleştirilmesini kısıtlayabilir.

Belgelenen örneklerde, GPCR Tβ1AR-GFP'nin işlevsel olarak katlanmış fraksiyonundaki varyasyon, yaklaşık% 30'a kadar, yüzde birkaç aralığındadır. İşlevsel katlama, bir dizi parametrenin dikkatli bir şekilde ayarlanmasını gerektirir14 ve benzer bir bireysel ve sıkıcı optimizasyon süreci diğer GPCR'ler için de gerekli olabilir22. Bununla birlikte, fonksiyonel olarak katlanmış GPCR'nin nihai olarak elde edilen verimi, diğer üretim sistemleriyle rekabet edebilir ve analitik ölçekli bir Mini-CECF reaktöründe tek bir 60 μL reaksiyondan ligand bağlama çalışmaları için 1.000'den > radyotahlilin kurulmasına izin verir. GPCR-GFP füzyon yapılarının ligand bağlama çalışmalarının herhangi bir saflaştırma adımı gerektirmediğini belirtmekte fayda var. Gerekirse, saflaştırma, sentezlenen MP'ye iliştirilmiş His-tags veya Strep-tag II gibi afinite etiketlerinden yararlanılarak sağlanabilir. RM daha sonra istenen tamponda seyreltilir ve buna göre önceden dengelenmiş karşılık gelen afinite kromatografisi sütununa yüklenir. PR ve diğer CF sentezlenmiş milletvekillerinin NMR spektroskopisi veya kristalizasyonu ile yapısal olarak değerlendirilmesi, CF ekspresyon sistemlerinin MP araştırmalarında çekirdek platformlar olarak kurulmasına yardımcı olmuştur. MP / nanodisk komplekslerinin üretimi için açıklanan strateji, elektron mikroskobu ile gelecekteki yapısal çalışmalar için özellikle ilginç hale gelebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) hibesi BE1911/8-1'e, LOEWE projesi GLUE'ya ve işbirlikçi araştırma merkezi Transport and Communication across Membranes'a (SFB807) finansal destek için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) Carl Roth (Germany) 4855
2-Mercaptoethanol Carl Roth (Germany) 4227
2-Propanol Carl Roth (Germany) 9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride American Radiolabeled Chemicals (USA) ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) Merck (Germany) 1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) Sigma Aldrich (Germany) A9251
Alprenolol hydrochloride Merck (Germany) A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® Sigma-Aldrich (Germany) Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1 Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1 B.Braun (Germany)
Centrifuge Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid Carl Roth (Germany) 8137
Coomassie Brilliant Blue R250 Carl Roth (Germany) 3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt Sigma-Aldrich (Germany) C1506
D-glucose monohydrate Carl Roth (Germany) 6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate Carl Roth (Germany) 6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing Fisher Scientific (Germany) 8700152
Dithiothreit Carl Roth (Germany) 6908
Ethanol Carl Roth (Germany) K928
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma-Aldrich (Germany) 47612
French pressure cell disruptor SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol Carl Roth (Germany) 3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) Sigma-Aldrich (Germany) G8877
Hydrochloric Acid Carl Roth (Germany) K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL GE Life Sciences (Germany) GE17-5248
Imidazole Carl Roth (Germany) 3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Carl Roth (Germany) 2316
Kanamycin Carl Roth (Germany) T832
L-Alanine Carl Roth (Germany) 3076.1
L-Arginine Carl Roth (Germany) 6908
L-Asparagine Carl Roth (Germany) HN23
L-Aspartic Acid Carl Roth (Germany) T202
L-Cysteine Carl Roth (Germany) T203
L-Glutamic Acid Carl Roth (Germany) 3774
L-Glutamine Carl Roth (Germany) 3772
L-Glycine Carl Roth (Germany) 3187
L-Histidine Carl Roth (Germany) 3852
L-Isoleucine Carl Roth (Germany) 3922
L-Leucine Carl Roth (Germany) 1699
L-Lysine Carl Roth (Germany) 4207
L-Methionine Carl Roth (Germany) 9359
L-Proline Carl Roth (Germany) 1713
L-Phenylalanine Carl Roth (Germany) 1709
L-Serine Carl Roth (Germany) 4682
L-Threonine Carl Roth (Germany) 1738
L-Tryptophane Carl Roth (Germany) 7700
L-Tyrosine Carl Roth (Germany) T207
MD100 dialysis units Scienova (Germany) 40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) Carl Roth (Germany) 6763
n-dodecylphosphocholine Antrace (USA) F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000 Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine Carl Roth (Germany) 6681
Peristaltic pump: ip-12 Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt Sigma Aldrich (Germany) 860077
Potassium dihydrogen phosphate Carl Roth (Germany) P018
Potassium acetate Carl Roth (Germany) 4986
Potassium chloride Carl Roth (Germany) 6781
Pyruvate Kinase Roche (Germany) 10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL Hidex (Finland)
SDS pellets Carl Roth (Germany) 8029
Sodium azide Sigma-Aldrich (Germany) K305
Sodium chloride Carl Roth (Germany) P029
Spectrophotometer Nanodrop Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli) Roche (Germany) 10109550001
Ultra sonificator Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) Sigma-Aldrich (Germany) U6625
Y-30 antifoam Sigma-Aldrich (Germany) A6457
Yeast extract Carl Roth (Germany) 2904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  2. Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
  3. Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  4. Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
  5. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  6. Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
  7. Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
  8. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  9. Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
  10. Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
  11. Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
  12. Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
  14. Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
  15. Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
  16. Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  17. Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
  18. Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
  19. Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
  20. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  21. Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
  22. Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
  23. Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
  24. Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
  25. Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
  26. Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
  27. Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
  28. Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
  29. Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
  30. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  31. Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
  32. Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
  33. Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
  34. Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).

Tags

Biyokimya Sayı 165 In vitro ekspresyon hücresiz L-CF deterjansız nanodiskler membran proteinleri G-protein kuplajlı reseptörler proteorhodopsin membran tasarımı ko-translasyonel membran yerleştirme
Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levin, R., Koeck, Z., Dötsch,… More

Levin, R., Koeck, Z., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs. J. Vis. Exp. (165), e61844, doi:10.3791/61844 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter