Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Samtranslationell insättning av membranproteiner i förformade nanodiscs

Published: November 19, 2020 doi: 10.3791/61844
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biophysical Chemistry, Goethe University Frankfurt

Summary

Samtranslationell insättning i förformade nanodiscs gör det möjligt att studera cellfria syntetiserade membranproteiner i definierade lipidmiljöer utan kontakt med tvättmedel. Detta protokoll beskriver beredningen av väsentliga systemkomponenter och de kritiska parametrarna för att förbättra uttryckseffektiviteten och provkvaliteten.

Abstract

Cellfria uttryckssystem möjliggör skräddarsydd design av reaktionsmiljöer för att stödja funktionell vikning av även komplexa proteiner såsom membranproteiner. De experimentella procedurerna för samtranslationell införande och vikning av membranproteiner i förformade och definierade membran som levereras som nanodiscs demonstreras. Protokollet är helt tvättmedelsfritt och kan generera milligram renade prover inom en dag. De resulterande membranprotein/ nanodisc-proverna kan användas för en mängd olika funktionella studier och strukturella applikationer såsom kristallisering, kärnmagnetisk resonans eller elektronmikroskopi. Beredningen av grundläggande nyckelkomponenter såsom cellfria lysater, nanodiscs med designade membran, kritiska stamlösningar samt montering av tvåfacks cellfria uttrycksreaktioner beskrivs. Eftersom vikningskraven för membranproteiner kan vara mycket olika, är ett huvudfokus i detta protokoll modulering av parametrar och reaktionssteg som är viktiga för provkvalitet, såsom kritiska grundläggande reaktionsföreningar, membransammansättning av nanodiscs, redox- och chaperonmiljö eller DNA-malldesign. Hela processen demonstreras med syntesen av proteorhodopsin och en G-proteinkopplad receptor.

Introduction

Membranproteiner (MPs) är utmanande mål i proteinproduktionsstudier på grund av deras olöslighet i vattenhaltiga miljöer. Konventionella MP-produktionsplattformar består av cellbaserade system som E. coli, jäst eller eukaryota celler. De syntetiserade rekombinanta mp:erna extraheras antingen från cellmembran eller viks om från inklusionskroppar1. Efter tvättmedelslöslighet kan parlamentsledamöter överföras till lämpliga membranmiljöer genom etablerade in vitro-beredningsprotokoll. Förutom vesiklar och liposomer har MP-rekonstituering till plana membran i form av nanodiscs2 eller salipro3-partiklar blivit rutintekniker på senare tid. Alla dessa strategier innebär emellertid tvättmedelskontakt med parlamentsledamöter som kan leda till destabilisering, dissociation av oligomerer och till och med förlust av proteinstruktur och aktivitet4. Screening för optimal tvättmedelsupplösning och beredningsförhållanden kan därför vara tråkigt och tidskrävande5.

Den öppna naturen hos cellfria (CF) system gör att uttrycksreaktionen kan levereras direkt med förformade membran med en definierad lipidkomposition. I detta lipidbaserade uttrycksläge (L-CF) har de syntetiserade mp:erna möjlighet att samtranslationellt infoga 6,7 i de tillhandahållna dubbelskikten(figur 1). Nanodiscs som består av ett membranställningsprotein (MSP) som omger en plan lipid-dubbelskiktsskiva8 verkar vara särskilt lämpliga för denna strategi 9,10. Nanodiscs kan rutinmässigt monteras in vitro med en mängd olika lipider, de är mycket stabila och lager kan koncentreras upp till 1 mM. MSP-uttryck i E. coli och dess rening är emellertid nödvändigt. Som en alternativ strategi kan MSP uttryckas tillsammans med mål-MP i CF-reaktioner som levereras med liposomer11,12,13. DNA-mallar för både MSP och MP läggs till i reaktionen och MP/nanodiscs kan bildas vid uttryck. Även om MSP-produktion undviks kräver samuttrycksstrategin noggrann finjustering av de slutliga DNA-mallkoncentrationerna och högre variationer i effektiviteten i provproduktionen kan förväntas.

Den samtranslationella insättningen av mps i membran av förformade nanodiscs är en icke-fysiologisk och fortfarande till stor del okänd mekanism oberoende av translogonmaskiner och signalsekvenser13,14,15,16. Viktiga determinanter för införingseffektiviteten är typen av membranprotein såväl som lipidkompositionen hos det tillhandahållna membranet, med en frekvent preferens för negativt laddade lipider15,17. Eftersom nanodiscmembranen är relativt begränsade i storlek frigörs en betydande mängd lipider vid MP-insättning18. Variation av nanodiscstorlek möjliggör insättning och inställning av högre oligomera MP-komplex15,18. Bland annat visades korrekt sammansättning av homooligomera komplex för jonkanalen KcsA, för jonpumpen proteorhodopsin (PR) och för multidrogtransportören EmrE15,18. Parlamentsledamöter kommer sannolikt att komma in i det symmetriska nanodiscmembranet från båda sidor med relativt lika frekvens. Det bör därför beaktas att olika monomerer eller oligomerer som sätts in i en nanodisc kan ha motsatta orienteringar. En bias i orientering kan dock orsakas av kooperativa insättningsmekanismer som rapporterats för bildandet av PR-hexamerer och KcsA-tetramerer18. En ytterligare bias i MP-orientering kan bero på orienteringsomkopplare av insatta parlamentsledamöter troligen vid kanten av nanodiscmembranen.

Produktionen av CF-lysater från E. coli-stammar är en pålitlig rutinteknik och kan utföras i nästan alla biokemiska laboratorier19,20. Det bör beaktas att förutom disulfidbrobildning saknas de flesta andra post-translationella modifieringar om en MP syntetiseras med användning av E. coli-lysater. Även om detta kan generera mer homogena urval för strukturstudier, kan det vara nödvändigt att utesluta potentiella effekter på funktionen hos enskilda mp-mål. Den effektiva produktionen av högkvalitativa prover av G-proteinkopplade receptorer (GPCR)14,21,22, eukaryota transportörer 23 eller stora heteromera enheter 24 i E. coli CF-lysater indikerar dock deras lämplighet för även komplexa mål. Preparativa skalmängder (≈ 1 mg/ml) av ett prov kan erhållas med CECF-konfigurationen (Continuous Exchange Cell-Free) med två fack, bestående av en reaktionsblandning (RM) och ett matningsblandningsfack (FM). FM-volymen överstiger RM-volymen 15 till 20 gånger och ger en reservoar av lågmolekylära energiföreningar och prekursorer19. Uttrycksreaktionen förlängs således i flera timmar och det slutliga utbytet av MP-målet ökas. RM- och FM-facken separeras av ett dialysmembran med en 10-14 kDa-avstängning. De två avdelningarna kräver en särskild utformning av CECF:s reaktionsbehållare (figur 1). Kommersiella dialyskassetter som RM-behållare i kombination med skräddarsydda plexiglasbehållare som håller FM är lämpliga exempel. MP-utbyten kan vidare manipuleras genom att ändra RM: FM-förhållandena eller genom att byta FM efter en viss inkubationsperiod.

Utbyte och kvalitet hos en MP kräver ofta intensiv optimering av reaktionsparametrar. En viktig fördel med CF-uttryck är möjligheten att modifiera och finjustera nästan vilken förening som helst enligt de individuella kraven för en MP. En enkel strategi är att först fokusera på att förbättra utbytet av en MP genom att upprätta ett grundläggande produktionsprotokoll och sedan optimera MP-kvaliteten genom att finjustera reaktions- och vikningsförhållandena. Frånvaron av fysiologiska processer i CF-lysater och deras minskade komplexitet resulterar i höga framgångsgrader för effektiv produktion av parlamentsledamöter25. Rutinmässiga överväganden för DNA-malldesign och optimering av Mg 2+ jonkoncentration är i de flesta fall tillräckliga för att uppnå tillfredsställande utbyten26. Beroende på uttrycksläge kan optimering av MP-kvalitet bli tidskrävande, eftersom en större mängd parametrar måste screenas14,17,22.

För att upprätta den beskrivna CF-uttrycksplattformen krävs protokoll för produktion av E. coli CF-lysat (i), T7-RNA-polymeras (ii), nanodiscs (iii) och de grundläggande CECF-reaktionsföreningarna (iv) (figur 1). E. coli K12-stammen A1927 - eller BL21-derivaten används ofta för framställning av effektiva S30 -lysater (centrifugering vid 30 000 x g). Förutom S30-lysater kan motsvarande lysater centrifugerade vid andra g-krafter (t.ex. S12) användas. Lysaterna skiljer sig åt i uttryckseffektivitet och i proteomkomplexitet. Proteomet hos S30-lysatet framställt av det beskrivna protokollet har studerats i detalj28. S30-proteomet innehåller fortfarande några kvarvarande yttre membranproteiner som kan ge bakgrundsproblem vid uttryck och analys av jonkanaler. För sådana mål rekommenderas användning av S80-S100-lysater. En värdefull modifiering under lysatberedningen är induktionen av SOS-svaret genom kombinerad värmechock och etanoltillförsel vid mitten av logtillväxtfasen av cellerna. De resulterande HS30-lysaterna är berikade i chaperoner och kan användas i blandningar med S30-lysater för förbättrad MP-vikning22. CF-uttryck i E. coli lysater drivs som en kopplad transkriptions-/translationsprocess med DNA-mallar som innehåller promotorer som styrs av T7-RNA-polymeras (T7RNAP). Enzymet kan produceras effektivt i BL21(DE3)-stjärnceller som bär pAR1219-plasmiden29.

Två kopior av MSP1E3D1 monteras i en nanodisc med en diameter på 10-12 nm, men protokollet som beskrivs nedan kan också fungera för andra MSP-derivat. Nanodiscs som är större än de som bildas med MSP1E3D1 tenderar dock att vara mindre stabila medan mindre nanodiscs som bildas med MSP-derivat som MSP1 kanske inte rymmer större parlamentsledamöter eller MP-komplex. MSP1E3D1 nanodiscs kan monteras in vitro med ett stort antal olika lipider eller lipidblandningar. Förformade nanodiscs är vanligtvis stabila i > 1 år vid -80 °C, medan stabiliteten kan variera för olika lipidkomponenter. För screening av lipideffekter på vikning och stabilitet hos en MP är det nödvändigt att förbereda en omfattande uppsättning nanodiscs monterade med en representativ mängd lipider / lipidblandningar. Följande lipider kan ge ett bra startval: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (POPG) och 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin (POPC).

Ett protokoll för beredning av en 3 ml CECF-reaktion beskrivs. Ytterligare upp- eller nedskalning i förhållandet 1: 1 är möjlig. För CECF-konfigurationen med två avdelningar måste ett RM som innehåller alla föreningar och ett FM som endast innehåller föreningar med låg molekylvikt framställas. Kommersiella 3 ml dialysanordningar med 10-14 kDa MWCO kan användas som RM-behållare, som sedan placeras i skräddarsydda plexiglasbehållare som håller FM (Figur 1D)30. Förhållandet mellan RM: FM är 1:20, så 60 ml FM måste förberedas för 3 ml RM. Kvalitet, koncentration eller typ av flera komponenter kan vara avgörande för det slutliga utbytet och / eller kvaliteten på den syntetiserade MP (tabell 1). DNA-mallar bör utarbetas enligt publicerade riktlinjer och kodonoptimering av målets läsram kan ytterligare förbättra produktutbytet26. För CECF-reaktion i preparativ skala beskrivs ett etablerat protokoll för produktion av PR. För att upprätta uttrycksprotokoll för nya parlamentsledamöter är det vanligtvis nödvändigt att utföra optimeringsskärmar av vissa föreningar (tabell 1) för att förbättra utbytet och kvaliteten. För Mg2+ joner finns det ett välfokuserat koncentrationsoptimum som ofta visar betydande variation för olika DNA-mallar. Andra CF-reaktionsföreningar såsom nya satser av T7RNAP- eller S30-lysater kan ytterligare förändra den optimala Mg2+ koncentrationen. Som ett exempel beskrivs en typisk Mg 2+ skärm inom intervallet 14-24 mM koncentration och i steg om 2 mM. Varje koncentration screenas i dubbletter och i CECF-reaktioner i analytisk skala. Som CECF-reaktionsbehållare används skräddarsydda Mini-CECF plexiglasbehållare30 som håller RM i kombination med vanliga 24-brunns mikroplattor som håller FM (figur 1B). Alternativt kan kommersiella dialyspatroner i kombination med 96-djupa brunnsmikroplattor eller andra kommersiella dialysatoranordningar i lämpliga inställningar användas (figur 1C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av S30-lysat

  1. Dag 1: Stryk ut celler från glycerollager på en LB-agarplatta och inkubera vid 37 °C över natten.
  2. Dag 2: Inokulera 200 ml LB-medium med cellerna från agarplattan och inkubera vid 37 °C i 12–14 timmar.
  3. Dag 3: Inokulera 10 liter sterilt YPTG-medium (10 g/L jästextrakt, 16 g/l trypton, 5 g/L NaCl, 19,8 g/L glukos, 4,4 mM KH 2 PO 4, 8 mMK 2HPO4) härdat till 37 °C i en 15 L omrörd tankreaktor med 100 ml av förodlingen (1:100). Odla vid 37 °C, 500 rpm och hög luftning (~ 3 luftvolymer per minut). För att förhindra överdriven skumning, tillsätt sterilt skumdämpande medel.
  4. Mät optisk densitet (OD) vid 600 nm i regelbundna tidsintervaller. Efter ca 2 h går kulturen in i loggfasen.
  5. Modifiering för HS30-lysat: När cellerna befinner sig i mitten av logfasen (OD600 ≈ 3,6-4,2) tillsätt 300 ml etanol till odlingsmediet och fortsätt odlingen vid 42 °C, 500 rpm och hög luftning (cirka 3 luftvolymer per minut) i ytterligare 45 minuter. Fortsätt sedan med kylning och skörd av cellkulturen enligt beskrivningen i steg 1.6. För produktion av standard S30-lysat, hoppa över detta steg och fortsätt med steg 1.6.
  6. När cellerna befinner sig i mitten av logfasen (OD600 ≈ 3,6-4,2), sval fermentor under 20 °C inom < 30 minuter. Den slutliga OD600 bör vara runt 4,5-5,5. Skörda celler vid 4 500 x g i 20 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten. Håll cellerna vid 4 °C i följande steg.
    OBS: Under kylning kan överdriven skumning uppstå. I detta fall, antingen tillsätt skumdämpande eller minska omrörningshastigheten och / eller minska luftströmmen i bioreaktorn.
  7. Suspendera cellerna helt i 300 ml S30-A-buffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KCl, 6 mM 2-merkaptoetanol) med hjälp av en spatel följt av pipettering av suspensionen upp och ner tills homogenitet. Centrifugera vid 8 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Upprepa detta steg två gånger.
    VARNING: 2-merkaptoetanol är giftigt. Undvik kontakt med hud eller luftvägar. Om möjligt, arbeta under en huva. Väg den tomma centrifugbägaren före det sista tvättsteget. Efter centrifugering, väg våtcellpelleten och fortsätt antingen med steg 1.8 eller förvara pelleten tills vidare användning.
    OBS: Vikten av våtcellpelleten är 5-7 g per 1 liter bioreaktorkultur. Vid denna tidpunkt kan protokollet pausas och pelleten kan frysas i flytande kväve och förvaras vid -80 °C i 4-8 veckor.
  8. Suspendera cellerna noggrant i 1,1 volymer (1 g = 1 ml) S30-B-buffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg(OAc)2, 60 mM KOAc, 1 mM DTT, 1 tablett cOmpleteproteashämmare). Fyll suspensionen i en förkyld fransk presstryckscell och stör cellerna vid 1 000 psig. Passera celler genom den franska pressen en gång.
  9. Centrifugera lysatet vid 30 000 x g i 30 minuter vid 4 °C. Överför supernatanten till ett nytt rör och upprepa centrifugeringssteget.
    OBS: Ett löst och slemmigt skikt kan finnas ovanpå pelleten efter den första centrifugeringen, som inte bör överföras med supernatanten.
  10. Applicera ett högt salt- och värmesteg för att avlägsna instabila lysatkomponenter och för att frigöra mRNA från ribosomer. Justera lysatet till 0,4 M NaCl och inkubera vid 42 °C i 45 minuter i ett vattenbad.
    OBS: Detta steg kommer att orsaka betydande fällningsbildning. Vänd eller invertera röret under inkubation då och då.
  11. Överför den grumliga suspensionen (vanligtvis 50-80 ml) till dialysrör med en 10-14 kDa-avstängning och dialysera mot 5 L S30-C-buffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 14 mM Mg (OAc) 2, 60 mM KOAc, 0,5 mM DTT). Byt ut S30-C-dialysbufferten efter 2-3 timmar och dialysera i ytterligare 12-14 timmar.
  12. Dag 4: Överför den dialyserade suspensionen till centrifugrör och centrifugera vid 30 000 x g i 30 minuter vid 4 °C. Överför supernatant (S30-lysat) till färska 50 ml rör och blanda försiktigt. Proteinkoncentrationen av lysatet bör vara cirka 30-40 mg / ml. Stötfrysning alikvoter (t.ex. 0,5 ml, 1 ml) i flytande kväve och förvaras vid -80 °C. Alikvoterna är stabila i > 1 år.

2. Uttryck och rening av T7-RNA-polymeras

  1. Dag 1: Inokulera 200 ml LB-medium innehållande 100 μg/ml ampicillin med nypläterade BL21(DE3) Star x pAR1219-celler och inkubera vid 37 °C och 180 rpm i 12-16 timmar.
  2. Dag 2: Inokulera 1 L fantastisk buljong (12 g / L trypton, 24 g / L jästextrakt, 4 ml / L glycerol) i en 2 L förbryllad kolv med 10 ml av förkulturen och inkubera vid 37 ° C och 180 rpm omrörning. Start-OD600 bör vara runt 0,1.
  3. När OD600 når 0,6-0,9, tillsätt IPTG till en slutlig koncentration på 1 mM för att inducera T7RNAP-uttryck och fortsätt odlingen i ytterligare 5 timmar.
  4. Skörda cellerna genom centrifugering vid 4 500 x g i 20 minuter vid 4 °C. Frys cellerna i flytande kväve och förvara vid -80 °C.
    OBS: Protokollet kan pausas här.
  5. Dag 3: Tillsätt 30 ml iskall suspensionsbuffert (30 mM Tris-HCl, pH 8,0 med en tablett cOmplete-proteashämmare) till den frysta cellpelleten och tina pelleten i ett vattenbad vid rumstemperatur. Suspendera sedan pelleten genom att pipettera upp och ner tills den är homogen.
  6. Utför cellstörning med hjälp av en fransk press som beskrivs i föregående avsnitt eller använd en ultraljudsbehandling enligt tillverkarens rekommendationer. Centrifugera därefter vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 °C och överför supernatanten till ett nytt rör.
  7. För att fälla ut genomiskt DNA, tillsätt streptomycinsulfat långsamt och under mild omrörning till supernatanten tills en slutlig koncentration på 3% (w / v) har uppnåtts. Inkubera vid 4 °C i 5–10 minuter under försiktig omrörning. Centrifugera vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 °C.
  8. Filtrera supernatanten med ett 0,45 μm filter och ladda den på en Q-Sepharose-kolonn med en kolonnvolym (CV) på 40 ml jämvikt med 2 CV jämviktsbuffert (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% glycerol och 10 mM 2-merkaptoetanol) med hjälp av en peristaltisk pump med en flödeshastighet på 4 ml/min. Anslut sedan kolonnen till en UV-detektor och fortsätt elueringen med jämviktsbuffert tills UV-signalen vid 280 nm når en stabil baslinje.
  9. Elute T7RNAP med en gradient från 50 mM till 500 mM NaCl per CV med en flödeshastighet på 3 ml/min. Samla in 1 ml fraktioner och förbered prover för SDS-PAGE-analys genom att blanda 10 μL av varje fraktion med 2 x SDS-provbuffert. Kör SDS-PAGE och färga gelén med Coomassie Blue R. T7RNAP bör visas som ett framträdande band vid cirka 90 kDa tillsammans med många ytterligare band av föroreningar.
  10. Poolfraktioner som innehåller T7RNAP och dialyserar med membran med en 12-14 kDa MWCO i 12-16 timmar i dialysbuffert (10 mM K 2 HPO 4/KH2PO4, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5% (w/v) glycerol).
  11. Dag 4: Samla upp T7RNAP-lösningen och koncentrera med filterenheter med 12-14 MWCO till en slutlig koncentration på 3-10 mg / ml. T7RNAP kan börja fällas ut under koncentrationen. Stoppa koncentrationen omedelbart så snart grumlighet i provet inträffar. Tillsätt glycerol till en slutlig koncentration på 50% (w/v) och blanda försiktigt. Stötfrysning 0,5-1 ml alikvoter och förvaras vid -80 °C. Fungerande T7RNAP-alikvoter kan förvaras vid -20 °C.
    OBS: Cirka 20-40 ml 5 mg / ml delvis renad T7RNAP med 20 000-40 000 enheter bör erhållas från en 1 L jäsning. För att testa den optimala mängden av varje T7RNAP-sats bör CF-uttrycksreaktioner av grönt fluorescerande protein (GFP) innehållande 0,02 mg/ml-0,1 mg/ml av det beredda T7RNAP-provet utföras.

3. Uttryck och rening av MSP1E3D1

  1. Dag 1: Transformera E. coli BL21 (DE3)-stjärnceller med pET28(a)-MSP1E3D1-vektorn31 med hjälp av standardprotokoll för värmechocktransformation eller elektroporering. Stryk ut eller plåttransformerade celler på LB-agar som innehåller 30 μg/ml kanamycin och inkubera vid 37 °C i 12–16 timmar.
  2. Dag 2: Inokulera 200 ml LB-medium kompletterat med 0,5% (w/v) glukos och 30 μg/ml kanamycin med en enda koloni plockad från agarplattan och inkubera vid 37 °C vid 180 rpm i 12-16 timmar.
  3. Dag 3: Inokulera 10 L LB-medium kompletterat med 0,5% (w / v) glukos och 30 μg / ml kanamycin med 100 ml av förkulturen i en bioreaktor med omrörd tank. Utför jäsning vid 37 °C, 500 rpm och luftning av cirka 3 bioreaktorvolymer per minut. Vid överdriven skumning, tillsätt skumdämpning.
    OBS: Förbryllade skakkolvar kan användas istället för en fermentor.
  4. Vid OD600 på 6,5–7,5 tillsätt IPTG till en slutlig koncentration på 1 mM och fortsätt inkubationen vid 37 °C i 1 timme. Skörda cellerna genom centrifugering vid 4 500 x g i 20 minuter vid 4 °C. Tvätta cellpellets med 200 ml 0,9 % (vikt/volym) NaCl och centrifugera igen vid 8 000 x g i 10 min vid 4 °C. Kassera supernatant och överför celler till 50 ml rör med en spatel. Den förväntade våtpelletsvikten är 8-12 g per liter bioreaktorkultur. Chockfrys cellpellets i flytande kväve och förvara vid -80 °C tills vidare användning.
    OBS: Protokollet kan pausas här.
  5. Dag 4: För rening, tina cellpellets i ett vattenbad vid RT. Suspendera cellerna i MSP-A-buffert (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w / v) Triton X-100, 1 tablett c0mplete proteashämmare cocktail per 50 ml cellsuspension) för att ge en 30-40% (w / v) cellsuspension.
  6. Störa celler genom ultraljudsbehandling eller med hjälp av en fransk press och centrifugera vid 30,000 x g för 30 min vid 4 °C. Överför supernatanten till ett nytt rör och filtrera genom ett 0,45 μm filter. Applicera filtratet på enNi2+ laddad nitrilotriättiksyrakolonn (CV > 15 ml) jämställd med 5 CV MSP-B-buffert (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100) med hjälp av en peristaltisk pump.
    OBS: För att underlätta filtrering kan supernatanten sonikeras i ytterligare en minut för att bryta ner stora DNA-fragment.
  7. Tvätta kolonnen med 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl, 50 mM cholsyra), 5 CV MSP-D (40 mM Tris-HCl, pH 8,9, 300 mM NaCl), 5 CV MSP-E (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl) och 5 CV MSP-F (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol).
    OBS: Cholsyra i MSP-C-bufferten är viktig för att ta bort lipider som är fästa vid MSP. Cholsyra är inte helt löslig vid låga pH-värden. pH-värdet måste därför justeras till 8,9 i MSP-C och MSP-D. Det är viktigt att tvätta kolonnen med MSP-D-buffert, eftersom ett lägre pH kan orsaka att kvarvarande cholsyra fälls ut och blockerar eller skadar kolonnen.
  8. Elute MSP med MSP-G (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol). Samla fraktioner av 1 ml och övervaka UV-absorptionen vid 280 nm. Samla och slå samman fraktionerna av elueringstoppen.
  9. Överför poolade MSP-fraktioner till 12-14 kDa MWCO-dialysmembranrör och dialysera mot 5 L MSP-H (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol) i 2-3 timmar vid 4 °C. Byt till färsk 5 L MSP-H-buffert och dialysera i ytterligare 12-16 timmar vid 4 °C.
  10. Dag 5: Överför MSP-lösningen till centrifugrören och centrifugera vid 18 000 x g i 30 minuter vid 4 °C för att avlägsna fällningen. Överför supernatant till ett nytt rör och koncentrera till 200-800 μM med hjälp av ultrafiltreringsanordningar med 12-14 kDa MWCO vid 4 °C. Mät koncentrationen med hjälp av en UV/VIS-mätanordning. Använd extinktionskoefficienten 27,31 M-1 cm-1 och molekylmassan 31,96 kDa för beräkning av koncentration.
    OBS: Uttryck i en bioreaktor ger vanligtvis 15-30 mg MSP1E3D1 per l kultur.
  11. Alikvoter med chockfrysning av den koncentrerade MSP-lösningen i flytande kväve och förvaras vid -80 °C.

4. Montering av MSP1E3D1 nanodiscs

  1. Dag 1: Bered 1-2 ml 50 mM lipidlager (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC eller POPC) i 100 mM natriumkolat. Förvaras vid -20 °C om det inte används samma dag.
    OBS: Lipidlösningen måste vara klar. Om lösningen inte är klar kan natriumkolatkoncentrationen ökas till 150 mM.
  2. Blanda MSP1E3D1-lösningen med lipidlösningen. Tillsätt dodecylfosfokolin (DPC) i en slutlig koncentration av 0,1 % (vikt/volym). Monteringsreaktioner kan justeras till slutliga volymer på 3 ml (tabell 2) eller 12 ml motsvarande typiska volymer dialyskassetter (10 kDa MWCO). Inkubera monteringsreaktioner i 1 timme vid 21 °C under försiktig omrörning.
    OBS: För varje lipid måste ett specifikt MSP1E3D1:lipid-förhållande användas för att säkerställa homogen nanodisc-beredning (tabell 2). För nya lipider eller lipidblandningar bör det optimala förhållandet bestämmas med ett pilotexperiment och storleksuteslutningskromatografianalys14.
  3. Förfukta membranet i en dialyskassett med skivbildningsbuffert (DF) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl). Överför monteringsblandningen till dialyskassetten med en spruta. Potentiella luftbubblor kan avlägsnas genom aspiration med sprutan.
  4. Dag 1-4: Dialysera mot 3 x 5 L DF-buffert i 10-20 timmar vid RT under omrörning med hjälp av en omrörningsstång. Överför sedan monteringsblandningen från dialyskassetten till centrifugalfilterenheter med 10 kDa MWCO jämvikt med DF-buffert. Koncentrera vid 4 000 x g vid 4 °C.
    OBS: En grumlig dialysblandning kan indikera ett felaktigt stökiometriskt förhållande mellan MSP: lipid. Fällningen skall avlägsnas vid 18 000 x g i 20 minuter vid 4 °C före provkoncentration. För att undvika nederbörd under provkoncentrationen, använd ultrafiltreringsenheter med en stor deadstop.
  5. Koncentrera de sammansatta nanodiscarna till en koncentration av minst 300 μM. Mät koncentrationen med hjälp av en UV/VIS-läsare. Tänk på att en nanodisc bildas av två MSP1E3D1-molekyler och därmed måste koncentrationen av MSP divideras med 2 för att bestämma rätt mängd nanodiscs.
    OBS: Den beskrivna installationen (tabell 2) ger 0,6-1 ml av en 300 μM nanodisc-lösning.
  6. Centrifugera det koncentrerade nanodiscpreparatet vid 18 000 x g i 20 minuter vid 4 °C för att avlägsna fällningen. Aspirera sedan supernatanten och chockfrys 50 μL alikvoter i flytande kväve och lagra vid -80 °C.
    OBS: Det är lämpligt att utvärdera framgången med nanodiscbildning med hjälp av storleksuteslutningskromatografi. Provet ska vara monodisperst och bör endast innehålla en låg mängd ballast. Aggregat indikerar att mängden lipid i installationen är för hög. Som referens kan renad MSP1E3D1 användas. Om nanodisc-preparatet visar en topp på höjden av referenstoppen MSP1E3D1 var det valda förhållandet mellan lipid och MSP1E3D1 för lågt.

5. Preparativ skala 3 ml CECF-reaktionsinställning

  1. Dag 1: Förbered alla nödvändiga lagerlösningar enligt listan (tabell 3). Lagren lagras vid -20 °C och tinas vid rumstemperatur. Se till att blanda alla lager noggrant efter upptining och före pipettering. Beräkna de nödvändiga volymerna för alla lager och gör ett pipetteringsschema (tabell 4). Föreningar med hög molekylvikt kommer endast att tillsättas i RM. För föreningar med låg molekylvikt kan en kombinerad 3 x mastermix för RM och FM framställas.
    OBS: De slutliga volymerna av sammansatta blandningar kan vara mindre än beräknat på grund av volymförlust under blandningen. Detta kan undvikas genom att lägga till en överskottsvolym på 2-5% för att kompensera för volymförlust.
  2. Balansera membranet i en 3 ml dialyskassett i 100 mM Tris-acetat, pH 8,0. Se till att ta bort överflödig buffert.
  3. Använd en spruta för att överföra RM till dialyskassetten. Ta bort överdriven luft i RM-facket genom aspiration med sprutan. Placera dialyskassetten i dialyskammaren.
  4. Fyll upp dialyskammaren med 60 ml FM. Placera locket på kammaren och dra åt skruvarna för att fixera det. Inkubera kammaren i 12–16 timmar vid 30 °C vid 200 rpm.
    OBS: Se till att kammaren förblir i upprätt läge under omrörning, annars kommer utbyte av lågmolekylära föreningar att hindras.
  5. Dag 2: Använd en spruta och sug RM från dialyskammaren. Överför RM till färska rör och centrifugera vid 16 000 x g vid 4 °C i 10 minuter för att avlägsna fällningen. Överför supernatanten till färska rör. Proteinet i supernatanten kan nu analyseras ytterligare.
    OBS: I vissa fall kommer en pellet att finnas efter centrifugering. Detta kan ge viktig information om lämpligheten hos de analyserade nanodiscsna eller reaktionsföreningarna för att hålla den syntetiserade MP löslig. Det är därför lämpligt att analysera mängden mål som potentiellt finns i fällningen genom att använda SDS-PAGE, Western Blot eller genom visuell utvärdering av pelletsstorleken.

6. Analysskala 60 μL CECF-reaktionsinställning för Mg2+ jonscreening

  1. Dag 1: Blanda alla komponenter i respektive 3x mastermix och fördela 60 μL till RM och 825 μL till FM. Fyll upp FM medH2Ooch blanda FM genom virvel. Överför FM till 3 brunnar på den 24 brunnens mikroplatta (tabell 5).
    OBS: Eftersom den anpassade Mini-CECF-behållaren kanske inte är tillgänglig beräknas volymerna i tabell 5 för en reaktion som utförs i dialyspatroner (10-14 kDa MWCO, RM: 100 μL) med en FM-volym på 1,7 ml i 96 djupbrunnsplattor (2 ml) (figur 1).
  2. Skär regenererade cellulosadialysrör med en 10-14 kDa MWCO i cirka 25 x 20 mm stora bitar och förvara iH2Omed 0,05% (w / v) natriumazid.
    VARNING: Natriumazid är mycket giftigt. Undvik kontakt med hud eller slemhinna. Använd inte metallbehållare eftersom natriumazid kan reagera med metaller för att bilda explosiva metallazider.
  3. Innan Mini-CECF-behållarmontering, ta bort överdrivenH2Ofrån dialysmembranen med en vävnad. Placera ett membranstycke på varje behållare och fixera membranen med en polytetrafluoretylenring.
  4. Överför Mini-CECF-behållaren till brunnarna på en 24-brunnsplatta med 825 μL FM. Undvik luftbubblor under dialysmembranet i Mini-CECF-behållaren.
  5. Tillsätt högmolekylära komponenter till RM enligt beskrivningen (tabell 5) och blanda genom pipettering upp och ner. Tillsätt 60 μl till reaktionsbehållaren. Undvik luftbubblor under överföring av den viskösa lösningen.
  6. Skär 2 8 x 10 cm ark av en tätande termoplastfilm och linda dem runt 24-brunnsplattan med reaktionsbehållarna inuti. Detta kommer att minska avdunstningen från reaktionsblandningen. Placera nu locket på cellodlingsplattan på plattan och fixa det med tejp. Inkubera plattan vid 30 °C och 200 rpm omrörning i 12-16 timmar.
  7. Dag 2: Skörda reaktionsblandningen genom att tränga igenom dialysmembranet med pipettspetsen vid Mini-CECF-behållaren och suga RM. Överför RM till färska rör och centrifugera vid 16 000 x g vid 4 °C i 10 minuter för att avlägsna utfällningar. Överför supernatanten till färska rör. Proteinet i supernatanten kan nu analyseras ytterligare.
    OBS: I vissa fall kommer en pellet att finnas efter centrifugering. Detta kan ge viktig information om lämpligheten hos de analyserade nanodiscsna eller andra reaktionsföreningar för att hålla den syntetiserade MP löslig. Det är därför lämpligt att analysera mängden mål som potentiellt finns i fällningen av SDS-PAGE, Western Blot eller visuell utvärdering av pelletsstorleken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Effekten av finjusterande reaktionsföreningar på det slutliga utbytet eller kvaliteten hos syntetiserade MPs exemplifieras. Ett vanligt rutintillvägagångssätt är att justera den optimala Mg2+ -koncentrationen i CF-reaktioner genom uttryck av grönt fluorescerande protein (GFP) som en bekväm övervakning av systemets effektivitet. Som ett exempel syntetiserades GFP från en pET-21a(+)-vektor vid Mg 2+ koncentrationer mellan 14 och24 mM (figur 2). SDS-PAGE-analys identifierade den optimala Mg 2+ koncentrationen vid 20 mM (figur 2A), vilket är i god överensstämmelse med komplementära fluorescensmätningar (excitation vid 485 nm, utsläppsmätning vid 535 nm) av CF-reaktionssupernatanten (figur 2B). För CF-uttrycket av bakteriell PR uttryckt från pIVEX 2.3-vektorn och av kalkon β 1 adrenerg receptor (Tβ1AR) uttryckt från pET-21a(+)-vektorn, identifierades den optimala Mg 2+-koncentrationen vid 20-22 mM.

Som ett ytterligare exempel visas kvalitetsförfining av syntetiserade parlamentsledamöter med den beskrivna strategin. Avstämbara parametrar för samtranslationell insättning av mps i förformade nanodiscs är (i) lipidkompositionen i nanodiscmembranet och (ii) den slutliga nanodisckoncentrationen i reaktionen. Det är välkänt att den hydrofoba miljön är en viktig parameter för korrekt vikning, oligomer montering och stabilitet hos parlamentsledamöter. Eftersom lipidsammansättning i nanodiscs kan moduleras, möjliggör det beskrivna tillvägagångssättet en enkel systematisk screening av lipideffekter på struktur och funktion hos en MP. I inledande experiment, Det rekommenderas att screena lipider med fosfatidylkolin (PC) och fosfatidylglycerol (PG) huvudgrupper och att testa olika kedjelängder och mättnader. Effekten av membrankomposition och nanodisckoncentration på solubiliseringseffektiviteten och kvaliteten hos två olika parlamentsledamöter visas. PR är en ljusaktiverad protonpump och en mycket stabil och mycket syntetiserad MP som når slutliga koncentrationer på > 100 μM i RM. Därför rekommenderas det att använda den som en positiv kontroll för att säkerställa korrekt reaktionsinställning eftersom PR-koncentrationen lätt kan bedömas genom mätning av absorption vid 530 nm i RM-supernatanten. Däremot är Tβ1AR ett exempel på den stora familjen eukaryota G-proteinkopplade receptorer (GPCR) och är en komplex och instabil MP. För bekväm övervakning syntetiserades en Tβ1AR-GFP-fusionskonstruktion och den totala koncentrationen av nanodisc solubiliserad receptor i CF-reaktionerna bestämdes via GFP-fluorescens (figur 3A). Fraktionen av funktionellt vikta och ligandbindande aktiva receptorn bestämdes ytterligare med hjälp av en filterbindningsanalys och den märkta liganden [3H] -dihydroalprenolol (figur 3B). Filterbindningsanalysen utfördes som beskrivits tidigare14. I korthet bestämdes Tβ1AR-GFP-koncentrationen i RM via dess fluorescens. GPCR inkuberades med den radioaktivt märkta liganden i 1 timme vid 20 °C, applicerades på ett filter och obunden ligand tvättades bort. För bestämning av ospecifik [3H] -dihydroalprenololbindning mättades receptorn med omärkt alprenolol i en kontrollreaktion. Räkningarna av den radioaktiva liganden i filtren mättes i en scintillationsräknare och mängden bunden ligand bestämdes via dess specifika etikettaktivitet. Procent GPCR-bindningsaktivitet beräknades sedan utifrån mängden bunden ligand, Tβ1AR-GFP-koncentrationen och analysvolymen. Den övergripande syntesen och nanodisc-solubiliseringen av Tβ1AR-GFP är liknande med alla analyserade membrankompositioner och inom intervallet 8-13 μM (figur 3A). Däremot är en mycket högre variation detekterbar i kvaliteten på den syntetiserade GPCR. Lägsta aktivitet med mindre än 10% aktiv fraktion erhålls med lipiderna DMPC och POPC. Med DOPG och POPG kunde den aktiva fraktionen av Tβ1AR-GFP ökas till cirka 30% (figur 3B). Resultaten indikerar att laddning av lipidhuvudgruppen samt flexibilitet i fettsyrakedjan är viktiga modulatorer för vikning och aktivitet av denna GPCR.

Förutom nanodisc-sammansättning kan deras slutliga koncentration i CF-reaktionen vara en viktig faktor för MP-kvalitet. När en lämplig membransammansättning av en nanodisc har identifierats bör dess koncentration under MP-syntesen screenas. Det är uppenbart att nanodisckoncentrationen måste justeras efter uttryckseffektiviteten hos en MP. CF-syntes av Tβ1AR-GFP-receptor och PR resulterar i slutliga koncentrationer på cirka 10 μM respektive 100 μM i RM. Om nanodisckoncentrationen screenas inom ett intervall av 3,75-60 μM, erhålls en fullständig solubilisering av GPCR vid cirka 30 μM nanodiscs, vilket ger ett förhållande mellan Tβ 1 AR: nanodisc på1: 3 (Figur 4A). Däremot uppnås redan fullständig solubilisering av PR med cirka 10 μM nanodiscs och ger ett PR: nanodisc-förhållande på 10: 1 (figur 4B). Ett överskott av nanodiscs är därför nödvändigt för att uppnå nästan fullständig solubilisering av Tβ1AR-GFP, medan ett inverterat förhållande i fallet med PR indikerar införandet av flera PR-kopior i en nanodisc. Efterföljande studier av renade PR/nanodisc-komplex med inhemsk masspektrometri bekräftade denna observation och fann en förekomst av högre oligomera former av PR om de syntetiserades vid lägre nanodisckoncentrationer15,18. Titreringen av CF-syntetiserade mps med nanodiscs kan därför användas som ett verktyg för att utlösa oligomera sammansättningar och för att studera deras effekter på MP-funktionen.

Figure 1
Figur 1: CECF:s uttrycksstrategi för införande av membranproteiner i nanodiscs. (A) Grundläggande arbetsflöde som illustrerar de viktigaste stegen i processen. (B) Anpassade reaktionskärl i analytisk skala för CECF-uttryck. (C) Kommersiellt tillgängliga dialyspatroner för CECF-installation i analytisk skala. (D) Preparativ skala (3 ml RM) inklusive en 3 ml dialyskassett och en anpassad plexiglas FM-behållare. (E) Samtranslationell insättning av parlamentsledamöter i förformade nanodiscs och lipidscreening i CECF-konfigurationen. RM innehåller det nödvändiga transkriptions- / översättningsmaskineriet och nanodiscs medan föreningar med låg molekylvikt finns i båda facken. Biokemiska och strukturella tillämpningar av de producerade MP/nanodisc-proverna illustreras ytterligare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Effekt av olika Mg2+ koncentrationer på CF GFP-syntes. GFP syntetiserades i CF-reaktioner med Mg 2+ koncentrationer inom ett intervall av 14-24 mM. (A) SDS-PAGE-analys visar det starkaste bandet av GFP vid 20 mM Mg2+. M: Markör. B) GFP-fluorescens efter CF-uttryck med olika koncentrationer av Mg2+ . Den maximala GFP-fluorescensen vid 20 mM Mg2+ motsvarar 4,6 mg/ml. Felstaplar representerar standardavvikelsen för ett duplikatmått. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Effekt av nanodisc membrankomposition på solubilisering och kvalitet av en CF syntetiserad GPCR. Utbyte och aktivitet av Tβ1AR-GFP syntetiserad i närvaro av 30 μM nanodiscs innehållande olika membrankompositioner. Det totala syntetiserade proteinet ( A ) och fraktionen av ligandbindande aktiv receptor (B) ges i μM. Total koncentration bestämdes via fluorescensmätning av GFP-fusionen. Aktiviteten mättes via filterbindningsanalys med den radiomärkta liganden [3H]-dihydroalprenolol. Felstaplar representerar standardavvikelser för oberoende tredubblar. Data hämtade från tidigare publicerat manuskript14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Solubiliseringsskärm av CF-syntetiserade parlamentsledamöter med ökande nanodisckoncentrationer. MPs syntetiserades i närvaro av levererade nanodiscs inom ett intervall av 3,75-60 μM. (A) Uttryck av Tβ1AR-GFP med nanodiscs (DMPC) i CF-reaktionen. Den totala koncentrationen bestämdes genom fluorescensmätning av GFP-fusionen. Data hämtade från tidigare publicerat manuskript14. Affinitetstaggrenade prover analyserades av SDS-PAGE och Coomassie-Blue-färgning visar två framträdande band som motsvarar Tβ1AR-GFP vid cirka 50 kDa och MSP1E3D1 över 25 kDa (B) Uttryck av PR med nanodiscs (DOPG) i CF-reaktionen. Den totala koncentrationen av PR bestämdes via absorptionsmätning vid 530 nm. Uppgifter hämtade från tidigare publicerat manuskript10,18. Bilderna visar den röda färgen på de slutliga reaktionerna på grund av närvaron av vikta PR. Piktogrammen illustrerar den modulerade PR-sammansättningen mot lägre oligomera konformationer vid ökade nanodisckoncentrationer, vilket avslöjas av efterföljande inhemsk masspektrometri18. Affinitetstaggrenade prover analyserades av SDS-PAGE och Coomassie-Blue färgning visar två framstående band som motsvarar PR vid cirka 20 kDa och MSP1E3D1 över 25 kDa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Förening Slutligt koncentrationsintervall Effekt på MP-exempel
Mg2+ 10 - 30 mM avkastning
DTT 1 - 20 mM disulfidbrobildning, vikning
20 Aminosyrablandning1 0,2 – 2 mM avkastning
GSSG : GSH2 (1–10 μM): (1–10 μM) disulfidbrobildning, vikning
Nanodiscs 10 - 100 μM solubilisering, oligomer montering, vikning
Lipid typ solubilisering, oligomer montering, vikning
S30 : HS30 lysat3 (50-100 %) : (50-100 %) vikning
S12 - S100 20 – 50 % avkastning, MP-bakgrund i kanalanalyser
DNA-mall 0,5 – 30 ng/μL RM utbyte, oligomer montering, vikning
Design av DNA-mall avkastning
1, blandningen kan varieras beroende på den individuella sammansättningen av en MP för att t.ex. förbättra utbytet eller optimera NMR-märkningsscheman.
2, GSH bör alltid tillagas nyligen.
3, bör den totala koncentrationen av CF-lysat i RM vara minst 35 % med en S30-halt på minst 50 % för att säkerställa höga uttrycksnivåer.

Tabell 1: Kritiska screeningkomponenter för CF-reaktioner.

MSP1E3D1 Lipid DPC
Förhållande (410 μM lager) (50 000 μM lager) (10 % (vikt/volym) lager)
Lipid Lipid : MSP V(MSP) c(MSPslutlig) V(lipid) c(lipidfinal) V(DPC) c(DPCslutlig) DF-buffert
[μL] [μM] [μL] [μM] [μL] [%] [μL]
Dmpc 115 : 1 1500.0 205.0 1415.0 23 575 30.0 0.1 55.5
DOPC 80 :1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPC 85 : 1 1500.0 205.0 1046.0 17 425 30.0 0.1 425.0
Dmpg 110 : 1 1500.0 205.0 1353.0 22 550 30.0 0.1 117.0
Dopg 80 : 1 1500.0 205.0 984.0 16 400 30.0 0.1 486.0
POPG 90 : 1 1500.0 205.0 1107.0 18 450 30.0 0.1 363.0

Tabell 2: Lipid till MSP1E3D1-förhållanden för 3 ml in vitro-monteringsinställningar.

Förening Koncentration Förberedelse
DNA-plasmidmall1 > 400 μg/ml i 10 mM Tris-HCl pH 8,0 Beredning av Midi/Maxi-kit (t.ex. Qiagen)2
Blandning av 20 aminosyror3 25 mM vardera i H2O fällning kvarstår4
Blandning av 4 NTP (75 x) c(CTP) 240 mM, c(ATP) 360 mM, c(UTP) 240 mM, c(GTP) 240 mM
iH2O. Justera pH till 7-8 med KOH		 En liten fällning återstår4
Acetylfosfat 1 M iH2O, justera pH 7-8 med KOH fällning kvarstår4
Fosfo(enol)pyruvsyra (K+) 1 M iH2O, justera pH 7-8 med KOH
Folinsyra 10 mg/ml iH2O fällning kvarstår4
DTT 0,5 m i H2O
C0mplete proteashämmare cocktail 1 tablett per 1 ml iH2O
Trisaacetat, pH 8,0 2,4 m iH2O
Mg(OAc)2 1 m i H2O
KOAc 10 m i H2O
Ribolock RNas-hämmare 40 U/ml Thermo Fisher Vetenskaplig
tRNA (E. coli) 40 mg/ml iH2O Roche (Tyskland)
T7RNAP 3-7 mg/ml5 se protokoll avsnitt 2
Pyruvatkinas 10 mg/ml Roche (Tyskland)
Nanodiscs (DMPG) 0,2-1,0 mM6 på 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 100 mM NaCl Se protokollavsnitt 3 och 4
1, PCR-mall kan användas vid liknande koncentrationer.
2, kvaliteten på "Mini" -kit beredd DNA är inte tillfredsställande.
3, cystein tenderar att vara instabil och kan tillsättas separat.
4, lösningen är övermättad, noggrann blandning omedelbart innan alikvoter tas bort är nödvändig.
5, för varje ny T7RNAP-batch rekommenderas en initial skärm för att identifiera den bästa slutliga koncentrationen.
6, löslighet av nanodiscs kan bero på deras lipidkomposition.

Tabell 3: Beredning av CF-stamlösningar.

Förening
För Mastermix (3,0 x) c(slutlig) V [μL]
Blandning av 20 aminosyror 1 mM 2520.0
Blandning av 4 NTP (75 x) 1x 840.0
Acetylfosfat 20 mM 1260.0
Fosfo(enol)
pyruvsyra		 20 mM 1260.0
Folinsyra 0,1 mg/ml 630.0
Trisaacetat, pH 8,0 100 mM 2625.0
c0mplete 50 x 1x 1260.0
Mg(OAc)2 19,8 (= 20)1 mM 1260.0
KOAc 180 (= 270)2 mM 1140.0
DTT 2 mM 252.0
H2O 7953.0
Total 21 000
För RM c(slutlig) V [μL]
3x Mastermix 1 x 1000.0
RNas-hämmare 0,3 U/μL 22.5
tRNA (E. coli) 0,5 mg/ml 37.5
Nanodiscs (DMPG)3 10 μM 75.0
DNA-mall4 0,015 ng/μL 112.5
Pyruvatkinas 0,04 mg/ml 12.0
T7RNAP5 0,03 mg/ml 15.0
S30 lysat 0.35 % 1050.0
All-trans retinal6 0,6 miljoner 9.0
H2O - 666.5
Total 3000.0
För FM c(slutlig) V [μL]
Mastermix (3 x) 1 x 20 000
H2O - 40 000
Total 60 000
1, 0,2 mM Mg2+ kommer från S30-lysatet.
2, 90 mM K+ kommer från acetylfosfat och fosfo(enol)pyruvsyra.
3, beräknad stamlösning är 400 μM.
4, beräknad stamlösning är 400 μg/ml.
5, beräknad stamlösning är 6 mg/ml.
6, specifik kofaktor för PR, lagerlösning är 200 mM i DMSO.

Tabell 4: Rörsystem för en CECF-reaktion med 3 ml RM och 60 ml FM

Förening
För Mastermix (3,0 x) c(slutlig) V [μL]
Blandning av 20 aminosyror 1 mM 864.0
Blandning av 4 NTP 1x 288.0
Acetylfosfat 20 mM 432.0
Fosfo(enol)pyruvsyra 20 mM 432.0
Folinsyra 0,1 mg/ml 216.0
Trisaacetat, pH 8,0 100 mM 900.0
c0mplete 1x 432.0
Mg(OAc)2 13,8 (= 14) mM1 298.0
KOAc 180 (= 270) mM2 389.0
DTT 2 mM 86.4
H2O - 2862.6
Totalt [μL]1 - 7200.0
Mg2+ koncentration
14 mM 16 mM 18 mM 20 mM 22 mM 24 mM
För RM c(slutlig) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0 67.0
0,1 m mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0
RNas-hämmare 0,3 U/μL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
tRNA (E. coli) 0,5 mg/ml 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
DNA-mall3 0,015 ng/μL 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5
Pyruvatkinas 0,04 mg/ml 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
T7RNAP4 0,03 mg/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
S30 lysat 35 % 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0 70.0
H2O - 49.7 45.7 41.7 37.7 33.7 29.7
Totalt [μL]5 - 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0 200.0
Mg2+ koncentration
14 mM 16 mM 18 mM 20 mM 22 mM 24 mM
För RM c(slutlig) V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL] V [μL]
3x Mastermix 1 x 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0 1133.0
0,1 m mg(OAc)2 14-24 mM 0.0 68.0 136.0 204.0 272.0 340.0
H2O - 2267.0 2199.0 2131.0 2064.0 1995.0 1927.0
Totalt [μL]5 - 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0 3400.0
1, 0,2 mM Mg2+ kommer från S30-lysatet. Mastermixen justeras till den lägsta screeningkoncentrationen.
2, 90 mM K+ kommer från acetlyfosfat och fosfo(enol)pyruvsyra.
3, beräknad stamlösning är 400 μg/ml.
4, beräknad stamlösning är 6 mg/ml.
5, reaktioner utförs i dubbletter.

Tabell 5: Rörsystem för koncentrationsskärmen Mg2+ med 100 μL RM och 1,7 ml FM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Upplägget och strategierna för att optimera CF-uttrycket och samtranslationell insättning av funktionella MPs i nanodiscs beskrivs. Den utrustning som krävs består av en bioreaktor, en fransk pressanordning eller liknande, en UV/VIS- och fluorescensläsare, CF-reaktionskärl som är lämpliga för en konfiguration med två fack och en temperaturkontrollerad inkubator. Ytterligare standardutrustning är centrifuger för skörd av E. coli-celler samt bordscentrifuger som når minst 30 000 x g för beredning av S30-lysater. Om S80-S100 lysater bör beredas är ultracentrifuger nödvändiga. Den listade utrustningen är regelbundet tillgänglig i biokemiska laboratorier och inga större initiala investeringar krävs för att komma igång med CF-uttryck. Dessutom är fermentering och hantering av E. coli-celler för CF-lysat- och T7RNAP-preparat vanliga och robusta tekniker. De dyraste föreningarna är CF-lysat, T7RNAP och nanodiscs. De kan utarbetas genom tillförlitliga och effektiva protokoll och alikvoterna är stabila i flera år vid -80 °C. Protokollen kräver tre dagar vardera för CF-lysat- och T7RNAP-beredning och ungefär en vecka för uttryck och rening av MSP och förformning av nanodiscs. Målmall-DNA kan levereras med pET-21, pIVEX eller liknande vektorsystem. För installation och optimering av CF-uttryckssystem kan produktion av GFP-varianter som skiftad GFP (GFP+) eller superfolderGFP användas som monitor20,32. För MP-produktionsförhållanden är uttrycket av PR ett bra modellsystem eller positiv kontroll eftersom det viks under många olika förhållanden och lätt kan övervakas med absorbans vid 530 nm10,15,18. För att upprätta ett effektivt CF-uttrycksprotokoll för en ny MP rekommenderas kodonoptimering av målläsningsramen och användning av fusioner med C-terminalt ansluten GFP25,26. Ytterligare nödvändiga material inkluderar kemikalier och enzymer som alla är kommersiellt tillgängliga. Dessa komponenter måste erhållas i hög kvalitet och en övergripande kostnadsberäkning för den beskrivna CF-reaktionen med 3 ml RM och 60 ml FM skulle uppgå till cirka 150-200 €. En viktig tillämpning för CF-uttryckssystem är därför produktion av proteiner som är svåra att erhålla i klassiska cellbaserade uttryckssystem som många MP eller toxiner. CF-system är dessutom kärnplattformar inom syntetisk biologi och ständigt växande användningsområden gör dem alltmer oumbärliga som ett verktyg inom molekylär forskning. Rutinmässiga tillämpningar är bland annat märkning av proteiner, processer med hög genomströmning eller syntetisk celldesign.

Den demonstrerade strategin möjliggör tvättmedelsfri produktion av rena mps som redan är införda i önskade lipidmiljöer av mycket lösliga nanodiscs. När CF-uttrycksprotokollet för en MP har upprättats och optimerats är produktionen mycket snabb och rena prover kan erhållas på mindre än 24 timmar även i preparativ skala. MP/nanodisc-komplexen renas direkt från CF-reaktionen via streptavidin II eller polyhistidintaggar fästa vid MP. Processen möjliggör parallell funktionell och strukturell analys av identiska MP-prover med en rad olika tekniker33. Strategins snabbhet och effektivitet är därför konkurrenskraftig jämfört med konventionella metoder som använder cellbaserade uttryckssystem och extraktion av rengöringsmedel från cellmembran följt av rutinmässig in vitro-rekonstituering 5,34. Den öppna tillgängligheten för CF-reaktioner underlättar ytterligare många unika mekanistiska studier av MP-vikning och membraninsättning 15,16,18, MP-komplex montering15,18,24 eller funktionell reglering 23.

En viktig skillnad i CF-uttryck jämfört med cellbaserat uttryck är frånvaron av kvalitetskontrollsystem för den syntetiserade proteinprodukten. Varje översatt polypeptid oberoende av dess funktionella vikning kommer att hamna i det slutliga produktprovet. Dessutom är insättningsprocessen i nanodiscmembran artificiell och translogonoberoende och kan resultera antingen i ofullständig integration eller kanske inte fungerar alls med ett antal MP-mål. Den slutligen solubiliserade produktfraktionen i en CF-reaktion kan således vara ganska heterogen innehållande helt införd men också endast delvis integrerad eller membranassocierad MPs. Följaktligen kan endast en liten del av ett renat prov av MP/nanodisc-komplex vikas funktionellt. Modifiering av membransammansättning och noggrann finjustering av MP till nanodisc-förhållanden genom att modulera koncentrationerna av nanodiscs och DNA-mallar är lämpliga verktyg för optimering. Icke desto mindre är nedströms kvalitetskontrollmetoder som storleksuteslutningsprofilering och målspecifika kvantitativa funktionella analyser alltid nödvändiga för optimering av CF-uttrycksprotokoll. Tillgängligheten av sådana analyser kan därför begränsa applikationer, särskilt i projekt inklusive parlamentsledamöter som kräver liposommiljöer för funktion som transportörer, kanaler eller pumpar. Dessutom kan storleksbegränsningarna för nanodiscs begränsa införandet av stora MP-enheter.

I de dokumenterade exemplen ligger variationen i den funktionellt vikta fraktionen av GPCR Tβ1AR-GFP inom intervallet några procent, upp till cirka 30%. Funktionell vikning kräver noggrann justering av ett antal parametrar14 och en liknande individuell och tråkig optimeringsprocess kan vara nödvändig för andra GPCR också22. Det slutligen uppnådda utbytet av funktionellt vikta GPCR är dock konkurrenskraftigt med andra produktionssystem och möjliggör installation av > 1 000 radioanalyser för ligandbindningsstudier från en enda 60 μl-reaktion i en mini-CECF-reaktor i analytisk skala. Det är värt att nämna att ligandbindningsstudier av GPCR-GFP-fusionskonstruktioner inte kräver några reningssteg. Vid behov kan rening uppnås genom att dra nytta av affinitetstaggar som är fästa vid den syntetiserade MP, såsom His-taggar eller Strep-tag II. RM späds sedan ut i önskad buffert och laddas på motsvarande affinitetskromatografikolonn som har förutjämnats i enlighet därmed. Den strukturella utvärderingen av PR och andra CF-syntetiserade parlamentsledamöter genom NMR-spektroskopi eller kristallisering har redan bidragit till att etablera CF-uttryckssystem som kärnplattformar i MP-forskning. Den beskrivna strategin för produktion av MP/nanodisc-komplex kan bli särskilt intressant för framtida strukturstudier med elektronmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) bidrag BE1911/8-1, LOEWE-projektet GLUE och samarbetsforskningscentret Transport and Communication across Membranes (SFB807) för ekonomiskt stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840445P
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850345C
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850375C
1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840475C
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids (USA) 850457C
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG) Avanti Polar Lipids (USA) 840034C
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris) Carl Roth (Germany) 4855
2-Mercaptoethanol Carl Roth (Germany) 4227
2-Propanol Carl Roth (Germany) 9781
[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride American Radiolabeled Chemicals (USA) ART0134
Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP) Merck (Germany) 1409
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) Sigma Aldrich (Germany) A9251
Alprenolol hydrochloride Merck (Germany) A0360000
Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose® Sigma-Aldrich (Germany) Q1126
Autoclave Type GE 446EC-1 Gettinge (Germany)
Bioreactor Type 884 124/1 B.Braun (Germany)
Centrifuge Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)
Cholic acid Carl Roth (Germany) 8137
Coomassie Brilliant Blue R250 Carl Roth (Germany) 3862
Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks Schott Duran (Germany)
Cytidine 5'-triphosphate disodium salt Sigma-Aldrich (Germany) C1506
D-glucose monohydrate Carl Roth (Germany) 6780
Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate Carl Roth (Germany) 6878
Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing Fisher Scientific (Germany) 8700152
Dithiothreit Carl Roth (Germany) 6908
Ethanol Carl Roth (Germany) K928
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma-Aldrich (Germany) 47612
French pressure cell disruptor SLM; Amico Instruments (USA)
Glycerol Carl Roth (Germany) 3783
Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP) Sigma-Aldrich (Germany) G8877
Hydrochloric Acid Carl Roth (Germany) K025
IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL GE Life Sciences (Germany) GE17-5248
Imidazole Carl Roth (Germany) 3899
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Carl Roth (Germany) 2316
Kanamycin Carl Roth (Germany) T832
L-Alanine Carl Roth (Germany) 3076.1
L-Arginine Carl Roth (Germany) 6908
L-Asparagine Carl Roth (Germany) HN23
L-Aspartic Acid Carl Roth (Germany) T202
L-Cysteine Carl Roth (Germany) T203
L-Glutamic Acid Carl Roth (Germany) 3774
L-Glutamine Carl Roth (Germany) 3772
L-Glycine Carl Roth (Germany) 3187
L-Histidine Carl Roth (Germany) 3852
L-Isoleucine Carl Roth (Germany) 3922
L-Leucine Carl Roth (Germany) 1699
L-Lysine Carl Roth (Germany) 4207
L-Methionine Carl Roth (Germany) 9359
L-Proline Carl Roth (Germany) 1713
L-Phenylalanine Carl Roth (Germany) 1709
L-Serine Carl Roth (Germany) 4682
L-Threonine Carl Roth (Germany) 1738
L-Tryptophane Carl Roth (Germany) 7700
L-Tyrosine Carl Roth (Germany) T207
MD100 dialysis units Scienova (Germany) 40077
N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid (HEPES) Carl Roth (Germany) 6763
n-dodecylphosphocholine Antrace (USA) F308S
PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell Biorad (Germany)
PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems Biorad (Germany)
PAGE gel power supply: Power Pac 3000 Biorad (Germany)
Tryptone/peptone from caseine Carl Roth (Germany) 6681
Peristaltic pump: ip-12 Ismatec (Germany)
Phosphoenol pyruvate monopotassium salt Sigma Aldrich (Germany) 860077
Potassium dihydrogen phosphate Carl Roth (Germany) P018
Potassium acetate Carl Roth (Germany) 4986
Potassium chloride Carl Roth (Germany) 6781
Pyruvate Kinase Roche (Germany) 10109045001
Scintillation counter: Hidex 300 SL Hidex (Finland)
SDS pellets Carl Roth (Germany) 8029
Sodium azide Sigma-Aldrich (Germany) K305
Sodium chloride Carl Roth (Germany) P029
Spectrophotometer Nanodrop Peqlab (Germany)
Spectrophotometer/fluorescence reader Spark® Tecan (Switzerland)
tRNA (E. coli) Roche (Germany) 10109550001
Ultra sonificator Labsonic U, B. Braun (Germany)
Uridine 5’-triphosphate tri-sodium salt (UTP) Sigma-Aldrich (Germany) U6625
Y-30 antifoam Sigma-Aldrich (Germany) A6457
Yeast extract Carl Roth (Germany) 2904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  2. Ritchie, T. K., et al. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs. Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).
  3. Frauenfeld, J., et al. A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  4. Yang, Z., et al. Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains. Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).
  5. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  6. Junge, F., et al. Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins. New Biotechnology. 28 (3), (2011).
  7. Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).
  8. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  9. Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Membrane protein expression: no cells required. Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).
  10. Roos, C., et al. Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).
  11. Cappuccio, J. A., et al. Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).
  12. Patriarchi, T., et al. Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).
  14. Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).
  15. Henrich, E., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 1-19 (2017).
  16. Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  17. Henrich, E., et al. Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway. Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).
  18. Peetz, O., et al. Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).
  19. Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).
  20. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  21. Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs. BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).
  22. Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding. Methods. 147 (1), 73-83 (2018).
  23. Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer. Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).
  24. Matthies, D., et al. Cell-free expression and assembly of ATP synthase. Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).
  25. Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins. Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).
  26. Haberstock, S., et al. A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems. Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).
  27. Falkinham, J. O., Clark, A. J. Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12. Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).
  28. Foshag, D., et al. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).
  29. Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).
  30. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  31. Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).
  32. Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein. European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).
  33. Henrich, E., et al. From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs. Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).
  34. Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).

Tags

Biokemi utgåva 165 In vitro-uttryck cellfri L-CF tvättmedelsfri nanodiscs membranproteiner G-proteinkopplade receptorer proteorhodopsin membrandesign samtranslationell membraninsättning
Samtranslationell insättning av membranproteiner i förformade nanodiscs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levin, R., Koeck, Z., Dötsch,… More

Levin, R., Koeck, Z., Dötsch, V., Bernhard, F. Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs. J. Vis. Exp. (165), e61844, doi:10.3791/61844 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter