Summary
在这里，我们为CRISPR/Cas9基础基因组工程提供详细的分步协议，用于基因敲除（KO）和敲击（KI），以研究B细胞中基因的生物功能和B细胞治疗的开发。
Abstract
B细胞是从造血干细胞中提取的淋巴细胞，是适应性免疫系统幽默手臂的关键组成部分。他们之所以成为细胞疗法的候选者，是因为它们容易与周围血液隔离，体外扩张能力，以及体内寿命。此外，它们的正常生物功能——产生大量的抗体——可以用来表达大量的治疗性蛋白质，如抗感染的重组抗体，或用于治疗酶病变的酶。在这里，我们提供详细的方法，将原人类B细胞从外周血单核细胞（PBMCs）中分离，并在体外激活/扩大分离的B细胞。然后，我们演示了使用CRISPR/Cas9系统在B细胞中针对内源基因的部位特定KO所涉及的步骤。这种方法可以有效地利用各种基因的KO，用于研究感兴趣的基因的生物功能。然后，我们演示了使用CRISPR/Cas9系统以及重组的、与腺相关的病毒（rAAV）载体的步骤，以有效实现B细胞中转基因表达盒的现场特定集成。该协议共同提供了一个分步工程平台，可用于人类B细胞的初级研究基因的生物功能以及B细胞治疗的开发。
Introduction
B细胞是来自造血干细胞的淋巴细胞系的子群。他们在适应性幽默免疫系统中发挥关键作用，产生大量的抗体来应对免疫挑战1。B细胞也是记忆B细胞和最终分化的长寿血浆细胞的前体，从而提供持久的幽默免疫力2。特别是等离子体细胞，在免疫细胞中独一无二，它们能够产生大量的特定抗体，同时存活多年或几十年。此外，从外周血液隔离的便利性使B细胞血统成为新细胞疗法4的极好候选者。
以前，随机整合方法，如那些使用扁桃体载体或睡美人转子，已经被用来工程B细胞的转基因传递和表达5，6，7，8。然而，这些方法的非特异性使得研究B细胞中特定基因的生物功能变得困难，并具有在治疗环境中插入突变和可变转基因表达和/或沉默的固有风险。
CRISPR/Cas9系统是一个强大的基因组工程工具，使研究人员能够精确编辑许多物种中各种细胞的基因组。最近，包括我们自己的两组已经成功地开发出了原始人类B细胞9、10的外活扩张和靶向基因组工程方法。我们将描述从白血病样本中净化原人类B细胞的过程。之后，我们将描述我们更新的 B 细胞扩展和激活孤立 B 细胞的协议。然后，我们将描述一个通过电波将CRISPR/Cas9 mRNA与CD19 sgRNA一起引入激活的B细胞，从而敲除分化19（CD19）的簇、特定的B细胞受体和B细胞的标志的过程。
Cas9 mRNA 被翻译并绑定到 CD19 sgRNA，以形成 CRISPR/Cas9-sgRNA 核糖核蛋白复合物 （RNP）。随后，复合物中的sgRNA导致Cas9在基因exon2上的目标序列中产生双链断裂（DSB）。细胞将通过引入或删除核苷酸来修复DSB，导致帧移位突变并导致基因被消灭。然后，我们将用流细胞测量测量CD19的损失，并通过分解（TIDE）分析对英德尔的形成进行跟踪分析。
然后，我们将描述使用CRISPR/Cas9与重组AAV6载体（rAAV6，同源定向修复（HDR）的捐赠模板）一起，以调解在腺相关病毒集成站点1（AAVS1）基因中插入增强型绿色荧光蛋白（EGFP） 的现场特定插入过程。AAVS1基因是一种没有已知生物功能的活性球体，也是人类基因组上的AAV病毒整合站点：因此，它被认为是基因组工程的"安全港"。在这里，我们报告说，B细胞的膨胀和激活允许在7天的培养中扩大44倍（图1）。B细胞的电扩散显示，在24小时后，整体细胞健康（图2A）略有下降。对 CD19 标记（图 2B）的分散图分析显示编辑的单元块（图 2C）减少高达83%。
TIDE对色谱仪（图3A）的分析显示，英德尔的百分比与流动细胞仪（图3B）所导致的蛋白质损失相似。KI实验的流动细胞学分析表明，接受AAV载体（图4）的细胞与RNP一起表示高达64%的EGFP阳性细胞（图5A），随后通过结点聚合酶链反应（PCR）（图5B）显示成功整合。细胞计数显示，所有样本在工程后3天内迅速恢复（图5C）。
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Protocol
从健康献血者那里获得的白血病样本是从当地血库获得的。此处描述的所有实验均被确定为豁免供机构审查委员会 （IRB） 研究，并经明尼苏达大学机构生物安全委员会 （IBC） 批准。
注：所有实验都是按照血液传播病原体的普遍预防措施进行的，采用无菌/无菌技术和适当的生物安全2级设备。
1. 为B细胞扩张介质准备补充剂
- 将 CpG 寡核苷酸重组为浓度为 1 毫克/mL。
- 将 CD40 配体 （CD40L） 重组为浓度为 100μg/mL。
- 重组重组人类IL-10（rhIL-10），浓度为50微克/mL。
- 重组重组人类IL-15（rhIL-15），浓度为10微克/mL。
注意：将每种补充剂保持在-20°C至-80°C的小参考中长达6个月。
2. 准备基础介质
- 结合B细胞基底介质与5%（v/v）介质补充体外免疫细胞扩张（如CTS免疫细胞SR）和1%（v/v）青霉素和链霉素。
- 使用 0.22μm 滤芯适配器将基底介质过滤消毒到消毒瓶中。
- 将基底介质保持在 4 °C，最长达 1 个月。
3. 准备B细胞扩展介质
- 将基底介质所需的量转移到无菌容器中，以 5 × 105 细胞/mL 培养 B 细胞。
- 以 1 μg/mL CpG、100 ng/mL CD40L、50 ng/mL rhIL-10 和 10 ng/mL rhIL-15 补充基础介质。
- 使用 0.22 μm 过滤器过滤 B 细胞扩展介质。
- 在 37 °C、5% CO2、 湿度至少 30 分钟之前，在组织培养孵化器中平衡 B 细胞膨胀介质。
注意：准备新鲜的B细胞扩展介质，使用一天。 不要 准备 B 细胞扩展介质使用多天。这种介质配方鼓励记忆B细胞的增殖，并激活原发性人类B细胞。
4. 人类B细胞净化和扩张
注：按照制造商的指示，在温度控制的冷冻容器中加入 99–100% 异丙醇，并在开始第 4.1 步之前将冷冻容器冷却在 4 °C。
- 从白血病样本中分离 PBMC
- 将白血病样本（约 8–10 mL）转移到无菌的 50 mL 锥形管中。
- 将体积调高至 35 mL，无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
- 在 15 mL 密度梯度介质上仔细分层 35 mL leuka 磷化样本。
- 离心机在500× 克 25分钟没有刹车，去除等离子层，而不会干扰抛光外套（PBMC层），从接口收集PCBCs，并转移到一个新的无菌50mL圆锥管。
- 将 PBMC 与 1 倍 PBS 一起提起 50 mL。
- 离心机在500× 克 5分钟没有刹车。在不干扰 PBMC 颗粒的情况下取出超自然，PBMC 颗粒可能呈红色。
- 加入7mL的铵-氯化钾-溶解缓冲器，移液器3次混合良好，并在室温下（RT）孵育3分钟。
- 将音量调高至 50 mL，并配备 1 倍 PBS。
- 离心机在400× 克 5分钟低阻力制动器。在不干扰颗粒的情况下取出超自然。弹丸应该看起来粉红色或白色。
注意：要继续培养刚分离的 B 细胞，请在开始 B 细胞分离之前准备 B 细胞扩展介质（步骤 4.2）。
- 使用人类初级 B 细胞负隔离套件从 PBMC 中分离 B 细胞
- 在隔离缓冲区中将 PBMC 恢复为浓度为 5 × 107 个单元/mL。
注意：如果 PBMC 总数小于 5 × 107 个单元，请缩小隔离缓冲器的体积，以保持 5 × 107 个单元格/mL。细胞悬架的最小和最大体积分别为 0.25 mL 和 8 mL。 - 将高达 8 mL（5 × 107 个电池/mL）转移到带盖子的无菌聚丙烯圆底管中。
- 在 PBMC 中添加 50μL/mL 的鸡尾酒增强剂。
- 在 PBMC 中加入 50μL/mL 的隔离鸡尾酒，盖上管子，然后倒置 2~3 次混合。
- 在 RT 孵化 5 分钟;在孵化的第4 分钟，涡流磁性微珠至少30秒。
- 每 1 mL PBMC 传输 50μL 的磁性微珠，封盖管子，并倒置 2–3 次混合。
- 使用隔离缓冲区充值至 10 mL，并轻轻上下 2–3 次移液器。
- 将管子放在磁站中，在 RT 孵化 3 分钟。
- 将磁铁和管子保持在一起，在一个动作中，将磁铁和管子倒在一起，将细胞悬架倒入新管中。丢弃旧管子。
- 重复步骤 4.2.8（将孵化时间缩短到 2 分钟），并将 B 细胞悬架倒入干净的圆锥形管中。
- 富集的 B 细胞已准备好使用。如果立即使用细胞，请继续使用第 4.3 节（人类 B 细胞扩展）。通过流动细胞学（可选）检查分离 B 细胞的纯度。如果细胞在使用前要冻结，请继续踩踏 4.2.12。
- 要冻结B细胞，离心机在400× 克 5分钟，并丢弃超自然分子，而不会干扰颗粒。
- 将细胞在冷冻介质中以107 个细胞/mL进行恢复，并引用1mL/低温。
- 将冷冻容器放在冰冷的冷冻容器中，并在 -80 °C 过夜;然后，将冷冻低温转移到液氮罐中：保持冷冻细胞长达1年。
注：分离B细胞的预期产量占全氟辛起伏碳化合物总量的2%-8%，生存能力为95%-99%。
- 在隔离缓冲区中将 PBMC 恢复为浓度为 5 × 107 个单元/mL。
- 人类B细胞扩张
注意：如果使用刚分离的 B 细胞，请跳过步骤 4.3.1– 4.3.5。数数细胞并将所需细胞数转移到无菌圆锥管中，并继续执行步骤 4.3.6。- 在解冻B细胞之前，在水浴中预热胎儿牛血清（FBS）。准备20mL的B细胞膨胀介质，转移到T25烧瓶，并在组织培养孵化器中预平衡介质（在37°C，5%CO2，湿度），至少15分钟使用前。
- 在37°C的水浴中解冻B细胞。在等待时，将 2 毫升预热 FBS 转移到无菌的 15 mL 圆锥管中。
- B细胞完全解冻后，立即在样品中加入1毫升预热的FBS。在 RT 孵化 1 分钟。
- 轻轻移液器，以补充样品，并转移整个体积，下降，到一个圆锥管含有2毫升预热的FBS。
- 将体积调高至 15 mL，带无菌 1 倍 PBS、盖，并轻轻地将管子倒置 2–3 倍。
- 离心机在 400 × g 5 分钟。
- 在不干扰细胞颗粒的情况下丢弃超细剂，用1mL的预平衡B细胞膨胀介质补充细胞颗粒，并计算细胞数。总细胞数应约为107 个单元格。
- 将细胞转移到含有 20 mL 预平衡 B 细胞膨胀介质的烧瓶中。细胞的最终浓度应约为5×105 细胞/mL。
- 将烧瓶垂直孵化在组织培养孵化器中。
- 通过将 B 细胞的整个体积转移到无菌圆锥管中，并重复步骤 4.3.6–4.3.9，每 2 天完全刷新一次扩展介质。
注：T25烧瓶可容纳10-20 mL的介质：T75 烧瓶可容纳高达 20–60 mL 的介质。
5. 初级人类B细胞工程
- 工程师 B 细胞在扩展/激活后以 48 ± 2 h 的速度工作，以获得最佳效果。准备B细胞膨胀介质，将介质的1mL放入48井组织培养板中，并在使用前至少15分钟在组织培养孵化器中预平衡。
注意：在为感兴趣的基因设计CRISPR/Cas9 sgRNA时，请按照下面概述的步骤操作。
- 使用在线工具11设计 sgRNA 。
- 在蛋白质的所有同位素中常见的外体上设计sgRNA。
- 从信誉良好的公司订购化学改装的 sgRNA。
-sgRNA通常以嗜血的形式出现：在无菌 DNase/无鼻塞三叶草 EDTA （TE） 缓冲区中重组 sgRNA，浓度为 1 μg/μL。 - 通过将化学改性 sgRNA 的 1 μL （1μg/μL） 与化学改性链 球菌 Cas 9 （S.p. Cas9） 核糖核酸混合，准备 CRISPR/Cas9 变种基板。要进行控制，请使用 1 μL 的 TE 缓冲区，而不是 sgRNA。
注：当 CD19 sgRNA 用于基因 KO 实验时，请参阅 图 2 了解结果。当 AAVS1 sgRNA 用于基因 KI 实验时，请参阅 图 5 了解结果。- 将所有组件保留在冰上。
- 轻轻混合，将每个反应的 2.5μL CRISPR/Cas9 变速基板传输到 0.2 mL 8 管条的管中;放在RT。
- 打开核燃机（电极器），并准备 如表1所示的转染试剂。
注意：如果必要的话，把所有试剂都放在冰上，这是暂停的好步骤。准备恢复实验时，从冰中取出所有试剂。当使用 S.p. Cas9 蛋白质时，研究者 必须 通过将 1μg sgRNA 与 5 μg S.p. Cas9 蛋白质混合，避免任何气泡，并在 RT 中孵育混合物至少 20 分钟，然后再使用以获得最佳效果。 - 计数并转移10个6 B细胞，每个转染反应到无菌圆锥管。
- 将体积调高至 15 mL，无菌 1 倍 PBS，离心机在 400 × g 下 5 分钟。在等待时，准备主细胞转染试剂（表2），并放在RT。
- 丢弃超自然的，而不会干扰细胞颗粒。
- 用 10 mL 的无菌 1 倍 PBS 和离心机在 400 × g 下重新注入细胞颗粒 5 分钟。
- 完全丢弃超纳特，而不会干扰细胞颗粒。
- 每106 B细胞将0.5微克化学改性GFP mRNA（作为传染报告器）转移到细胞颗粒（可选）。
- 每10个6B 细胞用20μL原细胞传染试剂补充细胞颗粒;通过管道轻轻混合5-6次。将 20.5 μL 的每次转染反应转移到包含 CRISPR/Cas9 转染基板 2.5 μL 的 8 管条的 0.2 mL 管中。
- 向上和向下一 次 将整个音量 （23 μL） 混合并传输到传输库维特。轻轻盖住并轻敲长凳上的绒布，以确保液体覆盖库维特的底部。
- 在核细胞核上使用人类原生B细胞协议进行转染。
注：核效应器（电容器）可放置在组织培养罩外使用。盖上小面包，确保不育。 - 将电波化细胞在 RT 的库维特中休息 15 分钟。
- 将预平衡 B 细胞膨胀介质的 80 μL 从组织培养板转移到库维特的转染反应中。将小面包放在组织培养孵化器中30分钟。
- 轻轻移液几次，将样品的整个体积从库维特混合并转移到含有 1 mL B 细胞膨胀介质的 48 井组织培养板的适当井中。细胞的最终浓度应该是106 个细胞/mL。
- 如果进行基因 KI 实验， 将 rAAV6 向量为 500，000 多种感染的载体转移到含有电波酸细胞的适当井中（大约 45 分钟后电波）。请参阅 图 4A中的示例 rAAV6 矢量构造。
注：例如：在没有CRISPR/Cas9或rAAV6矢量的情况下，对照样品将被电波解。仅矢量样品将电波化，无需 CRISPR/Cas9，然后与 rAAV6 矢量一起转导。KI 样品将用 CRISPR/Cas9 进行电波化，然后用 rAAV6 矢量进行转导。rAAV6 必须包含 HDR 目标 DSB 站点的上下同源臂。 - 将盘子放在湿度为 37 °C 和 5% CO2 的组织培养孵化器中。
- 计算细胞并记录工程后第 1 天的可行性。
- 通过计算细胞，然后将整个细胞体积转移到一个干净的 1.5 mL 微中微富格管中，每 2 天刷新一次 B 细胞扩展介质。离心机在 400 × g 5 分钟， 并丢弃超母体， 而不会干扰颗粒。用100μL的新鲜B细胞膨胀介质补充细胞，并转移到24井组织培养板的井中。提起中等体积，在 5 × 105 细胞/mL 时实现最终细胞浓度。
注：48井板可容纳1mL中/井：一个24井板可以容纳高达2 mL中/井：12井板可容纳4mL中/井，6井板可容纳8mL中/井。 - 允许工程细胞在进行下游分析（如流细胞学分析、TIDE 分析和交界 PCR）之前至少膨胀 5 天。
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Representative Results
更新的扩展和激活协议使B细胞在7天内迅速膨胀到44倍（图1;n=3捐赠者）。在KO实验中，使用Trypan蓝色染色进行的B细胞计数显示，在24小时后的控制和CD19 KO样本中，超过80%的可行细胞的细胞恢复略有减少（图2A：p≥0.05，n = 3捐赠者）。这一结果表明，电波轻微影响整体B细胞健康。B细胞在输血后的第5天收集，用于流动细胞学和潮汐分析。控制和KO样本的代表散射图图分别显示14%和95%CD19阴性细胞（图2B）。与控制（图2B;p≤0.0001，n = 3捐赠者）相比，KO样本中的CD19表达显著减少。基因组测序的色谱图（见表3中的引物序列）在CD19 KO B细胞中显示双峰，表示CRISPR/Cas9介质DSB后核苷酸的插入/删除，而在控制中观察到单个峰值，表示此样本中未发生DSB（图3A）。KO 样本的色谱仪（使用免费在线 TIDE 分析工具）的英德尔分析显示，英德尔形成率很高（+90%）在CD19球体，这是一致的% CD19蛋白质损失检测流细胞仪（图3B：p≥0.05，n = 3捐赠者）。这些结果表明，CRISPR/Cas9 在 B 细胞中高效生成了 CD19 KO。KI实验的B细胞是在工程后的第12天收集的，用于流动细胞测量和交界PCR分析（表4）。散射图显示，在接受 rAAV6 向量 （图 4） 和 RNP 的样本中，64% 的 EGFP 阳性细胞与 RNP 一起，而在控制中未观察到 EGFP 阳性细胞：在只接收 AAV 矢量的样本中观察到最小的 EGFP 积极性 （图 5A）。交汇点 PCR 放大（见表 3中的引物序列）显示 KI 样本中的 1.5 Kbps 放大器（图 5B），而在控制或仅矢量样本中均未观察到 PCR 产品。细胞计数表明，工程过程对KI样本中细胞恢复的影响大于对照照或仅限向量样本（图5B）。然而，所有样本在工程后3天内迅速反弹（图5B）。这些结果表明，EGFP在AAVS1球体的成功整合导致EGFP在工程后至少12天稳定地表达。
图1：体 外B细胞扩张。B细胞在第0天（零）在1个×106 个细胞播种，密度为5×每mL105， 并在7天内扩大44倍（n=3独立捐赠者）。 请单击此处查看此图的更大版本。
图2A：请单击此处查看此图的较大版本。
图2B：请单击此处查看此图的较大版本。
图2C：CRISPR/Cas9介质CD19淘汰赛（KO）在B细胞中。（A） 条形图显示 & gt;70% 细胞恢复（左面板）和 >80% 的存活率 （右面板） 细胞在输电后 24 小时在控制和 CD19 KO 样本中观察到。（B） 活细胞CD19门控的代表流动图分别显示对照样本和CD19 KO样本中84.3%和3.43%的CD19阳性细胞。（C） 条形图显示 CRISPR/Cas9 介控 CD19 KO 组 CD19 显著减少（p ≤ 0.0001）。 请单击此处查看此图的更大版本。
图3A：请单击此处查看此图的较大版本。
图3B：CD19蛋白质损失与英德尔形成。（A） 色谱图描绘了控制和 CD19 淘汰 （KO） 样本的测序峰值。控制峰值上的灰色框突出显示 CD19 gRNA 的目标序列，并带有箭头指示的预测切割位置。CD19 KO 显示"双峰"测序围绕预测的切割点，指示在双链断裂后插入/删除核苷酸。（B） 条形图显示 CD19 蛋白质损失百分比与 CD19 轨迹（p ≥ 0.05）的英德尔形成之间的一致结果。 请单击此处查看此图的更大版本。
图4：rAAV6 AAVS1 MND-GFP矢量构造。表达盒包含一个强大的合成促进器 （MND） 序列，紧接着是增强的绿色荧光蛋白 （EGFP） 编码序列和聚腺素化 （Poly A） 序列。AAVS1 同源臂侧翼在 MND 发起器上游和聚 A 序列的下游。EGFP 将根据 MND 发起人的法规进行表达。在构造的每个组件上方指示序列长度。 请单击此处查看此图的更大版本。
图 5A：请单击此处查看此图的较大版本。
图 5B：请单击此处查看此图的较大版本。
图5C：CRISPR/Cas9-和rAAV6在工程后第12天将EGFP记者录音带在B单元中的具体集成。（A） 代表流图显示控制或仅矢量样本中无EGFP阳性 B 细胞，而敲击 （KI） 样本中 EGFP 阳性 B 细胞为 64.4%。（B） KI样品的交界聚合酶链反应显示预测的1.5 Kbps波段：在控制或仅矢量样本中未发现带。在 PCR 过程中，水用于确保无污染。（C） 条形图描绘了在工程后 3 天内控制、仅矢量和 EGFP-KI 样本的细胞生长。断线表示 1 × 106 单元输入。 请单击此处查看此图的更大版本。
| 名字 | gRNA序列 |
| CD19 | 5'-克特格特克特卡格特卡-3' |
| AAVS1 | 5'-格特卡卡特塔格-3' |
表1：gRNA序列。
| 试剂 | 每 1 个反应的音量 |
| P3 主细胞解决方案 | 16.4升 |
| 补充 1 | 3.6升 |
| 总 | 20升 |
表2：准备核切除试剂组合。
| 描述 | 序列 | 目的 |
| CD19转发引号 | 5'-阿塔特卡加格-3' | 放大 CD19 轨迹进行英德尔分析 |
| CD19 反向引号 | 5'-GC控制技术-3' | 放大 CD19 轨迹进行英德尔分析 |
| 交界PCR前进引号 | 5'-格加格特塔卡塔克-3' | 交界 PCR |
| 交界 PCR 反向引件 | 5'-加加卡格特加卡卡特C-3 | 交界 PCR |
表3：使用引号。
| 描述 | 氟磷 | 克隆 |
| 反人类 CD19 | 佩尔帕普 | 希布 19 |
| 活力染料 | e弗鲁尔 780 | - |
表4：流动细胞测定抗体和活性染料。
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Discussion
直到最近9月10日，人类B细胞的精确基因组工程一直具有挑战性。我们以前曾发布过使用CRISPR/Cas9来设计原始人类B细胞9的协议。在这里，我们概述了改进的B细胞隔离，扩展和工程协议，以允许高效的KO CD19或敲击EGFP。
在这里，我们证明，我们的扩展协议允许在培养中快速扩展B细胞，在7天内扩展高达44倍（图1）。该协议显示的扩张速度比强生等人报告的要快9 和 Hung 等人10 确保原 B 细胞健康快速扩张的关键步骤是每两天用新的激活因子补充介质，并确保培养中的 B 细胞总数不超过 2 × 106 细胞/mL。
我们还发现，我们改进的CD19 KO的CRISPR/Cas9系统传输协议提高了CD19 KO效率（图2 和 图3）。与先前的研究9类似，我们观察到细胞恢复和电后存活率在24小时时略有下降。这表明电污染影响原发性B细胞的整体细胞健康：然而，细胞最终在48小时内反弹（数据未显示）。
使用此电极协议的好处是，我们可以以更快的速度电波化样品（在不到 1 分钟内发生 16 次反应），而以前的协议9、10需要大约 10-12 分钟进行 16 次反应。此外，这种转染系统消除了在先前研究9，10中观察到的电极的潜在电弧。此外，这种工程方法可以使用更大、市售的 cuvette（未显示的数据）扩展为更多 B 细胞。
确保最佳整体细胞健康和 KO 效率的几个关键步骤：首先，确保 B 细胞扩展介质在使用前至少 15 分钟准备和预平衡。第二，转染基板的总体积不应超过核试剂的20%（v/v）。第三，细胞必须扩展/激活48±2小时，以获得最佳效果。第四，在放入电监护器之前，轻轻敲击电孔，以确保变电反应溶液覆盖电极底部。第五，一定要在RT只休息15分钟：电波过长后将细胞留在细胞核试剂中会损害整个细胞的生存。第六，一定要在幼崽中用介质孵育细胞不超过30分钟。第七，在前48小时将106 个电波化细胞放入1mL中，往往比以较低的密度培养细胞更快地恢复（数据未显示）。最后，使用 Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白质将产生类似的编辑效率（未显示数据）;然而，我们使用Cas9 mRNA的方便和成本。
使用 CRISPR/Cas9 时的两个主要问题是脱靶效应和染色体迁移。sgRNA 碱基对与目标序列不匹配导致的脱靶效应，导致基因组上许多可能的结合位点，并创建多个不需要的基因 KOs。因此，应考虑预测的非目标分数以及目标得分，以尽量减少此问题。染色体错位可能发生由于脱靶效应或敲出多个基因时。这在实验和临床上都可能导致灾难性事件。基础编辑器12 改变单核苷酸（两类：细胞苷碱编辑器和腺苷碱编辑器），以破坏拼接元件，创建过早停止科顿，或创建点突变，导致目标基因KO没有DSB（广泛审查其他地方12）。因此，碱基编辑方法可用于单基因或多基因KO来规避染色体的迁移。
我们还证明，CRISPR/Cas9 与 rAAV6 一起，可用于在 AAVS1 轨迹上有效地调解特定站点的 KI 和EGFP的表达。工程后，我们观察了至少12天的EGFP表达。我们还观察到两个EGFP阳性人群：第12天KI样本中的高和中EGFP表达（图5A），而仅载体样本显示具有中间EGFP表达的细胞比例最小。我们推测，这种"高、中等人群"现象是由于双体融合的载体。可以使用跨越PCR13的中高EGFP细胞进行进一步调查，以证实这一假设。关于使用 AAV 作为载体的两个警告：首先，AAV 向量很小，高达 4.7 千基，在敲击大基因时会引起问题。减少同源手臂的大小将允许一个更大的基因的适应，这反过来又会降低KI效率（数据未显示）。或者，多个基因加载载体的同步或顺序整合可以使用14，15。研究已经报告了免疫反应和AV转导细胞在免疫能力动物模型16，17的清除。或者，可以探索非病毒捐赠者 HDR 模板，以规避此问题。
总之，我们已经展示了B细胞的分离、扩张和工程的全面、分步过程，从而产生了高基因修饰效率。该工程方法可用于基因KO和研究B细胞中基因的功能。此外，该方法还可用于设计B细胞以表达重组抗体以对抗感染。最后，这种方法可以应用于工程B细胞表达和分泌治疗酶，可以用作自体细胞为基础的治疗酶。
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Disclosures
以M.J.J、K.L.和B..M S.为发明人，对制造和使用基因组编辑的B细胞的方法提出了专利。B.S..M是伊姆穆索夫特公司的顾问，并拥有该公司的股票。伊姆穆索夫特公司赞助了B.S..M实验室的研究。
Acknowledgments
这项工作由儿童癌症研究基金（CCRF）和NIH R01 AI146009到B.S..M资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
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