Summary
本方案描述了研究在人体健康中具有重要作用的两种模型蛋白的结构和动力学的方法。该技术将台式生物物理表征与中子自旋回声光谱相结合，以访问与蛋白质域间运动相关的时间和长度尺度的动力学。
Abstract
大多数人体蛋白质的活性和功能都与蛋白质晶体结构内整个子结构的构型变化有关。晶体结构为描述蛋白质结构或动力学的任何计算奠定了基础，大多数时候具有很强的几何限制。然而，这些来自晶体结构的限制在溶液中并不存在。由于环或子域在微微到纳秒的时间尺度（即内部蛋白质动力学时间状态）上的重排，溶液中蛋白质的结构可能与晶体不同。本著作描述了如何使用中子散射来访问几十纳秒时间尺度上的慢动作。特别是，两种主要的人类蛋白质的动态表征，一种是缺乏明确定义的二级结构的内在无序蛋白质，另一种是经典的抗体蛋白，通过中子自旋回声波谱（NSE）结合各种实验室表征方法来解决。使用数学建模来描述实验中子数据并确定组合扩散和内部蛋白质运动之间的交叉，从而进一步了解蛋白质结构域动力学。提取从NSE获得的对中间散射函数的内部动态贡献，包括各种运动的时间尺度，可以进一步了解单个蛋白质的机械性质以及蛋白质在拥挤蛋白质溶液中几乎自然环境中的柔软度。
Introduction
用中子探测软物质的动力学
研究蛋白质和肽的动力学特性是生物物理研究的主要部分，并且今天存在许多开发良好的方法来访问广泛的能量景观1。将实验揭示的蛋白质动力学与其生物学功能联系起来是一项更加困难的任务，需要复杂的数学模型和计算机辅助动力学模拟。中子光谱学在蛋白质运动分析中的重要性已经在几项广受好评和广泛认可的研究1，2，3，4，5中得到强调。在探索内部蛋白质动力学的多样化能量景观之前，需要简要概述软物质中的动力学过程以及中子如何访问它们。
中子对同位素构型的敏感性以及它们与软物质相互作用的类型使中子散射成为最通用的研究技术之一6.中子可以访问广泛的相关长度尺度和相关时间，从核激发和原子振动到集体运动和缓慢松弛过程，如各向同性旋转和扩散运动。当研究散射中子的能量转移时，可以区分三个主要相互作用：弹性散射，其中入射中子和样品中的粒子之间没有能量交换;非弹性散射，中子和粒子之间具有大的，可量化的能量交换;以及准弹性散射的特殊情况，与入射中子能量1，7相比，它表示非常小的能量转移。这些相互作用提供了有关所研究材料的精确信息，并构成了各种中子散射技术的理论基础。
在弹性散射中，探测器将中子的方向记录为衍射图案，该衍射图谱显示样品原子相对于彼此的位置。获取有关原子位置相关性的信息（即，有关动量转移Q的积分强度 S（ Q），仅与结构信息有关）。这个原理构成了中子衍射8的基础。
当由于样品材料中的激发和内部波动而导致能量转移不再为零时，复杂性就会出现。这构成了中子光谱学的基础，其中散射中子被研究为能量转移 E 和动量转移 Q的函数。获得动态和结构信息。中子光谱测量能量转移的相同综合强度 S（Q）（即由于样品散射引起的中子的速度变化， S（Q，ω） = S（Q，E），也称为动态结构因子）9。
为了计算材料的散射，使用对相关函数7，10更合适。在衍射情况下，静态对相关函数 G（r） 给出了在给定距离 r 处找到一个粒子中心与另一个粒子中心的概率。光谱学推广了静态对相关函数，并在散射方程中包括能量/频率/时间。对相关函数 G（r） 成为时间 G（r， t） 的函数，它可以分解为不同的原子对相关函数 GD（r， t） 和自相关函数 GS（r， t）。这些描述了两种类型的相关性：控制相干散射的原子的对相关运动，以及控制非相干散射10的自相关。
相干散射是从“平均值”散射，取决于散射波的相对相位。在小角度散射状态下，来自不同散射中心（不同原子）的散射中子波建设性地干涉（具有相似的相位），并且观察到原子的集体运动具有很强的强度增强。相干散射本质上描述了来自样品10中所有原子核的单个中子的散射。
当来自不同中心的散射中子波之间没有发生相长干涉时，及时跟踪单个原子，并观察到时间 t = 0时原子的位置与时间 t 处的同一原子之间的自相关。因此，关于原子相对位置的信息丢失了，焦点只放在局部波动上。局部波动的散射支配着不相干的散射。非相干散射是各向同性的，有助于背景信号，并降低信噪比10，11。
结合上述所有内容，我们区分了四个主要的中子散射过程10：（1）弹性相干（测量原子位置的相关性），（2）非弹性相干（测量原子的集体运动），（3）弹性不相干（有助于背景，通过Debye-Waller因子（DWF）降低散射强度并测量弹性不相干结构因子（EISF），描述受限几何中扩散运动的几何形状， （4）非弹性非相干（测量单原子动力学和自相关）。
中子在生物学中可以进入的动力学过程范围从低频原子和分子振动的阻尼，溶剂分子与生物表面的相互作用，以及大分子和受限几何形状的水化层中的扩散过程，到短程平移，旋转和翻滚扩散运动，以及蛋白质结构域和变构运动1.用于测量蛋白质动力学的中子方法和仪器的广泛多样性是基于如何实现入射或流出中子束的色变化以及如何进行散射中子的能量分析。从三轴到飞行时间，反向散射和自旋回波光谱仪，人们可以探索特征时间在1 x 10-14 s和1 x 10-6 s（飞秒到微秒）之间的动态过程12。
橡树岭国家实验室拥有两个著名的中子源，散裂中子源 - SNS13 和高同位素通量反应堆 - HFIR14，拥有用于研究生物材料动力学的最佳光谱仪套件之一。一些最雄辩的例子包括在SNS15上使用冷中子斩波光谱仪（CNCS）来研究溶液16 中绿色荧光蛋白周围水合水的动态扰动或几种蛋白质17的亚皮秒集体振动。非弹性中子散射研究的一个反复出现的问题是，一些生物过程太慢而无法观察到。在没有导致中子强度巨大损失的极端设置的情况下，飞行时间光谱仪被限制为10μeV的能量分辨率，相当于最大时间尺度约为200 ps10，11。这不足以观察蛋白质的大规模运动。因此，通常需要具有更高能量分辨率的仪器，如反向散射光谱仪。结合飞行时间和反向散射技术已被证明对于研究细胞色素P450cam（CYP101）的内部动力学变化非常有效，细胞色素P450cam是一种催化羟基化樟脑18的酶。
SNS-BASIS19 的反向散射光谱仪测量的微观扩散率出奇地定义得很好，可以分为水的扩散性（水合作用，细胞质和块状水）和平面扁虫中细胞成分的扩散性，扁平扁虫是第一个通过中子散射20研究的活体动物.反向散射是一种高分辨率光谱技术，但它也仅限于几μeV = 几纳秒，而生物材料中的缓慢动力学也表现为原子位置或自旋取向之间相关性的生存时间（例如，弛豫过程，通常在十到数百纳秒的时间范围内发生）。
中子自旋回波光谱（NSE）是唯一达到如此高分辨率的中子散射技术。与其他中子技术不同，NSE不需要对光束进行消色变，因为它使用中子的量子力学相，即它们的磁矩。磁矩的操纵允许使用宽的中子束波长分布，而该技术对非常小的中子速度变化（1 x 10-4）敏感。NSE已成功用于研究许多蛋白质溶液中蛋白质的缓慢动力学。在这些众多的先驱研究中，我们承认对猪免疫球蛋白21的节段灵活性的研究;Taq聚合酶22中的耦合结构域运动;酵母醇脱氢酶23的四聚体中的结构域运动;底物结合3时磷酸甘油酯激酶构象的变化;Na+/H+交换调节辅因子1（NHERF1）蛋白4，24，25中结构域运动的激活和变构信号的动态传播;汞离子还原酶26的紧致状态的动力学;以及血红蛋白在红细胞中的扩散27。最近两项关于蛋白质动力学的研究揭示了人抗体免疫球蛋白G（IgG）作为熵弹簧28的柔韧性，以及溶剂对内在无序髓鞘碱性蛋白（MBP）动力学的贡献特征5。
本文解释了NSE的基本原理，推荐用于彻底蛋白质动力学研究的多种制备方法，以及SNS，SNS-NSE的NSE光谱仪NSE数据采集的方法和实验方案。该方案表征了两种蛋白质：IgG，一种常规的人抗体蛋白，以及内在无序的蛋白质MBP。简要讨论了生物物理意义，示例的研究相关性以及该技术的局限性。
NSE光谱，慢速动力学测量的方法
NSE是一种极化技术，它使用中子飞行时间来测量由于样品中中子和原子之间的准弹性相互作用而导致的能量交换（极化损失）。NSE光谱学的核心是两个基本原理：（1）中子自旋以与磁强度
成正比的频率在磁场中进动的能力，即拉莫尔频率29，以及（b）自旋回波或Hann回波，表示在施加一系列射频脉冲30时对偏振信号的操纵和重新对焦。
NSE 过程的基础知识可以用几个简单的步骤6，11 使用 图 1 进行总结。（1）源（位置1）产生的中子束被偏振（位置2），引导并传输（位置3），并到达NSE光谱仪的入口，在那里它被第一个pi-half鳍（位置4）旋转90°。（2）偏振光束（例如中子磁矩）垂直于第一磁体的磁力线（第一进动区，位置5）并开始进动。（3）在磁体的末端，中子自旋积累一定的进动角，与磁场强度和内部的飞行时间成正比（基本上与中子速度成反比）。单个中子速度在第一个进动区末端的进动角内编码。（4）靠近样品位置，pi-flipper（位置6）将自旋的方向反转180°，改变进动角的符号。（5）中子与样品的分子（位置7）相互作用并散射。（6）散射中子进入第二进动区（位置8）并进动，但变为反向定向。（7） 另一个圆周率半鳍（位置 9）用于将自旋的方向从垂直于水平方向旋转。这将停止进动，将进动角φ转换为与cos（φ）成比例的偏振。（8） 分析仪（位置 10）根据一个方向选择中子。如果与样品的相互作用是弹性的，则中子的速度不会改变。中子将花费相同的时间在第一和第二进动区飞行，并且累积的进动角被完全恢复。探测器（位置11）上的全偏振恢复为原始偏振的回波（即自旋回波）。（9）然而，在NSE中，散射是准弹性的，因此中子和样品分子之间的小能量交换导致样品散射后出现不同的中子速度。由于速度不同，中子将花费额外的时间飞过第二个进动区，并且不会正确恢复其进动角。在探测器上检索到部分偏振，并且由于自旋弛豫引起的偏振损失与光谱函数 S（Q，ω）的cos-傅里叶变换成正比，中间散射函数 F（Q，t）。（10）函数 F（Q，t）的时间参数与进动磁场强度成正比。因此，将极化损失作为磁场强度的函数进行扫描会产生一个松弛函数，该函数取决于样品内的动力学过程。
图 1：SNS （SNS-NSE） 的 NSE 光谱仪照片和包含最重要功能组件的中子飞行路径示意图。 从右到左：1 =中子源;2 = 斩波器-弯曲-偏振片-二次快门系统;3 = 光束传输导轨;4 = pi/2 鳍片，用于第一个 90° 自旋转动;5 = 第一进动区;6 = pi 鳍片用于 180° 自旋转动;7 = 样品面积和样品环境（此处为冷冻炉）;8 = 第二岁差区;9 = pi/2 鳍片，用于第二个 90° 自旋转动;10 = 分析仪;11 = 探测器。（请注意，3部分以及2和1部分位于屏蔽层内部的蓝色墙后面，斩波器被基于反应堆的NSE的速度选择器取代）。 请点击此处查看此图的大图。
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Protocol
本研究描述了两种蛋白质：常规的人抗体蛋白IgG和内在无序的MBP。蛋白质的冻干形式是从商业来源获得的（见 材料表）。
1. 蛋白质样品制备
- 通过将相应的固体试剂称量并溶解在重水（D2O）中来制备50 mM磷酸钠+ 0.1 M NaCl缓冲液（参见 材料表）。这是IgG的氘代缓冲溶剂。
- 将缓冲溶液的pH值调节至6.6。
- 通过将相应的固体组分称重并溶解在重水（D2O）中来制备20mM磷酸钠+ 6M尿素缓冲液。这是MBP的氘代缓冲溶剂。
- 将缓冲溶液的pH值调节至4.7。
- 使用0.2μm孔径过滤器过滤缓冲溶剂（参见 材料表）。
- 在高蛋白质浓度（〜50mg / mL）下将纯化的蛋白质冻干粉末在氘代溶剂中以高蛋白质浓度（步骤1.1.-1.2）称重并溶解。
- 将蛋白质溶液加载到具有3.5K MWCO透析膜的透析器篮中，并通过稍微摇动管以产生扩散梯度，在10°C下对MBP和25°C下透析24小时（参见 材料表）。
- 使用透析缓冲液以一系列浓度稀释蛋白质溶液：1，2，5，10和50mg / mL。
- 使用纳米滴分光光度计确定确切的浓度（参见 材料表）。
2. 通过动态光散射（DLS）进行初步样品表征
- 将上述浓度系列（步骤1.6）中的每个蛋白质溶液的80μL加载到DLS一次性电池中（参见 材料表）并确定扩散系数，平均超过10次采集。
- 将翻译扩散系数绘制为蛋白质浓度的函数，并外推至零浓度。
- 将浓度系列中的每个蛋白质溶液加载到粘度计的毛细管中（参见 材料表）并测量动态粘度。
- 绘制测量的动态粘度作为蛋白质浓度的函数，并外推至零浓度。
注意：将DLS扩散外推至零浓度可得出单个蛋白质的翻译扩散值。将动态粘度外推至零浓度必须产生实验测量的缓冲溶液的动态粘度值。
3. 收集小角度散射（中子或X射线）
- 测量四种蛋白质浓度的小角度中子散射（SANS）和/或小角度X射线散射（SAXS）（见 材料表），优选2毫克/毫升，5毫克/毫升，10毫克/毫升和50毫克/毫升。
- 通过蛋白质浓度使无症状和 SAXS 光谱正常化。
- 使用集成优化31 和/或 SasView32 软件将蛋白质形态 P（Q） 拟合到 SANS 和 SAXS 光谱。
- 通过将 SANS 和 SAXS 信号与每种浓度的 P（Q） 相除来计算结构因子 S（Q， c）。
注意：鼓励对如何测量和解释小角度散射数据作为NSE测量支持的读者彻底查阅参考文献23，28，31，32，33。
4. 国家可持续环境的测量
- 设置实验并按照以下步骤安装示例。
- 根据蛋白质溶液的浓度、测量所需的温度和可用的溶液量，选择样品上样池的厚度。
注：本研究使用顶部装载机40 mm x 30 mm x 4 mm的透明石英容器。 - 反复清洁细胞，在无磷酸盐的餐具洗涤剂（见 材料表），去离子水和70%乙醇之间交替。
- 在对流烤箱中干燥电池;石英电池的温度不超过80°C。
- 将4 mL蛋白质溶液加载到细胞中并用盖子关闭。使用蜡膜或任何密封剂（参见 材料表）密封样品池。
注意：在本研究中，使用~50mg / mL的4.8 mL溶液来获得足够的散射强度。 - 将4 mL透析缓冲液装入与蛋白质样品相同的容器中并密封。
- 将样品传送到光束线，关闭快门，然后进入光谱仪外壳洞穴区域34。
- 通过拧紧螺钉和固定板将样品池安装在铝制样品架上（图2，左面板）。
注意：鉴于所有样品都需要相同的测量方案，可以同时安装两个样品池。 - 将石墨样品和/或Al2O3 粉末样品装入与蛋白质样品相同的容器中。这些是 SNS-NSE 光束线支持提供的标准。
- 将样品架轻轻滑入温度强制系统（TFS，参见 材料表）的罐中， 将其放置。
注意：TFS是SNS-NSE最常用的样品环境，它将干燥的空气泵入样品罐中以达到所需的温度（图2，中间和右侧面板）。 - 关闭 TFS 盖，并通过访问 TFS 的交互式屏幕将温度设置为所需值。
- 安装中子相机（参见 材料表）以使样品与光束对齐。
- 清扫仪器外壳，撤离，关闭门，然后打开光束百叶窗。
注意：样品池由 SNS-NSE 光束线支持提供。有关可用的示例单元和示例环境库，请参阅 SNS-NSE 光束线网页7，35。
- 根据蛋白质溶液的浓度、测量所需的温度和可用的溶液量，选择样品上样池的厚度。
- 按照以下步骤收集 NSE 数据。
- 使用中子相机和四个独立的样品孔径将样品对准中子束中。
- 打开SNS-NSE数据收集软件36 ，并通过运行衍射扫描来收集所需散射角和波长的样品统计数据。
- 通过编辑辅助仪器科学家提供的测量宏，根据为每个样品收集的统计数据设置测量参数。
- 通过在命令提示符下键入协议名称开始扫描，并获取样本的回显。
- 开始扫描并获取回波，用于弹性参比和缓冲溶剂。对样品更换执行间歇性光束快门操作。
图 2：NSE 测量系统。 左图：蛋白质溶液样品在石英容器中，用螺钉和板安装在铝（Al）样品架上。Al 样品架提供了在样品环境中同时安装两个样品的可能性。中间面板：温度强制系统（TFS）样品可以安装在样品阶段，中子束窗口在右侧，而用于对准的中子相机在左侧可见。右面板：将带有两个样品的样品架放入样品中可以与硅（Si）窗口一起使用。 请点击此处查看此图的大图。
5. NSE 数据缩减
注意：SNS-NSE 配备了名为 DrSpine（自旋回波的数据缩减）的专用软件 37，38 ，可在 ORNL 中子科学远程分析群集、快速用户指南和内置帮助支持中找到。
- 使用 ORNL 用户凭据登录到中子科学远程分析聚类（参见 材料表），然后按 “启动会话” 按钮。
- 按照以下步骤设置数据缩减软件。
- 在用户目录中，打开终端窗口并键入：源/SNS/软件/nse/等/setup_nse.sh。
- 接下来，键入： drspine_create_env.sh。
- 在主目录中创建一个用于数据缩减的文件夹，并从共享目录中复制提供的脚本和宏。
- 相应地编辑、重命名和保存提供的 reduce 宏。
- 在命令提示符下键入 drspine ，然后按 回车 键启动软件缩减环境。
- 键入在步骤 5.4 中编辑的“缩减宏的名称”。在软件环境中的命令提示符下，然后按 Enter 键。
6. NSE数据拟合
- 使用简化的文件数据的名称编辑由辅助仪器科学家提供的 python 脚本“stapler-drspine.py”。
注意：python脚本免费提供给仪器用户。 - 编辑函数以适合所提供的库。
- 在命令提示符下键入已编辑脚本的名称“stapler-drspine.py”，然后按 Enter 读取、拟合和打印缩减的 NSE 数据。
注意：仪器科学家将为简化宏和“stapler-drspine.py”python 脚本提供一个模板，该脚本可以读取和拟合 NSE 简化数据。最终简化的NSE数据采用ASCII格式，可以通过各种首选软件读取。
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Representative Results
在D2O碱缓冲液中以高浓度（~50mg / mL）重组来自人血清和牛MBP蛋白的IgG蛋白。由于蛋白质以高浓度溶解，因此得到的溶液是拥挤的蛋白质溶液。使用NSE研究的动力学受到蛋白质所居住的拥挤环境（结构因子相互作用和流体动力学效应）的影响5，28，39。对每种蛋白质的浓度序列进行DLS以考虑拥挤效应。通过DLS测量的翻译扩散系数外推至零浓度，得出单个蛋白质的翻译扩散值。作为蛋白质浓度函数的动态粘度也必须在NSE之前测量，以考虑流体动力学相互作用。将动态粘度外推至零浓度作为浓度的函数，需要产生可以针对每个制备的蛋白质样品的缓冲溶液进行实验测量的值。
在任何NSE实验之前，都要评估浓缩溶液中蛋白质的形状和结构，以深入了解蛋白质形式因子和结构因子的强度，这可能会影响蛋白质在溶液中的移动方式。小角度散射是这些研究的首选方法。在本研究中，SAXS观察了溶液中IgG蛋白的结构构象，并用SANS评估了MBP的结构。测量的散射强度（Q）（步骤3.3.-3.4）与形状因子 P（Q）和结构因子 S（Q，c）之间的乘积成正比，由粒子数量加权（等式1）5，28，39：
I （Q） = N ∙ P （Q） ∙ S （Q， c） （1）
在克拉特基型 SAXS 仪器 40 上测量了1AXS，对于 IgG，X 射线波长为 0.154 nm，对于中子波长为 4.5 Å 的 MBP，测量了 SANS41。实验性小角度强度I（Q）经过背景和溶剂校正，按溶液浓度缩放，并使用免费的软件包（如 Ensemble Modeling-EOM 和 SasView24、25、29、39、42、43）计算形状因数。此外，从等式1获得每种蛋白质的结构因子。
在本研究中，NSE实验使用两个自旋回波光谱仪进行：图1中的SNS-NSE仪器34和菲尼克斯-J-NSE仪器44。在0.05 Å−1- 0.2 Å-≤1-0.2 Å−1之间的几次Q测量中，入射波长在8 Å - 12 Å之间，傅里叶时间在0.1 ns之间，最大≤130 ns。这两台光谱仪之间的差异是理解NSE科学的关键点，它们既代表了反应堆静态中子源的所谓“经典自旋回波”的旧概念，也代表了脉动中子源的新“飞行时间概念”。凤凰-J-NSE光谱仪是一种经典型NSE，其中速度选择器选择特定的波长。为了允许中子速度的变化，引入了±10%的波长带宽。尽管用于单次扫描的能量带非常窄，但Phoenix-J-NSE光谱仪在高通量反应堆源下的情况可确保在相对较短的测量时间内覆盖空间矢量和相关时间范围。SNS-NSE光谱仪是新一代超高分辨率斩波中子光谱仪，波长跨度为2 Å < λ < 14 Å，同步波长带宽为2.4 Å - 3.6 Å，具体取决于光谱仪的位置。由于这种宽带宽，可实现高数据收集效率，允许几乎无间隙地覆盖宽波矢量时间范围，只需很少的散射角设置。SNS-NSE中波段的选择由由四个斩波器组成的斩波系统完成。这里讨论的两种NSE光谱仪都具有基于超导技术的进动场，具有高磁场均匀性，用于杂散场校正的新型最先进的场校正元件，以及新型偏振弯曲器41，42。
在10°C下测量MBP蛋白的NSE光谱，在25°C下测量IgG1蛋白。NSE测量的相干中间散射强度I（Q，t）/I（Q，t = 0）是样本中在所研究的时间尺度内发生的所有动态过程的贡献结果。这包含内部蛋白质动力学，整体平移扩散，旋转和翻滚扩散以及蛋白质分子本身内的节段运动。简化模型假设内部动力学以及平移和旋转扩散完全解耦5，45，46，47，48并且可以单独表征。对于单个粒子，相干散射函数可以写为乘积（等式2）23，48：
F （Q， t） = F反式（Q， t） ∙ F腐烂（Q， t） ∙ F国际（Q， t） （2）
其中，单个刚性蛋白质的平移扩散项是平移扩散系数 DT 的指数函数（等式 3）23，48：
F反式（Q， t） = exp（−Q2∙ DT∙ t） （3）
对于大浓度的蛋白质，翻译扩散系数 DT 受蛋白质-蛋白质相互作用的影响，由结构因子 S（Q）和流体动力学函数 HT（Q）（等式4）23，48描述的流体动力学相互作用量化：
DT（Q） = DT0 ∙ HT（Q， c） / S（Q， c） （4）
在等式4中， DT0 是从DLS测量值（步骤2.2.）中推断出的扩散值至零浓度。 HT 的计算公式为 HT = 1 -c∙ [η]，其中c是蛋白质浓度，[η]是通过[η] = （η - η0）/η0 ∙ c计算的特性粘度， η0 是测量的动态粘度（步骤2.3.-2.4.）。结构因子 S（Q，c）是从IgG蛋白的SAXS测量和MBP蛋白的SANS测量中获得的。
图3显示了中间散射函数 I（Q，t）/ I（Q，t，t = 0）的示例，由NSE测量IgG和MBP蛋白。在短傅里叶时间尺度（<25 ns）上观察到与简单扩散样弛豫过程的明显偏差，表明NSE可以获得蛋白质内部动力学，并且需要更复杂的模型来描述观察到的动态过程。
图3：IgG和MBP蛋白的NSE弛豫光谱。 此处显示的 IgG 数据仅由单指数函数拟合，以显示在较短的傅里叶时间与扩散的偏差。观察到两种蛋白质的偏差。相比之下，MBP 数据在此处显示为全松弛范围，由Biehl45开发的模型拟合。该模型意味着粗粒度，并能够同时拟合短、中、长傅里叶时间状态。 请点击此处查看此图的大图。
因此，使用Biehl开发的模型通过两种蛋白质的原子建模来拟合散射函数，该模型在参考文献18，25，38，43，44，46中描述。中间散射函数通过粗晶粒计算到几百个单独的晶粒，而不是全原子模拟，以减少计算负载和时间，并且MMTK49 软件库（可自由访问）用于访问原子坐标并在蛋白质结构域和片段上实现跨旋转运动。两种蛋白质的中间散射函数计算结果与实验NSE数据非常吻合，证明在长傅里叶时间观察到的较慢动力学可归因于整体平移和旋转扩散过程，而在短时间尺度上观察到的快速动力学可归因于蛋白质结构域的动力学。
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Discussion
NSE光谱学提供了蛋白质动力学的独特而详细的视图，这是其他光谱技术无法产生的。在延长的时间尺度上进行测量可以观察蛋白质的翻译和旋转扩散，如图所示。节段动力学和其他内部振荡表明，它们在短时间内是相干散射函数 S（Q，t）的强衰减，并且与整体扩散弛豫过程很好地分离。NSE技术的主要局限性是测量时间长，并且获取良好统计信号所需的大量样品。这可能对测量具有低浓度移动物种和缩短寿命的相关大分子系统构成挑战。
IgG的内部动力学
IgG蛋白具有对抗体特有的Y形结构，可以通过柔性连接子连接的三个大片段近似。对于这种结构，假设了三个位于谐波势中的可大颗粒的数学模型。连接器由弹性弹簧近似，弹性弹簧提供固定的平衡位置，但允许波动作为布朗运动的一种形式。相对平衡28周围的每个片段允许三个自由度。等式2中 由Fint（Q，t）表示的内部动力学由奥恩施泰因-乌伦贝克过程50，51描述。该模型允许计算潜在倾角中碎片的均方位移、不同运动的时间尺度、摩擦和发生的力常数。通过法向模式分析近似内部运动的幅度，考虑每个片段的不同运动程度。对模型和由此产生的数学参数的广泛描述超出了此处的范围，但可以在参考文献28中找到详细信息。在IgG的这个案例研究中，在几纳秒的时间尺度上观察到内部动力学的清晰特征。链接器计算出的弹簧常数似乎与相似长度的熵弹簧具有现实的可比性。观察到的有效摩擦力似乎接近于自由的未结合IgG片段的摩擦力。预先存在的平衡假说得到了验证，假设处于平衡状态的IgG共存的“开放”或“封闭”构型表现出不同的结合位点和结合特异性28。该信息可能与了解抗体的机制以及该机械行为是否可用于改善生物相容性和生物利用度有关。
MBP的内部动态
MBP结构具有紧凑的球形核心，通过其灵活的随机线圈末端允许强大的拉伸和弯曲运动。MBP动力学使用柔性聚合物模型进行解释，有和没有增加内部摩擦28，39。与IgG的情况一样，MBP内部动力学的观察可以在布朗运动理论中调和，其中较大的运动振幅导致更长的弛豫时间，并受到蛋白质链内摩擦的影响。膨胀时间的增加，运动振幅较大，但摩擦力较小，可以使用与谐波势中布朗运动相同的Ornstein-Uhlenbeck过程50，51 来描述。通过降低链构型的恢复力（二面体势）和平滑局部能量势垒，在MBP从其天然状态完全变性时，具有大振幅但缓慢弛豫时间的内部运动变得活跃。MBP在原生和变性状态下的内部动力学的详细描述可以在参考文献28，39中进一步找到。在MBP的研究中，使用NSE的研究表明，在随机线圈聚合物和球状蛋白质之间，蛋白质的中间致密性存在动态行为。内部蛋白质动力学的显著贡献以几纳秒的弛豫速率由低频集体拉伸和弯曲运动控制5。由于蛋白质内摩擦值大，聚合物理论分解的模型提供了对天然MBP动力学的描述。在变性MBP中，蛋白质链内的内摩擦减少，松弛光谱的聚合物链特征占上风。结构集合运动的高灵活性可能有助于增加可接近的蛋白质表面，从而促进与不同结合伙伴的相互作用。
动态模型
虽然NSE作为一种技术在评估生物大分子和分子亚基中的低频谐波运动方面在实验上是独一无二的，但中间散射函数的分析需要与来自各种数学模型的中子光谱进行比较。这里提出的由Biehl等人开发的用于浓缩蛋白质溶液的模型使用 弹性网络近似，其中中间散射函数是适当模函数的卷积，布朗振荡器代表内部动力学。这是用于分析蛋白质节段动力学的极少数可用模型之一。稀释蛋白质溶液的另一个成熟模型是Bu等人提出的模型，这是一个使用统计力学的鲁棒模型，不需要复杂的拟合或多个参数。基于动态解耦近似的类似方法也可以应用于稀释系统，以将有效扩散表征为自平移运动和内部运动53的总和。我们的一些参考资料可以提供有关这些模型及其局限性的全面报告。我们强烈建议菲特等人1 和刘等人54。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益，也没有利益冲突。手稿的内容基于作者在2019-2021年间在结构生物学学院的HANDS-中子散射应用中发表的演讲。
Acknowledgments
这项研究使用了散裂中子源（BL-15，BL-6，生物和化学实验室）的资源，这是由橡树岭国家实验室运营的科学用户设施的美国能源部办公室。这项研究还使用了MLZ-FRM2反应堆加兴（KWS-2，菲尼克斯-J-NSE）和德国尤利希研究中心JCNS1的资源。作者感谢Ralf Biehl博士和Andreas Stadler博士在建模方面的帮助以及他们对IgG和MBP蛋白研究的贡献，Piotr A. Ż ołnierczuk博士为NSE数据减少支持，长武博士对SANS测量的支持，以及朗达·穆迪和凯文·韦斯博士对SNS生物化学实验室的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine MBP protein solution | Sigma-Aldrich | M1891 | lyophilized powder reconstituted in D2O |
| D2O - heavy water | Sigma-Aldrich | Product No. 151882 | liquid |
| Dionized water | in house | - | for washing / cleanning cells |
| DLS instrument | Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich | - | dynamic light scattering instrument |
| Elastic scattering standards | SNS-NSE, ORNL | - | Al2O3 and Graphite powders |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 65350-M | 70% ethanol for cleaning cells |
| IgG protein solution | Sigma-Aldrich | I4506 | lyophilized powder reconstituted in D2O |
| KWS-2 instrument | JCNS outstation at the MLZ, Garching, Germany | - | small angle neutron instrument |
| Liquinox dish detergent | Alconox | - | Phosphate-free liquid lab glassware cleaner |
| Na2HPO4·7H2O | Sigma-Aldrich | Product No.S9390 | disodium phosphate heptahydrate salt |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Product No.S9888 | sodium chloride salt |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | Product No. S9638 | monosodium phosphate monohydrate salt |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Catalog number: ND-2000 | NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer |
| Neutron alignment camera | NeutronOptics, Grenoble | NOG210222 | 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor |
| Parafilm M - wax parafilm | Bemis | Parafilm M - 5259-04LC PM996 | all-purpose laboratory film in cardboard dispenser |
| Phoenix-J-NSE Spectrometer | JCNS outstation at the MLZ, Garching, Germany | - | neutron spectrometer |
| SasView | https://www.sasview.org/ | ||
| SAXSpace, Anton Paar instrument | FZ-Jülich | - | small angle x-ray instrument |
| Slide-A-Lyzer dialysis membranes | Thermo Scientific | 88400-88405 | Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO |
| SNS Remote Analysis Cluster | Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) | https://analysis.sns.gov | |
| SNS-NSE spectrometer | ORNL, Oak Ridge, TN, USA | - | neutron spectrometer |
| Sterile syringe filters | VWR | N.A. PN:28145-501 | 0.2 µm pore size filters |
| Temperature Forcing System (TFS) | SP Scientific | Part Number 100004055 | sample environment equipment |
| Urea -d4 | Sigma-Aldrich | Product No. 176087 | deuterated Urea salt |
| Viscometer | FZ-Jülich | - | falling ball viscometer |
References
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