Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Undersøgelse af proteindynamik via neutronspinekkospektroskopi

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/61862
Automatic Translation
1
1NSD, Oak Ridge National Laboratory

Summary

Denne protokol beskriver metoder til undersøgelse af strukturen og dynamikken i to modelproteiner, der har en vigtig rolle i menneskers sundhed. Teknikken kombinerer bench-top biofysisk karakterisering med neutron spin ekko spektroskopi for at få adgang til dynamikken på tids- og længdeskalaer, der er relevante for protein interdomain bevægelser.

Abstract

De fleste menneskelige kropsproteiners aktivitet og funktionalitet er relateret til konfigurationsændringer af hele underdomæner inden for proteinkrystalstrukturen. Krystalstrukturerne bygger grundlaget for enhver beregning, der beskriver strukturen eller dynamikken i et protein, det meste af tiden med stærke geometriske begrænsninger. Disse begrænsninger fra krystalstrukturen er imidlertid ikke til stede i opløsningen. Strukturen af proteinerne i opløsningen kan afvige fra krystallen på grund af omlejringer af sløjfer eller underdomæner på pico til nanosekund tidsskala (dvs. det interne proteindynamiktidsregime). Det nuværende arbejde beskriver, hvordan langsomme bevægelser på tidsskalaer på flere titalls nanosekunder kan tilgås ved hjælp af neutronspredning. Især den dynamiske karakterisering af to store humane proteiner, et iboende uordnet protein, der mangler en veldefineret sekundær struktur og et klassisk antistofprotein, behandles ved neutron spin ekkospektroskopi (NSE) kombineret med en bred vifte af laboratoriekarakteriseringsmetoder. Yderligere indsigt i proteindomænedynamik blev opnået ved hjælp af matematisk modellering til at beskrive de eksperimentelle neutrondata og bestemme crossover mellem kombinerede diffusive og interne proteinbevægelser. Ekstraktionen af det interne dynamiske bidrag til den mellemliggende spredningsfunktion opnået fra NSE, herunder tidsskalaen for de forskellige bevægelser, tillader yderligere syn på de mekaniske egenskaber af enkeltproteiner og proteinernes blødhed i deres næsten naturlige miljø i den overfyldte proteinopløsning.

Introduction

Sonderende dynamik af blødt stof med neutroner
Undersøgelse af proteiners og peptiders dynamiske egenskaber er en stor del af biofysisk forskning, og der findes i dag mange veludviklede metoder til at få adgang til en bred vifte af energilandskaber1. At relatere proteinernes eksperimentelt afslørede dynamik til deres biologiske funktion er en langt vanskeligere opgave, der kræver komplekse matematiske modeller og computerstøttede dynamiksimuleringer. Betydningen af neutronspektroskopi for analyse af proteinbevægelser er blevet understreget i flere velmodtagne og bredt anerkendte undersøgelser 1,2,3,4,5. Før du udforsker det mangfoldige energilandskab af intern proteindynamik, kræves der et kort overblik over de dynamiske processer i blødt stof, og hvordan neutroner kan få adgang til dem.

Neutronernes følsomhed over for isotopkonfiguration og den type interaktioner, de viser med blødt stof, gør neutronspredning til en af de mest alsidige undersøgelsesteknikker6. Der er et bredt spektrum af korrelationslængdeskalaer og korrelationstider, som neutroner kan få adgang til, fra nukleare excitationer og atomvibrationer til kollektive bevægelser og langsomme afslapningsprocesser som isotropiske rotationer og diffusive bevægelser. Når man undersøger de spredte neutroner for deres energioverførsel, kan der skelnes mellem tre hovedinteraktioner: den elastiske spredning, hvor der ikke er nogen energiudveksling mellem indkommende neutron og partikel i prøven; den uelastiske spredning med en stor, kvantificerbar energiudveksling mellem neutron og partikel; og det ejendommelige tilfælde af kvasi-elastisk spredning, der betegner en meget lille energioverførsel sammenlignet med den indfaldende neutronenergi 1,7. Disse interaktioner giver præcise oplysninger om det undersøgte materiale og danner det teoretiske grundlag for en lang række neutronspredningsteknikker.

I elastisk spredning registrerer detektoren neutronernes retninger som et diffraktionsmønster, der viser prøveatomernes position i forhold til hinanden. Oplysninger om korrelationerne mellem atompositioner erhverves (dvs. integreret intensitet S (Q) vedrørende momentumoverførslen Q, som kun vedrører strukturel information). Dette princip danner grundlaget for neutrondiffraktion8.

Kompleksitet opstår, når energioverførslen ikke længere er nul på grund af excitationer og interne udsving i prøvematerialet. Dette danner grundlag for neutronspektroskopi, hvor de spredte neutroner undersøges som en funktion af både energioverførslen E og momentumoverførslen Q. Dynamisk og strukturel information opnås. Neutronspektroskopi måler den samme integrerede intensitet S(Q) for energioverførsel (dvs. hastighedsændring af neutronerne på grund af prøvespredning, S(Q,ω) = S(Q, E), som også kaldes den dynamiske strukturfaktor)9.

Til beregning af spredningen fra et materiale er det mere hensigtsmæssigt at anvende parkorrelationsfunktionen 7,10. I diffraktionssagen giver den statiske parkorrelationsfunktion G (r) sandsynligheden for at finde midten af en partikel i en given afstand r fra centrum af en anden partikel. Spektroskopien generaliserer den statiske parkorrelationsfunktion og inkluderer energi / frekvens / tid i spredningsligningen. Parkorrelationsfunktionen G(r) bliver en funktion af tiden G(r, t), som kan nedbrydes til en særskilt atomparkorrelationsfunktion GD(r, t) og en selvkorrelationsfunktion GS(r, t). Disse beskriver to typer korrelationer: parkorrelerede bevægelser af atomer, der styrer den sammenhængende spredning, og selvkorrelation, der styrer den usammenhængende spredning10.

Sammenhængende spredning er spredningen fra "gennemsnittet" og afhænger af den relative fase af de spredte bølger. I småvinkelspredningsregimet interfererer de spredte neutronbølger fra forskellige spredningscentre (forskellige atomer) konstruktivt (har lignende faser), og atomernes kollektive bevægelse observeres med stærk intensitetsforbedring. Sammenhængende spredning beskriver i det væsentlige spredningen af en enkelt neutron fra alle kernerne i prøve10.

Når der ikke opstår nogen konstruktiv interferens mellem de spredte neutronbølger fra forskellige centre, følges et enkelt atom i tide, og selvkorrelationen mellem atomets position på tidspunktet t = 0 og det samme atom på tidspunktet t observeres. Således går oplysningerne om atomernes relative positioner tabt, og fokus er kun på lokale udsving. Spredning fra lokale udsving styrer usammenhængende spredning. Usammenhængende spredning er isotrop, bidrager til baggrundssignalet og nedbryder signal-til-støj10,11.

Ved at kombinere alt det ovenstående skelner vi mellem fire store neutronspredningsprocesser10: (1) elastisk sammenhængende (måler korrelationerne mellem atompositioner), (2) uelastisk sammenhængende (måler kollektive bevægelser af atomer), (3) elastisk usammenhængende (bidrager til baggrunden, reducerer spredningsintensiteten ved Debye-Waller-faktor (DWF) og måler elastisk usammenhængende strukturfaktor (EISF), der beskriver geometrien af diffusive bevægelser i begrænset geometri, og (4) uelastisk usammenhængende (måler enkeltatomdynamik og selvkorrelation).

Dynamikprocesser, som neutroner kan få adgang til i biologi, spænder fra dæmpning af lavfrekvente atomare og molekylære vibrationer, interaktionen mellem opløsningsmiddelmolekyler og biooverflader og diffusionsprocesser i hydreringslaget af makromolekyler og begrænset geometri til kortdistance translationelle, roterende og tumlende diffusive bevægelser og proteindomæner og allosteriske bevægelser1 . Den brede mangfoldighed af neutronmetoder og instrumenter til måling af proteindynamik er baseret på, hvordan akromatiseringen af den indfaldende eller udgående neutronstråle opnås, og hvordan energianalysen af de spredte neutroner udføres. Fra triple-axis til time-of-flight, backscattering og spin-echo spektrometre kan man udforske dynamiske processer med karakteristiske tider mellem 1 x 10-14 s og 1 x 10-6 s (femtosekund til mikrosekunder)12.

Oak Ridge National Laboratory, med sine to berømte neutronkilder, Spallation Neutron Source - SNS13 og High Isotope Flux Reactor - HFIR14, har en af de bedste suiter af spektrometre til undersøgelse af dynamik i biomaterialer. Nogle af de mest veltalende eksempler inkluderer brugen af det kolde neutronhakkerspektrometer (CNCS) ved SNS15 til at undersøge den dynamiske forstyrrelse af hydreringsvand omkring grønt fluorescerende protein i opløsning16 eller de sub-picosekund kollektive vibrationer af flere proteiner17. Et tilbagevendende problem med uelastiske neutronspredningsundersøgelser er, at nogle biologiske processer er for langsomme til at blive observeret. Uden ekstreme opsætninger, der fører til et enormt tab af neutronintensitet, er time-of-flight-spektrometre begrænset til 10 μeV energiopløsning, svarende til en maksimal tidsskala på ~ 200 ps10,11. Dette er ikke tilstrækkeligt til at observere store bevægelser i proteiner. Derfor er der ofte brug for instrumenter med højere energiopløsning som backscattering-spektrometrene. Kombinationen af flyvetids- og backscatteringsteknikker har vist sig at være effektiv til at undersøge ændringen i den interne dynamik i Cytochrome P450cam (CYP101), et enzym, der katalyserer hydroxyleringskamferen18.

Mikroskopisk diffusivitet målt ved backscattering-spektrometeret ved SNS-BASIS19 var overraskende veldefineret og kunne adskilles i diffusiviteten af vand (hydrering, cytoplasmisk og bulklignende vand) og diffusiviteten af cellebestanddele i planariske fladorme, det første levende dyr, der blev undersøgt ved neutronspredning20 . Backscattering er en højopløsningsspektroskopisk teknik, men den er også begrænset til flere μeV = flere nanosekunder, mens den langsomme dynamik i biomaterialer også manifesterer sig som overlevelsestiden for korrelation mellem atomposition eller spinorientering (f.eks. Afslapningsprocesser, som regelmæssigt sker i tidsintervallet ti til hundreder af nanosekunder).

Neutron spin ekko spektroskopi (NSE) er den eneste neutronspredningsteknik, der når så høj opløsning. I modsætning til andre neutronteknikker kræver NSE ikke akromatisering af strålen, da den bruger neutronernes kvantemekaniske fase, som er deres magnetiske øjeblikke. Manipulationen af magnetiske øjeblikke tillader anvendelse af en bred neutronstrålebølgelængdefordeling, mens teknikken er følsom over for meget små neutronhastighedsændringer i størrelsesordenen 1 x 10-4. NSE er med succes blevet brugt til at undersøge den langsomme dynamik af proteiner i opløsning for mange proteiner. Blandt disse mange pionerstudier anerkender vi undersøgelsen af segmentfleksibiliteten af svineimmunoglobulin21; de koblede domænebevægelser i Taq-polymerase22; domænebevægelserne i tetrameren af gæralkoholdehydrogenase23; ændringen af konformation i phosphoglyceratkinase ved substratbinding3; aktivering af domænebevægelser og dynamisk udbredelse af allosteriske signaler i Na+/H+-udvekslingsregulerende cofaktor 1 (NHERF1)-proteinet 4,24,25 dynamikken i en kompakt tilstand af mercurisk ionreduktase26; og diffusion af hæmoglobin i røde blodlegemer27. To nyere undersøgelser i proteindynamik har afsløret fleksibiliteten af humant antistof Immunoglobulin G (IgG) som en entropisk forår28 og egenskaberne ved opløsningsmiddelbidrag til dynamikken i iboende forstyrret myelinbasisk protein (MBP)5.

Denne artikel forklarer de grundlæggende principper for NSE, de mange forberedende metoder, der anbefales til en grundig proteindynamikundersøgelse, samt metoden og den eksperimentelle protokol til NSE-dataindsamling ved NSE-spektrometeret ved SNS, SNS-NSE. Protokollen karakteriserer to proteiner: IgG, et almindeligt humant antistofprotein, og det iboende uordnede protein MBP. De biofysiske implikationer, eksemplernes forskningsrelevans og teknikkens begrænsninger diskuteres kort.

NSE-spektroskopi, metoden til målinger af langsom dynamik
NSE er en polariseret teknik, der bruger neutron-time-of-flight til at måle udvekslingen af energi (tab af polarisering) på grund af den kvasi-elastiske interaktion mellem neutroner og atomer i en prøve. Kernen i NSE-spektroskopi ligger to grundlæggende principper: (1) neutronspinets evne til at præcessere i magnetfeltet med en frekvens, der er proportional med magnetisk styrke Equation 1, nemlig Larmor-frekvensen29, og (b) spin-ekkoet eller Hann-ekkoet, der repræsenterer manipulation og refokusering af polarisationssignalet, når der anvendes en række radiofrekvensimpulser30.

Det grundlæggende i NSE-processen kan opsummeres i et par enkle trin 6,11 ved hjælp af figur 1. (1) Neutronstrålen produceret af kilden (position 1) polariseres (position 2), styres og transporteres (position 3) og ankommer til indgangen til NSE-spektrometeret, hvor den roteres med 90 ° af den første pi-half flipper (position 4). (2) Den polariserede stråle (f.eks. neutronmagnetiske øjeblikke) bliver vinkelret på den første magnets magnetfeltlinjer (første præcessionszone, position 5) og begynder at gå forud. (3) I slutningen af magneten akkumulerer neutronspins en bestemt præcessionsvinkel, der er proportional med magnetfeltstyrken og flyvetiden brugt indeni (stort set omvendt proportional med neutronhastigheden). De enkelte neutronhastigheder er kodet inden for deres præcessionsvinkel i slutningen af den første præcessionszone. (4) Tæt på prøvepositionen vender pi-flipperen (position 6) orienteringen af spin med 180° og ændrer tegnet på præcessionsvinklen. (5) Neutronerne interagerer med prøvens molekyler (position 7) og bliver spredt. (6) De spredte neutroner kommer ind og går ind i den anden præcessionszone (position 8), men bliver omvendt orienterede. (7) En anden pi-half flipper (position 9) bruges til at rotere spinnets retning fra vinkelret på vandret retning. Dette vil stoppe præcessionen og oversætte præcessionsvinklen φ til polarisering proportional med cos (φ). (8) Analysatoren (position 10) vælger neutronerne baseret på en retning. Hvis interaktionen med prøven er elastisk, ændres neutronens hastighed ikke. Neutronerne vil bruge en identisk mængde tid på at flyve i den første og anden præcessionszone, og de akkumulerede præcessionsvinkler genvindes fuldt ud. Den fulde polarisering genoprettes på detektoren (position 11) som et ekko af den oprindelige polarisering (dvs. spin-ekko). (9) I NSE er spredningen imidlertid kvasi-elastisk, så en lille energiudveksling mellem neutroner og prøvemolekyler fører til forskellige neutronhastigheder efter spredning af prøven. På grund af de forskellige hastigheder vil neutronerne bruge en ekstra tid på at flyve gennem den anden præcessionszone og vil ikke have genoprettet deres præcessionsvinkel korrekt. En delvis polarisering hentes på detektoren, og tabet af polarisation på grund af spinafslapning er proportional med cos-Fourier-transformationen af spektralfunktionen S(Q, ω), den mellemliggende spredningsfunktion F(Q, t). (10) Tidsparameteren for funktionen F(Q, t) er proportional med præcessionens magnetfeltstyrke. Scanning af tabet af polarisation som en funktion af magnetfeltstyrken giver derfor en afslapningsfunktion, der afhænger af de dynamiske processer i prøven.

Figure 1
Figur 1: Fotografi af NSE-spektrometeret ved SNS (SNS-NSE) og neutronfluebane skematisk med de vigtigste funktionelle komponenter. Fra højre mod venstre: 1 = neutronkilde; 2 = choppers-bender-polarizer-sekundær lukkersystem; 3 = bjælketransport guider; 4 = pi/2 flipper til første 90° spin-turn; 5 = første præcessionszone; 6 = pi flipper til 180 ° spin-turn; 7 = prøveareal og prøvemiljø (her vises kryoovnen); 8 = anden præcessionszone; 9 = pi/2 flipper til anden 90° spin-turn; 10 = analysator; 11 = detektor. (Bemærk, at dele af 3, såvel som 2 og 1, er placeret bag den blå væg inde i afskærmning; chopperne erstattes af en hastighedsvælger til reaktorbaseret NSE). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Det nuværende arbejde karakteriserer to proteiner: et almindeligt humant antistofprotein IgG og det iboende forstyrrede MBP. Den frysetørrede form af proteinerne blev opnået fra kommercielle kilder (se Materialetabel).

1. Forberedelse af proteinprøver

  1. Der fremstilles en 50 mM natriumphosphat + 0,1 M NaCl buffer ved vejning og opløsning af de respektive faste reagenser i tungt vand (D2O) (se materialetabel). Dette er det deutererede bufferopløsningsmiddel til IgG.
    1. Bufferopløsningens pH justeres til 6,6.
  2. Der fremstilles en 20 mM natriumphosphat + 6 M ureabuffer ved vejning og opløsning af de respektive faste bestanddele i tungt vand (D2O). Dette er det deutererede bufferopløsningsmiddel til MBP.
    1. Bufferopløsningens pH-værdi justeres til 4,7.
  3. Bufferopløsningsmidlerne filtreres ved hjælp af filtre i porestørrelse på 0,2 μm (se materialetabel).
  4. De oprensede proteinlyofiliserede pulvere vejes og opløses i de deutererede opløsningsmidler for de respektive proteiner (trin 1.1.-1.2) ved høj proteinkoncentration (~50 mg/ml).
  5. Proteinopløsningen fyldes i dialysekurve med dialysemembraner på 3,5 K MWCO, og dialyseres mod den filtrerede buffer i 24 timer ved 10 °C for MBP og 25 °C for IgG (se materialetabel) ved at ryste rørene let for at skabe en diffusionsgradient.
  6. Fortynd proteinopløsningen ved hjælp af dialysebufferen i en række koncentrationer: 1, 2, 5, 10 og 50 mg / ml.
  7. Bestem de nøjagtige koncentrationer ved hjælp af et Nanodrop-spektrofotometer (se Materialetabel).

2. Foreløbig prøvekarakterisering ved dynamisk lysspredning (DLS)

  1. Indfør 80 μL af hver proteinopløsning fra koncentrationsserien fremstillet ovenfor (trin 1.6.) i DLS-engangscellen (se materialetabel), og diffusionskoefficienterne bestemmes i gennemsnit over 10 anskaffelser.
  2. De translationelle diffusionskoefficienter afbildes som funktion af proteinkoncentrationen, og der ekstrapoleres til nulkoncentration.
  3. Indlæs hver proteinopløsning fra koncentrationsserien i kapillærrørene på et viskosimeter (se materialetabel), og mål den dynamiske viskositet.
  4. De dynamiske viskositeter målt som funktion af proteinkoncentrationen afbildes, og der ekstrapoleres til nulkoncentration.
    BEMÆRK: Ekstrapoleringen af DLS-diffusion til nulkoncentration giver værdien af translationel diffusion for et enkelt protein. Ekstrapoleringen af dynamisk viskositet til nulkoncentration skal give den dynamiske viskositetsværdi målt eksperimentelt for bufferopløsningen.

3. Indsamling af småvinkelspredning (neutron eller røntgen)

  1. Småvinklet neutronspredning (SANS) og/eller småvinklet røntgenspredning (SAXS) (se materialetabel) måles på fire proteinkoncentrationer, fortrinsvis 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml og 50 mg/ml.
  2. Normaliser SANS- og SAXS-spektre efter proteinkoncentration.
  3. Tilpas proteinformfaktor P(Q) til SANS- og SAXS-spektrene ved hjælp af ensembleoptimering31 og/eller SasView32-software .
  4. Strukturfaktoren S(Q, c) beregnes ved at dividere SANS- og SAXS-signalet med P(Q) for hver koncentration.
    BEMÆRK: Læsere, der er interesseret i, hvordan man måler og fortolker småvinkelspredningsdata som støtte til NSE-målinger, opfordres til grundigt at konsultere referencerne 23,28,31,32,33.

4. Måling af NSE

  1. Konfigurer eksperimentet, og monter eksemplet ved at følge nedenstående trin.
    1. Vælg tykkelsen af cellen til prøvebelastning baseret på koncentrationen af proteinopløsningen, den temperatur, der er nødvendig til måling, og mængden af tilgængelig opløsning.
      BEMÆRK: I denne undersøgelse blev der anvendt toplæsser gennemsigtige kvartsbeholdere på 40 mm x 30 mm x 4 mm.
    2. Rengør cellen gentagne gange, skiftevis mellem fosfatfrit opvaskemiddel (se Materialetabel), deioniseret vand og 70% ethanol.
    3. Tør cellen i konvektionsovnen; må ikke overstige 80 °C for kvartscellerne.
    4. Hæld 4 ml proteinopløsning i cellen og luk med hætter. Brug voksfilm eller ethvert fugemasse (se Materialetabel) til at forsegle prøvecellerne.
      BEMÆRK: I denne undersøgelse blev der anvendt 4,8 ml opløsning ved ~50 mg/ml for at opnå tilstrækkelig spredningsintensitet.
    5. Der hældes 4 ml dialysebuffer i en identisk beholder som proteinprøven og forsegles.
    6. Transporter prøver til strålelinjen, luk lukkeren, og gå ind i spektrometerindkapslingens huleområde34.
    7. Prøvecellen monteres på aluminiumsprøveholderen ved at stramme skruerne og holdepladerne (figur 2, venstre panel).
      BEMÆRK: Man kan montere to prøveceller på samme tid, da den samme måleprotokol er nødvendig for alle prøver.
    8. Grafitprøven og/eller Al2 O3-pulverprøvenanbringes i en beholder, der er identisk med proteinprøven. Disse er standarder leveret af SNS-NSE beamline support.
    9. Anbring prøveholderen ved forsigtigt at skubbe den ned i dåsen i temperaturtvingningssystemet (TFS, se Materialetabel).
      BEMÆRK: TFS er det mest anvendte prøvemiljø ved SNS-NSE og pumper tør luft ind i prøvebeholderen for at opnå den ønskede temperatur (figur 2, midterste og højre paneler).
    10. Luk TFS-låget, og indstil temperaturen til den ønskede værdi ved at få adgang til TFS'ens interaktive skærm.
    11. Monter neutronkameraet (se Materialetabel) for justering af prøverne til strålen.
    12. Fej instrumentkabinettet, evakuer, luk dørene, og åbn strålelukkeren.
      BEMÆRK: Prøveceller leveres af SNS-NSE-strålelinjestøtten. For tilgængelige prøveceller og prøvemiljøbiblioteket henvises til SNS-NSE beamline-websidenside 7,35.
  2. Indsaml NSE-dataene ved at følge nedenstående trin.
    1. Juster prøven i neutronstrålen ved hjælp af neutronkameraet og de fire uafhængige prøveåbninger.
    2. Åbn SNS-NSE-dataindsamlingssoftwaren36 , og indsaml eksempelstatistikker ved at køre diffraktionsscanninger for de ønskede spredningsvinkler og bølgelængde.
    3. Konfigurer måleparametrene baseret på de statistikker, der er indsamlet for hver prøve, ved at redigere målemakroerne fra den assisterende instrumentforsker.
    4. Start scanningen ved at skrive protokolnavnet ved kommandoprompten, og hent ekkoer til prøven.
    5. Start scanning og indhent ekkoer også til den elastiske reference og det bufferede opløsningsmiddel. Udfør intermitterende strålelukker for prøveændringen.

Figure 2
Figur 2: NSE målesystem. Venstre panel: proteinopløsningsprøver i kvartsbeholder monteret med skruer og plader på aluminium (Al) prøveholderen. Al-prøveholderen giver mulighed for at montere to prøver samtidigt inde i prøvemiljøet. Mellempanel: TfS-prøven (Temperature Forcing System) kan monteres på prøvetrinnet neutronstrålevinduet er til højre, mens neutronkameraet, der bruges til justering, er synligt på venstre side. Højre panel: Placering af prøveholderen med to prøver i prøven kan arbejde med silicium (Si) vinduer. Klik her for at se en større version af denne figur.

5. Reduktion af NSE-data

BEMÆRK: SNS-NSE er udstyret med en dedikeret software ved navn DrSpine (datareduktion for spin-echo)37,38 tilgængelig på ORNL Neutron Sciences Remote Analysis Cluster, en hurtig brugervejledning og indbygget hjælpesupport.

  1. Log ind på Neutron Sciences Remote Analysis Cluster (se Materialetabel) med ORNL-brugerlegitimationsoplysninger, og tryk på knappen Start session .
  2. Konfigurer datareduktionssoftwaren ved at følge nedenstående trin.
    1. Åbn et terminalvindue i brugermappen og skriv: source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh.
    2. Skriv derefter: drspine_create_env.sh.
  3. Opret en mappe til datareduktion i hjemmemappen, og kopier de medfølgende scripts og makroer fra den delte mappe.
  4. Rediger, omdøb og gem den reduktionsmakro, der leveres i overensstemmelse hermed.
  5. Skriv drspine ved kommandoprompten, og tryk på enter for at starte softwarereduktionsmiljøet.
  6. Skriv "navnet på reduktionsmakroen" redigeret i trin 5.4. i kommandoprompten i softwaremiljøet, og tryk på Enter.

6. Tilpasning af NSE-data

  1. Rediger python-scriptet "stapler-drspine.py", leveret af den assisterende instrumentforsker, med navnene på de reducerede fildata.
    BEMÆRK: Python-scriptet er frit tilgængeligt for brugere af instrumentet.
  2. Rediger funktionen, så den passer fra det angivne bibliotek.
  3. Skriv navnet på det redigerede script "stapler-drspine.py" ved kommandoprompten, og tryk på Enter for at læse, tilpasse og plotte reducerede NSE-data.
    BEMÆRK: Instrumentforskeren vil levere en skabelon til reduktionsmakroen og python-scriptet "stapler-drspine.py", der kan læse og passe til NSE-reducerede data. De endelige reducerede NSE-data er i ASCII-format og kan læses af forskellige foretrukne software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

IgG-protein fra humant serum og bovint MBP-protein blev rekonstitueret i høje koncentrationer (~ 50 mg / ml) i D2O-basebuffere. Da proteinerne blev opløst i høje koncentrationer, var de opnåede opløsninger overfyldte proteinopløsninger. Dynamikken undersøgt ved hjælp af NSE lider af det overfyldte miljø, som proteinerne befinder sig i (strukturfaktorinteraktioner og hydrodynamikeffekter)5,28,39. DLS blev udført på en koncentrationsserie for hvert protein for at tage højde for trængselseffekter. Ekstrapoleringen til nulkoncentration af de translationelle diffusionskoefficienter målt ved DLS giver værdien af translationel diffusion for et enkelt protein. Den dynamiske viskositet som funktion af proteinkoncentrationen skal også måles før NSE for at tage højde for de hydrodynamiske interaktioner. Ekstrapoleringen til nulkoncentration af de dynamiske viskositeter som funktion af koncentrationen skal give den værdi, der eksperimentelt kan måles for bufferopløsningen af hver fremstillet proteinprøve.

Formen og strukturen af proteiner i koncentreret opløsning blev vurderet forud for ethvert NSE-eksperiment for at få indsigt i proteinformfaktoren og styrken af strukturfaktoren, hvilket kan påvirke, hvordan proteinerne bevæger sig i opløsning. Småvinkelspredning var den foretrukne metode til disse undersøgelser. I denne undersøgelse blev den strukturelle konformation af IgG-protein i opløsning observeret af SAXS, og strukturen af MBP blev vurderet af SANS. Den målte spredningsintensitet (Q) (trin 3.3.-3.4) er proportional med produktet mellem formfaktoren P(Q) og strukturfaktoren S(Q,c) vægtet med antallet af partikler (ligning 1)5,28,39:

I (Q) = N ∙ P (Q) ∙S (Q, c) (1)

SAXS blev målt på et Kratky-type SAXS instrument40 med en røntgenbølgelængde på 0,154 nm for IgG, og SANS blev målt41 for MBP med en neutronbølgelængde på 4,5 Å. De eksperimentelle småvinkelintensiteter I(Q) var baggrunds- og opløsningsmiddelkorrigerede, skaleret efter opløsningskoncentration, og formfaktoren blev beregnet ved hjælp af frit tilgængelige softwarepakker som Ensemble modeling-EOM og SasView 24,25,29,39,42,43. Endvidere blev strukturfaktoren for hvert protein opnået fra ligning 1.

Til denne undersøgelse blev NSE-eksperimenterne udført med to spin-ekko-spektrometre: SNS-NSE-instrumentet34 i figur 1 og Phoenix-J-NSE-instrumentet44. Der blev målt hændelsesbølgelængder mellem 8 Å - 12 Å, med Fourier gange mellem 0,1 ns ≤ tmax ≤ 130 ns for flere Q-målinger mellem 0,05 Å−1- 0,2 Å−1. Forskellen mellem de to spektrometre er et afgørende punkt i forståelsen af NSE-videnskaben, og de repræsenterer både det gamle koncept med et såkaldt "klassisk spin-ekko" for den statiske neutronkilde i en reaktor og det nye "time-of-flight-koncept" for den pulserende neutronkilde. Phoenix-J-NSE-spektrometeret er en klassisk type NSE, hvor en hastighedsvælger vælger en bestemt bølgelængde. For at tillade variationer i neutronhastighederne introduceres en ± 10% bølgelængdebåndbredde. På trods af det meget smalle energibånd, der bruges til en enkelt scanning, sikrer situationen for Phoenix-J-NSE-spektrometeret ved en reaktorkilde med høj flux rumvektor og korrelationer, at tidsintervaller dækkes i relativt korte måletider. SNS-NSE-spektrometeret er den nye generation af choppers neutronspektrometer med ultrahøj opløsning med et bølgelængdespænd på 2 Å < λ < 14 Å og en samtidig bølgelængdebåndbredde på 2,4 Å - 3,6 Å, afhængigt af spektrometerets position. På grund af denne brede båndbredde opnås høj dataindsamlingseffektivitet, hvilket muliggør næsten gapless dækning af et bredt bølgevektortidsinterval med kun få spredningsvinkelindstillinger. Valget af bølgelængdebånd i SNS-NSE foretages af et choppersystem bestående af fire choppere. Begge NSE-spektrometre, der diskuteres her, har præcessionsfelter baseret på superledende teknologi med høj magnetfelthomogenitet, nye state-of-the-art feltkorrektionselementer til omstrejfende feltkorrektioner og nye polariserende benders41,42.

NSE-spektrene blev målt ved 10 °C for MBP-protein og 25 °C for IgG1-protein. Den sammenhængende mellemliggende spredningsintensitet I(Q, t) / I(Q, t = 0) målt ved NSE er det bidragende resultat af alle de dynamiske processer i prøven, der sker inden for den undersøgte tidsskala. Dette indeholder den interne proteindynamik, den overordnede translationelle diffusion, rotations- og tumblingdiffusionen og segmentbevægelserne i selve proteinmolekylet. En forenklet model forudsætter, at den interne dynamik og de translationelle og roterende diffusioner er fuldstændigt afkoblet 5,45,46,47,48 og kan karakteriseres separat. For den enkelte partikel kan den sammenhængende spredningsfunktion skrives som produktet (ligning 2)23,48:

F (Q, t) = Ftrans(Q, t) ∙Frot(Q, t) ∙Fint(Q, t) (2)

hvor den translationelle diffusionsbetegnelse for et enkelt stift protein er en eksponentiel funktion af den translationelle diffusionskoefficient DT (ligning 3)23,48:

Ftrans(Q, t) = exp(−Q2∙ DT∙ t) (3)

For store koncentrationer af proteiner påvirkes den translationelle diffusionskoefficient DT af protein-protein-interaktioner, kvantificeret af strukturfaktoren S(Q) og af hydrodynamiske interaktioner beskrevet ved den hydrodynamiske funktion HT(Q) (ligning 4)23,48:

DT(Q) = DT0 ∙HT(Q, c) / S(Q, c) (4)

I ligning 4 er DT0 den ekstrapolerede diffusionsværdi til nulkoncentration fra DLS-målingerne (trin 2.2.). HT beregnes som HT = 1 -c∙ [η], hvor c er proteinkoncentrationen, [η] er den indre viskositet beregnet ved [η] = (η - η0) / η0 ∙ c, og η0 er den målte dynamiske viskositet (trin 2.3.-2.4.). Strukturfaktoren S(Q, c) blev opnået ud fra SAXS-målinger for IgG-proteinet og SANS-målinger for MBP-proteinet.

Figur 3 viser eksempler på mellemliggende spredningsfunktioner I(Q, t) / I(Q, t = 0), målt ved NSE for IgG- og MBP-proteiner. En klar afvigelse fra en simpel diffusionslignende afslapningsproces blev observeret på den korte Fourier-tidsskala, <25 ns, hvilket indikerer tilgængeligheden af proteinintern dynamik ved NSE og behovet for en mere kompleks model til at beskrive de observerede dynamiske processer.

Figure 3
Figur 3: NSE-afslapningsspektre for IgG- og MBP-proteiner. IgG-dataene er vist her kun tilpasset af en enkelt eksponentiel funktion for at afsløre afvigelsen fra diffusion ved kortere Fourier-tider. Afvigelsen blev observeret for begge proteiner. I modsætning hertil vises MBP-dataene her i det fulde afslapningsområde, monteret af modellen udviklet afBiehl45. Modellen indebærer grovkornet og muliggør samtidig tilpasning af korte, mellemliggende og lange Fourier-tidsregimer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Derfor blev spredningsfunktionerne tilpasset ved atommodellering af begge proteiner ved hjælp af modeller udviklet af Biehl, beskrevet ireferencerne 18,25,38,43,44,46. Den mellemliggende spredningsfunktion blev beregnet ved grovkorning til et par hundrede individuelle korn, i modsætning til all-atom simulering, for at reducere beregningsbelastning og tid, og MMTK49 softwarebiblioteket (frit tilgængeligt) blev brugt til at få adgang til atomkoordinater og implementere transrotationsbevægelser på proteindomæner og fragmenter. Resultaterne af den mellemliggende spredningsfunktionsberegning for begge proteiner var i fremragende overensstemmelse med de eksperimentelle NSE-data og beviste, at den langsommere dynamik observeret ved lange Fourier-tider kan tilskrives de overordnede translationelle og roterende diffusionsprocesser, mens den hurtige dynamik observeret på korte tidsskalaer kan tilskrives dynamikken i proteindomæner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NSE-spektroskopi giver et unikt og detaljeret billede af proteinernes dynamik, som andre spektroskopiske teknikker ikke kan producere. Målinger over en længere tidsskala giver observationer af både proteinernes translationelle og rotationsdiffusion, som præsenteret her. Segmentdynamikken og andre interne svingninger afslører sig som et stærkt henfald af den sammenhængende spredningsfunktion S(Q, t) på en kort tidsskala og er godt adskilt fra de overordnede diffusionsafspændingsprocesser. De vigtigste begrænsninger ved NSE-teknikken er den forlængede måletid og de store prøvemængder, der er nødvendige for at opnå et godt statistisk signal. Dette kan udgøre en udfordring for måling af relevante makromolekylære systemer, der udviser lave koncentrationer af de mobile arter og reducerede levetider.

Intern dynamik i IgG
IgG-protein har en Y-formet struktur, der er specifik for antistoffer, der kan tilnærmes af tre store fragmenter forbundet med fleksible linkere. En matematisk model af tre betydelige partikler, der bor i harmonisk potentiale, blev antaget for denne form for struktur. Linkerne blev tilnærmet af elastiske fjedre, der giver en fast ligevægtsposition, men tillader udsving som en form for brownsk bevægelse. Tre frihedsgrader blev tilladt for hvert fragment omkring den relative ligevægt28. Den interne dynamik repræsenteret af Fint (Q, t) i ligning 2 blev beskrevet af Ornstein-Uhlenbeck-processen50,51. Modellen tillader beregning af den gennemsnitlige kvadratiske forskydning af fragmenterne i den potentielle dip, tidsskalaen for forskellige bevægelser, friktionen og de kraftkonstanter, der opstår. Amplituden af den indre bevægelse blev tilnærmet ved normal tilstandsanalyse under hensyntagen til forskellige bevægelsesgrader for hvert fragment. En omfattende beskrivelse af modellen og de resulterende matematiske parametre er uden for rækkevidde her, men kan findes i detaljer i reference28. I dette casestudie af IgG blev der observeret en klar signatur af den interne dynamik på tidsskalaen for flere nanosekunder. Den beregnede fjederkonstant for linkeren ser ud til at være realistisk sammenlignelig med en entropisk fjeder af tilsvarende længde. Den observerede effektive friktion synes tæt på friktionen af et frit ubundet IgG-fragment. Den allerede eksisterende ligevægtshypotese blev valideret med antaget sameksisterende "åbne" eller "lukkede" konfigurationer af IgG'er, der er i ligevægt, der udviser forskellige bindingssteder og bindingsspecificiteter28. Disse oplysninger kan være relevante for at forstå antistoffernes mekanik, og om denne mekaniske adfærd kan bruges til at forbedre biokompatibilitet og biotilgængelighed.

Intern dynamik i MBP
MBP-strukturen har en kompakt kugleformet kerne, der tillader stærke stræknings- og bøjningsbevægelser med sine fleksible tilfældige spoleender. MBP-dynamik blev fortolket ved hjælp af fleksible polymermodeller med og uden tilsætning af intern friktion28,39. Som i tilfældet med IgG kan observationerne af MBP's interne dynamik forenes inden for teorien om brownsk bevægelse, hvor en større bevægelsesamplitude resulterer i længere afslapningstid med påvirkninger fra den indre friktion i proteinkæden. Den øgede afslapningstid med en større amplitude af bevægelser, men mindre friktion kan beskrives ved hjælp af den samme Ornstein-Uhlenbeck-proces50,51 af brownsk bevægelse i et harmonisk potentiale. Interne bevægelser med store amplituder, men langsomme afslapningstider, bliver aktive ved fuld denaturering af MBP fra dets oprindelige tilstand ved at reducere de genoprettende kræfter i kædekonfiguration (dihedrale potentialer) og ved at udjævne de lokale energibarrierer. Detaljerede beskrivelser af MBP's interne dynamik i den oprindelige og denaturerede tilstand findes yderligere ireferencerne 28,39. I undersøgelsen af MBP afslørede undersøgelsen ved hjælp af NSE en dynamisk adfærd, der pegede mod mellemliggende kompaktitet af proteinet mellem tilfældige spolepolymerer og kugleformede proteiner. Det betydelige bidrag fra intern proteindynamik med en afslapningshastighed på flere nanosekunder blev styret af lavfrekvente kollektive stræknings- og bøjningsbevægelser5. Beskrivelse af den oprindelige MBP-dynamik ved modeller fra polymerteorinedbrydning blev tilvejebragt på grund af en stor værdi af proteinintern friktion. I denatureret MBP reduceres den interne friktion i proteinkæden, og polymerkædekarakteren af afslapningsspektret hersker. Den høje fleksibilitet i de strukturelle ensemblebevægelser kan bidrage til at øge den tilgængelige proteinoverflade og derved lette interaktionen med forskellige bindingspartnere.

Dynamiske modeller
Mens NSE som teknik er eksperimentelt unik til vurdering af lavfrekvente harmoniske bevægelser i biologiske makromolekyler og molekylære underenheder, kræver analysen af den mellemliggende spredningsfunktion en sammenligning med neutronspektre afledt af forskellige matematiske modeller. Modellen præsenteret her og udviklet af Biehl et al.28 til koncentrerede proteinopløsninger bruger en elastisk netværks tilnærmelse, hvor den mellemliggende spredningsfunktion er en sammenblanding af korrekte modulære funktioner, og brownske oscillatorer repræsenterer den interne dynamik. Dette er en af de meget få tilgængelige modeller til analyse af proteinernes segmentdynamik. En anden veletableret model for fortyndede proteinopløsninger er modellen foreslået af Bu et al.52, som er en robust model, der bruger statistisk mekanik og ikke kræver komplekse pasformer eller flere parametre. En lignende tilgang baseret på dynamisk afkoblingstilnærmelse kan også anvendes på fortyndede systemer for at karakterisere den effektive diffusion som en sum af selvtranslationelle og interne bevægelser53. Flere af vores referencer kan give omfattende rapportering om disse modeller og deres begrænsninger. Vi anbefaler stærkt Fitter et al.1 og Liu et al.54.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser og ingen interessekonflikter. Manuskriptets indhold er baseret på den forelæsning, forfatteren præsenterede i HANDS-Neutron Scattering Applications in Structural Biology School mellem 2019-2021.

Acknowledgments

Denne forskning brugte ressourcer på Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, Biologi og Kemi laboratorier), et DOE Office of the Science User Facility, der drives af Oak Ridge National Laboratory. Denne forskning brugte også ressourcer på MLZ-FRM2-reaktoren Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) og JCNS1 på Forschungszentrum Jülich GmbH, Tyskland. Forfatteren anerkender Dr. Ralf Biehl og Dr. Andreas Stadler for deres hjælp med modellering og deres bidrag til både IgG- og MBP-proteinforskning, Dr. Piotr A. Żołnierczuk for NSE-datareduktionsstøtte, Dr. Changwoo Do for støtte med SANS-målinger og Rhonda Moody og Dr. Kevin Weiss for SNS biokemilaboratoriestøtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine MBP protein solution Sigma-Aldrich M1891 lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O - heavy water Sigma-Aldrich Product No. 151882 liquid
Dionized water in house - for washing / cleanning cells
DLS instrument Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich - dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standards SNS-NSE, ORNL - Al2O3  and Graphite powders
Ethanol Sigma-Aldrich 65350-M 70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solution Sigma-Aldrich I4506 lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrument JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - small angle neutron instrument
Liquinox dish detergent Alconox - Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2O Sigma-Aldrich Product No.S9390 disodium phosphate heptahydrate salt
NaCl Sigma-Aldrich Product No.S9888 sodium chloride salt
NaH2PO4·H2O Sigma-Aldrich Product No. S9638 monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific Catalog number: ND-2000 NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment camera NeutronOptics, Grenoble NOG210222 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M - wax parafilm Bemis Parafilm M - 5259-04LC PM996 all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE Spectrometer JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - neutron spectrometer
SasView https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument FZ-Jülich - small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranes Thermo Scientific 88400-88405 Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis Cluster Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometer ORNL, Oak Ridge, TN, USA - neutron spectrometer
Sterile syringe filters VWR N.A. PN:28145-501 0.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS) SP Scientific Part Number 100004055 sample environment equipment
Urea -d4 Sigma-Aldrich Product No. 176087 deuterated Urea salt
Viscometer FZ-Jülich - falling ball viscometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fitter, J., Gutberlet, T., Katsaras, J. Neutron Scattering in Biology: Techniques and Applications. , New York. (2006).
  2. Stadler, A., Monkenbusch, M., Biehl, R., Richter, D., Ollivier, J. Neutron spin-echo and TOF reveals protein dynamics in solution. Journal of the Physical Society of Japan. 82, (2013).
  3. Inoue, R. Large domain fluctuations on 50-ns timescale enable catalytic activity in phosphoglycerate kinase. Biophysical Journal. 99 (7), 2309-2317 (2010).
  4. Callaway, D. J. E., et al. Controllable activation of nanoscale dynamics in a disordered protein alters binding kinetics. Journal of Molecular Biology. 429 (7), 987-998 (2017).
  5. Stingaciu, L. R., Biehl, R., Changwoo, D., Richter, D., Stadler, A. M. Reduced internal friction by osmolyte interaction in intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (1), 292-296 (2020).
  6. Monkenbusch, M., Richter, D. High resolution neutron spectroscopy-a tool for the investigation of dynamics of polymers and soft matter. Comptes Rendus Physique. , (2007).
  7. Richter, D., Monkenbusch, M., Schwahn, D. Neutron Scattering. Polymer Science: A Comprehensive Reference, 10 Volume Set. , (2012).
  8. Wilson, C. C. Single Crystal Neutron Diffraction From Molecular Materials. , World Scientific. Singapore. (2000).
  9. Marshall, W. Theory of thermal neutron scattering. , Oxford University Press. (1971).
  10. Roger Pynn Introduction & Neutron Scattering "Theory". , Available from: https://neutrons.ornl.gov/sites/default/files/intro_to_neutron_scattering.pdf (2004).
  11. Richter, D. Neutron scattering in polymer physics. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 22-29 (2000).
  12. Harroun, T. A., Wignall, G. D., Katsaras, J. Neutron scattering for biology. Neutron Scattering in Biology. , (2006).
  13. SNS. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/sna (2020).
  14. HFIR. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/hfir (2020).
  15. CNCS. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/cncs (2020).
  16. Perticaroli, S., et al. Description of hydration water in protein (green fluorescent protein) solution. Journal of the American Chemical Society. 139 (3), 1098-1105 (2017).
  17. Perticaroli, S., Nickels, J. D., Ehlers, G., Sokolov, A. P. Rigidity, secondary structure, and the universality of the boson peak in proteins. Biophysical Journal. 106 (12), 2667-2674 (2014).
  18. Miao, Y., et al. Coupled flexibility change in cytochrome p450cam substrate binding determined by neutron scattering, NMR, and molecular dynamics simulation. Biophysical Journal. 103 (10), 2167-2176 (2012).
  19. Mamontov, E., Zamponi, M., Hammons, S., Keener, W. S., Hagen, M., Herwig, K. W. BASIS: A new backscattering spectrometer at the SNS. Neutron News. 19 (3), 22-24 (2008).
  20. Mamontov, E. Microscopic diffusion processes measured in living planarians. Scientific Reports. 9, 8708 (2018).
  21. Alpert, Y., Cser, L., Faragó, B., Franěk, F., Mezei, F., Ostanevich, Y. M. Segmental flexibility in pig immunoglobulin G studied by neutron spin-echo technique. Biopolymers. 24 (9), 1769-1784 (1985).
  22. Bu, Z., Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D., Callaway, D. J. E. Coupled protein domain motion in Taq polymerase revealed by neutron spin-echo spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (49), 17646-17651 (2005).
  23. Biehl, R., et al. Direct observation of correlated interdomain motion in alcohol dehydrogenase. Physical Review Letters. 101, 138102 (2008).
  24. Farago, B., Li, J., Cornilescu, G., Callaway, D. J. E., Bu, Z. Activation of nanoscale allosteric protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Journal. 99 (10), 3473-3482 (2010).
  25. Bu, Z., Callaway, D. J. E. Dynamic propagation of long-range allosteric signals by nanoscale protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Journal. 100 (3), 223 (2011).
  26. Hong, L., et al. Structure and dynamics of a compact state of a multidomain protein, the mercuric ion reductase. Biophysical Journal. 107 (2), 393-400 (2014).
  27. Longeville, S., Stingaciu, L. -R. Hemoglobin diffusion and the dynamics of oxygen capture by red blood cells. Scientific Reports. 7, 10448 (2017).
  28. Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring. Scientific Reports. 6, 22148 (2016).
  29. Hahn, E. L. Nuclear induction due to free larmor precession. Physical Review. 77, 297 (1950).
  30. Hahn, E. L. Spin echoes. Physical Review. 80, 580 (1950).
  31. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735-1782 (2003).
  32. Sasview. , Available from: https://www.sasview.org (2020).
  33. Zhao, J. K., Gao, C. Y., Liu, D. The extended Q-range small-angle neutron scattering diffractometer at the SNS. Journal of Applied Crystallography. 43, 5 PART 1 1068-1077 (2010).
  34. Ohl, M., et al. The high-resolution neutron spin-echo spectrometer for the SNS with τ ≥ 1 µs. Physica B: Condensed Matter. 350, 147-150 (2004).
  35. SNS-NSE web page. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/nse (2022).
  36. Ohl, M., et al. The spin-echo spectrometer at the Spallation Neutron Source (SNS). Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 696, 85-99 (2012).
  37. Zolnierczuk, P. A., Holderer, O., Pasini, S., Kozielewski, T., Stingaciu, L. R., Monkenbusch, M. Efficient data extraction from neutron time-of-flight spin-echo raw data. Journal of Applied Crystallography. 52 (5), 1022-1034 (2019).
  38. Dr Spine hub. , Available from: https://jugit.fz-juelich.de/nse/drspine (2022).
  39. Stadler, A. M., et al. Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), (2014).
  40. FZJ. , Available from: https://www.fz-juelich.de/portal/EN/AboutUs (2022).
  41. KWS2. , Available from: https://miz-garching.de/kws-2 (2022).
  42. Moorhouse, M., Barry, P. The protein databank. Bioinformatics Biocomputing and Perl. , (2005).
  43. Tria, G., Mertens, H. D. T., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (2), 207-217 (2015).
  44. Holderer, O., Monkenbusch, M., Schätzler, R., Kleines, H., Westerhausen, W., Richter, D. The JCNS neutron spin-echo spectrometer J-NSE at the FRM II. Measurement Science and Technology. 90 (4), 043107 (2008).
  45. Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D. Exploring internal protein dynamics by neutron spin echo spectroscopy. Soft Matter. 7 (4), 1299-1307 (2011).
  46. Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring. Scientific Reports. 6, 22148 (2016).
  47. Stadler, A. M., et al. Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6987-6994 (2014).
  48. Biehl, R., Richter, D. Slow internal protein dynamics in solution. Journal of Physics: Condensed Matter. 26 (50), 503103 (2014).
  49. Hinsen, K. The molecular modeling toolkit: A new approach to molecular simulations. Journal of Computational Chemistry. 21 (2), 79-85 (2000).
  50. Uhlenbeck, G. E., Ornstein, L. S. On the theory of the Brownian motion. Physical Review. 36 (5), 823 (1930).
  51. Wang, M. C., Uhlenbeck, G. E. On the theory of the Brownian motion II. Reviews of Modern Physics. 17, 323 (1945).
  52. Callaway, D. J. E., Bu, Z. Nanoscale protein domain motion and long-range allostery in signaling proteins-a view from neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Reviews. 7 (2), 165-174 (2015).
  53. Liu, Y. Intermediate scattering function for macromolecules in solution probed by neutron spin echo. Physical Review E. 95, 020501 (2017).
  54. Liu, Y. Short-time dynamics of proteins in solutions studied by neutron spin echo. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 42, 147-156 (2019).

Tags

Engineering Udgave 182 Neutronspredning neutron spin-ekko proteinopløsning langsom dynamik proteindomænebevægelser proteinfleksibilitet
Undersøgelse af proteindynamik <em>via</em> neutronspinekkospektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stingaciu, L. R. Study of Protein… More

Stingaciu, L. R. Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy. J. Vis. Exp. (182), e61862, doi:10.3791/61862 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter