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Engineering

Étude de la dynamique des protéines par spectroscopie d’écho de spin neutronique

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/61862
Automatic Translation
1
1NSD, Oak Ridge National Laboratory

Summary

Le présent protocole décrit des méthodes pour étudier la structure et la dynamique de deux protéines modèles qui jouent un rôle important dans la santé humaine. La technique combine la caractérisation biophysique de paillasse avec la spectroscopie d’écho de spin neutronique pour accéder à la dynamique aux échelles de temps et de longueur pertinentes pour les mouvements interdomaines des protéines.

Abstract

L’activité et la fonctionnalité de la plupart des protéines du corps humain sont liées à des changements de configuration de sous-domaines entiers au sein de la structure cristalline de la protéine. Les structures cristallines constituent la base de tout calcul qui décrit la structure ou la dynamique d’une protéine, la plupart du temps avec de fortes restrictions géométriques. Cependant, ces restrictions de la structure cristalline ne sont pas présentes dans la solution. La structure des protéines dans la solution peut différer de celle du cristal en raison de réarrangements de boucles ou de sous-domaines sur l’échelle de temps pico à nanoseconde (c’est-à-dire le régime temporel de la dynamique interne des protéines). Le présent travail décrit comment les ralentis sur des échelles de temps de plusieurs dizaines de nanosecondes peuvent être accessibles en utilisant la diffusion des neutrons. En particulier, la caractérisation dynamique de deux protéines humaines majeures, une protéine intrinsèquement désordonnée qui n’a pas de structure secondaire bien définie et une protéine d’anticorps classique, est traitée par spectroscopie d’écho de spin neutronique (NSE) combinée à un large éventail de méthodes de caractérisation en laboratoire. D’autres connaissances sur la dynamique du domaine protéique ont été obtenues à l’aide de la modélisation mathématique pour décrire les données expérimentales sur les neutrons et déterminer le croisement entre les mouvements diffusifs et internes combinés des protéines. L’extraction de la contribution dynamique interne à la fonction de diffusion intermédiaire obtenue à partir de NSE, y compris l’échelle de temps des différents mouvements, permet une vision plus approfondie des propriétés mécaniques des protéines uniques et de la douceur des protéines dans leur environnement presque naturel dans la solution protéique encombrée.

Introduction

Dynamique de sondage de la matière molle avec des neutrons
L’étude des propriétés dynamiques des protéines et des peptides est une partie importante de la recherche biophysique, et de nombreuses méthodes bien développées existent aujourd’hui pour accéder à un large éventail de paysages énergétiques1. Relier la dynamique révélée expérimentalement des protéines à leur fonction biologique est une tâche beaucoup plus difficile, nécessitant des modèles mathématiques complexes et des simulations dynamiques assistées par ordinateur. L’importance de la spectroscopie neutronique pour l’analyse des mouvements des protéines a été soulignée dans plusieurs études bien reçues et largement reconnues 1,2,3,4,5. Avant d’explorer le paysage énergétique diversifié de la dynamique interne des protéines, un bref aperçu des processus dynamiques dans la matière molle et de la façon dont les neutrons peuvent y accéder est nécessaire.

La sensibilité des neutrons à la configuration isotopique et le type d’interactions qu’ils présentent avec la matière molle font de la diffusion des neutrons l’une des techniques d’investigation les plus polyvalentes6. Il existe un large spectre d’échelles de longueur de corrélation et de temps de corrélation auxquels les neutrons peuvent accéder, des excitations nucléaires et des vibrations atomiques aux mouvements collectifs et aux processus de relaxation lents comme les rotations isotropes et les mouvements diffusifs. Lors de l’étude des neutrons diffusés pour leur transfert d’énergie, trois interactions principales peuvent être distinguées: la diffusion élastique, dans laquelle il n’y a pas d’échange d’énergie entre le neutron entrant et la particule dans l’échantillon; la diffusion inélastique, avec un grand échange d’énergie quantifiable entre le neutron et la particule; et le cas particulier de la diffusion quasi-élastique qui désigne un très petit transfert d’énergie par rapport à l’énergie neutronique incidente 1,7. Ces interactions donnent des informations précises sur le matériau étudié et constituent la base théorique d’une grande variété de techniques de diffusion des neutrons.

En diffusion élastique, le détecteur enregistre les directions des neutrons sous la forme d’un motif de diffraction, qui montre la position des atomes de l’échantillon les uns par rapport aux autres. Des informations sur les corrélations des positions atomiques sont acquises (c’est-à-dire l’intensité intégrée S(Q) concernant le transfert de quantité de mouvement Q, qui se rapporte uniquement à l’information structurelle). Ce principe constitue la base de la diffractionneutronique 8.

La complexité survient lorsque le transfert d’énergie n’est plus nul en raison des excitations et des fluctuations internes du matériau de l’échantillon. Cela constitue la base de la spectroscopie neutronique, dans laquelle les neutrons diffusés sont étudiés en fonction du transfert d’énergie E et du transfert de quantité de mouvement Q. Des informations dynamiques et structurelles sont obtenues. La spectroscopie neutronique mesure la même intensité intégrée S(Q) pour le transfert d’énergie (c.-à-d. le changement de vitesse des neutrons dû à la diffusion de l’échantillon, S(Q,ω) = S(Q, E), également appelé facteur de structure dynamique)9.

Pour calculer la diffusion à partir d’un matériau, il est plus approprié d’utiliser la fonction de corrélation de paire 7,10. Dans le cas de la diffraction, la fonction de corrélation de paire statique G(r) donne la probabilité de trouver le centre d’une particule à une distance donnée r du centre d’une autre particule. La spectroscopie généralise la fonction de corrélation des paires statiques et inclut l’énergie/fréquence/temps dans l’équation de diffusion. La fonction de corrélation de paire G(r) devient une fonction de temps G(r, t), qui peut être décomposée en une fonction de corrélation de paire d’atomes distincte GD(r, t) et une fonction d’auto-corrélation GS(r, t). Ceux-ci décrivent deux types de corrélations : les mouvements d’atomes corrélés par paires qui régissent la diffusion cohérente, et l’auto-corrélation qui régit la diffusion incohérente10.

La diffusion cohérente est la diffusion à partir de « la moyenne » et dépend de la phase relative des ondes diffusées. Dans le régime de diffusion à petit angle, les ondes neutroniques diffusées à partir de différents centres de diffusion (différents atomes) interfèrent de manière constructive (ont des phases similaires), et le mouvement collectif des atomes est observé avec une forte amélioration de l’intensité. La diffusion cohérente décrit essentiellement la diffusion d’un seul neutron à partir de tous les noyaux de l’échantillon10.

Lorsqu’aucune interférence constructive ne se produit entre les ondes neutroniques diffusées de différents centres, un seul atome est suivi dans le temps, et l’auto-corrélation entre la position de l’atome au temps t = 0 et le même atome au temps t est observée. Ainsi, l’information sur les positions relatives des atomes est perdue et l’accent est mis uniquement sur les fluctuations locales. La diffusion à partir des fluctuations locales régit la diffusion incohérente. La diffusion incohérente est isotrope, contribue au signal de fond et dégrade le rapport signal-bruit10,11.

En combinant tout ce qui précède, nous distinguons quatre grands processus de diffusion de neutrons10: (1) cohérent élastique (mesure les corrélations des positions atomiques), (2) cohérent inélastique (mesure les mouvements collectifs des atomes), (3) incohérent élastique (contribue à l’arrière-plan, réduit l’intensité de diffusion par le facteur de Debye-Waller (DWF) et mesure le facteur de structure incohérente élastique (EISF), décrivant la géométrie des mouvements diffusifs en géométrie confinée, et (4) incohérent inélastique (mesure la dynamique et l’auto-corrélation d’un seul atome).

Les processus dynamiques auxquels les neutrons peuvent accéder en biologie vont de l’amortissement des vibrations atomiques et moléculaires à basse fréquence, de l’interaction des molécules de solvant avec les bio-surfaces et des processus de diffusion dans la couche d’hydratation des macromolécules et de la géométrie confinée, aux mouvements diffusifs translationnels, rotationnels et tumbling à courte portée, aux domaines protéiques et aux mouvements allostériques1 . La grande diversité des méthodes et des instruments neutroniques pour mesurer la dynamique des protéines est basée sur la façon dont l’achromatisation du faisceau de neutrons incident ou sortant est réalisée et sur la façon dont l’analyse énergétique des neutrons diffusés est effectuée. Des spectromètres à triple axe aux spectromètres à temps de vol, en passant par la rétrodiffusion et l’écho de spin, on peut explorer des processus dynamiques avec des temps caractéristiques compris entre 1 x 10-14 s et 1 x 10-6 s (femtosecondes à microsecondes)12.

Le Laboratoire national d’Oak Ridge, avec ses deux sources de neutrons renommées, la source de neutrons de spallation - SNS13 et le réacteur à flux isotopique élevé - HFIR14, possède l’une des meilleures suites de spectromètres pour étudier la dynamique des biomatériaux. Parmi les exemples les plus éloquents, citons l’utilisation du spectromètre à neutrons froids (CNCS) de SNS15 pour étudier la perturbation dynamique de l’eau d’hydratation autour de la protéine fluorescente verte dans la solution16 ou les vibrations collectives sub-picosecondes de plusieurs protéines17. Un problème récurrent des recherches sur la diffusion inélastique des neutrons est que certains processus biologiques sont trop lents pour être observés. Sans configurations extrêmes qui entraînent une énorme perte d’intensité neutronique, les spectromètres à temps de vol sont limités à une résolution d’énergie de 10 μeV, correspondant à une échelle de temps maximale d’environ 200 ps10,11. Cela ne suffit pas pour observer des mouvements à grande échelle dans les protéines. Par conséquent, des instruments avec une résolution d’énergie plus élevée comme les spectromètres à rétrodiffusion sont souvent nécessaires. La combinaison des techniques de temps de vol et de rétrodiffusion s’est avérée puissante pour étudier le changement de dynamique interne du cytochrome P450cam (CYP101), une enzyme qui catalyse l’hydroxylation camphre18.

La diffusivité microscopique mesurée par le spectromètre à rétrodiffusion de SNS-BASIS19 était étonnamment bien définie et pouvait être séparée en diffusivité de l’eau (hydratation, cytoplasmique et eau de type vrac) et en diffusivité des constituants cellulaires chez les vers plats planaires, le premier animal vivant à être étudié par diffusion neutronique20 . La rétrodiffusion est une technique spectroscopique à haute résolution, mais elle est également limitée à plusieurs μeV = plusieurs nanosecondes, tandis que la dynamique lente dans les biomatériaux se manifeste également par le temps de survie de la corrélation entre la position atomique ou les orientations de spin (par exemple, les processus de relaxation, qui se produisent régulièrement dans la gamme de temps de dix à des centaines de nanosecondes).

La spectroscopie d’écho de spin neutronique (NSE) est la seule technique de diffusion neutronique à atteindre une résolution aussi élevée. Contrairement à d’autres techniques neutroniques, NSE ne nécessite pas d’achromatisation du faisceau puisqu’il utilise la phase mécanique quantique des neutrons, qui est leurs moments magnétiques. La manipulation des moments magnétiques permet l’utilisation d’une large distribution de longueur d’onde du faisceau de neutrons, tandis que la technique est sensible à de très petits changements de vitesse des neutrons de l’ordre de 1 x 10-4. NSE a été utilisé avec succès pour étudier la dynamique lente des protéines en solution pour de nombreuses protéines. Parmi ces nombreuses études pionnières, nous reconnaissons l’étude de la flexibilité segmentaire de l’immunoglobuline21 porcine; les mouvements du domaine couplé dans la Taq polymérase22; les mouvements du domaine dans le tétramère de l’alcool déshydrogénasede levure 23; le changement de conformation dans la phosphoglycérate kinase lors de la liaison du substrat3; l’activation des mouvements du domaine et la propagation dynamique des signaux allostériques dans la protéine 4,24,25 du cofacteur régulateur de l’échange Na+/H+ (NHERF1); la dynamique d’un état compact de l’ion mercurique réductase26; et la diffusion de l’hémoglobine dans les globules rouges27. Deux études plus récentes sur la dynamique des protéines ont exposé la flexibilité de l’anticorps humain Immunoglobuline G (IgG) en tant que source entropique28 et les caractéristiques de la contribution du solvant à la dynamique de la protéine de base de la myéline intrinsèquement désordonnée (MBP)5.

Le présent article explique les principes de base de la NSE, les multiples méthodes préparatoires recommandées pour une étude approfondie de la dynamique des protéines, ainsi que la méthodologie et le protocole expérimental pour l’acquisition de données NSE au spectromètre NSE du SNS, SNS-NSE. Le protocole caractérise deux protéines : l’IgG, une protéine d’anticorps humains ordinaire, et la protéine MBP intrinsèquement désordonnée. Les implications biophysiques, la pertinence des exemples pour la recherche et les limites de la technique sont brièvement discutées.

Spectroscopie NSE, la méthode pour les mesures de dynamique lente
NSE est une technique polarisée qui utilise le temps de vol des neutrons pour mesurer l’échange d’énergie (perte de polarisation) dû à l’interaction quasi-élastique entre les neutrons et les atomes dans un échantillon. Au cœur de la spectroscopie NSE se trouvent deux principes de base : (1) la capacité du spin neutronique à précéder dans le champ magnétique avec une fréquence proportionnelle à la force Equation 1magnétique, à savoir la fréquence de Larmor29, et (b) l’écho de spin ou écho de Hann, représentant la manipulation et le recentrage du signal de polarisation lors de l’application d’une série d’impulsions de radiofréquence30.

Les bases du processus NSE peuvent être résumées en quelques étapes simples 6,11 à l’aide de la figure 1. (1) Le faisceau de neutrons produit par la source (position 1) est polarisé (position 2), guidé et transporté (position 3), et arrive à l’entrée du spectromètre NSE, où il est tourné de 90° par la première nageoire pi-half (position 4). (2) Le faisceau polarisé (p. ex., les moments magnétiques neutroniques) devient perpendiculaire aux lignes de champ magnétique du premier aimant (première zone de précession, position 5) et commence à précession. (3) À l’extrémité de l’aimant, les spins neutroniques accumulent un certain angle de précession proportionnel à l’intensité du champ magnétique et au temps de vol passé à l’intérieur (essentiellement inversement proportionnel à la vitesse du neutron). Les vitesses individuelles des neutrons sont codées dans leur angle de précession à la fin de la première zone de précession. (4) Près de la position de l’échantillon, le pi-flipper (position 6) inverse l’orientation du spin de 180°, modifiant le signe de l’angle de précession. (5) Les neutrons interagissent avec les molécules de l’échantillon (position 7) et se dispersent. (6) Les neutrons diffusés pénètrent et précèdent dans la deuxième zone de précession (position 8) mais deviennent orientés vers l’inverse. (7) Une autre nageoire pi-half (position 9) est utilisée pour faire pivoter l’orientation du spin de perpendiculaire à la direction horizontale. Cela arrêtera la précession, traduisant l’angle de précession φ en polarisation proportionnelle au cos(φ). (8) L’analyseur (position 10) sélectionne les neutrons en fonction d’une orientation. Si l’interaction avec l’échantillon est élastique, la vitesse du neutron ne changera pas. Les neutrons passeront un temps identique à voler dans les première et deuxième zones de précession, et les angles de précession accumulés sont entièrement récupérés. La polarisation complète est restaurée sur le détecteur (position 11) en tant qu’écho de la polarisation d’origine (c’est-à-dire spin-écho). (9) Cependant, dans NSE, la diffusion est quasi-élastique, de sorte qu’un petit échange d’énergie entre les neutrons et les molécules d’échantillon conduit à des vitesses de neutrons différentes après diffusion par l’échantillon. En raison des différentes vitesses, les neutrons passeront un temps supplémentaire à voler à travers la deuxième zone de précession et n’auront pas correctement récupéré leur angle de précession. Une polarisation partielle est récupérée sur le détecteur, et la perte de polarisation due à la relaxation du spin est proportionnelle à la transformation de Cos-Fourier de la fonction spectrale S(Q, ω), la fonction de diffusion intermédiaire F(Q, t). (10) Le paramètre de temps de la fonction F(Q, t) est proportionnel à l’intensité du champ magnétique de précession. Le balayage de la perte de polarisation en fonction de l’intensité du champ magnétique donne donc une fonction de relaxation qui dépend des processus dynamiques au sein de l’échantillon.

Figure 1
Figure 1 : Photographie du spectromètre NSE au SNS (SNS-NSE) et schéma de trajectoire de vol des neutrons avec les composants fonctionnels les plus importants. De droite à gauche : 1 = source de neutrons ; 2 = choppers-bender-polarizer-système d’obturateur secondaire; 3 = guides de transport de faisceau; 4 = pi/2 flipper pour le premier spin-turn à 90° ; 5 = première zone de précession; 6 = pi flipper pour un spin-turn de 180°; 7 = surface de l’échantillon et environnement de l’échantillon (ici, le cryo-four est montré); 8 = deuxième zone de précession; 9 = pi/2 flipper pour le deuxième spin-turn à 90° ; 10 = analyseur; 11 = détecteur. (Notez que les parties de 3, ainsi que 2 et 1, sont situées derrière le mur bleu à l’intérieur du blindage; les hachoirs sont remplacés par un sélecteur de vitesse pour le NSE basé sur un réacteur). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocol

Les présents travaux caractérisent deux protéines : une protéine d’anticorps humains IgG régulière et le MBP intrinsèquement désordonné. La forme lyophilisée des protéines a été obtenue à partir de sources commerciales (voir tableau des matériaux).

1. Préparation d’échantillons de protéines

  1. Préparer un tampon de phosphate de sodium de 50 mM + 0,1 M de NaCl en pesant et en dissolvant les réactifs solides respectifs dans de l’eau lourde (D2O) (voir tableau des matériaux). Il s’agit du solvant tampon deutéré pour les IgG.
    1. Ajuster le pH de la solution tampon à 6,6.
  2. Préparer un tampon de phosphate de sodium de 20 mM + 6 M d’urée en pesant et en dissolvant les composants solides respectifs dans de l’eau lourde (D2O). Il s’agit du solvant tampon deutéré pour le MBP.
    1. Ajuster le pH de la solution tampon à 4,7.
  3. Filtrer les solvants tampons à l’aide de filtres de taille de pores de 0,2 μm (voir tableau des matériaux).
  4. Peser et dissoudre les poudres lyophilisées de protéines purifiées dans les solvants deutérés pour les protéines respectives (étapes 1.1.-1.2.) à une concentration élevée en protéines (~50 mg/mL).
  5. Charger la solution protéique dans des paniers de dialyze avec des membranes de dialyse de 3,5 K MWCO, et dialyze contre le tampon filtré pendant 24 h à 10 °C pour MBP et 25 °C pour IgG (voir Tableau des matériaux) en secouant légèrement les tubes pour créer un gradient de diffusion.
  6. Diluer la solution protéique à l’aide du tampon de dialyse en une série de concentrations : 1, 2, 5, 10 et 50 mg/mL.
  7. Déterminez les concentrations exactes à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop (voir Tableau des matériaux).

2. Caractérisation préliminaire de l’échantillon par diffusion dynamique de la lumière (DLS)

  1. Chargez 80 μL de chaque solution protéique de la série de concentrations préparée ci-dessus (étape 1.6.) dans la cellule jetable DLS (voir Tableau des matériaux) et déterminez les coefficients de diffusion, en moyenne sur 10 acquisitions.
  2. Tracer les coefficients de diffusion translationnelle en fonction de la concentration en protéines et extrapoler à la concentration nulle.
  3. Chargez chaque solution protéique de la série de concentration dans les tubes capillaires d’un viscosimètre (voir Tableau des matériaux) et mesurez la viscosité dynamique.
  4. Tracer les viscosités dynamiques mesurées en fonction de la concentration en protéines et extrapoler à la concentration nulle.
    REMARQUE: L’extrapolation de la diffusion DLS à une concentration nulle donne la valeur de la diffusion translationnelle pour une seule protéine. L’extrapolation de la viscosité dynamique à la concentration nulle doit donner la valeur de viscosité dynamique mesurée expérimentalement pour la solution tampon.

3. Collecte de la diffusion à petit angle (neutrons ou rayons X)

  1. Mesurer la diffusion neutronique à petit angle (SANS) et/ou la diffusion des rayons X à petit angle (SAXS) (voir tableau des matériaux) sur quatre concentrations de protéines, de préférence 2 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL et 50 mg/mL.
  2. Normaliser les spectres SANS et SAXS par concentration en protéines.
  3. Adaptez le facteur de forme des protéines P(Q) aux spectres SANS et SAXS à l’aide du logiciel d’optimisation d’ensemble31 et/ou SasView32 .
  4. Calculer le facteur de structure S(Q, c) en divisant le signal SANS et SAXS par P(Q) pour chaque concentration.
    REMARQUE : Les lecteurs qui s’intéressent à la façon de mesurer et d’interpréter les données de diffusion à petit angle comme support pour les mesures NSE sont encouragés à consulter attentivement les références 23,28,31,32,33.

4. Mesure de l’ESN

  1. Configurez l’expérience et montez l’exemple en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Sélectionnez l’épaisseur de la cellule pour la charge de l’échantillon en fonction de la concentration de la solution protéique, de la température nécessaire à la mesure et de la quantité de solution disponible.
      REMARQUE: La présente étude a utilisé des conteneurs de quartz transparents à chargement par le haut de 40 mm x 30 mm x 4 mm.
    2. Nettoyez la cellule à plusieurs reprises, en alternant entre le détergent à vaisselle sans phosphate (voir tableau des matériaux), l’eau désionisée et l’éthanol à 70%.
    3. Sécher la cellule dans le four à convection; ne dépassent pas 80 °C pour les cellules de quartz.
    4. Chargez 4 mL de solution protéique dans la cellule et fermez avec des bouchons. Utilisez un film de cire ou tout autre scellant (voir Tableau des matériaux) pour sceller les cellules de l’échantillon.
      NOTE : Dans la présente étude, 4,8 mL de solution à ~50 mg/mL ont été utilisés pour obtenir une intensité de diffusion suffisante.
    5. Chargez 4 mL de tampon de dialyse dans un récipient identique à celui de l’échantillon de protéines et scellez.
    6. Transportez les échantillons jusqu’à la ligne de faisceau, fermez l’obturateur et entrez dans la zone de la grotte de l’enceinte du spectromètre34.
    7. Montez la cellule d’échantillonnage sur le porte-échantillon en aluminium en serrant les vis et les plaques de maintien (Figure 2, panneau de gauche).
      REMARQUE: On peut monter deux cellules d’échantillon en même temps, étant donné que le même protocole de mesure est nécessaire pour tous les échantillons.
    8. Montez l’échantillon de graphite et/ou l’échantillon de poudre Al2O3 chargé dans un récipient identique à celui de l’échantillon de protéines. Ce sont des normes fournies par la prise en charge de la ligne de faisceau SNS-NSE.
    9. Placez le porte-échantillon en le faisant glisser doucement dans la boîte du système de forçage de température (TFS, voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE: TFS est l’environnement d’échantillonnage le plus utilisé chez SNS-NSE et pompe de l’air sec dans la cartouche d’échantillon pour atteindre la température souhaitée (Figure 2, panneaux du milieu et de droite).
    10. Fermez le couvercle du TFS et réglez la température à la valeur souhaitée en accédant à l’écran interactif du TFS.
    11. Montez la caméra à neutrons (voir Tableau des matériaux) pour l’alignement des échantillons sur le faisceau.
    12. Balayez le boîtier de l’instrument, évacuez, fermez les portes et ouvrez le volet de faisceau.
      REMARQUE: Les cellules d’échantillon sont fournies par le support de ligne de faisceau SNS-NSE. Pour connaître les exemples de cellules disponibles et la bibliothèque d’exemples d’environnement, reportez-vous à la page Web 7,35 de la ligne de faisceau SNS-NSE.
  2. Collectez les données NSE en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Alignez l’échantillon dans le faisceau de neutrons à l’aide de la caméra à neutrons et des quatre ouvertures d’échantillon indépendantes.
    2. Ouvrez le logiciel de collecte de données SNS-NSE36 et collectez des statistiques d’échantillons en exécutant des analyses de diffraction pour les angles de diffusion et la longueur d’onde souhaités.
    3. Configurez les paramètres de mesure en fonction des statistiques collectées pour chaque échantillon en éditant les macros de mesure fournies par le scientifique de l’instrument qui l’assiste.
    4. Commencez l’analyse en tapant le nom du protocole dans le prompteur de commandes et acquérez des échos pour l’exemple.
    5. Commencez à scanner et acquérez des échos également pour la référence élastique et le solvant tamponné. Effectuez un fonctionnement intermittent de l’obturateur de faisceau pour le changement d’échantillon.

Figure 2
Figure 2 : Système de mesure NSE. Panneau de gauche: échantillons de solution protéique dans un récipient en quartz monté avec des vis et des plaques sur le porte-échantillon en aluminium (Al). Le porte-échantillon Al offre la possibilité de monter deux échantillons simultanément dans l’environnement de l’échantillon. Panneau central: L’échantillon du système de forçage de température (TFS) peut être monté à l’étape de l’échantillon, la fenêtre du faisceau de neutrons se trouve à droite, tandis que la caméra à neutrons utilisée pour l’alignement est visible sur le côté gauche. Panneau de droite: placer le porte-échantillon avec deux échantillons dans l’échantillon peut fonctionner avec des fenêtres en silicium (Si). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Réduction des données NSE

REMARQUE: SNS-NSE est équipé d’un logiciel dédié nommé DrSpine (réduction des données pour l’écho de spin)37,38 disponible sur le cluster d’analyse à distance ORNL Neutron Sciences, d’un guide d’utilisation rapide et d’une assistance intégrée.

  1. Connectez-vous à Neutron Sciences Remote Analysis Cluster (voir Table of Materials) avec les informations d’identification de l’utilisateur ORNL, puis appuyez sur le bouton Lancer la session .
  2. Configurez le logiciel de réduction des données en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Dans le répertoire utilisateur, ouvrez une fenêtre de terminal et tapez : source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh.
    2. Ensuite, tapez : drspine_create_env.sh.
  3. Créez un dossier pour la réduction des données dans le répertoire de base et copiez les scripts et macros fournis à partir du répertoire partagé.
  4. Modifiez, renommez et enregistrez la macro de réduction fournie en conséquence.
  5. Tapez drspine à l’invite de commandes et appuyez sur Entrée pour démarrer l’environnement de réduction logicielle.
  6. Tapez « le nom de la macro de réduction » modifié à l’étape 5.4. dans le prompteur de commandes de l’environnement logiciel et appuyez sur Entrée.

6. Ajustement des données NSE

  1. Modifiez le script python « stapler-drspine.py », fourni par l’Instrument Scientist qui l’assiste, avec les noms des données de fichier réduites.
    REMARQUE: Le script python est disponible gratuitement pour les utilisateurs de l’instrument.
  2. Modifiez la fonction pour l’adapter à partir de la bibliothèque fournie.
  3. Tapez le nom du script modifié « stapler-drspine.py » dans le prompteur de commandes et appuyez sur Entrée pour lire, ajuster et tracer des données NSE réduites.
    REMARQUE: L’Instrument Scientist fournira un modèle pour la macro de réduction et le script python « stapler-drspine.py » qui peut lire et adapter les données réduites NSE. Les données NSE finales réduites sont au format ASCII et peuvent être lues par divers logiciels préférés.

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Representative Results

Les protéines IgG du sérum humain et des protéines MBP bovines ont été reconstituées à des concentrations élevées (~50 mg/mL) dans des tampons D2O-base. Comme les protéines ont été dissoutes à des concentrations élevées, les solutions obtenues étaient des solutions protéiques encombrées. Les dynamiques étudiées à l’aide de NSE souffrent de l’environnement surpeuplé dans lequel résident les protéines (interactions des facteurs de structure et effets hydrodynamiques)5,28,39. Le DLS a été réalisé sur une série de concentrations pour chaque protéine afin de tenir compte des effets d’encombrement. L’extrapolation à la concentration nulle des coefficients de diffusion translationnelle mesurés par DLS donne la valeur de la diffusion translationnelle pour une seule protéine. La viscosité dynamique en fonction de la concentration en protéines doit également être mesurée avant l’ESN pour tenir compte des interactions hydrodynamiques. L’extrapolation à la concentration nulle des viscosités dynamiques en fonction de la concentration doit donner la valeur qui peut être mesurée expérimentalement pour la solution tampon de chaque échantillon de protéine préparé.

La forme et la structure des protéines en solution concentrée ont été évaluées avant toute expérience NSE afin de mieux comprendre le facteur de forme de la protéine et la force du facteur de structure, ce qui pourrait influencer la façon dont les protéines se déplacent en solution. La diffusion à petit angle était la méthode de choix pour ces enquêtes. Dans la présente étude, la conformation structurale de la protéine IgG en solution a été observée par SAXS, et la structure du MBP a été évaluée par SANS. L’intensité de diffusion (Q) mesurée (étapes 3.3.-3.4.) est proportionnelle au produit entre le facteur de forme P(Q) et le facteur de structure S(Q,c) pondéré par le nombre de particules (équation 1)5,28,39:

I (Q) = N ∙ P (Q) ∙S (Q, c) (1)

SAXS a été mesuré sur un instrument SAXS de type Kratky40 avec une longueur d’onde de rayons X de 0,154 nm pour IgG, et SANS a été mesuré41 pour MBP avec une longueur d’onde neutronique de 4,5 Å. Les intensités expérimentales à petit angle I(Q) ont été corrigées du fond et du solvant, mises à l’échelle par concentration de solution, et le facteur de forme a été calculé à l’aide de progiciels disponibles gratuitement tels que Ensemble modeling-EOM et SasView 24,25,29,39,42,43. De plus, le facteur de structure de chaque protéine a été obtenu à partir de l’équation 1.

Pour la présente étude, les expériences NSE ont été réalisées avec deux spectromètres à écho de spin : l’instrument SNS-NSE34 de la figure 1 et l’instrument Phoenix-J-NSE44. Des longueurs d’onde incidentes comprises entre 8 Å et 12 Å, avec des temps de Fourier compris entre 0,1 ns ≤ tmax ≤ 130 ns pour plusieurs mesures Q comprises entre 0,05 Å−1- 0,2 Å−1, ont été mesurées. La différence entre les deux spectromètres est un point essentiel dans la compréhension de la science NSE, et ils représentent à la fois l’ancien concept d’un soi-disant « écho de spin classique » pour la source de neutrons statiques d’un réacteur et le nouveau « concept de temps de vol » pour la source de neutrons pulsés. Le spectromètre Phoenix-J-NSE est un NSE de type classique, dans lequel un sélecteur de vitesse sélectionne une longueur d’onde particulière. Pour permettre des variations dans les vitesses des neutrons, une bande passante de longueur d’onde de ±10% est introduite. Malgré la bande d’énergie très étroite utilisée pour un seul balayage, la situation du spectromètre Phoenix-J-NSE à une source de réacteur à haut flux garantit que les plages de temps espace-vecteur et corrélations sont couvertes dans des temps de mesure relativement courts. Le spectromètre SNS-NSE est le spectromètre à neutrons choppers de nouvelle génération, à ultra-haute résolution, avec une portée de longueur d’onde de 2 Å < λ < 14 Å et une largeur de bande de longueur d’onde simultanée de 2,4 Å - 3,6 Å, selon la position du spectromètre. Grâce à cette large bande passante, une efficacité élevée de collecte de données est atteinte, permettant une couverture presque sans espace d’une large plage de temps de vecteur d’onde avec seulement quelques paramètres d’angle de diffusion. La sélection de la bande de longueur d’onde dans le SNS-NSE est effectuée par un système de hachage composé de quatre hachoirs. Les deux spectromètres NSE discutés ici ont des champs de précession basés sur une technologie supraconductrice avec une homogénéité de champ magnétique élevée, de nouveaux éléments de correction de champ de pointe pour les corrections de champ parasite et de nouveaux cintres polarisants41,42.

Les spectres NSE ont été mesurés à 10 °C pour la protéine MBP et à 25 °C pour la protéine IgG1. L’intensité de diffusion intermédiaire cohérente I(Q, t) / I(Q, t = 0) mesurée par NSE est le résultat contributif de tous les processus dynamiques de l’échantillon qui se produisent dans l’échelle de temps étudiée. Celui-ci contient la dynamique interne des protéines, la diffusion translationnelle globale, la diffusion rotationnelle et tumbling, et les mouvements segmentaires au sein de la molécule de protéine elle-même. Un modèle simplifié suppose que la dynamique interne et les diffusions translationnelles et rotationnelles sont totalement découplées 5,45,46,47,48 et peuvent être caractérisées séparément. Pour la particule unique, la fonction de diffusion cohérente peut être écrite comme le produit (équation 2)23,48:

F (Q, t) = Ftrans(Q, t) ∙Frot(Q, t) ∙Fint(Q, t) (2)

où le terme de diffusion translationnelle pour une seule protéine rigide est une fonction exponentielle du coefficient de diffusion translationnelle DT (équation 3)23,48 :

Ftrans(Q, t) = exp(−Q2∙ DT∙ t) (3)

Pour les grandes concentrations de protéines, le coefficient de diffusion translationnelle DT est influencé par les interactions protéine-protéine, quantifiées par le facteur de structure S(Q) et par les interactions hydrodynamiques décrites par la fonction hydrodynamique HT(Q) (équation 4)23,48 :

DT(Q) = DT0 ∙HT(Q, c) / S(Q, c) (4)

Dans l’équation 4, DT0 est la valeur de diffusion extrapolée à la concentration nulle à partir des mesures DLS (étape 2.2.). HT est calculé comme HT = 1 -c∙ [η], où c est la concentration en protéines, [η] est la viscosité intrinsèque calculée par [η] = (η - η0) /η0 ∙ c, et η0 est la viscosité dynamique mesurée (étapes 2.3.-2.4.). Le facteur de structure S(Q, c) a été obtenu à partir de mesures SAXS pour la protéine IgG et de mesures SANS pour la protéine MBP.

La figure 3 montre des exemples de fonctions de diffusion intermédiaires I(Q, t) / I(Q, t = 0), mesurées par NSE pour les protéines IgG et MBP. Un écart clair par rapport à un simple processus de relaxation de type diffusion a été observé sur la courte échelle de temps de Fourier, <25 ns, indiquant l’accessibilité de la dynamique interne des protéines par NSE et la nécessité d’un modèle plus complexe pour décrire les processus dynamiques observés.

Figure 3
Figure 3 : Spectres de relaxation NSE pour les protéines IgG et MBP. Les données IgG sont montrées ici ajustées simplement par une fonction exponentielle unique pour révéler l’écart par rapport à la diffusion à des temps de Fourier plus courts. La déviation a été observée pour les deux protéines. En revanche, les données MBP sont présentées ici dans la gamme de relaxation complète, équipée par le modèle développé parBiehl45. Le modèle implique un grain grossier et permet l’ajustement simultané de régimes de temps de Fourier courts, intermédiaires et longs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Par conséquent, les fonctions de diffusion ont été ajustées par modélisation atomique des deux protéines à l’aide de modèles développés par Biehl, décrits dans les références 18,25,38,43,44,46. La fonction de diffusion intermédiaire a été calculée par grain grossier sur quelques centaines de grains individuels, par opposition à la simulation de tous les atomes, pour réduire la charge et le temps de calcul, et la bibliothèque logicielle MMTK49 (librement accessible) a été utilisée pour accéder aux coordonnées atomiques et mettre en œuvre des mouvements trans-rotationnels sur des domaines et des fragments de protéines. Les résultats du calcul de la fonction de diffusion intermédiaire pour les deux protéines étaient en excellent accord avec les données expérimentales de NSE et ont prouvé que la dynamique plus lente observée à long temps de Fourier peut être attribuée aux processus globaux de diffusion translationnelle et rotationnelle, tandis que la dynamique rapide observée à de courtes échelles de temps peut être attribuée à la dynamique des domaines protéiques.

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Discussion

La spectroscopie NSE fournit une vue unique et détaillée de la dynamique des protéines, que d’autres techniques spectroscopiques ne peuvent pas produire. Les mesures sur une longue échelle de temps fournissent des observations de la diffusion translationnelle et rotationnelle des protéines, comme présenté ici. La dynamique segmentaire et d’autres oscillations internes se révèlent comme une forte désintégration de la fonction de diffusion cohérente S(Q, t) à une courte échelle de temps et sont bien séparées des processus globaux de relaxation diffusionnelle. Les principales limites de la technique NSE sont le temps de mesure prolongé et les grands volumes d’échantillons nécessaires pour acquérir un bon signal statistique. Cela peut poser un défi pour mesurer les systèmes macromoléculaires pertinents qui présentent de faibles concentrations d’espèces mobiles et des durées de vie réduites.

Dynamique interne des IgG
La protéine IgG a une structure en forme de Y spécifique aux anticorps qui peut être approchée par trois gros fragments reliés par des liants flexibles. Un modèle mathématique de trois particules importantes résidant dans un potentiel harmonique a été supposé pour ce type de structure. Les linkers ont été approximés par des ressorts élastiques qui donnent une position d’équilibre fixe mais permettent des fluctuations comme une forme de mouvement brownien. Trois degrés de liberté ont été autorisés pour chaque fragment autour de l’équilibre relatif28. La dynamique interne représentée par Fint(Q, t) dans l’équation 2 a été décrite par le processus d’Ornstein-Uhlenbeck50,51. Le modèle permet de calculer le déplacement carré moyen des fragments dans le pendage potentiel, l’échelle de temps des différents mouvements, le frottement et les constantes de force qui se produisent. L’amplitude du mouvement interne a été approchée par l’analyse des modes normaux, en tenant compte de différents degrés de mouvement pour chaque fragment. Une description détaillée du modèle et des paramètres mathématiques qui en résultent est hors de portée ici, mais peut être trouvée en détail dans la référence28. Dans cette étude de cas d’IgG, une signature claire de la dynamique interne a été observée sur une échelle de temps de plusieurs nanosecondes. La constante de ressort calculée de l’éditeur de liens semble être réalistement comparable à un ressort entropique de longueur similaire. Le frottement efficace observé semble proche du frottement d’un fragment d’IgG libre non lié. L’hypothèse de l’équilibre préexistant a été validée, avec des configurations « ouvertes » ou « fermées » coexistantes supposées d’IgG qui sont en équilibre présentant différents sites de liaison et des spécificités de liaison28. Cette information peut être pertinente pour comprendre la mécanique des anticorps et si ce comportement mécanique peut être utilisé pour améliorer la biocompatibilité et la biodisponibilité.

Dynamique interne du MBP
La structure MBP a un noyau globulaire compact qui permet de forts mouvements d’étirement et de flexion avec ses extrémités de bobine aléatoires flexibles. La dynamique des MBP a été interprétée à l’aide de modèles polymères flexibles avec et sans ajout de frottement interne28,39. Comme dans le cas des IgG, les observations de la dynamique interne du MBP peuvent être réconciliées dans la théorie du mouvement brownien, dans laquelle une plus grande amplitude de mouvement entraîne un temps de relaxation plus long avec des influences du frottement interne au sein de la chaîne protéique. L’augmentation du temps de relaxation avec une plus grande amplitude de mouvements mais un frottement plus faible peut être décrite en utilisant le même processus d’Ornstein-Uhlenbeck 50,51 du mouvement brownien dans un potentiel harmonique. Les mouvements internes avec de grandes amplitudes mais des temps de relaxation lents deviennent actifs lors de la dénaturation complète du MBP de son état natif en réduisant les forces de restauration de la configuration de la chaîne (potentiels dièdres) et en lissant les barrières énergétiques locales. Des descriptions détaillées de la dynamique interne du MBP à l’état natif et dénaturé peuvent être trouvées plus en détail dans les références28,39. Dans l’étude du MBP, l’enquête utilisant NSE a révélé un comportement dynamique pointant vers une compacité intermédiaire de la protéine entre les polymères de bobine aléatoires et les protéines globulaires. La contribution significative de la dynamique interne des protéines avec un taux de relaxation de plusieurs nanosecondes a été régie par des mouvements collectifs d’étirement et de flexion à basse fréquence5. La description de la dynamique native du MBP par des modèles issus de la décomposition de la théorie des polymères a été fournie en raison d’une grande valeur de frottement interne des protéines. Dans le MBP dénaturé, le frottement interne au sein de la chaîne protéique est réduit et le caractère de chaîne polymère du spectre de relaxation prévaut. La grande flexibilité des mouvements de l’ensemble structurel pourrait aider à augmenter la surface protéique accessible, facilitant ainsi l’interaction avec différents partenaires de liaison.

Modèles dynamiques
Alors que la NSE en tant que technique est expérimentalement unique dans l’évaluation des mouvements harmoniques à basse fréquence dans les macromolécules biologiques et les sous-unités moléculaires, l’analyse de la fonction de diffusion intermédiaire nécessite une comparaison avec les spectres de neutrons dérivés de divers modèles mathématiques. Le modèle présenté ici et développé par Biehl et al.28 pour les solutions de protéines concentrées utilise une approximation de réseau élastique, dans laquelle la fonction de diffusion intermédiaire est une convolution de fonctions modulaires appropriées, et les oscillateurs browniens représentent la dynamique interne. C’est l’un des très rares modèles disponibles pour analyser la dynamique segmentaire des protéines. Un autre modèle bien établi pour les solutions de protéines diluées est le modèle proposé par Bu et al.52, qui est un modèle robuste qui utilise la mécanique statistique et ne nécessite pas d’ajustements complexes ou de paramètres multiples. Une approche similaire basée sur l’approximation du découplage dynamique peut également être appliquée aux systèmes dilués pour caractériser la diffusion effective comme une somme de mouvements auto-translationnels et internes53. Plusieurs de nos références peuvent fournir des rapports complets sur ces modèles et leurs limites. Nous recommandons fortement Fitter et al.1 et Liu et al.54.

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Disclosures

L’auteur ne déclare aucun intérêt financier concurrent et aucun conflit d’intérêts. Le contenu du manuscrit est basé sur la conférence que l’auteur a présentée à la HANDS-Neutron Scattering Applications in Structural Biology School entre 2019 et 2021.

Acknowledgments

Cette recherche a utilisé les ressources de la source de neutrons de spallation (BL-15, BL-6, laboratoires de biologie et de chimie), un bureau du DOE de l’installation des utilisateurs scientifiques exploité par le laboratoire national d’Oak Ridge. Cette recherche a également utilisé les ressources du réacteur MLZ-FRM2 garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) et du JCNS1 de Forschungszentrum Jülich GmbH, en Allemagne. L’auteur remercie le Dr Ralf Biehl et le Dr Andreas Stadler pour leur aide à la modélisation et leur contribution à la recherche sur les protéines IgG et MBP, le Dr Piotr A. Żołnierczuk pour le soutien à la réduction des données NSE, le Dr Changwoo Do pour le soutien avec les mesures SANS, et Rhonda Moody et le Dr Kevin Weiss pour le soutien du laboratoire de biochimie SNS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine MBP protein solution Sigma-Aldrich M1891 lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O - heavy water Sigma-Aldrich Product No. 151882 liquid
Dionized water in house - for washing / cleanning cells
DLS instrument Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich - dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standards SNS-NSE, ORNL - Al2O3  and Graphite powders
Ethanol Sigma-Aldrich 65350-M 70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solution Sigma-Aldrich I4506 lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrument JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - small angle neutron instrument
Liquinox dish detergent Alconox - Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2O Sigma-Aldrich Product No.S9390 disodium phosphate heptahydrate salt
NaCl Sigma-Aldrich Product No.S9888 sodium chloride salt
NaH2PO4·H2O Sigma-Aldrich Product No. S9638 monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific Catalog number: ND-2000 NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment camera NeutronOptics, Grenoble NOG210222 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M - wax parafilm Bemis Parafilm M - 5259-04LC PM996 all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE Spectrometer JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - neutron spectrometer
SasView https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument FZ-Jülich - small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranes Thermo Scientific 88400-88405 Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis Cluster Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometer ORNL, Oak Ridge, TN, USA - neutron spectrometer
Sterile syringe filters VWR N.A. PN:28145-501 0.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS) SP Scientific Part Number 100004055 sample environment equipment
Urea -d4 Sigma-Aldrich Product No. 176087 deuterated Urea salt
Viscometer FZ-Jülich - falling ball viscometer

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References

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Ingénierie Numéro 182 Diffusion neutronique écho-spin neutronique solution protéique dynamique lente mouvements du domaine protéique flexibilité des protéines
Étude de la dynamique des protéines <em>par</em> spectroscopie d’écho de spin neutronique
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Stingaciu, L. R. Study of Protein… More

Stingaciu, L. R. Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy. J. Vis. Exp. (182), e61862, doi:10.3791/61862 (2022).

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