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Engineering

Untersuchung der Proteindynamik mittels Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/61862
Automatic Translation
1
1NSD, Oak Ridge National Laboratory

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Struktur und Dynamik von zwei Modellproteinen, die eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit spielen. Die Technik kombiniert die biophysikalische Charakterisierung auf dem Labortisch mit der Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie, um auf die Dynamik auf Zeit- und Längenskalen zuzugreifen, die für Proteininterdomänenbewegungen relevant sind.

Abstract

Die Aktivität und Funktionalität der meisten menschlichen Körperproteine hängt mit Konfigurationsänderungen ganzer Subdomänen innerhalb der Proteinkristallstruktur zusammen. Die Kristallstrukturen bilden die Grundlage für jede Berechnung, die die Struktur oder Dynamik eines Proteins beschreibt, meist mit starken geometrischen Einschränkungen. Diese Einschränkungen aus der Kristallstruktur sind jedoch in der Lösung nicht vorhanden. Die Struktur der Proteine in der Lösung kann sich vom Kristall aufgrund von Umlagerungen von Schleifen oder Subdomänen auf der Pico-Nanosekunden-Zeitskala (d. h. dem internen Proteindynamik-Zeitregime) unterscheiden. Die vorliegende Arbeit beschreibt, wie Zeitlupe auf Zeitskalen von mehreren zehn Nanosekunden mittels Neutronenstreuung erreicht werden kann. Insbesondere die dynamische Charakterisierung von zwei großen menschlichen Proteinen, einem intrinsisch ungeordneten Protein, dem eine klar definierte Sekundärstruktur fehlt, und einem klassischen Antikörperprotein, wird durch Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie (NSE) in Kombination mit einer breiten Palette von Laborcharakterisierungsmethoden behandelt. Weitere Einblicke in die Dynamik der Proteindomäne wurden mithilfe mathematischer Modellierung erzielt, um die experimentellen Neutronendaten zu beschreiben und die Überschneidung zwischen kombinierten diffusiven und internen Proteinbewegungen zu bestimmen. Die Extraktion des internen dynamischen Beitrags zur aus NSE erhaltenen Zwischenstreufunktion, einschließlich der Zeitskala der verschiedenen Bewegungen, ermöglicht einen weiteren Einblick in die mechanischen Eigenschaften einzelner Proteine und die Weichheit von Proteinen in ihrer fast natürlichen Umgebung in der überfüllten Proteinlösung.

Introduction

Sondierung der Dynamik weicher Materie mit Neutronen
Die Untersuchung der dynamischen Eigenschaften von Proteinen und Peptiden ist ein wichtiger Teil der biophysikalischen Forschung, und es gibt heute viele gut entwickelte Methoden, um Zugang zu einer Vielzahl von Energielandschaften zu erhalten1. Die experimentell aufgedeckte Dynamik der Proteine mit ihrer biologischen Funktion in Beziehung zu setzen, ist eine weitaus schwierigere Aufgabe, die komplexe mathematische Modelle und computergestützte Dynamiksimulationen erfordert. Die Bedeutung der Neutronenspektroskopie für die Analyse von Proteinbewegungen wurde in mehreren gut aufgenommenen und weithin anerkannten Studienhervorgehoben 1,2,3,4,5. Bevor die vielfältige Energielandschaft der internen Proteindynamik erforscht wird, ist ein kurzer Überblick über die dynamischen Prozesse in weicher Materie erforderlich und wie Neutronen auf sie zugreifen können.

Die Empfindlichkeit von Neutronen gegenüber der Isotopenkonfiguration und die Art der Wechselwirkungen, die sie mit weicher Materie zeigen, macht die Neutronenstreuung zu einer der vielseitigsten Untersuchungstechniken6. Es gibt ein breites Spektrum von Korrelationslängenskalen und Korrelationszeiten, auf die Neutronen zugreifen können, von nuklearen Anregungen und atomaren Schwingungen bis hin zu kollektiven Bewegungen und langsamen Relaxationsprozessen wie isotropen Rotationen und diffusiven Bewegungen. Bei der Untersuchung der gestreuten Neutronen für ihren Energietransfer können drei Hauptwechselwirkungen unterschieden werden: die elastische Streuung, bei der kein Energieaustausch zwischen einfallendem Neutron und Teilchen in der Probe stattfindet; die inelastische Streuung mit einem großen, quantifizierbaren Energieaustausch zwischen Neutron und Teilchen; und der eigentümliche Fall der quasi-elastischen Streuung, der einen sehr kleinen Energietransfer im Vergleich zur einfallenden Neutronenenergie 1,7 bezeichnet. Diese Wechselwirkungen geben präzise Aufschluss über das untersuchte Material und bilden die theoretische Grundlage verschiedenster Neutronenstreutechniken.

Bei der elastischen Streuung zeichnet der Detektor die Richtungen der Neutronen als Beugungsmuster auf, das die Position der Probenatome relativ zueinander zeigt. Es werden Informationen über die Korrelationen atomarer Positionen gewonnen (d.h. integrierte Intensität S(Q) bezüglich der Impulsübertragung Q, die sich nur auf strukturelle Informationen bezieht). Dieses Prinzip bildet die Grundlage der Neutronenbeugung8.

Komplexität entsteht, wenn die Energieübertragung aufgrund von Anregungen und internen Schwankungen im Probenmaterial nicht mehr Null ist. Dies bildet die Grundlage der Neutronenspektroskopie, bei der die gestreuten Neutronen sowohl als Funktion des Energietransfers E als auch des Impulstransfers Q untersucht werden. Es werden dynamische und strukturelle Informationen gewonnen. Die Neutronenspektroskopie misst die gleiche integrierte Intensität S(Q) für den Energietransfer (d.h. Geschwindigkeitsänderung der Neutronen aufgrund der Probenstreuung, S(Q,ω) = S(Q, E), die auch als dynamischer Strukturfaktor bezeichnet wird)9.

Zur Berechnung der Streuung aus einem Material ist es sinnvoller, die Paarkorrelationsfunktion 7,10 zu verwenden. Im Beugungsfall gibt die statische Paarkorrelationsfunktion G(r) die Wahrscheinlichkeit an, den Mittelpunkt eines Teilchens in einem gegebenen Abstand r vom Zentrum eines anderen Teilchens zu finden. Die Spektroskopie verallgemeinert die statische Paarkorrelationsfunktion und bezieht Energie/Frequenz/Zeit in die Streugleichung mit ein. Die Paarkorrelationsfunktion G(r) wird zu einer Funktion der Zeit G(r, t), die in eine ausgeprägte Atompaarkorrelationsfunktion G D(r, t) und eine Selbstkorrelationsfunktion GS(r, t) zerlegt werden kann. Diese beschreiben zwei Arten von Korrelationen: paarkorrelierte Bewegungen von Atomen, die die kohärente Streuung steuern, und Selbstkorrelation, die die inkohärente Streuungsteuert 10.

Kohärente Streuung ist die Streuung vom "Durchschnitt" und hängt von der relativen Phase der gestreuten Wellen ab. Im Kleinwinkelstreuregime interferieren die gestreuten Neutronenwellen aus verschiedenen Streuzentren (verschiedene Atome) konstruktiv (haben ähnliche Phasen), und die kollektive Bewegung der Atome wird mit starker Intensitätsverstärkung beobachtet. Die kohärente Streuung beschreibt im Wesentlichen die Streuung eines einzelnen Neutrons aus allen Kernen in der Probe10.

Wenn keine konstruktive Interferenz zwischen den gestreuten Neutronenwellen aus verschiedenen Zentren auftritt, wird ein einzelnes Atom zeitlich verfolgt und die Selbstkorrelation zwischen der Position des Atoms zum Zeitpunkt t = 0 und demselben Atom zum Zeitpunkt t beobachtet. Somit geht die Information über die relativen Positionen von Atomen verloren, und der Fokus liegt nur auf lokalen Fluktuationen. Die Streuung aus lokalen Schwankungen steuert die inkohärente Streuung. Inkohärente Streuung ist isotrop, trägt zum Hintergrundsignal bei und verschlechtert das Signal-Rauschen10,11.

Wenn wir alle oben genannten Punkte kombinieren, unterscheiden wir vier Hauptneutronenstreuprozesse10: (1) elastisch kohärent (misst die Korrelationen atomarer Positionen), (2) inelastisch kohärent (misst kollektive Bewegungen von Atomen), (3) elastisch inkohärent (trägt zum Hintergrund bei, reduziert die Streuintensität durch den Debye-Waller-Faktor (DWF) und misst den elastischen inkohärenten Strukturfaktor (EISF), der die Geometrie diffusiver Bewegungen in begrenzter Geometrie beschreibt, und (4) inelastisch inkohärent (misst die Dynamik einzelner Atome und die Selbstkorrelation).

Dynamische Prozesse, auf die Neutronen in der Biologie zugreifen können, reichen von der Dämpfung niederfrequenter atomarer und molekularer Schwingungen, der Wechselwirkung von Lösungsmittelmolekülen mit Biooberflächen und Diffusionsprozessen in der Hydratationsschicht von Makromolekülen und begrenzter Geometrie bis hin zu kurzreichweitigen translationalen, rotationalen und taumelnden diffusiven Bewegungen sowie Proteindomänen und allosterischen Bewegungen1 . Die große Vielfalt an Neutronenmethoden und -instrumenten zur Messung der Proteindynamik basiert darauf, wie die Achromatisierung des einfallenden oder ausgehenden Neutronenstrahls erreicht wird und wie die Energieanalyse der gestreuten Neutronen durchgeführt wird. Von Dreiachsen- bis hin zu Flugzeit-, Rückstreu- und Spin-Echo-Spektrometern kann man dynamische Prozesse mit charakteristischen Zeiten zwischen 1 x 10-14 s und 1 x 10-6 s (Femtosekunden bis Mikrosekunden) untersuchen12.

Das Oak Ridge National Laboratory verfügt mit seinen beiden renommierten Neutronenquellen, der Spallation Neutron Source - SNS13 und dem High Isotope Flux Reactor - HFIR14, über eine der besten Suiten von Spektrometern zur Untersuchung der Dynamik in Biomaterialien. Einige der eloquentesten Beispiele sind die Verwendung des Kaltneutronen-Chopper-Spektrometers (CNCS) bei SNS15, um die dynamische Störung von Hydratationswasser um grün fluoreszierendes Protein in Lösung16 oder die kollektiven Schwingungen mehrerer Proteine17 unter Pikosekunden zu untersuchen. Ein wiederkehrendes Problem der Untersuchungen der inelastischen Neutronenstreuung ist, dass einige biologische Prozesse zu langsam sind, um beobachtet zu werden. Ohne extreme Setups, die zu einem enormen Verlust der Neutronenintensität führen, sind Time-of-Flight-Spektrometer auf eine Energieauflösung von 10 μeV begrenzt, was einer maximalen Zeitskala von ~200 ps10,11 entspricht. Dies reicht nicht aus, um großräumige Bewegungen in Proteinen zu beobachten. Daher werden häufig Instrumente mit höherer Energieauflösung wie die Rückstreuspektrometer benötigt. Die Kombination der Flugzeit- und Rückstreutechniken hat sich als leistungsfähig erwiesen, um die Veränderung der internen Dynamik von Cytochrom P450cam (CYP101) zu untersuchen, einem Enzym, das den Hydroxylierungskampfer18 katalysiert.

Die mikroskopische Diffusivität, die mit dem Rückstreuspektrometer an SNS-BASIS19 gemessen wurde, war überraschend gut definiert und konnte in die Diffusivität von Wasser (Hydratation, zytoplasmatisches und massenartiges Wasser) und die Diffusivität von Zellbestandteilen in planarischen Plattwürmern, dem ersten lebenden Tier, das durch Neutronenstreuunguntersucht wurde 20, getrennt werden. . Die Rückstreuung ist eine hochauflösende spektroskopische Technik, die aber auch auf mehrere μeV = mehrere Nanosekunden begrenzt ist, während sich die langsame Dynamik in Biomaterialien auch als Überlebenszeit der Korrelation zwischen atomaren Positionen oder Spinorientierungen manifestiert (z. B. Relaxationsprozesse, die regelmäßig im Zeitbereich von zehn bis Hunderten von Nanosekunden auftreten).

Die Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie (NSE) ist die einzige Neutronenstreutechnik, die eine so hohe Auflösung erreicht. Im Gegensatz zu anderen Neutronentechniken erfordert NSE keine Achromatisierung des Strahls, da es die quantenmechanische Phase der Neutronen verwendet, die ihre magnetischen Momente sind. Die Manipulation magnetischer Momente ermöglicht die Verwendung einer breiten Wellenlängenverteilung des Neutronenstrahls, während die Technik empfindlich auf sehr kleine Neutronengeschwindigkeitsänderungen in der Größenordnung von 1 x 10-4 reagiert. NSE wurde erfolgreich eingesetzt, um die langsame Dynamik von Proteinen in Lösung für viele Proteine zu untersuchen. Unter diesen vielen Pionierstudien erkennen wir die Untersuchung der segmentalen Flexibilität von Schweineimmunglobulin21 an; die gekoppelten Domänenbewegungen in Taq-Polymerase22; die Domänenbewegungen im Tetramer der Hefealkoholdehydrogenase23; die Änderung der Konformation in der Phosphoglyceratkinase bei Substratbindung3; die Aktivierung von Domänenbewegungen und die dynamische Ausbreitung allosterischer Signale im Na+/H+-Exchange Regulatory Cofactor 1 (NHERF1)-Protein4,24,25; die Dynamik eines kompakten Zustands der Quecksilberionenreduktase26; und die Diffusion von Hämoglobin in roten Blutkörperchen27. Zwei neuere Studien zur Proteindynamik haben die Flexibilität des humanen Antikörpers Immunglobulin G (IgG) als entropisches Frühjahr28 und die Eigenschaften des Lösungsmittelbeitrags zur Dynamik des intrinsisch ungeordneten Myelin-Basisproteins (MBP)5 aufgedeckt.

Der vorliegende Artikel erklärt die Grundprinzipien von NSE, die vielfältigen vorbereitenden Methoden, die für eine gründliche Untersuchung der Proteindynamik empfohlen werden, sowie die Methodik und das experimentelle Protokoll für die NSE-Datenerfassung am NSE-Spektrometer an der SNS, SNS-NSE. Das Protokoll charakterisiert zwei Proteine: IgG, ein normales menschliches Antikörperprotein, und das intrinsisch ungeordnete Protein MBP. Die biophysikalischen Implikationen, die Forschungsrelevanz der Beispiele und die Grenzen der Technik werden kurz diskutiert.

NSE-Spektroskopie, die Methode zur Messung der langsamen Dynamik
NSE ist eine polarisierte Technik, die die Neutronenflugzeit verwendet, um den Energieaustausch (Polarisationsverlust) aufgrund der quasi-elastischen Wechselwirkung zwischen Neutronen und Atomen in einer Probe zu messen. Im Kern der NSE-Spektroskopie liegen zwei Grundprinzipien: (1) die Fähigkeit des Neutronenspins, im Magnetfeld mit einer Frequenz proportional zur magnetischen Stärke Equation 1zu präzessieren, nämlich der Larmorfrequenz29, und (b) das Spin-Echo oder Hann-Echo, das die Manipulation und Neufokussierung des Polarisationssignals bei Anlegen einer Reihe von Hochfrequenzimpulsen30 darstellt.

Die Grundlagen des NSE-Prozesses können in einigen einfachen Schritten 6,11 mithilfe von Abbildung 1 zusammengefasst werden. (1) Der von der Quelle erzeugte Neutronenstrahl (Position 1) wird polarisiert (Position 2), geführt und transportiert (Position 3) und erreicht den Eingang des NSE-Spektrometers, wo er vom ersten Pi-Halb-Flipper um 90° gedreht wird (Position 4). (2) Der polarisierte Strahl (z. B. neutronenmagnetische Momente) wird senkrecht zu den Magnetfeldlinien des ersten Magneten (erste Präzessionszone, Position 5) und beginnt zu präzessieren. (3) Am Ende des Magneten akkumulieren Neutronenspins einen bestimmten Präzessionswinkel, der proportional zur magnetischen Feldstärke und der im Inneren verbrachten Flugzeit ist (im Wesentlichen umgekehrt proportional zur Neutronengeschwindigkeit). Die einzelnen Neutronengeschwindigkeiten werden innerhalb ihres Präzessionswinkels am Ende der ersten Präzessionszone kodiert. (4) In der Nähe der Stichprobenposition kehrt der Pi-Flipper (Position 6) die Ausrichtung des Spins um 180° um und ändert das Vorzeichen des Präzessionswinkels. (5) Die Neutronen interagieren mit den Molekülen der Probe (Position 7) und werden gestreut. (6) Die gestreuten Neutronen treten in die zweite Präzessionszone (Position 8) ein und treten in sie vor, werden aber umgekehrt. (7) Ein weiterer Pi-Halb-Flipper (Position 9) wird verwendet, um die Ausrichtung des Spins von senkrecht zur horizontalen Richtung zu drehen. Dadurch wird die Präzession gestoppt, wodurch der Präzessionswinkel φ in eine Polarisation proportional zu cos(φ) übersetzt wird. (8) Der Analysator (Position 10) wählt die Neutronen anhand einer Orientierung aus. Wenn die Wechselwirkung mit der Probe elastisch ist, ändert sich die Geschwindigkeit des Neutrons nicht. Die Neutronen verbringen eine identische Menge an Zeit damit, in der ersten und zweiten Präzessionszone zu fliegen, und die akkumulierten Präzessionswinkel werden vollständig zurückgewonnen. Die volle Polarisation wird auf dem Detektor (Position 11) als Echo der ursprünglichen Polarisation (d.h. Spin-Echo) wiederhergestellt. (9) Bei NSE ist die Streuung jedoch quasi-elastisch, so dass ein kleiner Energieaustausch zwischen Neutronen und Probenmolekülen nach der Streuung durch die Probe zu unterschiedlichen Neutronengeschwindigkeiten führt. Aufgrund der unterschiedlichen Geschwindigkeiten werden die Neutronen eine zusätzliche Zeit damit verbringen, durch die zweite Präzessionszone zu fliegen und ihren Präzessionswinkel nicht richtig wiedererlangt zu haben. Eine partielle Polarisation wird auf dem Detektor abgerufen, und der Verlust der Polarisation aufgrund der Spinrelaxation ist proportional zur cos-Fourier-Transformation der Spektralfunktion S(Q, ω), der Zwischenstreufunktion F(Q, t). (10) Der Zeitparameter der Funktion F(Q, t) ist proportional zur Präzessionsmagnetfeldstärke. Die Abtastung des Polarisationsverlustes in Abhängigkeit von der magnetischen Feldstärke ergibt daher eine Relaxationsfunktion, die von den dynamischen Prozessen innerhalb der Probe abhängt.

Figure 1
Abbildung 1: Aufnahme des NSE-Spektrometers am SNS (SNS-NSE) und Neutronenflugbahnschema mit den wichtigsten Funktionskomponenten. Von rechts nach links: 1 = Neutronenquelle; 2 = Chopper-Bender-Polarizer-Sekundärverschlusssystem; 3 = Leitfäden für den Strahltransport; 4 = Pi/2 Flipper für erste 90° Drehung; 5 = erste Präzessionszone; 6 = Pi-Flipper für 180° Drehung; 7 = Probenfläche und Probenumgebung (hier ist der Kryoofen dargestellt); 8 = zweite Präzessionszone; 9 = Pi/2 Flipper für zweite 90° Drehung; 10 = Analysator; 11 = Detektor. (Beachten Sie, dass sich Teile von 3 sowie 2 und 1 hinter der blauen Wand in der Abschirmung befinden; die Chopper werden durch einen Geschwindigkeitswähler für reaktorbasierte NSE ersetzt.) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Protocol

Die vorliegende Arbeit charakterisiert zwei Proteine: ein normales humanes Antikörperprotein IgG und das intrinsisch ungeordnete MBP. Die lyophilisierte Form der Proteine wurde aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Vorbereitung der Proteinprobe

  1. Es wird ein 50 mM Natriumphosphat + 0,1 M NaCl-Puffer hergestellt, indem die jeweiligen festen Reagenzien in schwerem Wasser (D2O) gewogen und gelöst werden (siehe Materialtabelle). Dies ist das deuterierte Pufferlösungsmittel für IgG.
    1. Stellen Sie den pH-Wert der Pufferlösung auf 6,6 ein.
  2. Es wird ein 20 mM Natriumphosphat + 6 M Harnstoffpuffer hergestellt, indem die jeweiligen festen Komponenten in schwerem Wasser (D2O)gewogen und gelöst werden. Dies ist das deuterierte Pufferlösungsmittel für MBP.
    1. Stellen Sie den pH-Wert der Pufferlösung auf 4,7 ein.
  3. Filtern Sie die Pufferlösungsmittel mit 0,2 μm Porengrößenfiltern (siehe Materialtabelle).
  4. Die gereinigten proteinlyophilisierten Pulver werden in den deuterierten Lösungsmitteln für die jeweiligen Proteine (Schritte 1.1.-1.2.) bei hoher Proteinkonzentration (~50 mg/ml) gewogen und gelöst.
  5. Laden Sie die Proteinlösung in Dialysekörbe mit Dialysemembranen von 3,5 K MWCO und dialysieren Sie gegen den gefilterten Puffer für 24 h bei 10 °C für MBP und 25 °C für IgG (siehe Materialtabelle), indem Sie die Röhrchen leicht schütteln, um einen Diffusionsgradienten zu erzeugen.
  6. Verdünnen Sie die Proteinlösung mit dem Dialysepuffer in einer Reihe von Konzentrationen: 1, 2, 5, 10 und 50 mg / ml.
  7. Bestimmen Sie die genauen Konzentrationen mit einem Nanodrop-Spektralphotometer (siehe Materialtabelle).

2. Vorläufige Probencharakterisierung durch dynamische Lichtstreuung (DLS)

  1. Laden Sie 80 μL jeder Proteinlösung aus der oben vorbereiteten Konzentrationsreihe (Schritt 1.6.) in die DLS-Einwegzelle (siehe Materialtabelle) und bestimmen Sie die Diffusionskoeffizienten, wobei der Durchschnitt über 10 Akquisitionen beträgt.
  2. Zeichnen Sie die translationalen Diffusionskoeffizienten als Funktion der Proteinkonzentration auf und extrapolieren Sie auf Nullkonzentration.
  3. Laden Sie jede Proteinlösung aus der Konzentrationsreihe in die Kapillarröhrchen eines Viskosimeters (siehe Materialtabelle) und messen Sie die dynamische Viskosität.
  4. Zeichnen Sie die gemessenen dynamischen Viskositäten in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration auf und extrapolieren Sie auf die Konzentration Null.
    HINWEIS: Die Extrapolation der DLS-Diffusion auf die Nullkonzentration ergibt den Wert der translationalen Diffusion für ein einzelnes Protein. Die Extrapolation der dynamischen Viskosität auf die Nullkonzentration muss den experimentell für die Pufferlösung gemessenen dynamischen Viskositätswert ergeben.

3. Sammlung der Kleinwinkelstreuung (Neutron oder Röntgen)

  1. Messung der Kleinwinkel-Neutronenstreuung (SANS) und/oder der kleinwinkligen Röntgenstreuung (SAXS) (siehe Materialtabelle) an vier Proteinkonzentrationen, vorzugsweise 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml und 50 mg/ml.
  2. Normalisieren Sie SANS- und SAXS-Spektren durch Proteinkonzentration.
  3. Passen Sie den Proteinformfaktor P(Q) mithilfe der Ensemble-Optimierung31 und/oder der SasView32-Software an die SANS- und SAXS-Spektren an.
  4. Berechnen Sie den Strukturfaktor S(Q, c), indem Sie das SANS- und SAXS-Signal für jede Konzentration durch P(Q) dividieren.
    HINWEIS: Leser, die daran interessiert sind, Kleinwinkelstreudaten als Unterstützung für NSE-Messungen zu messen und zu interpretieren, werden gebeten, die Referenzen 23,28,31,32,33 gründlich zu konsultieren.

4. Messung von NSE

  1. Richten Sie sich für das Experiment ein und mounten Sie das Beispiel mit den folgenden Schritten.
    1. Wählen Sie die Dicke der Zelle für die Probenbeladung basierend auf der Konzentration der Proteinlösung, der für die Messung erforderlichen Temperatur und der verfügbaren Lösungsmenge.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden transparente Toplader-Quarzbehälter von 40 mm x 30 mm x 4 mm verwendet.
    2. Reinigen Sie die Zelle wiederholt, abwechselnd zwischen phosphatfreiem Geschirrspülmittel (siehe Materialtabelle), entionisiertem Wasser und 70% Ethanol.
    3. Trocknen Sie die Zelle im Konvektionsofen; 80 °C für die Quarzzellen nicht überschreiten.
    4. Laden Sie 4 ml Proteinlösung in die Zelle und schließen Sie sie mit Kappen. Verwenden Sie Wachsfolie oder ein anderes Dichtungsmittel (siehe Materialtabelle), um die Probenzellen zu versiegeln.
      HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurden 4,8 ml Lösung bei ~50 mg/ml verwendet, um eine ausreichende Streuintensität zu erhalten.
    5. Laden Sie 4 ml Dialysepuffer in einen identischen Behälter wie die Proteinprobe und versiegeln Sie ihn.
    6. Transportieren Sie Proben zur Beamline, schließen Sie den Verschluss und betreten Sie den Spektrometer-Höhlenbereich34.
    7. Montieren Sie die Probenzelle auf dem Aluminium-Probenhalter, indem Sie die Schrauben und die Halteplatten anziehen (Abbildung 2, linke Seite).
      HINWEIS: Man kann zwei Probenzellen gleichzeitig montieren, da für alle Proben das gleiche Messprotokoll benötigt wird.
    8. Montieren Sie die Graphitprobe und/oder die Al2O3 Pulverprobe in einem identischen Behälter wie die Proteinprobe. Dies sind Standards, die von der SNS-NSE-Beamline-Unterstützung bereitgestellt werden.
    9. Platzieren Sie den Probenhalter, indem Sie ihn vorsichtig in die Dose des Temperaturantriebssystems (TFS, siehe Materialtabelle) schieben.
      HINWEIS: TFS ist die am häufigsten verwendete Probenumgebung bei SNS-NSE und pumpt trockene Luft in den Probenbehälter, um die gewünschte Temperatur zu erreichen (Abbildung 2, mittlere und rechte Abbildung).
    10. Schließen Sie den TFS-Deckel und stellen Sie die Temperatur auf den gewünschten Wert ein, indem Sie auf den interaktiven Bildschirm des TFS zugreifen.
    11. Montieren Sie die Neutronenkamera (siehe Materialtabelle) für die Ausrichtung der Proben am Strahl.
    12. Kehren Sie das Instrumentengehäuse auf, evakuieren Sie, schließen Sie die Türen und öffnen Sie den Balkenverschluss.
      HINWEIS: Probenzellen werden von der SNS-NSE-Beamline-Unterstützung bereitgestellt. Die verfügbaren Beispielzellen und die Beispielumgebungsbibliothek finden Sie auf der SNS-NSE-Beamline-Webseite 7,35.
  2. Sammeln Sie die NSE-Daten mit den folgenden Schritten.
    1. Richten Sie die Probe im Neutronenstrahl mit der Neutronenkamera und den vier unabhängigen Probenöffnungen aus.
    2. Öffnen Sie die SNS-NSE-Datenerfassungssoftware36 und sammeln Sie Stichprobenstatistiken, indem Sie Beugungsscans für die gewünschten Streuwinkel und Wellenlängen ausführen.
    3. Richten Sie die Messparameter basierend auf den für jede Probe gesammelten Statistiken ein, indem Sie die Messmakros bearbeiten, die vom assistierenden Instrumentenwissenschaftler bereitgestellt werden.
    4. Starten Sie den Scan, indem Sie den Protokollnamen an der Eingabeaufforderung eingeben, und erfassen Sie Echos für das Beispiel.
    5. Beginnen Sie mit dem Scannen und erfassen Sie Echos auch für die elastische Referenz und das gepufferte Lösungsmittel. Führen Sie für den Probenwechsel einen intermittierenden Strahlverschlussbetrieb durch.

Figure 2
Abbildung 2: NSE-Messsystem. Linkes Feld: Proteinlösungsproben in Quarzbehältern, die mit Schrauben und Platten auf dem Aluminium (Al) -Probenhalter montiert sind. Der Al-Probenhalter bietet die Möglichkeit, zwei Proben gleichzeitig in der Probenumgebung zu montieren. Mittleres Feld: Die Probe des Temperaturantriebssystems (TFS) kann auf der Probenstufe montiert werden, das Neutronenstrahlfenster befindet sich auf der rechten Seite, während die für die Ausrichtung verwendete Neutronenkamera auf der linken Seite sichtbar ist. Rechte Platte: Wenn Sie den Probenhalter mit zwei Proben in die Probe legen, können Sie mit Siliziumfenstern (Si) arbeiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

5. NSE-Datenreduktion

HINWEIS: SNS-NSE ist mit einer speziellen Software namens DrSpine (Datenreduktion für Spin-Echo)37,38 ausgestattet, die auf dem ORNL Neutron Sciences Remote Analysis Cluster, einem Quick User Guide und integriertem Hilfe-Support verfügbar ist.

  1. Melden Sie sich mit den ORNL-Benutzeranmeldeinformationen beim Neutron Sciences Remote Analysis Cluster (siehe Tabelle der Materialien) an und klicken Sie auf die Schaltfläche Sitzung starten .
  2. Richten Sie die Datenreduktionssoftware mit den folgenden Schritten ein.
    1. Öffnen Sie im Benutzerverzeichnis ein Terminalfenster und geben Sie Folgendes ein: source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh.
    2. Geben Sie als Nächstes Folgendes ein: drspine_create_env.sh.
  3. Erstellen Sie einen Ordner für die Datenreduktion im Basisverzeichnis und kopieren Sie die bereitgestellten Skripts und Makros aus dem freigegebenen Verzeichnis.
  4. Bearbeiten, umbenennen und speichern Sie das bereitgestellte Reduktionsmakro entsprechend.
  5. Geben Sie drspine an der Eingabeaufforderung ein und drücken Sie die Eingabetaste , um die Softwarereduktionsumgebung zu starten.
  6. Geben Sie "den Namen des Reduktionsmakros" ein, der in Schritt 5.4 bearbeitet wurde. in der Eingabeaufforderung innerhalb der Softwareumgebung und drücken Sie die Eingabetaste.

6. NSE-Datenanpassung

  1. Bearbeiten Sie das Python-Skript "stapler-drspine.py", das vom assistierenden Instrument Scientist bereitgestellt wird, mit den Namen der reduzierten Dateidaten.
    HINWEIS: Das Python-Skript ist für Benutzer des Instruments frei verfügbar.
  2. Bearbeiten Sie die Funktion so, dass sie aus der bereitgestellten Bibliothek passt.
  3. Geben Sie den Namen des bearbeiteten Skripts "stapler-drspine.py" an der Eingabeaufforderung ein und drücken Sie die Eingabetaste , um reduzierte NSE-Daten zu lesen, anzupassen und darzustellen.
    HINWEIS: Der Instrument Scientist stellt eine Vorlage für das Reduktionsmakro und das Python-Skript "stapler-drspine.py" bereit, das NSE-reduzierte Daten lesen und anpassen kann. Die endgültigen reduzierten NSE-Daten liegen im ASCII-Format vor und können von verschiedenen bevorzugten Softwares gelesen werden.

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Representative Results

IgG-Protein aus humanen Serum- und Rinder-MBP-Proteinen wurde in hohen Konzentrationen (~50 mg/ml) inD2O-Basenpuffernrekonstituiert. Da die Proteine in hohen Konzentrationen gelöst waren, handelte es sich bei den erhaltenen Lösungen um überfüllte Proteinlösungen. Die mit NSE untersuchte Dynamik leidet unter der überfüllten Umgebung, in der sich die Proteine befinden (Strukturfaktorwechselwirkungen und hydrodynamische Effekte)5,28,39. DLS wurde an einer Konzentrationsreihe für jedes Protein durchgeführt, um Crowding-Effekte zu berücksichtigen. Die Extrapolation der mit DLS gemessenen translationalen Diffusionskoeffizienten auf Null ergibt den Wert der translationalen Diffusion für ein einzelnes Protein. Die dynamische Viskosität als Funktion der Proteinkonzentration muss ebenfalls vor NSE gemessen werden, um die hydrodynamischen Wechselwirkungen zu berücksichtigen. Die Extrapolation der dynamischen Viskositäten auf Null als Funktion der Konzentration muss den Wert ergeben, der experimentell für die Pufferlösung jeder vorbereiteten Proteinprobe gemessen werden kann.

Die Form und Struktur von Proteinen in konzentrierter Lösung wurden vor jedem NSE-Experiment bewertet, um Erkenntnisse über den Proteinformfaktor und die Stärke des Strukturfaktors zu gewinnen, die beeinflussen könnten, wie sich die Proteine in Lösung bewegen. Die Kleinwinkelstreuung war die Methode der Wahl für diese Untersuchungen. In der vorliegenden Studie wurde die strukturelle Konformation des IgG-Proteins in Lösung von SAXS beobachtet und die Struktur von MBP von SANS bewertet. Die gemessene Streuintensität (Q) (Schritte 3.3.-3.4.) ist proportional zum Produkt zwischen Formfaktor P(Q) und Strukturfaktor S(Q,c), gewichtet mit der Anzahl der Partikel (Gleichung 1)5,28,39:

I (Q) = N ∙ P (Q) ∙S (Q, c) (1)

SAXS wurde auf einem SAXS-Instrument 40 vom Kratky-Typ mit einer Röntgenwellenlänge von 0,154 nm für IgG gemessen, und SANS wurde41 für MBP mit einer Neutronenwellenlänge von4,5 Å gemessen. Die experimentellen Kleinwinkelintensitäten I(Q) wurden hintergrund- und lösungsmittelkorrigiert, skaliert durch die Lösungskonzentration, und der Formfaktor wurde mit frei verfügbaren Softwarepaketen wie Ensemble modeling-EOM und SasView 24,25,29,39,42,43 berechnet. Weiterhin wurde der Strukturfaktor für jedes Protein aus Gleichung 1 erhalten.

Für die vorliegende Studie wurden die NSE-Experimente mit zwei Spin-Echo-Spektrometern durchgeführt: dem SNS-NSE-Instrument 34 in Abbildung 1 und dem Phoenix-J-NSE-Instrument44. Einfallende Wellenlängen zwischen 8 Å - 12 Å, mit Fourier-Zeiten zwischen 0,1 ns ≤ tmax ≤ 130 ns für mehrere Q-Messungen zwischen 0,05 Å−1- 0,2 Å−1, wurden gemessen. Der Unterschied zwischen den beiden Spektrometern ist ein entscheidender Punkt im Verständnis der NSE-Wissenschaft, und sie repräsentieren sowohl das alte Konzept eines sogenannten "klassischen Spin-Echos" für die statische Neutronenquelle eines Reaktors als auch das neue "Time-of-Flight-Konzept" für die pulsierende Neutronenquelle. Das Phoenix-J-NSE-Spektrometer ist ein klassisches NSE, bei dem ein Geschwindigkeitswähler eine bestimmte Wellenlänge auswählt. Um Variationen der Neutronengeschwindigkeiten zu ermöglichen, wird eine Wellenlängenbandbreite von ±10% eingeführt. Trotz des sehr schmalen Energiebandes, das für einen einzigen Scan verwendet wird, stellt die Situation des Phoenix-J-NSE-Spektrometers an einer Hochflussreaktorquelle sicher, dass Raumvektor- und Korrelationszeiträume in relativ kurzen Messzeiten abgedeckt werden. Das SNS-NSE-Spektrometer ist das neue, ultrahochauflösende Chopper-Neutronenspektrometer mit einer Wellenlängenspanne von 2 Å < λ < 14 Å und einer simultanen Wellenlängenbandbreite von 2,4 Å - 3,6 Å, abhängig von der Position des Spektrometers. Aufgrund dieser großen Bandbreite wird eine hohe Datenerfassungseffizienz erreicht, die eine nahezu lückenlose Abdeckung eines breiten Wellenvektor-Zeitbereichs mit nur wenigen Streuwinkeleinstellungen ermöglicht. Die Auswahl des Wellenlängenbandes im SNS-NSE erfolgt durch ein Chopper-System, das aus vier Choppern besteht. Beide hier diskutierten NSE-Spektrometer verfügen über Präzessionsfelder, die auf supraleitender Technologie mit hoher Magnetfeldhomogenität basieren, neuartige hochmoderne Feldkorrekturelemente für Streufeldkorrekturen und neuartige Polarisationsbieger41,42.

Die NSE-Spektren wurden bei 10 °C für MBP-Protein und 25 °C für IgG1-Protein gemessen. Die kohärente Zwischenstreuintensität I(Q, t)/I(Q, t = 0), gemessen durch NSE, ist das beitragende Ergebnis aller dynamischen Prozesse in der Probe, die innerhalb der untersuchten Zeitskala ablaufen. Dies beinhaltet die interne Proteindynamik, die gesamte translationale Diffusion, die rotierende und taumelnde Diffusion und die segmentalen Bewegungen innerhalb des Proteinmoleküls selbst. Ein vereinfachtes Modell geht davon aus, dass die interne Dynamik und die translationalen und rotationalen Diffusionen vollständigentkoppelt sind 5,45,46,47,48 und separat charakterisiert werden können. Für das einzelne Teilchen kann die kohärente Streufunktion als Produkt geschrieben werden (Gleichung 2)23,48:

F (Q, t) = Ftrans(Q, t) ∙F rot(Q, t) ∙Fint(Q, t) (2)

wobei der translationale Diffusionsterm für ein einzelnes starres Protein eine exponentielle Funktion des translationalen Diffusionskoeffizienten DT (Gleichung 3)23,48 ist:

Ftrans(Q, t) = exp(−Q2∙ DT∙ t) (3)

Für große Proteinkonzentrationen wird der translationale Diffusionskoeffizient D T durch Protein-Protein-Wechselwirkungen, quantifiziert durch den Strukturfaktor S(Q) und durch hydrodynamische Wechselwirkungen, die durch die hydrodynamische Funktion HT(Q) beschrieben werden, beeinflusst (Gleichung 4)23,48:

D T(Q) = DT0 ∙HT(Q, c) / S(Q, c) (4)

In Gleichung 4 ist DT0 der extrapolierte Diffusionswert auf Nullkonzentration aus den DLS-Messungen (Schritt 2.2.). H T wird berechnet als HT = 1 -c∙ [η], wobei c die Proteinkonzentration, [η] die intrinsische Viskosität ist, berechnet durch [η] = (η - η 0) /η 0 ∙ c und η 0 die gemessene dynamische Viskosität ist (Schritte 2.3.-2.4.). Der Strukturfaktor S(Q, c) wurde aus SAXS-Messungen für das IgG-Protein und SANS-Messungen für das MBP-Protein gewonnen.

Abbildung 3 zeigt Beispiele für Zwischenstreufunktionen I(Q, t) / I(Q, t = 0), wie sie von NSE für IgG- und MBP-Proteine gemessen wurden. Eine deutliche Abweichung von einem einfachen diffusionsähnlichen Relaxationsprozess wurde auf der kurzen Fourier-Zeitskala <25 ns beobachtet, was auf die Zugänglichkeit der internen Dynamik von Proteinen durch NSE und die Notwendigkeit eines komplexeren Modells zur Beschreibung der beobachteten dynamischen Prozesse hinweist.

Figure 3
Abbildung 3: NSE-Relaxationsspektren für IgG- und MBP-Proteine. Die IgG-Daten sind hier dargestellt, die nur durch eine Einzelexponentialfunktion angepasst sind, um die Abweichung von der Diffusion bei kürzeren Fourier-Zeiten aufzudecken. Die Abweichung wurde für beide Proteine beobachtet. Im Gegensatz dazu werden die MBP-Daten hier im Vollrelaxationsbereich dargestellt, der mit dem von Biehl45 entwickelten Modell ausgestattet ist. Das Modell impliziert eine grobe Körnung und ermöglicht die gleichzeitige Anpassung von kurzen, mittleren und langen Fourier-Zeitregimen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Daher wurden die Streufunktionen durch atomare Modellierung beider Proteine unter Verwendung von von Biehl entwickelten Modellen angepasst, die in den Referenzen 18,25,38,43,44,46 beschrieben sind. Die Zwischenstreufunktion wurde durch Grobkörnung auf ein paar hundert einzelne Körner berechnet, im Gegensatz zur Allatomsimulation, um die Rechenlast und -zeit zu reduzieren, und die MMTK49-Softwarebibliothek (frei zugänglich) wurde verwendet, um auf atomare Koordinaten zuzugreifen und Transrotationsbewegungen auf Proteindomänen und -fragmenten zu implementieren. Die Ergebnisse der Berechnung der Zwischenstreufunktion für beide Proteine stimmten hervorragend mit den experimentellen NSE-Daten überein und bewiesen, dass die langsamere Dynamik, die bei langen Fourier-Zeiten beobachtet wurde, auf die gesamten translationalen und rotationalen Diffusionsprozesse zurückzuführen ist, während die auf kurzen Zeitskalen beobachtete schnelle Dynamik auf die Dynamik von Proteindomänen zurückzuführen ist.

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Discussion

Die NSE-Spektroskopie liefert einen einzigartigen und detaillierten Blick auf die Dynamik von Proteinen, den andere spektroskopische Techniken nicht erzeugen können. Messungen über eine erweiterte Zeitskala ermöglichen Beobachtungen sowohl der translationalen als auch der Rotationsdiffusion der Proteine, wie hier dargestellt. Die segmentale Dynamik und andere interne Schwingungen entpuppen sich als starker Zerfall der kohärenten Streufunktion S(Q, t) auf einer kurzen Zeitskala und sind gut von den gesamten diffusionalen Relaxationsprozessen getrennt. Die Haupteinschränkungen der NSE-Technik sind die verlängerte Messzeit und die großen Probenvolumina, die benötigt werden, um ein gutes statistisches Signal zu erfassen. Dies kann eine Herausforderung für die Messung relevanter makromolekularer Systeme darstellen, die niedrige Konzentrationen der mobilen Spezies und reduzierte Lebensdauern aufweisen.

Interne Dynamik des IgG
Das IgG-Protein hat eine Y-förmige Struktur, die spezifisch für Antikörper ist und durch drei große Fragmente angenähert werden kann, die durch flexible Linker verbunden sind. Für diese Art von Struktur wurde ein mathematisches Modell von drei beträchtlichen Teilchen angenommen, die sich im harmonischen Potential befinden. Die Linker wurden durch elastische Federn angenähert, die eine feste Gleichgewichtsposition ergeben, aber Schwankungen als eine Form der Brownschen Bewegung zulassen. Für jedes Fragment wurden drei Freiheitsgrade um das relative Gleichgewicht28 erlaubt. Die interne Dynamik, die durch Fint(Q, t) in Gleichung 2 dargestellt wird, wurde durch den Ornstein-Uhlenbeck-Prozess50,51 beschrieben. Das Modell ermöglicht die Berechnung der mittleren quadratischen Verschiebung der Fragmente im Potentialeinbruch, der Zeitskala verschiedener Bewegungen, der Reibung und der auftretenden Kraftkonstanten. Die Amplitude der inneren Bewegung wurde durch die Analyse der normalen Moden unter Berücksichtigung unterschiedlicher Bewegungsgrade für jedes Fragment angenähert. Eine ausführliche Beschreibung des Modells und der daraus resultierenden mathematischen Parameter ist hier außerhalb des Rahmens, kann aber im Detail in Referenz28 gefunden werden. In dieser Fallstudie von IgG wurde eine klare Signatur der internen Dynamik auf der Zeitskala von mehreren Nanosekunden beobachtet. Die berechnete Federkonstante des Linkers scheint realistisch vergleichbar mit einer entropischen Feder ähnlicher Länge zu sein. Die beobachtete effektive Reibung scheint der Reibung eines freien ungebundenen IgG-Fragments nahe zu kommen. Die bereits bestehende Gleichgewichtshypothese wurde validiert, wobei angenommene koexistierende "offene" oder "geschlossene" Konfigurationen von IgGs, die sich im Gleichgewicht befinden, unterschiedliche Bindungsstellen und Bindungsspezifitäten aufweisen28. Diese Informationen können für das Verständnis der Mechanik von Antikörpern relevant sein und ob dieses mechanische Verhalten zur Verbesserung der Biokompatibilität und Bioverfügbarkeit genutzt werden kann.

Interne Dynamik von MBP
Die MBP-Struktur verfügt über einen kompakten Kugelkern, der mit seinen flexiblen zufälligen Spulenenden starke Dehnungs- und Biegebewegungen ermöglicht. Die MBP-Dynamik wurde mit flexiblen Polymermodellen mit und ohne Zugabe von innerer Reibunginterpretiert 28,39. Wie im Fall von IgG können die Beobachtungen der internen Dynamik von MBP innerhalb der Theorie der Brownschen Bewegung in Einklang gebracht werden, in der eine größere Amplitude der Bewegung zu einer längeren Relaxationszeit mit Einflüssen aus der inneren Reibung innerhalb der Proteinkette führt. Die erhöhte Relaxationszeit mit einer größeren Amplitude von Bewegungen, aber geringerer Reibung kann mit dem gleichen Ornstein-Uhlenbeck-Prozess50,51 der Brownschen Bewegung in einem harmonischen Potential beschrieben werden. Interne Bewegungen mit großen Amplituden, aber langsamen Entspannungszeiten werden bei vollständiger Denaturierung von MBP aus seinem nativen Zustand aktiv, indem die Wiederherstellungskräfte der Kettenkonfiguration (dihedrale Potentiale) reduziert und die lokalen Energiebarrieren geglättet werden. Detaillierte Beschreibungen der MBP-internen Dynamik im nativen und denaturierten Zustand finden Sie weiter in den Referenzen28,39. In der Studie von MBP zeigte die Untersuchung mit NSE ein dynamisches Verhalten, das auf eine intermediäre Kompaktheit des Proteins zwischen zufälligen Spulenpolymeren und kugelförmigen Proteinen hinweist. Der signifikante Beitrag der inneren Proteindynamik mit einer Relaxationsrate von mehreren Nanosekunden wurde durch niederfrequente kollektive Dehnungs- und Biegebewegungen bestimmt5. Die Beschreibung der nativen MBP-Dynamik durch Modelle aus dem polymertheoretischen Zusammenbruch wurde aufgrund eines großen Wertes der inneren Reibung des Proteins bereitgestellt. Bei denaturiertem MBP wird die innere Reibung innerhalb der Proteinkette reduziert und der Polymerkettencharakter des Relaxationsspektrums überwiegt. Die hohe Flexibilität der strukturellen Ensemblebewegungen könnte dazu beitragen, die zugängliche Proteinoberfläche zu vergrößern und dadurch die Interaktion mit verschiedenen Bindungspartnern zu erleichtern.

Dynamische Modelle
Während NSE als Technik experimentell einzigartig in der Beurteilung niederfrequenter harmonischer Bewegungen in biologischen Makromolekülen und molekularen Untereinheiten ist, erfordert die Analyse der Zwischenstreufunktion einen Vergleich mit Neutronenspektren, die aus verschiedenen mathematischen Modellen abgeleitet wurden. Das hier vorgestellte und von Biehl et al.28 entwickelte Modell für konzentrierte Proteinlösungen verwendet eine elastische Netzwerkapproximation, bei der die Zwischenstreufunktion eine Faltung richtiger modularer Funktionen ist und Brownsche Oszillatoren die interne Dynamik darstellen. Dies ist eines der wenigen verfügbaren Modelle, um die Segmentdynamik von Proteinen zu analysieren. Ein weiteres etabliertes Modell für verdünnte Proteinlösungen ist das von Bu et al.52 vorgeschlagene Modell, ein robustes Modell, das statistische Mechanik verwendet und keine komplexen Anpassungen oder mehrere Parameter erfordert. Ein ähnlicher Ansatz, der auf dynamischer Entkopplungsnäherung basiert, kann auch auf verdünnte Systeme angewendet werden, um die effektive Diffusion als Summe von selbsttranslationalen und internen Bewegungen zu charakterisieren53. Mehrere unserer Referenzen können eine umfassende Berichterstattung über diese Modelle und ihre Einschränkungen liefern. Wir empfehlen Fitter et al.1 und Liu et al.54 dringend.

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Disclosures

Der Autor erklärt keine konkurrierenden finanziellen Interessen und keine Interessenkonflikte. Der Inhalt des Manuskripts basiert auf dem Vortrag, den der Autor in der HANDS-Neutron Scattering Applications in Structural Biology School zwischen 2019-2021 gehalten hat.

Acknowledgments

Diese Forschung verwendete Ressourcen an der Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, Biologie und Chemielabors), einem DOE-Büro der Science User Facility, das vom Oak Ridge National Laboratory betrieben wird. Diese Forschung nutzte auch Ressourcen am MLZ-FRM2-Reaktor Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) und am JCNS1 an der Forschungszentrum Jülich GmbH, Deutschland. Der Autor dankt Dr. Ralf Biehl und Dr. Andreas Stadler für ihre Hilfe bei der Modellierung und ihren Beitrag zur IgG- und MBP-Proteinforschung, Dr. Piotr A. Żołnierczuk für die Unterstützung der NSE-Datenreduktion, Dr. Changwoo Do für die Unterstützung bei SANS-Messungen und Rhonda Moody und Dr. Kevin Weiss für die Unterstützung des SNS-Biochemielabors.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine MBP protein solution Sigma-Aldrich M1891 lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O - heavy water Sigma-Aldrich Product No. 151882 liquid
Dionized water in house - for washing / cleanning cells
DLS instrument Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich - dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standards SNS-NSE, ORNL - Al2O3  and Graphite powders
Ethanol Sigma-Aldrich 65350-M 70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solution Sigma-Aldrich I4506 lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrument JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - small angle neutron instrument
Liquinox dish detergent Alconox - Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2O Sigma-Aldrich Product No.S9390 disodium phosphate heptahydrate salt
NaCl Sigma-Aldrich Product No.S9888 sodium chloride salt
NaH2PO4·H2O Sigma-Aldrich Product No. S9638 monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific Catalog number: ND-2000 NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment camera NeutronOptics, Grenoble NOG210222 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M - wax parafilm Bemis Parafilm M - 5259-04LC PM996 all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE Spectrometer JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - neutron spectrometer
SasView https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument FZ-Jülich - small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranes Thermo Scientific 88400-88405 Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis Cluster Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometer ORNL, Oak Ridge, TN, USA - neutron spectrometer
Sterile syringe filters VWR N.A. PN:28145-501 0.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS) SP Scientific Part Number 100004055 sample environment equipment
Urea -d4 Sigma-Aldrich Product No. 176087 deuterated Urea salt
Viscometer FZ-Jülich - falling ball viscometer

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References

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Engineering Ausgabe 182 Neutronenstreuung Neutronen-Spin-Echo Proteinlösung langsame Dynamik Proteindomänenbewegungen Proteinflexibilität
Untersuchung der Proteindynamik <em>mittels</em> Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie
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Stingaciu, L. R. Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy. J. Vis. Exp. (182), e61862, doi:10.3791/61862 (2022).

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