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Engineering

न्यूट्रॉन स्पिन इको स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से प्रोटीन गतिशीलता का अध्ययन

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/61862
Automatic Translation
1
1NSD, Oak Ridge National Laboratory

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल मानव स्वास्थ्य में महत्वपूर्ण भूमिका है कि दो मॉडल प्रोटीन की संरचना और गतिशीलता की जांच के लिए तरीकों का वर्णन करता है। तकनीक प्रोटीन इंटरडोमेन गतियों के लिए प्रासंगिक समय और लंबाई के तराजू पर गतिशीलता तक पहुंचने के लिए न्यूट्रॉन स्पिन इको स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ बेंच-टॉप बायोफिजिकल लक्षण वर्णन को जोड़ती है।

Abstract

अधिकांश मानव शरीर प्रोटीन की गतिविधि और कार्यक्षमता प्रोटीन क्रिस्टल संरचना के भीतर पूरे उपडोमेन के विन्यास परिवर्तनों से संबंधित हैं। क्रिस्टल संरचनाएं किसी भी गणना के लिए आधार बनाती हैं जो प्रोटीन की संरचना या गतिशीलता का वर्णन करती है, ज्यादातर समय मजबूत ज्यामितीय प्रतिबंधों के साथ। हालांकि, क्रिस्टल संरचना से ये प्रतिबंध समाधान में मौजूद नहीं हैं। समाधान में प्रोटीन की संरचना पिको पर लूप या उपडोमेन के पुनर्व्यवस्था के कारण क्रिस्टल से नैनोसेकंड टाइम स्केल (यानी, आंतरिक प्रोटीन गतिशीलता समय शासन) से भिन्न हो सकती है। वर्तमान कार्य बताता है कि न्यूट्रॉन बिखरने का उपयोग करके कई दसियों नैनोसेकंड के टाइमस्केल पर धीमी गति तक कैसे पहुंचा जा सकता है। विशेष रूप से, दो प्रमुख मानव प्रोटीनों के गतिशील लक्षण वर्णन, एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन जिसमें एक अच्छी तरह से परिभाषित माध्यमिक संरचना और एक शास्त्रीय एंटीबॉडी प्रोटीन की कमी होती है, को प्रयोगशाला लक्षण वर्णन विधियों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संयुक्त न्यूट्रॉन स्पिन इको स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएसई) द्वारा संबोधित किया जाता है। प्रोटीन डोमेन गतिशीलता में आगे की अंतर्दृष्टि प्रयोगात्मक न्यूट्रॉन डेटा का वर्णन करने और संयुक्त विसारक और आंतरिक प्रोटीन गतियों के बीच क्रॉसओवर निर्धारित करने के लिए गणितीय मॉडलिंग का उपयोग करके प्राप्त की गई थी। एनएसई से प्राप्त मध्यवर्ती बिखरने वाले फ़ंक्शन में आंतरिक गतिशील योगदान का निष्कर्षण, जिसमें विभिन्न आंदोलनों का टाइमस्केल शामिल है, एकल प्रोटीन के यांत्रिक गुणों और भीड़ वाले प्रोटीन समाधान में उनके लगभग प्राकृतिक वातावरण में प्रोटीन की कोमलता में आगे की दृष्टि की अनुमति देता है।

Introduction

न्यूट्रॉन के साथ नरम पदार्थ की गतिशीलता की जांच
प्रोटीन और पेप्टाइड्स के गतिशील गुणों की जांच करना बायोफिजिकल अनुसंधान का एक प्रमुख हिस्सा है, और ऊर्जा परिदृश्य की एक विस्तृत श्रृंखला तक पहुंचने के लिए आज कई अच्छी तरह से विकसित तरीके मौजूद हैं1. प्रोटीन की प्रयोगात्मक रूप से प्रकट गतिशीलता को उनके जैविक कार्य से संबंधित करना एक अधिक कठिन कार्य है, जिसके लिए जटिल गणितीय मॉडल और कंप्यूटर-एडेड गतिशीलता सिमुलेशन की आवश्यकता होती है। प्रोटीन गतियों के विश्लेषण के लिए न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी के महत्व पर कई अच्छी तरह से प्राप्त और व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त अध्ययनों 1,2,3,4,5 में जोर दिया गया है। आंतरिक प्रोटीन गतिशीलता के विविध ऊर्जा परिदृश्य की खोज करने से पहले, नरम पदार्थ में गतिशील प्रक्रियाओं का एक संक्षिप्त अवलोकन और न्यूट्रॉन उन्हें कैसे एक्सेस कर सकते हैं, इसकी आवश्यकता होती है।

आइसोटोपिक कॉन्फ़िगरेशन के लिए न्यूट्रॉन की संवेदनशीलता और नरम पदार्थ के साथ प्रदर्शित इंटरैक्शन का प्रकार न्यूट्रॉन बिखरने को सबसे बहुमुखी जांच तकनीकों में से एक बनाता है6. सहसंबंध लंबाई तराजू और सहसंबंध समय का एक व्यापक स्पेक्ट्रम है जो न्यूट्रॉन परमाणु उत्तेजना और परमाणु कंपन से सामूहिक गतियों और आइसोट्रोपिक घूर्णन और विसारक गतियों जैसी धीमी विश्राम प्रक्रियाओं तक पहुंच सकते हैं। उनके ऊर्जा हस्तांतरण के लिए बिखरे हुए न्यूट्रॉन की जांच करते समय, तीन मुख्य इंटरैक्शन को प्रतिष्ठित किया जा सकता है: लोचदार बिखरने, जिसमें नमूने में आने वाले न्यूट्रॉन और कण के बीच कोई ऊर्जा विनिमय नहीं होता है; न्यूट्रॉन और कण के बीच एक बड़े, मात्रात्मक ऊर्जा विनिमय के साथ अप्रत्याशित प्रकीर्णन; और अर्ध-लोचदार बिखरने का अजीब मामला जो घटना न्यूट्रॉन ऊर्जा 1,7 की तुलना में बहुत कम ऊर्जा हस्तांतरण को नामित करता है। ये इंटरैक्शन जांच की गई सामग्री के बारे में सटीक जानकारी देते हैं और विभिन्न प्रकार की न्यूट्रॉन बिखरने वाली तकनीकों का सैद्धांतिक आधार बनाते हैं।

लोचदार बिखरने में, डिटेक्टर न्यूट्रॉन की दिशाओं को एक विवर्तन पैटर्न के रूप में रिकॉर्ड करता है, जो एक दूसरे के सापेक्ष नमूना परमाणुओं की स्थिति को दर्शाता है। परमाणु पदों के सहसंबंधों के बारे में जानकारी प्राप्त की जाती है (यानी, गति हस्तांतरण क्यू से संबंधित एकीकृत तीव्रता एस ( क्यू), जो अकेले संरचनात्मक जानकारी से संबंधित है)। यह सिद्धांत न्यूट्रॉन विवर्तन 8 का आधार बनाताहै।

जटिलता तब उत्पन्न होती है जब नमूना सामग्री में उत्तेजना और आंतरिक उतार-चढ़ाव के कारण ऊर्जा हस्तांतरण अब शून्य नहीं होता है। यह न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी का आधार बनाता है, जिसमें बिखरे हुए न्यूट्रॉन की जांच ऊर्जा हस्तांतरण ई और गति हस्तांतरण क्यू दोनों के एक समारोह के रूप में की जाती है। गतिशील और संरचनात्मक जानकारी प्राप्त की जाती है। न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी ऊर्जा हस्तांतरण के लिए एक ही एकीकृत तीव्रता एस (क्यू) को मापता है (यानी, नमूना बिखरने के कारण न्यूट्रॉन का वेग परिवर्तन, एस (क्यू, ω) = एस (क्यू, ई), जिसे गतिशील संरचना कारक भी कहा जाता है)9।

किसी सामग्री से बिखरने की गणना के लिए, जोड़ी सहसंबंध फ़ंक्शन 7,10 का उपयोग करना अधिक पर्याप्त है। विवर्तन मामले में, स्थैतिक जोड़ी सहसंबंध फ़ंक्शन जी (आर) किसी अन्य कण के केंद्र से किसी दिए गए दूरी पर एक कण के केंद्र को खोजने की संभावना देता है। स्पेक्ट्रोस्कोपी स्थिर जोड़ी सहसंबंध फ़ंक्शन को सामान्यीकृत करता है और बिखरने वाले समीकरण में ऊर्जा / आवृत्ति / समय शामिल करता है। जोड़ी सहसंबंध फ़ंक्शन जी (आर) समय जी (आर, टी) का एक फ़ंक्शन बन जाता है, जिसे एक अलग परमाणु जोड़ी सहसंबंध फ़ंक्शन जीडी (आर, टी), और एक आत्म-सहसंबंध फ़ंक्शन जीएस (आर, टी) में विघटित किया जा सकता है। ये दो प्रकार के सहसंबंधों का वर्णन करते हैं: परमाणुओं की जोड़ी-सहसंबद्ध गति जो सुसंगत बिखरने को नियंत्रित करती है, और आत्म-सहसंबंध जो असंगत बिखरने को नियंत्रित करती है10.

सुसंगत प्रकीर्णन "औसत" से बिखरना है और बिखरी हुई तरंगों के सापेक्ष चरण पर निर्भर करता है। छोटे कोण बिखरने वाले शासन में, विभिन्न बिखरने वाले केंद्रों (विभिन्न परमाणुओं) से बिखरी हुई न्यूट्रॉन तरंगें रचनात्मक रूप से हस्तक्षेप करती हैं (समान चरण होते हैं), और परमाणुओं की सामूहिक गति मजबूत तीव्रता वृद्धि के साथ देखी जाती है। सुसंगत प्रकीर्णन अनिवार्य रूप से नमूना10 में सभी नाभिक से एक न्यूट्रॉन के बिखरने का वर्णन करता है।

जब विभिन्न केंद्रों से बिखरे हुए न्यूट्रॉन तरंगों के बीच कोई रचनात्मक हस्तक्षेप नहीं होता है, तो समय पर एक एकल परमाणु का पालन किया जाता है, और समय पर परमाणु की स्थिति के बीच आत्म-सहसंबंध टी = 0 और समय पर एक ही परमाणु टी मनाया जाता है। इस प्रकार, परमाणुओं की सापेक्ष स्थिति पर जानकारी खो जाती है, और ध्यान केवल स्थानीय उतार-चढ़ाव पर होता है। स्थानीय उतार-चढ़ाव से बिखरने से असंगत बिखरने को नियंत्रित करता है। असंगत प्रकीर्णन आइसोट्रोपिक है, पृष्ठभूमि संकेत में योगदान देता है, और सिग्नल-टू-शोर10,11 को नीचा दिखाता है।

उपरोक्त सभी के संयोजन से, हम चार प्रमुख न्यूट्रॉन बिखरने की प्रक्रियाओं को अलग करते हैं10: (1) लोचदार सुसंगत (परमाणु पदों के सहसंबंधों को मापता है), (2) अप्रत्याशित सुसंगत (परमाणुओं की सामूहिक गति को मापता है), (3) लोचदार असंगत (पृष्ठभूमि में योगदान देता है, डेबी-वालर कारक (डीडब्ल्यूएफ) द्वारा बिखरने की तीव्रता को कम करता है और लोचदार असंगत संरचना कारक (ईआईएसएफ) को मापता है। और (4) अप्रत्याशित असंगत (एकल परमाणु गतिशीलता और आत्म-सहसंबंध को मापता है)।

गतिशीलता प्रक्रियाएं जो न्यूट्रॉन जीव विज्ञान में कम आवृत्ति परमाणु और आणविक कंपन के भिगोना, जैव-सतहों के साथ विलायक अणुओं की बातचीत, और मैक्रोमोलेक्यूल्स और सीमित ज्यामिति की जलयोजन परत में प्रसार प्रक्रियाओं से लेकर छोटी दूरी की ट्रांसलेशनल, घूर्णी और टम्बलिंग डिफ्यूसिव गतियों, और प्रोटीन डोमेन और एलोस्टेरिक गतियोंतक पहुंच सकती हैं। . प्रोटीन गतिशीलता को मापने के लिए न्यूट्रॉन विधियों और उपकरणों की विस्तृत विविधता इस बात पर आधारित है कि घटना या आउटगोइंग न्यूट्रॉन बीम का अक्रोमेटाइजेशन कैसे प्राप्त किया जाता है और बिखरे हुए न्यूट्रॉन का ऊर्जा विश्लेषण कैसे किया जाता है। ट्रिपल-अक्ष से टाइम-ऑफ-फ्लाइट, बैकस्कैटरिंग और स्पिन-इको स्पेक्ट्रोमीटर तक, कोई भी 1 एक्स 10-14 एस और 1 एक्स 10-6 एस (फेम्टोसेकंड से माइक्रोसेकंड) 12 के बीच विशिष्ट समय के साथ गतिशील प्रक्रियाओं का पता लगा सकता है।

ओक रिज नेशनल लेबोरेटरी, अपने दो प्रसिद्ध न्यूट्रॉन स्रोतों के साथ, स्पैलेशन न्यूट्रॉन स्रोत - एसएनएस13 और उच्च आइसोटोप फ्लक्स रिएक्टर - एचएफआईआर14, जैव-सामग्री में गतिशीलता की जांच के लिए स्पेक्ट्रोमीटर के सबसे अच्छे सुइट्स में से एक है। कुछ सबसे वाक्पटु उदाहरणों में समाधान16 में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के आसपास जलयोजन पानी की गतिशील गड़बड़ी की जांच करने के लिए एसएनएस 15 में ठंडे न्यूट्रॉन हेलिकॉप्टर स्पेक्ट्रोमीटर (सीएनसीएस) का उपयोग या कईप्रोटीनों के उप-पिकोसेकंड सामूहिक कंपन17 शामिल हैं। अप्रत्याशित न्यूट्रॉन बिखरने की जांच की एक आवर्ती समस्या यह है कि कुछ जैविक प्रक्रियाएं देखी जाने वाली बहुत धीमी हैं। चरम सेटअप के बिना जो न्यूट्रॉन तीव्रता के भारी नुकसान का कारण बनता है, टाइम-ऑफ-फ्लाइट स्पेक्ट्रोमीटर 10 μeV ऊर्जा रिज़ॉल्यूशन तक सीमित होते हैं, जो ~ 200 पीएस10,11 के अधिकतम समय पैमाने के अनुरूप होते हैं। यह प्रोटीन में बड़े पैमाने पर गति का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त नहीं है। इसलिए, बैकस्कैटरिंग स्पेक्ट्रोमीटर जैसे उच्च ऊर्जा रिज़ॉल्यूशन वाले उपकरणों की अक्सर आवश्यकता होती है। टाइम-ऑफ-फ्लाइट और बैकस्कैटरिंग तकनीकों का संयोजन साइटोक्रोम पी 450 कैम (सीवाईपी 101) की आंतरिक गतिशीलता में परिवर्तन की जांच के लिए शक्तिशाली साबित हुआ है, एक एंजाइम जो हाइड्रॉक्सिलेशन कपूर18 को उत्प्रेरित करता है।

एसएनएस-बेसिस19 में बैकस्कैटरिंग स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा मापा गया सूक्ष्म फैलाव आश्चर्यजनक रूप से अच्छी तरह से परिभाषित किया गया था और इसे पानी की विसारकता (जलयोजन, साइटोप्लाज्मिक और थोक जैसे पानी) और प्लेनेरियन फ्लैटवर्म में सेल घटकों की फैलाव में अलग किया जा सकता है, न्यूट्रॉन बिखरने20 द्वारा अध्ययन किया जाने वाला पहला जीवित जानवर . बैकस्कैटरिंग एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीक है, लेकिन यह कई μeV = कई नैनोसेकंड तक भी सीमित है, जबकि बायोमैटेरियल्स में धीमी गतिशीलता परमाणु स्थिति या स्पिन झुकाव के बीच सहसंबंध के जीवित रहने के समय के रूप में भी प्रकट होती है (उदाहरण के लिए, विश्राम प्रक्रियाएं, जो नियमित रूप से दस से सैकड़ों नैनोसेकंड की समय सीमा में होती हैं)।

न्यूट्रॉन स्पिन इको स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएसई) इस तरह के उच्च रिज़ॉल्यूशन तक पहुंचने वाली एकमात्र न्यूट्रॉन बिखरने वाली तकनीक है। अन्य न्यूट्रॉन तकनीकों के विपरीत, एनएसई को बीम के एक्रोमेटाइजेशन की आवश्यकता नहीं होती है क्योंकि यह न्यूट्रॉन के क्वांटम यांत्रिक चरण का उपयोग करता है, जो उनके चुंबकीय क्षण हैं। चुंबकीय क्षणों का हेरफेर एक व्यापक न्यूट्रॉन बीम तरंग दैर्ध्य वितरण के उपयोग की अनुमति देता है, जबकि तकनीक 1 x 10-4 के क्रम में बहुत छोटे न्यूट्रॉन वेग परिवर्तनों के प्रति संवेदनशील है। एनएसई का उपयोग कई प्रोटीनों के समाधान में प्रोटीन की धीमी गतिशीलता की जांच करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। इन कई अग्रणी अध्ययनों में, हम सुअर इम्युनोग्लोबुलिन21 के खंडीय लचीलेपन के अध्ययन को स्वीकार करते हैं; टैक पोलीमरेज़22 में युग्मित डोमेन गति; खमीर अल्कोहल डिहाइड्रोजनेज23 के टेट्रामर में डोमेन गति; सब्सट्रेट बाध्यकारी3 पर फॉस्फोग्लिसरेट किनेज में विरूपण का परिवर्तन; एच + एक्सचेंज नियामक कॉफ़ेक्टर 1 (एनएचईआरएफ 1) प्रोटीन 4,24,25 में डोमेन गतियों की सक्रियता और एलोस्टेरिक संकेतों का गतिशील प्रसार; मर्क्यूरिक आयन रिडक्टेस26 की एक कॉम्पैक्ट अवस्था की गतिशीलता; और लाल रक्त कोशिकाओं में हीमोग्लोबिन का प्रसार27. प्रोटीन गतिशीलता में दो और हालिया अध्ययनों ने मानव एंटीबॉडी इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) के लचीलेपन को एन्ट्रोपिक वसंत28 के रूप में उजागर किया है और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित माइलिन मूल प्रोटीन (एमबीपी) 5 की गतिशीलता में विलायक योगदान की विशेषताओं को उजागर किया है।

वर्तमान लेख एनएसई के बुनियादी सिद्धांतों, पूरी तरह से प्रोटीन गतिशीलता जांच के लिए अनुशंसित कई प्रारंभिक विधियों के साथ-साथ एसएनएस, एसएनएस-एनएसई में एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर में एनएसई डेटा अधिग्रहण के लिए पद्धति और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की व्याख्या करता है। प्रोटोकॉल दो प्रोटीनों की विशेषता है: आईजीजी, एक नियमित मानव एंटीबॉडी प्रोटीन, और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन एमबीपी। बायोफिजिकल निहितार्थ, उदाहरणों की अनुसंधान प्रासंगिकता और तकनीक की सीमाओं पर संक्षेप में चर्चा की जाती है।

एनएसई स्पेक्ट्रोस्कोपी, धीमी गति से गतिशीलता माप के लिए विधि
एनएसई एक ध्रुवीकृत तकनीक है जो एक नमूने में न्यूट्रॉन और परमाणुओं के बीच अर्ध-लोचदार बातचीत के कारण ऊर्जा के आदान-प्रदान (ध्रुवीकरण की हानि) को मापने के लिए न्यूट्रॉन टाइम-ऑफ-फ्लाइट का उपयोग करती है। एनएसई स्पेक्ट्रोस्कोपी के मूल में दो बुनियादी सिद्धांत निहित हैं: (1) चुंबकीय शक्ति Equation 1के आनुपातिक आवृत्ति के साथ चुंबकीय क्षेत्र में न्यूट्रॉन स्पिन की क्षमता, अर्थात् लार्मर आवृत्ति 29, और (बी) स्पिन-इको याहैन इको, रेडियोफ्रीक्वेंसी दालोंकी एक श्रृंखला को लागू करते समय ध्रुवीकरण संकेत के हेरफेर और पुन: फोकसिंग का प्रतिनिधित्व करते हैं।

एनएसई प्रक्रिया की मूल बातें चित्रा 1 का उपयोग करके कुछ सरल चरणों 6,11 में संक्षेप ति की जा सकती हैं। (1) स्रोत (स्थिति 1) द्वारा उत्पादित न्यूट्रॉन बीम ध्रुवीकृत (स्थिति 2), निर्देशित और परिवहन (स्थिति 3) है, और एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर के प्रवेश द्वार पर आता है, जहां यह पहले पाई-आधा फ्लिपर (स्थिति 4) द्वारा 90 ° तक घुमाया जाता है। (2) ध्रुवीकृत बीम (जैसे, न्यूट्रॉन चुंबकीय क्षण) पहले चुंबक की चुंबकीय क्षेत्र रेखाओं (पहले पूर्ववर्ती क्षेत्र, स्थिति 5) के लंबवत हो जाता है और पूर्ववर्ती होने लगता है। (3) चुंबक के अंत में, न्यूट्रॉन स्पिन चुंबकीय क्षेत्र की ताकत और अंदर बिताए गए समय-उड़ान के आनुपातिक एक निश्चित पूर्ववर्ती कोण जमा करते हैं (मूल रूप से न्यूट्रॉन वेग के विपरीत आनुपातिक)। व्यक्तिगत न्यूट्रॉन वेग को पहले पूर्ववर्ती क्षेत्र के अंत में उनके पूर्ववर्ती कोण के भीतर एन्कोड किया जाता है। (4) नमूना स्थिति के करीब, पाई-फ्लिपर (स्थिति 6) स्पिन के अभिविन्यास को 180 ° तक उलट देता है, पूर्ववर्ती कोण के संकेत को बदल देता है। (5) न्यूट्रॉन नमूने के अणुओं (स्थिति 7) के साथ बातचीत करते हैं और बिखरे हुए हो जाते हैं। (6) बिखरे हुए न्यूट्रॉन दूसरे पूर्ववर्ती क्षेत्र (स्थिति 8) में प्रवेश करते हैं और पूर्ववर्ती होते हैं लेकिन उलट-उन्मुख हो जाते हैं। (7) एक और पाई-आधा फ्लिपर (स्थिति 9) का उपयोग स्पिन के अभिविन्यास को लंबवत से क्षैतिज दिशा में घुमाने के लिए किया जाता है। यह पूर्वाग्रह को रोक देगा, φ पूर्ववर्ती कोण को सीओएस (φ) के आनुपातिक ध्रुवीकरण में अनुवाद करेगा। (8) विश्लेषक (स्थिति 10) एक अभिविन्यास के आधार पर न्यूट्रॉन का चयन करता है। यदि नमूने के साथ बातचीत लोचदार है, तो न्यूट्रॉन का वेग नहीं बदलेगा। न्यूट्रॉन पहले और दूसरे पूर्ववर्ती क्षेत्रों में उड़ान भरने में समान समय बिताएंगे, और संचित पूर्वाग्रह कोण पूरी तरह से पुनर्प्राप्त हो जाते हैं। पूर्ण ध्रुवीकरण डिटेक्टर (स्थिति 11) पर मूल ध्रुवीकरण (यानी, स्पिन-इको) की गूंज के रूप में बहाल किया जाता है। (9) हालांकि, एनएसई में, बिखरने अर्ध-लोचदार है, इसलिए न्यूट्रॉन और नमूना अणुओं के बीच एक छोटा ऊर्जा विनिमय नमूने द्वारा बिखरने के बाद विभिन्न न्यूट्रॉन वेगों की ओर जाता है। विभिन्न वेगों के कारण, न्यूट्रॉन दूसरे पूर्ववर्ती क्षेत्र के माध्यम से उड़ान भरने में एक अतिरिक्त समय बिताएंगे और अपने पूर्ववर्ती कोण को ठीक से पुनर्प्राप्त नहीं करेंगे। डिटेक्टर पर एक आंशिक ध्रुवीकरण पुनर्प्राप्त किया जाता है, और स्पिन विश्राम के कारण ध्रुवीकरण का नुकसान वर्णक्रमीय फ़ंक्शन एस (क्यू, ω), मध्यवर्ती प्रकीर्णन फ़ंक्शन एफ (क्यू, टी) के कॉस-फूरियर-ट्रांसफॉर्म के आनुपातिक है। (10) फ़ंक्शन एफ (क्यू, टी) का समय पैरामीटर पूर्ववर्ती चुंबकीय क्षेत्र की ताकत के लिए आनुपातिक है। चुंबकीय क्षेत्र की ताकत के एक समारोह के रूप में ध्रुवीकरण के नुकसान को स्कैन करना पैदावार, इसलिए, एक विश्राम फ़ंक्शन जो नमूने के भीतर गतिशील प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है।

Figure 1
चित्रा 1: एसएनएस (एसएनएस-एनएसई) में एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर की तस्वीर और सबसे महत्वपूर्ण कार्यात्मक घटकों के साथ न्यूट्रॉन फ्लाई पथ योजनाबद्ध। दाएं से बाएं: 1 = न्यूट्रॉन स्रोत; 2 = हेलिकॉप्टर-बेंडर-पोलराइज़र-माध्यमिक शटर सिस्टम; 3 = बीम परिवहन गाइड; 4 = पहले 90 ° स्पिन-टर्न के लिए पाई /2 फ्लिपर; 5 = पहला पूर्ववर्ती क्षेत्र; 6 = 180 ° स्पिन-टर्न के लिए पाई फ्लिपर; 7 = नमूना क्षेत्र और नमूना पर्यावरण (यहां, क्रायो-भट्ठी दिखाया गया है); 8 = दूसरा पूर्ववर्ती क्षेत्र; 9 = दूसरे 90 ° स्पिन-टर्न के लिए पाई/2 फ्लिपर; 10 = विश्लेषक; 11 = डिटेक्टर। (ध्यान दें कि 3, साथ ही 2 और 1 के हिस्से परिरक्षण के अंदर नीली दीवार के पीछे स्थित हैं; हेलिकॉप्टरों को रिएक्टर-आधारित एनएसई के लिए एक वेग चयनकर्ता द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

वर्तमान कार्य दो प्रोटीनों की विशेषता है: एक नियमित मानव एंटीबॉडी प्रोटीन आईजीजी, और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित एमबीपी। प्रोटीन का लियोफिलाइज्ड रूप वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. प्रोटीन नमूना तैयारी

  1. भारी पानी (डी2ओ) में संबंधित ठोस अभिकर्मकों को तौलकर और भंग करके 50 एमएम सोडियम फॉस्फेट + 0.1 एम एनएसीएल बफर तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। यह आईजीजी के लिए ड्यूटेरेटेड बफर विलायक है।
    1. 6.6 करने के लिए बफर समाधान के पीएच समायोजित करें।
  2. भारी पानी (डी 2 ओ) में संबंधित ठोस घटकों को तौलकर और भंग करके20एमएम सोडियम फॉस्फेट + 6 एम यूरिया बफर तैयार करें। यह एमबीपी के लिए ड्यूटेरेटेड बफर विलायक है।
    1. 4.7 करने के लिए बफर समाधान के पीएच समायोजित करें।
  3. 0.2 μm ताकना आकार फिल्टर का उपयोग कर बफर सॉल्वैंट्स फ़िल्टर ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. उच्च प्रोटीन एकाग्रता (~ 50 मिलीग्राम / एमएल) पर संबंधित प्रोटीन (चरण 1.1.-1.2.) के लिए ड्यूटेरेटेड सॉल्वैंट्स में शुद्ध प्रोटीन लियोफिलाइज्ड पाउडर का वजन और भंग करें।
  5. 3.5 के एमडब्ल्यूसीओ के डायलिसिस झिल्ली के साथ डायलाइज टोकरी में प्रोटीन समाधान लोड करें, और एमबीपी के लिए 10 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए फ़िल्टर किए गए बफर के खिलाफ डायलाइज करें और आईजीजी के लिए 25 डिग्री सेल्सियस ( सामग्री की तालिका देखें) एक प्रसार ढाल बनाने के लिए ट्यूबों को थोड़ा हिलाकर।
  6. सांद्रता की एक श्रृंखला में डायलिसिस बफर का उपयोग करके प्रोटीन समाधान को पतला करें: 1, 2, 5, 10, और 50 मिलीग्राम /
  7. नैनोड्रॉप स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके सटीक सांद्रता निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

2. गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) द्वारा प्रारंभिक नमूना लक्षण वर्णन

  1. ऊपर तैयार एकाग्रता श्रृंखला (चरण 1.6.) से प्रत्येक प्रोटीन समाधान के 80 μL को डीएलएस डिस्पोजेबल सेल में लोड करें ( सामग्री की तालिका देखें) और प्रसार गुणांक निर्धारित करें, औसतन 10 से अधिक अधिग्रहण।
  2. प्रोटीन एकाग्रता के एक समारोह के रूप में अनुवादक प्रसार गुणांक प्लॉट करें और शून्य एकाग्रता के लिए एक्सट्रपलेशन करें।
  3. एक विस्कोमीटर की केशिका ट्यूबों में एकाग्रता श्रृंखला से प्रत्येक प्रोटीन समाधान लोड करें ( सामग्री की तालिका देखें) और गतिशील चिपचिपाहट को मापें।
  4. प्रोटीन एकाग्रता के एक समारोह के रूप में मापा गतिशील चिपचिपापन प्लॉट और शून्य एकाग्रता के लिए एक्सट्रपलेशन।
    नोट: शून्य एकाग्रता के लिए डीएलएस प्रसार का एक्सट्रपलेशन एक एकल प्रोटीन के लिए ट्रांसलेशनल प्रसार का मूल्य पैदा करता है। शून्य एकाग्रता के लिए गतिशील चिपचिपाहट के एक्सट्रपलेशन बफर समाधान के लिए प्रयोगात्मक रूप से मापा गतिशील चिपचिपाहट मूल्य उपज चाहिए।

3. छोटे कोण प्रकीर्णन का संग्रह (न्यूट्रॉन या एक्स-रे)

  1. चार प्रोटीन सांद्रता, अधिमानतः 2 मिलीग्राम / एमएल, 5 मिलीग्राम / एमएल, 10 मिलीग्राम / एमएल, और 50 मिलीग्राम / एमएल पर छोटे कोण न्यूट्रॉन बिखरने (एसएएनएस) और / या छोटे कोण एक्स-रे बिखरने (एसएएक्सएस) ( सामग्री की तालिका देखें) को मापें।
  2. प्रोटीन एकाग्रता द्वारा एसएएनएस और सैक्स स्पेक्ट्रा को सामान्य करें।
  3. या सासव्यू 32 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सैन्स और सैक्स स्पेक्ट्रा के लिए प्रोटीन फॉर्म फैक्टर पी (क्यू) फिट करें।
  4. प्रत्येक एकाग्रता के लिए पी (क्यू) के साथ एसएएनएस और सैक्स सिग्नल को विभाजित करके संरचना कारक एस (क्यू, सी) की गणना करें।
    नोट: एनएसई माप के समर्थन के रूप में छोटे कोण बिखरने वाले डेटा को मापने और व्याख्या करने के तरीके में रुचि रखने वाले पाठकों को संदर्भ23,28,31,32,33 से अच्छी तरह से परामर्श करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है।

4. एनएसई का मापन

  1. प्रयोग के लिए सेट करें और नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए नमूना माउंट करें।
    1. प्रोटीन समाधान की एकाग्रता, माप के लिए आवश्यक तापमान और उपलब्ध समाधान की मात्रा के आधार पर नमूना लोडिंग के लिए सेल की मोटाई का चयन करें।
      नोट: वर्तमान अध्ययन में 40 मिमी x 30 मिमी x 4 मिमी के शीर्ष लोडर पारदर्शी क्वार्ट्ज कंटेनरों का उपयोग किया गया था।
    2. बार-बार सेल को साफ करें, फॉस्फेट मुक्त डिश डिटर्जेंट ( सामग्री की तालिका देखें), विआयनीकृत पानी और 70% इथेनॉल के बीच बारी-बारी से।
    3. संवहन ओवन में सेल को सूखा; क्वार्ट्ज कोशिकाओं के लिए 80 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं है।
    4. सेल में प्रोटीन समाधान के 4 मिलीलीटर लोड करें और टोपी के साथ बंद करें। नमूना कोशिकाओं को सील करने के लिए मोम फिल्म या किसी सीलेंट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
      नोट: वर्तमान अध्ययन में, ~ 50 मिलीग्राम / एमएल पर 4.8 मिलीलीटर समाधान का उपयोग पर्याप्त बिखरने की तीव्रता प्राप्त करने के लिए किया गया था।
    5. प्रोटीन नमूना और सील के रूप में एक समान कंटेनर में डायलिसिस बफर के 4 मिलीलीटर लोड करें।
    6. बीमलाइन के लिए परिवहन नमूने, शटर बंद करें, और स्पेक्ट्रोमीटर संलग्नक गुफा क्षेत्र34 में प्रवेश करें।
    7. शिकंजा और होल्डिंग प्लेटों (चित्रा 2, बाएं पैनल) को कसकर एल्यूमीनियम नमूना धारक पर नमूना सेल माउंट करें।
      नोट: एक ही समय में दो नमूना कोशिकाओं माउंट कर सकते हैं, यह देखते हुए कि सभी नमूनों के लिए एक ही माप प्रोटोकॉल की आवश्यकता है।
    8. प्रोटीन नमूने के रूप में एक समान कंटेनर में लोड ग्रेफाइट नमूना और / या अल2हे3 पाउडर नमूना माउंट करें। ये एसएनएस-एनएसई बीमलाइन समर्थन द्वारा प्रदान किए गए मानक हैं।
    9. तापमान मजबूर प्रणाली (टीएफएस, सामग्री की तालिका देखें) के कैन में धीरे-धीरे फिसलने से नमूना धारक रखें।
      नोट: टीएफएस एसएनएस-एनएसई में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला नमूना वातावरण है और वांछित तापमान (चित्रा 2, मध्य और दाएं पैनल) को प्राप्त करने के लिए नमूना कनस्तर में शुष्क हवा पंप करता है।
    10. टीएफएस ढक्कन बंद करें और टीएफएस की इंटरैक्टिव स्क्रीन तक पहुंचकर तापमान को वांछित मूल्य पर सेट करें।
    11. बीम के लिए नमूनों के संरेखण के लिए न्यूट्रॉन कैमरा माउंट (सामग्री की तालिका देखें)।
    12. उपकरण बाड़े को स्वीप करें, खाली करें, दरवाजे बंद करें, और बीम शटर खोलें।
      नोट: नमूना कोशिकाओं एसएनएस-एनएसई बीमलाइन समर्थन द्वारा प्रदान की जाती हैं। उपलब्ध नमूना कोशिकाओं और नमूना पर्यावरण लाइब्रेरी के लिए, कृपया एसएनएस-एनएसई बीमलाइन वेब पेज 7,35 देखें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए एनएसई डेटा एकत्र करें।
    1. न्यूट्रॉन कैमरा और चार स्वतंत्र नमूना एपर्चर का उपयोग करके न्यूट्रॉन बीम में नमूना संरेखित करें।
    2. एसएनएस-एनएसई डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर36 खोलें और वांछित बिखरने वाले कोणों और तरंग दैर्ध्य के लिए विवर्तन स्कैन चलाकर नमूना आंकड़े एकत्र करें।
    3. सहायक साधन वैज्ञानिक द्वारा प्रदान किए गए माप मैक्रोज़ को संपादित करके प्रत्येक नमूने के लिए एकत्र किए गए आंकड़ों के आधार पर माप मापदंडों को सेट करें।
    4. कमांड प्रॉम्प्टर पर प्रोटोकॉल नाम टाइप करके स्कैनिंग शुरू करें और नमूने के लिए गूंज प्राप्त करें।
    5. लोचदार संदर्भ और बफर विलायक के लिए भी गूंज स्कैनिंग शुरू करें और प्राप्त करें। नमूना परिवर्तन के लिए आंतरायिक बीम शटर ऑपरेशन करें।

Figure 2
चित्र 2: एनएसई माप प्रणाली। बाएं पैनल: एल्यूमीनियम (अल) नमूना धारक पर शिकंजा और प्लेटों के साथ घुड़सवार क्वार्ट्ज कंटेनर में प्रोटीन समाधान के नमूने। अल नमूना धारक नमूना पर्यावरण के अंदर एक साथ दो नमूनों को माउंट करने की संभावना प्रदान करता है। मध्य पैनल: तापमान मजबूर प्रणाली (टीएफएस) नमूना नमूना चरण में घुड़सवार किया जा सकता है न्यूट्रॉन बीम खिड़की दाईं ओर है, जबकि संरेखण के लिए उपयोग किया जाने वाला न्यूट्रॉन कैमरा बाईं ओर दिखाई देता है। सही पैनल: नमूना धारक को नमूने में दो नमूनों के साथ रखना सिलिकॉन (सी) खिड़कियों के साथ काम कर सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. एनएसई डेटा में कमी

नोट: एसएनएस-एनएसई ओआरएनएल न्यूट्रॉन साइंसेज रिमोट एनालिसिस क्लस्टर, एक त्वरित उपयोगकर्ता गाइड और अंतर्निहित सहायता समर्थन पर उपलब्ध डीआरपीन (स्पिन-इको के लिए डेटा कमी) 37,38 नामक एक समर्पित सॉफ़्टवेयर से लैस है।

  1. ओआरएनएल उपयोगकर्ता क्रेडेंशियल्स के साथ न्यूट्रॉन विज्ञान दूरस्थ विश्लेषण क्लस्टर ( सामग्री की तालिका देखें) में लॉग इन करें, और लॉन्च सत्र बटन दबाएं।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए डेटा कमी सॉफ़्टवेयर सेट करें।
    1. उपयोगकर्ता निर्देशिका में, एक टर्मिनल विंडो खोलें और टाइप करें: स्रोत / एसएनएस / सॉफ्टवेयर / एनएसई / आदि / setup_nse.sh।
    2. अगला, टाइप करें: drspine_create_env.sh।
  3. होम निर्देशिका में डेटा कमी के लिए एक फ़ोल्डर बनाएँ और साझा निर्देशिका से प्रदान की गई स्क्रिप्ट और मैक्रोज़ की प्रतिलिपि बनाएँ।
  4. तदनुसार प्रदान किए गए कमी मैक्रो को संपादित करें, नाम बदलें और सहेजें।
  5. कमांड प्रॉम्प्टर पर ड्रस्पाइन टाइप करें और सॉफ़्टवेयर कमी वातावरण शुरू करने के लिए एंटर दबाएं।
  6. चरण 5.4 पर संपादित "कमी मैक्रो का नाम" टाइप करें। सॉफ़्टवेयर वातावरण के भीतर कमांड प्रॉम्प्टर में और एंटर दबाएं।

6. एनएसई डेटा फिटिंग

  1. कम फ़ाइल डेटा के नाम के साथ सहायक साधन वैज्ञानिक द्वारा प्रदान की गई अजगर स्क्रिप्ट "stapler-drspine.py" को संपादित करें।
    नोट: पायथन स्क्रिप्ट उपकरण के उपयोगकर्ताओं के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है।
  2. प्रदान की गई लाइब्रेरी से फिट होने के लिए फ़ंक्शन संपादित करें।
  3. कमांड प्रॉम्प्टर पर संपादित स्क्रिप्ट "stapler-drspine.py" का नाम टाइप करें और कम एनएसई डेटा को पढ़ने, फिट करने और प्लॉट करने के लिए एंटर दबाएं।
    नोट: साधन वैज्ञानिक कमी मैक्रो और "stapler-drspine.py" पायथन स्क्रिप्ट के लिए एक टेम्पलेट प्रदान करेगा जो एनएसई कम डेटा को पढ़ और फिट कर सकता है। अंतिम कम एनएसई डेटा एएससीआईआई प्रारूप में हैं और विभिन्न पसंदीदा सॉफ्टवेयर द्वारा पढ़ा जा सकता है।

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Representative Results

मानव सीरम और गोजातीय एमबीपी प्रोटीन से आईजीजी प्रोटीन को डी2ओ-बेस बफर में उच्च सांद्रता (~ 50 मिलीग्राम / चूंकि प्रोटीन उच्च सांद्रता में भंग हो गए थे, इसलिए प्राप्त समाधान भीड़ वाले प्रोटीन समाधान थे। एनएसई का उपयोग करके जांच की गई गतिशीलता भीड़ भरे वातावरण से पीड़ित है जो प्रोटीन (संरचना कारक इंटरैक्शन और हाइड्रोडायनामिक्स प्रभाव) 5,28,39 में रहते हैं। डीएलएस भीड़ प्रभाव के लिए खाते में प्रत्येक प्रोटीन के लिए एक एकाग्रता श्रृंखला पर प्रदर्शन किया गया था। डीएलएस द्वारा मापा गया ट्रांसलेशनल प्रसार गुणांक की शून्य एकाग्रता के लिए एक्सट्रपलेशन एक प्रोटीन के लिए ट्रांसलेशनल प्रसार का मूल्य पैदा करता है। प्रोटीन एकाग्रता के एक समारोह के रूप में गतिशील चिपचिपाहट को हाइड्रोडायनामिक इंटरैक्शन के लिए खाते में एनएसई से पहले भी मापा जाना चाहिए। एकाग्रता के एक समारोह के रूप में गतिशील चिपचिपाहट की शून्य एकाग्रता के लिए एक्सट्रपलेशन को उस मूल्य को उत्पन्न करने की आवश्यकता होती है जिसे प्रत्येक तैयार प्रोटीन नमूने के बफर समाधान के लिए प्रयोगात्मक रूप से मापा जा सकता है।

केंद्रित समाधान में प्रोटीन के आकार और संरचना का मूल्यांकन प्रोटीन फॉर्म फैक्टर और संरचना कारक की ताकत पर अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए किसी भी एनएसई प्रयोग से पहले किया गया था, जो प्रभावित कर सकता है कि प्रोटीन समाधान में कैसे आगे बढ़ते हैं। छोटे कोण बिखरने इन जांचों के लिए पसंद की विधि थी। वर्तमान अध्ययन में, समाधान में आईजीजी प्रोटीन की संरचनात्मक रचना एसएएक्सएस द्वारा देखी गई थी, और एमबीपी की संरचना का आकलन एसएएनएस द्वारा किया गया था। प्रकीर्णन तीव्रता (क्यू) मापा (चरण 3.3.-3.4.) फॉर्म फैक्टर पी (क्यू) और संरचना कारक एस (क्यू, सी) कणों की संख्या (समीकरण 1) 5,28,39 द्वारा भारित के बीच उत्पाद के लिए आनुपातिक है:

I (Q) = N ∷ P (Q) ∙S (Q, c) (1)

एसएएक्सएस को आईजीजी के लिए0.154 एनएम की एक्स-रे तरंग दैर्ध्य के साथ एक क्रैटकी-प्रकार एसएएक्सएस उपकरण 40 पर मापा गया था, और एसएएनएसको 4.5 ए के न्यूट्रॉन तरंग दैर्ध्य के साथ एमबीपी के लिए 41 मापा गया था। प्रयोगात्मक छोटे कोण तीव्रता मैं (क्यू) पृष्ठभूमि और विलायक सही थे, समाधान एकाग्रता द्वारा स्केल किया गया था, और फार्म कारक की गणना स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर पैकेज जैसे पहनावा मॉडलिंग-ईओएम और सासव्यू24,25,29,39,42,43 का उपयोग करके की गई थी। इसके अलावा, प्रत्येक प्रोटीन के लिए संरचना कारक समीकरण 1 से प्राप्त किया गया था।

वर्तमान अध्ययन के लिए, एनएसई प्रयोगों को दो स्पिन-इको स्पेक्ट्रोमीटर के साथ किया गया था: चित्रा 1 में एसएनएस-एनएसई उपकरण34 और फीनिक्स-जे-एनएसई साधन44। 8 ए - 12 ए के बीच घटना तरंग दैर्ध्य, 0.05 ए−1- 0.2 ए−1 के बीच कई क्यू मापों के लिए 0.1 एनएस ≤ टीअधिकतम ≤ 130 एनएस के बीच फूरियर समय के साथ, मापा गया था। दो स्पेक्ट्रोमीटर के बीच का अंतर एनएसई विज्ञान की समझ में एक महत्वपूर्ण बिंदु है, और वे एक रिएक्टर के स्थिर न्यूट्रॉन स्रोत के लिए तथाकथित "क्लासिक स्पिन इको" की पुरानी अवधारणा और स्पंदित न्यूट्रॉन स्रोत के लिए नई "टाइम-ऑफ-फ्लाइट अवधारणा" दोनों का प्रतिनिधित्व करते हैं। फीनिक्स-जे-एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर एक क्लासिक-प्रकार का एनएसई है, जिसमें एक वेग चयनकर्ता एक विशेष तरंग दैर्ध्य का चयन करता है। न्यूट्रॉन वेग में भिन्नता की अनुमति देने के लिए, एक ±10% तरंग दैर्ध्य बैंडविड्थ पेश किया जाता है। एक स्कैन के लिए उपयोग किए जाने वाले बहुत संकीर्ण ऊर्जा बैंड के बावजूद, उच्च प्रवाह रिएक्टर स्रोत पर फीनिक्स-जे-एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर की स्थिति यह सुनिश्चित करती है कि अंतरिक्ष-वेक्टर और सहसंबंध समय सीमा अपेक्षाकृत कम माप समय में कवर की जाती है। एसएनएस-एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर नई पीढ़ी, अल्ट्रा-हाई रिज़ॉल्यूशन, हेलिकॉप्टर न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रोमीटर है, जिसमें स्पेक्ट्रोमीटर की स्थिति के आधार पर 2 ए < λ < 14 ए की तरंग दैर्ध्य अवधि और 2.4 ए - 3.6 ए की एक साथ तरंग दैर्ध्य बैंडविड्थ है। इस विस्तृत बैंडविड्थ के कारण, उच्च डेटा संग्रह दक्षता पूरी हो जाती है, जिससे केवल कुछ बिखरने वाले कोण सेटिंग्स के साथ एक व्यापक तरंग-वेक्टर समय सीमा के लगभग गैपलेस कवरेज की अनुमति मिलती है। एसएनएस-एनएसई में तरंग दैर्ध्य बैंड का चयन एक हेलीकॉप्टर प्रणाली द्वारा किया जाता है जिसमें चार हेलीकॉप्टर होते हैं। यहां चर्चा किए गए दोनों एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर में उच्च चुंबकीय क्षेत्र समरूपता के साथ सुपरकंडक्टिंग तकनीक पर आधारित पूर्ववर्ती क्षेत्र हैं, आवारा क्षेत्र सुधार के लिए उपन्यास अत्याधुनिक क्षेत्र सुधार तत्व, और उपन्यास ध्रुवीकरण बेंडर41,42।

एनएसई स्पेक्ट्रा को एमबीपी प्रोटीन के लिए 10 डिग्री सेल्सियस और आईजीजी 1 प्रोटीन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मापा गया था। सुसंगत मध्यवर्ती बिखरने की तीव्रता मैं (क्यू, टी) / मैं (क्यू, टी = 0) एनएसई द्वारा मापा गया नमूना में सभी गतिशील प्रक्रियाओं का योगदान परिणाम है जो जांच किए गए समय पैमाने के भीतर होता है। इसमें आंतरिक प्रोटीन गतिशीलता, समग्र ट्रांसलेशनल प्रसार, घूर्णी और टम्बलिंग प्रसार और प्रोटीन अणु के भीतर ही खंडीय गति शामिल है। एक सरलीकृत मॉडल मानता है कि आंतरिक गतिशीलता और अनुवादक और घूर्णी प्रसार पूरी तरह से 5,45,46,47,48 हैं और इसे अलग से चिह्नित किया जा सकता है। एकल कण के लिए, सुसंगत प्रकीर्णन फ़ंक्शन को उत्पाद (समीकरण 2)23,48 के रूप में लिखा जा सकता है:

एफ (क्यू, टी) = एफट्रांस(क्यू, टी) ∙एफसड़ांध(क्यू, टी) ∙एफइंट(क्यू, टी) (2)

जहां एक एकल कठोर प्रोटीन के लिए अनुवादक प्रसार शब्द ट्रांसलेशनल प्रसार गुणांक डीटी (समीकरण 3)23,48 का एक घातीय कार्य है:

एफट्रांस (क्यू, टी) = एक्सपी(−क्यू2∙ डीटी∙ टी) (3)

प्रोटीन की बड़ी सांद्रता के लिए, ट्रांसलेशनल डिफ्यूजन गुणांक डीटी प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन से प्रभावित होता है, जो संरचना कारक एस (क्यू) द्वारा निर्धारित होता है और हाइड्रोडायनामिक फ़ंक्शन एचटी (क्यू) (समीकरण 4) 23,48 द्वारा वर्णित हाइड्रोडायनामिक इंटरैक्शन द्वारा निर्धारित होता है:

डीटी (क्यू) = डीटी0 ∷एचटी(क्यू, सी) / एस(क्यू, सी) (4)

समीकरण 4 में, डीटी 0 डीएलएस माप (चरण 2.2.) से शून्य एकाग्रता के लिए एक्सट्रपलेशन प्रसार मूल्य है। एचटी की गणना एचटी = 1 -सी के रूप में की जाती है, [η], जहां सी प्रोटीन एकाग्रता है, [η] आंतरिक चिपचिपाहट है जिसकी गणना [η] = (η - η0) / η0 ∙ सी द्वारा की जाती है, और η0 मापा गतिशील चिपचिपाहट है (चरण 2.3.-2.4.)। संरचना कारक एस (क्यू, सी) एमबीपी प्रोटीन के लिए आईजीजी प्रोटीन और एसएएनएस माप के लिए सैक्स माप से प्राप्त किया गया था।

चित्रा 3 मध्यवर्ती बिखरने वाले कार्यों के उदाहरण प्रदर्शित करता है मैं (क्यू, टी) / आई (क्यू, टी = 0), जैसा कि आईजीजी और एमबीपी प्रोटीन के लिए एनएसई द्वारा मापा जाता है। एक सरल प्रसार जैसी विश्राम प्रक्रिया से एक स्पष्ट विचलन छोटे फूरियर समय पैमाने पर देखा गया था, <25 एनएस, एनएसई द्वारा प्रोटीन आंतरिक गतिशीलता की पहुंच और मनाया गतिशील प्रक्रियाओं का वर्णन करने के लिए एक अधिक जटिल मॉडल की आवश्यकता का संकेत देता है।

Figure 3
चित्रा 3: आईजीजी और एमबीपी प्रोटीन के लिए एनएसई विश्राम स्पेक्ट्रा। आईजीजी डेटा को यहां कम फूरियर समय पर प्रसार से विचलन को प्रकट करने के लिए केवल एकएकल-घातीय फ़ंक्शन द्वारा फिट दिखाया गया है। दोनों प्रोटीनों के लिए विचलन देखा गया था। इसके विपरीत, एमबीपी डेटा को यहां पूर्ण विश्राम रेंज में दिखाया गया है, जो बीहल45 द्वारा विकसित मॉडल द्वारा फिट किया गया है। मॉडल मोटे अनाज का तात्पर्य है और छोटे, मध्यवर्ती और लंबे फूरियर समय शासनों के एक साथ फिट को सक्षम बनाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इसलिए, प्रकीर्णन कार्यों को बीहल द्वारा विकसित मॉडल का उपयोग करके दोनों प्रोटीनों के परमाणु मॉडलिंग द्वारा फिट किया गया था, जो संदर्भ 18,25,38,43,44,46 में वर्णित है। कम्प्यूटेशनल लोड और समय को कम करने के लिए, सभी परमाणु सिमुलेशन के विपरीत, मध्यवर्ती बिखरने वाले फ़ंक्शन की गणना कुछ सौ व्यक्तिगत अनाजों के लिए मोटे अनाज द्वारा की गई थी, और एमएमटीके49 सॉफ्टवेयर लाइब्रेरी (स्वतंत्र रूप से सुलभ) का उपयोग परमाणु निर्देशांक तक पहुंचने और प्रोटीन डोमेन और टुकड़ों पर ट्रांस-घूर्णी गतियों को लागू करने के लिए किया गया था। दोनों प्रोटीनों के लिए मध्यवर्ती बिखरने समारोह गणना के परिणाम प्रयोगात्मक एनएसई डेटा के साथ उत्कृष्ट समझौते में थे और साबित कर दिया कि लंबे फूरियर समय पर देखी गई धीमी गतिशीलता को समग्र अनुवादक और घूर्णी प्रसार प्रक्रियाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जबकि कम समय के तराजू पर देखी गई तेज गतिशीलता को प्रोटीन डोमेन की गतिशीलता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है।

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Discussion

एनएसई स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रोटीन की गतिशीलता का एक अनूठा और विस्तृत दृश्य प्रदान करता है, जो अन्य स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीकों का उत्पादन नहीं कर सकता है। एक विस्तारित समय पैमाने पर माप प्रोटीन के अनुवादक और घूर्णी प्रसार दोनों के अवलोकन प्रदान करते हैं, जैसा कि यहां प्रस्तुत किया गया है। खंडीय गतिशीलता और अन्य आंतरिक दोलन खुद को थोड़े समय के पैमाने पर सुसंगत प्रकीर्णन फ़ंक्शन एस (क्यू, टी) के एक मजबूत क्षय के रूप में प्रकट करते हैं और समग्र प्रसार विश्राम प्रक्रियाओं से अच्छी तरह से अलग होते हैं। एनएसई तकनीक की मुख्य सीमाएं विस्तारित माप समय और एक अच्छा सांख्यिकीय संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक बड़े नमूना वॉल्यूम हैं। यह प्रासंगिक मैक्रोमोलेक्यूलर सिस्टम को मापने के लिए एक चुनौती पैदा कर सकता है जो मोबाइल प्रजातियों की कम सांद्रता और कम जीवनकाल प्रदर्शित करता है।

आईजीजी की आंतरिक गतिशीलता
आईजीजी प्रोटीन में एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट वाई-आकार की संरचना होती है जिसे लचीले लिंकर्स से जुड़े तीन बड़े टुकड़ों द्वारा अनुमानित किया जा सकता है। इस प्रकार की संरचना के लिए हार्मोनिक क्षमता में रहने वाले तीन बड़े कणों का एक गणितीय मॉडल माना गया था। लिंकर्स को लोचदार स्प्रिंग्स द्वारा अनुमानित किया गया था जो एक निश्चित संतुलन स्थिति देते हैं लेकिन ब्राउनियन गति के रूप में उतार-चढ़ाव की अनुमति देते हैं। सापेक्ष संतुलन28 के आसपास प्रत्येक टुकड़े के लिए स्वतंत्रता के तीन डिग्री की अनुमति दी गई थी। समीकरण 2 में एफ इंट (क्यू, टी) द्वारा दर्शाई गई आंतरिक गतिशीलता का वर्णन ऑर्नस्टीन-उहलेनबेक प्रक्रिया50,51 द्वारा किया गया था। मॉडल संभावित डुबकी में टुकड़ों के औसत वर्ग विस्थापन, विभिन्न गतियों के टाइमस्केल, घर्षण और होने वाले बल स्थिरांक की गणना की अनुमति देता है। आंतरिक गति के आयाम को सामान्य मोड विश्लेषण द्वारा अनुमानित किया गया था, प्रत्येक टुकड़े के लिए गति की विभिन्न डिग्री पर विचार किया गया था। मॉडल और परिणामी गणितीय मापदंडों का एक व्यापक विवरण यहां दायरे से बाहर है लेकिन संदर्भ28 में विस्तार से पाया जा सकता है। आईजीजी के इस मामले के अध्ययन में, कई नैनोसेकंड के टाइमस्केल पर आंतरिक गतिशीलता का एक स्पष्ट हस्ताक्षर देखा गया था। लिंकर का गणना वसंत स्थिरांक समान लंबाई के एन्ट्रोपिक वसंत के लिए वास्तविक रूप से तुलनीय प्रतीत होता है। मनाया प्रभावी घर्षण एक मुक्त अनबाउंड आईजीजी टुकड़े के घर्षण के करीब लगता है। पहले से मौजूद संतुलन परिकल्पना को मान्य किया गया था, जिसमें आईजीजी के "खुले" या "बंद" कॉन्फ़िगरेशन को ग्रहण किया गया था जो संतुलन में विभिन्न बाध्यकारी साइटों और बाध्यकारी विशिष्टताओं को प्रदर्शित करते हैं28. यह जानकारी एंटीबॉडी के यांत्रिकी को समझने के लिए प्रासंगिक हो सकती है और क्या उस यांत्रिक व्यवहार का उपयोग जैव संगतता और जैव उपलब्धता में सुधार के लिए किया जा सकता है।

एमबीपी की आंतरिक गतिशीलता
एमबीपी संरचना में एक कॉम्पैक्ट गोलाकार कोर होता है जो अपने लचीले यादृच्छिक कॉइल सिरों के साथ मजबूत खींचने और झुकने की गति की अनुमति देता है। एमबीपी गतिशीलता की व्याख्या आंतरिक घर्षण28,39 के अलावा और बिना लचीले बहुलक मॉडल का उपयोग करके की गई थी। आईजीजी के मामले में, एमबीपी की आंतरिक गतिशीलता की टिप्पणियों को ब्राउनियन गति के सिद्धांत के भीतर सामंजस्य स्थापित किया जा सकता है, जिसमें गति का एक बड़ा आयाम प्रोटीन श्रृंखला के भीतर आंतरिक घर्षण के प्रभावों के साथ लंबे समय तक विश्राम समय का परिणाम देता है। गति के एक बड़े आयाम के साथ वृद्धि हुई विश्राम समय लेकिन छोटे घर्षण को हार्मोनिक क्षमता में ब्राउनियन गति के एक ही ऑर्नस्टीन-उहलेनबेक प्रक्रिया50,51 का उपयोग करके वर्णित किया जा सकता है। बड़े आयामों के साथ आंतरिक गति लेकिन धीमी गति से विश्राम समय श्रृंखला विन्यास (डायहेड्रल क्षमता) की बहाली बलों को कम करके और स्थानीय ऊर्जा बाधाओं को चौरसाई करके अपने मूल राज्य से एमबीपी के पूर्ण विकृतीकरण पर सक्रिय हो जाते हैं। देशी और विकृत अवस्था में एमबीपी आंतरिक गतिशीलता का विस्तृत विवरण आगे संदर्भ28,39 में पाया जा सकता है। एमबीपी के अध्ययन में, एनएसई का उपयोग करके जांच में यादृच्छिक कॉइल पॉलिमर और गोलाकार प्रोटीन के बीच प्रोटीन की मध्यस्थ कॉम्पैक्टनेस की ओर इशारा करते हुए एक गतिशील व्यवहार का पता चला। कई नैनोसेकंड की विश्राम दर के साथ आंतरिक प्रोटीन गतिशीलता का महत्वपूर्ण योगदान कम आवृत्ति सामूहिक खींचने और झुकने की गति5 द्वारा नियंत्रित किया गया था। बहुलक सिद्धांत टूटने से मॉडल द्वारा देशी एमबीपी गतिशीलता का विवरण प्रोटीन आंतरिक घर्षण के एक बड़े मूल्य के कारण प्रदान किया गया था। विकृत एमबीपी में, प्रोटीन श्रृंखला के भीतर आंतरिक घर्षण कम हो जाता है, और विश्राम स्पेक्ट्रम का बहुलक श्रृंखला चरित्र प्रबल होता है। संरचनात्मक पहनावा गतियों का उच्च लचीलापन सुलभ प्रोटीन सतह को बढ़ाने में मदद कर सकता है, जिससे विभिन्न बाध्यकारी भागीदारों के साथ बातचीत की सुविधा मिल सकती है।

गतिशील मॉडल
जबकि एक तकनीक के रूप में एनएसई जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स और आणविक सबयूनिट्स में कम आवृत्ति हार्मोनिक गतियों का आकलन करने में प्रयोगात्मक रूप से अद्वितीय है, मध्यवर्ती प्रकीर्णन फ़ंक्शन के विश्लेषण के लिए विभिन्न गणितीय मॉडल से प्राप्त न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रा के साथ तुलना की आवश्यकता होती है। यहां प्रस्तुत मॉडल और केंद्रित प्रोटीन समाधानों के लिए बीहल एट अल .28 द्वारा विकसित एक लोचदार नेटवर्क सन्निकटन का उपयोग करता है, जिसमें मध्यवर्ती प्रकीर्णन फ़ंक्शन उचित मॉड्यूलर कार्यों का एक संयोजन है, और ब्राउनियन ऑसिलेटर आंतरिक गतिशीलता का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह प्रोटीन की खंडीय गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए बहुत कम उपलब्ध मॉडलों में से एक है। पतला प्रोटीन समाधान के लिए एक और अच्छी तरह से स्थापित मॉडल बू एट अल .52 द्वारा प्रस्तावित मॉडल है, जो एक मजबूत मॉडल है जो सांख्यिकीय यांत्रिकी का उपयोग करता है और जटिल फिट या कई मापदंडों की आवश्यकता नहीं होती है। गतिशील डिकपलिंग सन्निकटन के आधार पर एक समान दृष्टिकोण को पतला प्रणालियों पर भी लागू किया जा सकता है ताकि प्रभावी प्रसार को आत्म-अनुवादक और आंतरिक गतियों के योग के रूप में चिह्नित किया जा सके53. हमारे कई संदर्भ इन मॉडलों और उनकी सीमाओं पर व्यापक रिपोर्टिंग प्रदान कर सकते हैं। हम दृढ़ता से फिटर एट अल .1 और लियू एट अल .54 की सलाह देते हैं।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों और हितों के टकराव की घोषणा नहीं करता है। पांडुलिपि की सामग्री लेखक द्वारा 2019-2021 के बीच स्ट्रक्चरल बायोलॉजी स्कूल में हैंड्स-न्यूट्रॉन स्कैटरिंग एप्लिकेशन में प्रस्तुत व्याख्यान पर आधारित है।

Acknowledgments

इस शोध ने स्पैलेशन न्यूट्रॉन स्रोत (बीएल -15, बीएल -6, जीवविज्ञान और रसायन विज्ञान प्रयोगशालाओं) में संसाधनों का उपयोग किया, ओक रिज नेशनल लेबोरेटरी द्वारा संचालित विज्ञान उपयोगकर्ता सुविधा का एक डीओई कार्यालय। इस शोध ने एमएलजेड-एफआरएम 2 रिएक्टर गार्चिंग (केडब्ल्यूएस -2, फीनिक्स-जे-एनएसई) और जर्मनी के फोर्सचुंग्सज़ेंट्रम जुलिच जीएमबीएच में जेसीएनएस 1 में संसाधनों का भी उपयोग किया। राल्फ बीहल और डॉ एंड्रियास स्टैडलर को मॉडलिंग और आईजीजी और एमबीपी प्रोटीन अनुसंधान दोनों में उनके योगदान के साथ उनकी मदद के लिए स्वीकार करते हैं, एनएसई डेटा कमी समर्थन के लिए डॉ पियोटर ए स्ओनीरकज़ुक, एसएएनएस माप के साथ समर्थन के लिए डॉ चांगवू डू, और एसएनएस जैव रसायन प्रयोगशाला समर्थन के लिए रोंडा मूडी और डॉ केविन वीस।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine MBP protein solution Sigma-Aldrich M1891 lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O - heavy water Sigma-Aldrich Product No. 151882 liquid
Dionized water in house - for washing / cleanning cells
DLS instrument Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich - dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standards SNS-NSE, ORNL - Al2O3  and Graphite powders
Ethanol Sigma-Aldrich 65350-M 70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solution Sigma-Aldrich I4506 lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrument JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - small angle neutron instrument
Liquinox dish detergent Alconox - Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2O Sigma-Aldrich Product No.S9390 disodium phosphate heptahydrate salt
NaCl Sigma-Aldrich Product No.S9888 sodium chloride salt
NaH2PO4·H2O Sigma-Aldrich Product No. S9638 monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific Catalog number: ND-2000 NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment camera NeutronOptics, Grenoble NOG210222 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M - wax parafilm Bemis Parafilm M - 5259-04LC PM996 all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE Spectrometer JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - neutron spectrometer
SasView https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument FZ-Jülich - small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranes Thermo Scientific 88400-88405 Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis Cluster Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometer ORNL, Oak Ridge, TN, USA - neutron spectrometer
Sterile syringe filters VWR N.A. PN:28145-501 0.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS) SP Scientific Part Number 100004055 sample environment equipment
Urea -d4 Sigma-Aldrich Product No. 176087 deuterated Urea salt
Viscometer FZ-Jülich - falling ball viscometer

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इंजीनियरिंग अंक 182 न्यूट्रॉन बिखरने न्यूट्रॉन स्पिन-इको प्रोटीन समाधान धीमी गतिशीलता प्रोटीन डोमेन गति प्रोटीन लचीलापन
न्यूट्रॉन स्पिन इको स्पेक्ट्रोस्कोपी <em>के माध्यम से</em> प्रोटीन गतिशीलता का अध्ययन
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Stingaciu, L. R. Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy. J. Vis. Exp. (182), e61862, doi:10.3791/61862 (2022).

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