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Engineering

Studio della dinamica delle proteine tramite spettroscopia eco-spin neutronica

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/61862
Automatic Translation
1
1NSD, Oak Ridge National Laboratory

Summary

Il presente protocollo descrive i metodi per studiare la struttura e la dinamica di due proteine modello che hanno un ruolo importante nella salute umana. La tecnica combina la caratterizzazione biofisica da banco con la spettroscopia eco-spin neutronica per accedere alla dinamica alle scale di tempo e lunghezza rilevanti per i movimenti interdominio delle proteine.

Abstract

L'attività e la funzionalità della maggior parte delle proteine del corpo umano sono correlate ai cambiamenti configurazionali di interi sottodomini all'interno della struttura cristallina della proteina. Le strutture cristalline costruiscono la base per qualsiasi calcolo che descriva la struttura o la dinamica di una proteina, il più delle volte con forti restrizioni geometriche. Tuttavia, queste restrizioni dalla struttura cristallina non sono presenti nella soluzione. La struttura delle proteine nella soluzione può differire dal cristallo a causa di riarrangiamenti di loop o sottodomini sulla scala temporale da pico a nanosecondi (cioè il regime temporale della dinamica proteica interna). Il presente lavoro descrive come è possibile accedere a slow motion su scale temporali di diverse decine di nanosecondi utilizzando lo scattering neutronico. In particolare, la caratterizzazione dinamica di due principali proteine umane, una proteina intrinsecamente disordinata che manca di una struttura secondaria ben definita e una proteina anticorpale classica, è affrontata mediante spettroscopia eco-spin neutronica (NSE) combinata con una vasta gamma di metodi di caratterizzazione di laboratorio. Ulteriori approfondimenti sulla dinamica del dominio proteico sono stati ottenuti utilizzando la modellazione matematica per descrivere i dati sperimentali dei neutroni e determinare il crossover tra i moti diffusivi combinati e i movimenti proteici interni. L'estrazione del contributo dinamico interno alla funzione di scattering intermedio ottenuto da NSE, compresa la scala temporale dei vari movimenti, consente un'ulteriore visione delle proprietà meccaniche delle singole proteine e della morbidezza delle proteine nel loro ambiente quasi naturale nella soluzione proteica affollata.

Introduction

Sondare la dinamica della materia soffice con neutroni
Studiare le proprietà dinamiche di proteine e peptidi è una parte importante della ricerca biofisica e oggi esistono molti metodi ben sviluppati per accedere a una vasta gamma di paesaggi energetici1. Mettere in relazione la dinamica sperimentalmente rivelata delle proteine con la loro funzione biologica è un compito molto più difficile, che richiede complessi modelli matematici e simulazioni dinamiche assistite da computer. L'importanza della spettroscopia neutronica per l'analisi dei moti proteici è stata sottolineata in diversi studi ben accolti e ampiamente riconosciuti 1,2,3,4,5. Prima di esplorare il variegato panorama energetico della dinamica proteica interna, è necessaria una breve panoramica dei processi dinamici nella materia soffice e di come i neutroni possono accedervi.

La sensibilità dei neutroni alla configurazione isotopica e il tipo di interazioni che mostrano con la materia soffice rende lo scattering neutronico una delle tecniche di indagine più versatili6. Esiste un ampio spettro di scale di lunghezza di correlazione e tempi di correlazione a cui i neutroni possono accedere, dalle eccitazioni nucleari e dalle vibrazioni atomiche ai moti collettivi e ai processi di rilassamento lento come le rotazioni isotrope e i moti diffusivi. Quando si studiano i neutroni sparsi per il loro trasferimento di energia, si possono distinguere tre interazioni principali: lo scattering elastico, in cui non vi è scambio di energia tra neutrone in arrivo e particella nel campione; lo scattering anelastico, con un ampio scambio di energia quantificabile tra neutrone e particella; e il caso peculiare dello scattering quasi-elastico che designa un trasferimento di energia molto piccolo rispetto all'energia neutronica incidente 1,7. Queste interazioni forniscono informazioni precise sul materiale studiato e costituiscono la base teorica di un'ampia varietà di tecniche di scattering neutronico.

Nello scattering elastico, il rivelatore registra le direzioni dei neutroni come un modello di diffrazione, che mostra la posizione degli atomi campione l'uno rispetto all'altro. Vengono acquisite informazioni sulle correlazioni delle posizioni atomiche (cioè l'intensità integrata S(Q) relativa al trasferimento di quantità di moto Q, che riguarda solo le informazioni strutturali). Questo principio costituisce la base della diffrazione neutronica8.

La complessità sorge quando il trasferimento di energia non è più zero a causa di eccitazioni e fluttuazioni interne nel materiale campione. Questo costituisce la base della spettroscopia neutronica, in cui i neutroni sparsi sono studiati in funzione sia del trasferimento di energia E che del trasferimento di quantità di moto Q. Si ottengono informazioni dinamiche e strutturali. La spettroscopia neutronica misura la stessa intensità integrata S(Q) per il trasferimento di energia (cioè la variazione di velocità dei neutroni dovuta allo scattering del campione, S(Q,ω) = S(Q, E), che è anche indicato come fattore di struttura dinamica)9.

Per calcolare lo scattering da un materiale, è più appropriato utilizzare la funzione di correlazione di coppia 7,10. Nel caso della diffrazione, la funzione di correlazione della coppia statica G(r) dà la probabilità di trovare il centro di una particella ad una data distanza r dal centro di un'altra particella. La spettroscopia generalizza la funzione di correlazione della coppia statica e include energia/frequenza/tempo nell'equazione di scattering. La funzione di correlazione di coppia G(r) diventa una funzione del tempo G(r, t), che può essere scomposta in una distinta funzione di correlazione della coppia atomica GD(r, t), e una funzione di auto-correlazione GS(r, t). Questi descrivono due tipi di correlazioni: i moti correlati alle coppie degli atomi che governano lo scattering coerente e l'auto-correlazione che governa lo scattering incoerente10.

Lo scattering coerente è lo scattering da "la media" e dipende dalla fase relativa delle onde sparse. Nel regime di scattering a piccolo angolo, le onde di neutroni sparse da diversi centri di scattering (atomi diversi) interferiscono in modo costruttivo (hanno fasi simili) e il movimento collettivo degli atomi viene osservato con un forte aumento dell'intensità. Lo scattering coerente descrive essenzialmente lo scattering di un singolo neutrone da tutti i nuclei del campione10.

Quando non si verifica alcuna interferenza costruttiva tra le onde di neutroni sparse da centri diversi, un singolo atomo viene seguito nel tempo e si osserva l'auto-correlazione tra la posizione dell'atomo al tempo t = 0 e lo stesso atomo al tempo t. Pertanto, le informazioni sulle posizioni relative degli atomi vengono perse e l'attenzione si concentra solo sulle fluttuazioni locali. La dispersione da fluttuazioni locali governa lo scattering incoerente. Lo scattering incoerente è isotropo, contribuisce al segnale di fondo e degrada il segnale-rumore10,11.

Combinando tutto quanto sopra, distinguiamo quattro principali processi di scattering neutronico10: (1) coerente elastico (misura le correlazioni delle posizioni atomiche), (2) coerente anelastico (misura i moti collettivi degli atomi), (3) elastico incoerente (contribuisce allo sfondo, riduce l'intensità di scattering mediante il fattore di Debye-Waller (DWF) e misura il fattore di struttura incoerente elastica (EISF), descrivendo la geometria dei moti diffusivi in geometria confinata, e (4) incoerente anelastico (misura la dinamica del singolo atomo e l'auto-correlazione).

I processi dinamici a cui i neutroni possono accedere in biologia vanno dallo smorzamento delle vibrazioni atomiche e molecolari a bassa frequenza, all'interazione delle molecole di solvente con le biosuperfici e ai processi di diffusione nello strato di idratazione delle macromolecole e della geometria confinata, ai movimenti diffusivi traslazionali, rotazionali e di burattatura a corto raggio, ai domini proteici e ai moti allosterici1 . L'ampia diversità dei metodi e degli strumenti di neutroni per misurare la dinamica delle proteine si basa su come si ottiene l'acromatizzazione del fascio di neutroni incidente o in uscita e su come viene eseguita l'analisi energetica dei neutroni sparsi. Dagli spettrometri a triplo asse a time-of-flight, backscattering e spin-echo, si possono esplorare processi dinamici con tempi caratteristici compresi tra 1 x 10-14 s e 1 x 10-6 s (da femtosecondi a microsecondi)12.

L'Oak Ridge National Laboratory, con le sue due rinomate sorgenti di neutroni, la Spallation Neutron Source - SNS13 e l'High Isotope Flux Reactor - HFIR14, ha una delle migliori suite di spettrometri per lo studio della dinamica nei biomateriali. Alcuni degli esempi più eloquenti includono l'uso dello spettrometro chopper a neutroni freddi (CNCS) a SNS15 per studiare la perturbazione dinamica dell'acqua di idratazione intorno alla proteina fluorescente verde nella soluzione16 o le vibrazioni collettive sub-picosecondi di diverse proteine17. Un problema ricorrente delle indagini anelastiche sullo scattering dei neutroni è che alcuni processi biologici sono troppo lenti per essere osservati. Senza configurazioni estreme che portano a un'enorme perdita di intensità neutronica, gli spettrometri a tempo di volo sono limitati a una risoluzione di energia di 10 μeV, corrispondente a una scala temporale massima di ~ 200 ps10,11. Questo non è sufficiente per osservare movimenti su larga scala nelle proteine. Pertanto, sono spesso necessari strumenti con una risoluzione energetica più elevata come gli spettrometri backscattering. La combinazione del tempo di volo e delle tecniche di backscattering si è dimostrata efficace per studiare il cambiamento nella dinamica interna del citocromo P450cam (CYP101), un enzima che catalizza l'idrossilazione della canfora18.

La diffusività microscopica misurata dallo spettrometro retrodiffusante di SNS-BASIS19 era sorprendentemente ben definita e poteva essere separata nella diffusività dell'acqua (idratazione, citoplasmatica e acqua simile alla massa) e nella diffusività dei costituenti cellulari nei platelminti planari, il primo animale vivente ad essere studiato mediante scattering neutronico20 . Il backscattering è una tecnica spettroscopica ad alta risoluzione, ma è anche limitata a diversi μeV = diversi nanosecondi, mentre la dinamica lenta nei biomateriali si manifesta anche come il tempo di sopravvivenza della correlazione tra posizione atomica o orientamenti di spin (ad esempio, processi di rilassamento, che si verificano regolarmente nell'intervallo di tempo da dieci a centinaia di nanosecondi).

La spettroscopia eco di spin neutronico (NSE) è l'unica tecnica di scattering neutronico a raggiungere una risoluzione così elevata. A differenza di altre tecniche neutroniche, NSE non richiede l'acromatizzazione del fascio poiché utilizza la fase meccanica quantistica dei neutroni, che è i loro momenti magnetici. La manipolazione dei momenti magnetici consente l'uso di un'ampia distribuzione della lunghezza d'onda del fascio di neutroni, mentre la tecnica è sensibile a variazioni di velocità di neutroni molto piccole nell'ordine di 1 x 10-4. NSE è stato utilizzato con successo per studiare la lenta dinamica delle proteine in soluzione per molte proteine. Tra questi numerosi studi pionieristici, riconosciamo lo studio della flessibilità segmentale dell'immunoglobulina21 suina; i moti del dominio accoppiato nella Taq polimerasi22; i moti di dominio nel tetramero del lievito alcol deidrogenasi23; il cambiamento di conformazione della fosfoglicerato chinasi in base al legame del substrato3; l'attivazione dei moti di dominio e la propagazione dinamica dei segnali allosterici nella proteina 4,24,25) di regolazione dello scambio Na+/H+(NHERF1); la dinamica di uno stato compatto di ione reduttasi mercurico26; e la diffusione dell'emoglobina nei globuli rossi27. Due studi più recenti sulla dinamica delle proteine hanno esposto la flessibilità dell'anticorpo umano Immunoglobulina G (IgG) come molla entropica28 e le caratteristiche del contributo del solvente alla dinamica della proteina basica della mielina intrinsecamente disordinata (MBP)5.

Il presente articolo spiega i principi di base dell'NSE, i molteplici metodi preparatori raccomandati per un'indagine approfondita della dinamica delle proteine, nonché la metodologia e il protocollo sperimentale per l'acquisizione dei dati NSE presso lo spettrometro NSE di SNS, SNS-NSE. Il protocollo caratterizza due proteine: IgG, una normale proteina anticorpale umana, e la proteina intrinsecamente disordinata MBP. Le implicazioni biofisiche, la rilevanza della ricerca degli esempi e i limiti della tecnica sono discussi brevemente.

Spettroscopia NSE, il metodo per le misure di dinamica lenta
NSE è una tecnica polarizzata che utilizza il tempo di volo dei neutroni per misurare lo scambio di energia (perdita di polarizzazione) dovuto all'interazione quasi elastica tra neutroni e atomi in un campione. Al centro della spettroscopia NSE si trovano due principi di base: (1) la capacità dello spin neutronico di precedere nel campo magnetico con una frequenza proporzionale alla forza Equation 1magnetica, vale a dire la frequenza di Larmor29, e (b) l'eco di spin o eco di Hann, che rappresenta la manipolazione e la rifocalizzazione del segnale di polarizzazione quando si applica una serie di impulsi a radiofrequenza30.

Le basi del processo NSE possono essere riassunte in pochi semplici passaggi 6,11 utilizzando la Figura 1. (1) Il fascio di neutroni prodotto dalla sorgente (posizione 1) è polarizzato (posizione 2), guidato e trasportato (posizione 3) e arriva all'ingresso dello spettrometro NSE, dove viene ruotato di 90° dal primo pi-mezzo flipper (posizione 4). (2) Il fascio polarizzato (ad esempio, momenti magnetici di neutroni) diventa perpendicolare alle linee del campo magnetico del primo magnete (prima zona di precessione, posizione 5) e inizia a precedere. (3) Alla fine del magnete, gli spin dei neutroni accumulano un certo angolo di precessione proporzionale all'intensità del campo magnetico e al tempo di volo trascorso all'interno (fondamentalmente inversamente proporzionale alla velocità del neutrone). Le singole velocità dei neutroni sono codificate all'interno del loro angolo di precessione alla fine della prima zona di precessione. (4) Vicino alla posizione del campione, il pi-flipper (posizione 6) inverte l'orientamento dello spin di 180°, cambiando il segno dell'angolo di precessione. (5) I neutroni interagiscono con le molecole del campione (posizione 7) e si disperdono. (6) I neutroni sparsi entrano e precedono nella seconda zona di precessione (posizione 8) ma diventano orientati inversamente. (7) Un'altra pinna pi-mezza (posizione 9) viene utilizzata per ruotare l'orientamento dello spin dalla direzione perpendicolare a quella orizzontale. Questo fermerà la precessione, traducendo l'angolo di precessione φ in polarizzazione proporzionale a cos(φ). (8) L'analizzatore (posizione 10) seleziona i neutroni in base a un orientamento. Se l'interazione con il campione è elastica, la velocità del neutrone non cambierà. I neutroni trascorreranno una quantità identica di tempo volando nella prima e nella seconda zona di precessione e gli angoli di precessione accumulati saranno completamente recuperati. La polarizzazione completa viene ripristinata sul rivelatore (posizione 11) come eco della polarizzazione originale (cioè spin-echo). (9) Tuttavia, in NSE, lo scattering è quasi elastico, quindi un piccolo scambio di energia tra neutroni e molecole campione porta a diverse velocità di neutroni dopo la dispersione da parte del campione. A causa delle diverse velocità, i neutroni trascorreranno un ulteriore tempo volando attraverso la seconda zona di precessione e non avranno recuperato correttamente il loro angolo di precessione. Una polarizzazione parziale viene recuperata sul rivelatore e la perdita di polarizzazione dovuta al rilassamento dello spin è proporzionale alla trasformata cos-Fourier della funzione spettrale S(Q, ω), alla funzione di scattering intermedia F(Q, t). (10) Il parametro temporale della funzione F(Q, t) è proporzionale all'intensità del campo magnetico di precessione. La scansione della perdita di polarizzazione in funzione dell'intensità del campo magnetico produce, quindi, una funzione di rilassamento che dipende dai processi dinamici all'interno del campione.

Figure 1
Figura 1: Fotografia dello spettrometro NSE a SNS (SNS-NSE) e schema del percorso di volo dei neutroni con i componenti funzionali più importanti. Da destra a sinistra: 1 = sorgente di neutroni; 2 = choppers-bender-polarizer-sistema otturatore secondario; 3 = guide di trasporto del fascio; 4 = pi/2 flipper per il primo giro di 90°; 5 = prima zona di precessione; 6 = pi flipper per rotazione a 180°; 7 = area del campione e ambiente del campione (qui viene mostrato il crioforno); 8 = seconda zona di precessione; 9 = pi/2 flipper per secondo giro di 90°; 10 = analizzatore; 11 = rilevatore. (Si noti che porzioni di 3, così come 2 e 1, sono situate dietro la parete blu all'interno della schermatura; gli elicotteri sono sostituiti da un selettore di velocità per NSE basato su reattore). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

Il presente lavoro caratterizza due proteine: una proteina anticorpale umana regolare IgG e l'MBP intrinsecamente disordinata. La forma liofilizzata delle proteine è stata ottenuta da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione del campione proteico

  1. Preparare un tampone da 50 mM di fosfato di sodio + 0,1 M naCl pesando e sciogliendo i rispettivi reagenti solidi in acqua pesante (D2O) (vedi Tabella dei materiali). Questo è il solvente tampone deuterato per IgG.
    1. Regolare il pH della soluzione tampone a 6,6.
  2. Preparare un tampone di fosfato di sodio da 20 mM + urea da 6 M pesando e sciogliendo i rispettivi componenti solidi in acqua pesante (D2O). Questo è il solvente tampone deuterato per MBP.
    1. Regolare il pH della soluzione tampone a 4,7.
  3. Filtrare i solventi tampone utilizzando filtri di dimensioni dei pori da 0,2 μm (vedere Tabella dei materiali).
  4. Pesare e sciogliere le polveri liofilizzate proteiche purificate nei solventi deuterati per le rispettive proteine (Fasi 1.1.-1.2.) ad alta concentrazione proteica (~50 mg/ml).
  5. Caricare la soluzione proteica in cestelli dializzati con membrane di dialisi di 3,5 K MWCO e dializzare contro il tampone filtrato per 24 ore a 10 °C per MBP e 25 °C per IgG (vedi Tabella dei materiali) scuotendo leggermente i tubi per creare un gradiente di diffusione.
  6. Diluire la soluzione proteica utilizzando il tampone di dialisi in una serie di concentrazioni: 1, 2, 5, 10 e 50 mg/ml.
  7. Determinare le concentrazioni esatte utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop (vedere Tabella dei materiali).

2. Caratterizzazione preliminare del campione mediante diffusione dinamica della luce (DLS)

  1. Caricare 80 μL di ciascuna soluzione proteica della serie di concentrazioni preparata sopra (Fase 1.6.) nella cella monouso DLS (vedere Tabella dei materiali) e determinare i coefficienti di diffusione, con una media di oltre 10 acquisizioni.
  2. Tracciare i coefficienti di diffusione traslazionale in funzione della concentrazione proteica ed estrapolare a concentrazione zero.
  3. Caricare ogni soluzione proteica della serie di concentrazioni nei tubi capillari di un viscosimetro (vedere Tabella dei materiali) e misurare la viscosità dinamica.
  4. Tracciare le viscosità dinamiche misurate in funzione della concentrazione proteica ed estrapolare a concentrazione zero.
    NOTA: L'estrapolazione della diffusione dls a concentrazione zero produce il valore della diffusione traslazionale per una singola proteina. L'estrapolazione della viscosità dinamica a concentrazione zero deve produrre il valore di viscosità dinamica misurato sperimentalmente per la soluzione tampone.

3. Raccolta di scattering a piccolo angolo (neutroni o raggi X)

  1. Misurare lo scattering neutronico a piccolo angolo (SANS) e/o lo scattering a raggi X a piccolo angolo (SAXS) (vedere Tabella dei materiali) su quattro concentrazioni proteiche, preferibilmente 2 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL e 50 mg/mL.
  2. Normalizzare gli spettri SANS e SAXS in base alla concentrazione proteica.
  3. Adatta il fattore di forma proteico P(Q) agli spettri SANS e SAXS utilizzando l'ottimizzazione dell'insieme31 e/o il software SasView32 .
  4. Calcola il fattore di struttura S(Q, c) dividendo il segnale SANS e SAXS con P(Q) per ogni concentrazione.
    NOTA: I lettori interessati a misurare e interpretare i dati di scattering a piccolo angolo come supporto per le misurazioni NSE sono invitati a consultare accuratamente i riferimenti 23,28,31,32,33.

4. Misurazione delle NSE

  1. Impostare l'esperimento e montare il campione seguendo i passaggi seguenti.
    1. Selezionare lo spessore della cella per il carico del campione in base alla concentrazione della soluzione proteica, alla temperatura necessaria per la misurazione e alla quantità di soluzione disponibile.
      NOTA: Il presente studio ha utilizzato contenitori di quarzo trasparente caricatore dall'alto di 40 mm x 30 mm x 4 mm.
    2. Pulire ripetutamente la cella, alternando detersivo per piatti privo di fosfati (vedi Tabella dei materiali), acqua deionizzata ed etanolo al 70%.
    3. Asciugare la cella nel forno a convezione; non superare gli 80 °C per le celle al quarzo.
    4. Caricare 4 ml di soluzione proteica nella cellula e chiudere con tappi. Utilizzare un film di cera o qualsiasi sigillante (vedere Tabella dei materiali) per sigillare le celle del campione.
      NOTA: Nel presente studio, sono stati utilizzati 4,8 mL di soluzione a ~50 mg/mL per ottenere un'intensità di dispersione sufficiente.
    5. Caricare 4 mL di tampone per dialisi in un contenitore identico a quello del campione proteico e del sigillo.
    6. Trasportare i campioni alla beamline, chiudere l'otturatore ed entrare nell'area34 della grotta dell'involucro dello spettrometro.
    7. Montare la cella campione sul portacampioni in alluminio stringendo le viti e le piastre di tenuta (Figura 2, pannello di sinistra).
      NOTA: è possibile montare due celle campione contemporaneamente, dato che è necessario lo stesso protocollo di misurazione per tutti i campioni.
    8. Montare il campione di grafite e/o il campione di polvere di Al2O3 caricati in un contenitore identico al campione proteico. Questi sono gli standard forniti dal supporto della beamline SNS-NSE.
    9. Posizionare il portacampioni facendolo scorrere delicatamente nella lattina del sistema di forzatura della temperatura (TFS, vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: TFS è l'ambiente di campionamento più utilizzato presso SNS-NSE e pompa aria secca nel contenitore del campione per raggiungere la temperatura desiderata (Figura 2, pannelli centrale e destro).
    10. Chiudere il coperchio TFS e impostare la temperatura sul valore desiderato accedendo alla schermata interattiva del TFS.
    11. Montare la telecamera a neutroni (vedi Tabella dei materiali) per l'allineamento dei campioni al fascio.
    12. Spazzare l'involucro dello strumento, evacuare, chiudere le porte e aprire l'otturatore a fascio.
      NOTA: le celle campione sono fornite dal supporto della beamline SNS-NSE. Per le celle campione disponibili e la libreria dell'ambiente di esempio, fare riferimento alla pagina Web della beamline SNS-NSE 7,35.
  2. Raccogli i dati NSE seguendo i passaggi seguenti.
    1. Allineare il campione nel fascio di neutroni usando la telecamera a neutroni e le quattro aperture di campionamento indipendenti.
    2. Aprire il software di raccolta dati SNS-NSE36 e raccogliere statistiche di esempio eseguendo scansioni di diffrazione per gli angoli di diffusione e la lunghezza d'onda desiderati.
    3. Impostare i parametri di misura in base alle statistiche raccolte per ciascun campione modificando le macro di misura fornite dallo scienziato dello strumento di assistenza.
    4. Avviare la scansione digitando il nome del protocollo nel prompt dei comandi e acquisire echi per l'esempio.
    5. Avviare la scansione e acquisire echi anche per il riferimento elastico e il solvente tamponato. Eseguire il funzionamento intermittente dell'otturatore del fascio per il cambio del campione.

Figure 2
Figura 2: Sistema di misurazione NSE. Pannello di sinistra: campioni di soluzione proteica in contenitore di quarzo montato con viti e piastre sul portacampioni in alluminio (Al). Il portacampioni Al offre la possibilità di montare due campioni contemporaneamente all'interno dell'ambiente campione. Pannello centrale: il campione del sistema di forzatura della temperatura (TFS) può essere montato nella fase del campione, la finestra del fascio di neutroni è sulla destra, mentre la telecamera a neutroni utilizzata per l'allineamento è visibile sul lato sinistro. Pannello di destra: posizionare il portacampioni con due campioni nel campione può funzionare con finestre in silicio (Si). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Riduzione dei dati NSE

NOTA: SNS-NSE è dotato di un software dedicato denominato DrSpine (riduzione dei dati per spin-echo)37,38 disponibile sul cluster di analisi remota ORNL Neutron Sciences, una guida rapida per l'utente e supporto di aiuto integrato.

  1. Accedere a Neutron Sciences Remote Analysis Cluster (vedere Tabella dei materiali) con le credenziali utente ORNL e premere il pulsante Avvia sessione .
  2. Configurare il software di riduzione dei dati seguendo i passaggi seguenti.
    1. Nella directory utente, apri una finestra del terminale e digita: source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh.
    2. Quindi, digitare: drspine_create_env.sh.
  3. Creare una cartella per la riduzione dei dati nella home directory e copiare gli script e le macro forniti dalla directory condivisa.
  4. Modificare, rinominare e salvare la macro di riduzione fornita di conseguenza.
  5. Digitare drspine al prompt dei comandi e premere invio per avviare l'ambiente di riduzione del software.
  6. Digitare "il nome della macro di riduzione" modificato al passaggio 5.4. nel prompt dei comandi all'interno dell'ambiente software e premere Invio.

6. Raccordo dati NSE

  1. Modificare lo script python "stapler-drspine.py", fornito dallo scienziato dello strumento di assistenza, con i nomi dei dati del file ridotti.
    NOTA: Lo script python è disponibile gratuitamente per gli utenti dello strumento.
  2. Modificare la funzione per adattarla alla libreria fornita.
  3. Digitare il nome dello script modificato "stapler-drspine.py" nel prompt dei comandi e premere INVIO per leggere, adattare e tracciare dati NSE ridotti.
    NOTA: Lo Scienziato dello Strumento fornirà un modello per la macro di riduzione e lo script python "stapler-drspine.py" in grado di leggere e adattare i dati ridotti NSE. I dati NSE finali ridotti sono in formato ASCII e possono essere letti da vari software preferiti.

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Representative Results

Le proteine IgG provenienti da proteine MBP sieriche e bovine umane sono state ricostituite ad alte concentrazioni (~50 mg/mL) in tamponi D2O-base. Poiché le proteine sono state disciolte in alte concentrazioni, le soluzioni ottenute sono state soluzioni proteiche affollate. Le dinamiche studiate con NSE soffrono dell'ambiente affollato in cui risiedono le proteine (interazioni fattoriali di struttura ed effetti idrodinamici)5,28,39. DlS è stato eseguito su una serie di concentrazioni per ciascuna proteina per tenere conto degli effetti di affollamento. L'estrapolazione a concentrazione zero dei coefficienti di diffusione traslazionale misurati da DLS produce il valore di diffusione traslazionale per una singola proteina. Anche la viscosità dinamica in funzione della concentrazione proteica deve essere misurata prima dell'NSE per tenere conto delle interazioni idrodinamiche. L'estrapolazione a concentrazione zero delle viscosità dinamiche in funzione della concentrazione deve produrre il valore che può essere misurato sperimentalmente per la soluzione tampone di ciascun campione proteico preparato.

La forma e la struttura delle proteine in soluzione concentrata sono state valutate prima di qualsiasi esperimento NSE per ottenere informazioni sul fattore di forma proteico e sulla forza del fattore di struttura, che potrebbe influenzare il modo in cui le proteine si muovono in soluzione. Lo scattering a piccolo angolo è stato il metodo di scelta per queste indagini. Nel presente studio, saxs ha osservato la conformazione strutturale della proteina IgG in soluzione e la struttura della MBP è stata valutata da SANS. L'intensità di scattering (Q) misurata (Passi 3.3.-3.4.) è proporzionale al prodotto tra il fattore di forma P(Q) e il fattore di struttura S(Q,c) ponderato per il numero di particelle (Equazione 1)5,28,39:

I (Q) = N ∙ P (Q) ∙S (Q, c) (1)

SAXS è stato misurato su uno strumento SAXS40 di tipo Kratky con una lunghezza d'onda dei raggi X di 0,154 nm per IgG, e SANS è stato misurato41 per MBP con una lunghezza d'onda neutronica di 4,5 Å. Le intensità sperimentali a piccolo angolo I(Q) sono state corrette in base al solvente e al solvente, scalate in base alla concentrazione della soluzione e il fattore di forma è stato calcolato utilizzando pacchetti software liberamente disponibili come Ensemble modeling-EOM e SasView 24,25,29,39,42,43. Inoltre, il fattore di struttura per ciascuna proteina è stato ottenuto dall'equazione 1.

Per il presente studio, gli esperimenti NSE sono stati eseguiti con due spettrometri spin-echo: lo strumento SNS-NSE34 in Figura 1 e lo strumento Phoenix-J-NSE44. Sono state misurate lunghezze d'onda incidenti tra 8 Å - 12 Å, con tempi di Fourier tra 0,1 ns ≤ tmax ≤ 130 ns per diverse misurazioni Q tra 0,05 Å-1- 0,2 Å−1. La differenza tra i due spettrometri è un punto vitale nella comprensione della scienza NSE, e rappresentano sia il vecchio concetto di una cosiddetta "eco di spin classica" per la sorgente di neutroni statici di un reattore sia il nuovo "concetto di tempo di volo" per la sorgente di neutroni pulsanti. Lo spettrometro Phoenix-J-NSE è un NSE di tipo classico, in cui un selettore di velocità seleziona una particolare lunghezza d'onda. Per consentire variazioni nelle velocità dei neutroni, viene introdotta una larghezza di banda di lunghezza d'onda ±10%. Nonostante la banda di energia molto stretta utilizzata per una singola scansione, la situazione dello spettrometro Phoenix-J-NSE in una sorgente di reattore ad alto flusso garantisce che gli intervalli di tempo del vettore spaziale e delle correlazioni siano coperti in tempi di misurazione relativamente brevi. Lo spettrometro SNS-NSE è lo spettrometro a neutroni choppers ad altissima risoluzione di nuova generazione, con un intervallo di lunghezza d'onda di 2 Å < λ < 14 Å e una larghezza di banda simultanea di lunghezza d'onda di 2,4 Å - 3,6 Å, a seconda della posizione dello spettrometro. Grazie a questa ampia larghezza di banda, viene raggiunta un'elevata efficienza di raccolta dei dati, consentendo una copertura quasi senza pause di un ampio intervallo di tempo del vettore d'onda con solo poche impostazioni dell'angolo di diffusione. La selezione della banda di lunghezza d'onda nell'SNS-NSE è effettuata da un sistema chopper composto da quattro chopper. Entrambi gli spettrometri NSE discussi qui hanno campi di precessione basati sulla tecnologia superconduttrice con elevata omogeneità del campo magnetico, nuovi elementi di correzione del campo all'avanguardia per correzioni del campo vagante e nuovi piegatori polarizzanti41,42.

Gli spettri NSE sono stati misurati a 10 °C per la proteina MBP e a 25 °C per la proteina IgG1. L'intensità di scattering intermedia coerente I(Q, t) / I(Q, t = 0) misurata da NSE è il risultato contributivo di tutti i processi dinamici nel campione che avvengono all'interno della scala temporale indagata. Questo contiene la dinamica proteica interna, la diffusione traslazionale complessiva, la diffusione rotazionale e ruzzolante e i moti segmentali all'interno della molecola proteica stessa. Un modello semplificato presuppone che la dinamica interna e le diffusioni traslazionali e rotazionali siano totalmente disaccoppiate 5,45,46,47,48 e possano essere caratterizzate separatamente. Per la singola particella, la funzione di scattering coerente può essere scritta come prodotto (Equazione 2)23,48:

F (Q, t) = Ftrans(Q, t) ∙Frot(Q, t) ∙Fint(Q, t) (2)

dove il termine di diffusione traslazionale per una singola proteina rigida è una funzione esponenziale del coefficiente di diffusione traslazionale DT (Equazione 3)23,48:

Ftrans(Q, t) = exp(−Q2∙ DT∙ t) (3)

Per grandi concentrazioni di proteine, il coefficiente di diffusione traslazionale DT è influenzato dalle interazioni proteina-proteina, quantificate dal fattore di struttura S(Q) e dalle interazioni idrodinamiche descritte dalla funzione idrodinamica HT(Q) (Equazione 4)23,48:

DT(Q) = DT0 ∙HT(Q, c) / S(Q, c) (4)

Nell'equazione 4, DT0 è il valore di diffusione estrapolato a concentrazione zero dalle misurazioni DLS (Fase 2.2.). HT è calcolato come HT = 1 -c∙ [η], dove c è la concentrazione proteica, [η] è la viscosità intrinseca calcolata da [η] = (η - η0) /η0 ∙ c, e η0 è la viscosità dinamica misurata (Passi 2.3.-2.4.). Il fattore di struttura S(Q, c) è stato ottenuto dalle misurazioni SAXS per la proteina IgG e sans per la proteina MBP.

La Figura 3 mostra esempi di funzioni di scattering intermedie I(Q, t) / I(Q, t = 0), misurate da NSE per le proteine IgG e MBP. Una chiara deviazione da un semplice processo di rilassamento simile alla diffusione è stata osservata sulla breve scala temporale di Fourier, <25 ns, indicando l'accessibilità della dinamica interna delle proteine da parte di NSE e la necessità di un modello più complesso per descrivere i processi dinamici osservati.

Figure 3
Figura 3: Spettri di rilassamento NSE per proteine IgG e MBP. I dati IgG sono qui mostrati solo da una singola funzione esponenziale per rivelare la deviazione dalla diffusione a tempi di Fourier più brevi. La deviazione è stata osservata per entrambe le proteine. Al contrario, i dati MBP sono mostrati qui nella gamma full-relaxation, montata dal modello sviluppato da Biehl45. Il modello implica la grana grossa e consente l'adattamento simultaneo di regimi temporali di Fourier brevi, intermedi e lunghi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Pertanto, le funzioni di scattering sono state adattate dalla modellazione atomica di entrambe le proteine utilizzando modelli sviluppati da Biehl, descritti nei riferimenti 18,25,38,43,44,46. La funzione di scattering intermedio è stata calcolata mediante graining grossolano su un paio di centinaia di singoli grani, al contrario della simulazione di tutti gli atomi, per ridurre il carico e il tempo computazionale, e la libreria software MMTK49 (liberamente accessibile) è stata utilizzata per accedere alle coordinate atomiche e implementare movimenti trans-rotazionali su domini e frammenti proteici. I risultati del calcolo della funzione di scattering intermedio per entrambe le proteine sono stati in ottimo accordo con i dati sperimentali NSE e hanno dimostrato che la dinamica più lenta osservata a tempi di Fourier lunghi può essere attribuita ai processi complessivi di diffusione traslazionale e rotazionale, mentre la dinamica veloce osservata a scale temporali brevi può essere attribuita alla dinamica dei domini proteici.

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Discussion

La spettroscopia NSE offre una visione unica e dettagliata della dinamica delle proteine, che altre tecniche spettroscopiche non possono produrre. Le misurazioni su una scala temporale estesa forniscono osservazioni della diffusione traslazionale e rotazionale delle proteine, come presentato qui. La dinamica segmentale e altre oscillazioni interne si rivelano come un forte decadimento della funzione di scattering coerente S(Q, t) su scala temporale breve e sono ben separate dai processi generali di rilassamento diffusionale. I principali limiti della tecnica NSE sono il tempo di misurazione prolungato e i grandi volumi di campione necessari per acquisire un buon segnale statistico. Ciò può rappresentare una sfida per misurare i sistemi macromolecolari rilevanti che presentano basse concentrazioni delle specie mobili e vite ridotte.

Dinamica interna delle IgG
La proteina IgG ha una struttura a forma di Y specifica per gli anticorpi che può essere approssimata da tre grandi frammenti collegati da linker flessibili. Un modello matematico di tre particelle considerevoli che risiedono in potenziale armonico è stato assunto per questo tipo di struttura. I linker sono stati approssimati da molle elastiche che danno una posizione di equilibrio fissa ma consentono fluttuazioni come forma di moto browniano. Tre gradi di libertà erano consentiti per ogni frammento attorno all'equilibrio relativo28. Le dinamiche interne rappresentate da Fint(Q, t) nell'equazione 2 sono state descritte dal processo di Ornstein-Uhlenbeck50,51. Il modello consente il calcolo dello spostamento quadrato medio dei frammenti nel tuffo potenziale, la scala temporale dei diversi movimenti, l'attrito e le costanti di forza che si verificano. L'ampiezza del moto interno è stata approssimata dall'analisi dei modi normali, considerando diversi gradi di movimento per ogni frammento. Un'ampia descrizione del modello e dei parametri matematici risultanti è fuori portata qui, ma può essere trovata in dettaglio nel riferimento28. In questo caso di studio di IgG, è stata osservata una chiara firma delle dinamiche interne sulla scala temporale di diversi nanosecondi. La costante di molla calcolata del linker sembra essere realisticamente paragonabile a una molla entropica di lunghezza simile. L'attrito efficace osservato sembra vicino all'attrito di un frammento di IgG libero non legato. L'ipotesi di equilibrio preesistente è stata convalidata, con presunte configurazioni "aperte" o "chiuse" coesistenti di IgG che si trovano in equilibrio e che mostrano diversi siti di legame e specificità di legame28. Queste informazioni possono essere rilevanti per comprendere la meccanica degli anticorpi e se tale comportamento meccanico può essere utilizzato per migliorare la biocompatibilità e la biodisponibilità.

Dinamiche interne di MBP
La struttura MBP ha un nucleo globulare compatto che consente forti movimenti di allungamento e flessione con le sue estremità flessibili della bobina casuale. Le dinamiche MBP sono state interpretate utilizzando modelli polimerici flessibili con e senza l'aggiunta di attrito interno28,39. Come nel caso delle IgG, le osservazioni della dinamica interna di MBP possono essere riconciliate all'interno della teoria del moto browniano, in cui una maggiore ampiezza di movimento si traduce in un tempo di rilassamento più lungo con influenze dall'attrito interno all'interno della catena proteica. L'aumento del tempo di rilassamento con una maggiore ampiezza di movimenti ma un attrito minore può essere descritto usando lo stesso processo di Ornstein-Uhlenbeck50,51 del moto browniano in un potenziale armonico. I moti interni con grandi ampiezze ma tempi di rilassamento lenti diventano attivi dopo la completa denaturazione di MBP dal suo stato nativo riducendo le forze di ripristino della configurazione della catena (potenziali diedri) e appianando le barriere energetiche locali. Descrizioni dettagliate delle dinamiche interne MBP nello stato nativo e denaturato sono ulteriormente disponibili nei riferimenti28,39. Nello studio di MBP, l'indagine che utilizza NSE ha rivelato un comportamento dinamico che punta verso la compattezza intermedia della proteina tra polimeri a bobina casuale e proteine globulari. Il contributo significativo della dinamica proteica interna con un tasso di rilassamento di diversi nanosecondi è stato governato da movimenti collettivi di stretching e flessione a bassa frequenza5. La descrizione della dinamica MBP nativa da modelli della scomposizione della teoria dei polimeri è stata fornita a causa di un grande valore di attrito interno della proteina. Nella MBP denaturata, l'attrito interno all'interno della catena proteica è ridotto e prevale il carattere della catena polimerica dello spettro di rilassamento. L'elevata flessibilità dei movimenti dell'insieme strutturale potrebbe aiutare ad aumentare la superficie proteica accessibile, facilitando così l'interazione con diversi partner leganti.

Modelli dinamici
Mentre nSE come tecnica è sperimentalmente unica nella valutazione dei moti armonici a bassa frequenza in macromolecole biologiche e subunità molecolari, l'analisi della funzione di scattering intermedio richiede un confronto con spettri di neutroni derivati da vari modelli matematici. Il modello qui presentato e sviluppato da Biehl et al.28 per soluzioni proteiche concentrate utilizza un'approssimazione di rete elastica, in cui la funzione di scattering intermedia è una convoluzione di funzioni modulari appropriate e gli oscillatori browniani rappresentano la dinamica interna. Questo è uno dei pochissimi modelli disponibili per analizzare la dinamica segmentale delle proteine. Un altro modello ben consolidato per le soluzioni proteiche diluite è il modello proposto da Bu et al.52, che è un modello robusto che utilizza la meccanica statistica e non richiede adattamenti complessi o parametri multipli. Un approccio simile basato sull'approssimazione dinamica del disaccoppiamento può essere applicato anche ai sistemi diluiti per caratterizzare la diffusione effettiva come somma dei moti autotraslazionali e interni53. Molti dei nostri riferimenti possono fornire report completi su questi modelli e sui loro limiti. Raccomandiamo vivamente Fitter et al.1 e Liu et al.54.

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Disclosures

L'autore non dichiara interessi finanziari concorrenti e nessun conflitto di interessi. Il contenuto del manoscritto si basa sulla lezione che l'autore ha presentato nella HANDS-Neutron Scattering Applications in Structural Biology School tra il 2019 e il 2021.

Acknowledgments

Questa ricerca ha utilizzato risorse presso la Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, laboratori di biologia e chimica), un ufficio DOE della Science User Facility gestito dall'Oak Ridge National Laboratory. Questa ricerca ha utilizzato anche risorse del reattore MLZ-FRM2 garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) e del JCNS1 presso Forschungszentrum Jülich GmbH, Germania. L'autore riconosce il Dr. Ralf Biehl e il Dr. Andreas Stadler per il loro aiuto con la modellazione e il loro contributo alla ricerca sulle proteine IgG e MBP, il Dr. Piotr A. Żołnierczuk per il supporto alla riduzione dei dati NSE, il Dr. Changwoo Do per il supporto con le misurazioni SANS e Rhonda Moody e il Dr. Kevin Weiss per il supporto del laboratorio di biochimica SNS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine MBP protein solution Sigma-Aldrich M1891 lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O - heavy water Sigma-Aldrich Product No. 151882 liquid
Dionized water in house - for washing / cleanning cells
DLS instrument Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich - dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standards SNS-NSE, ORNL - Al2O3  and Graphite powders
Ethanol Sigma-Aldrich 65350-M 70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solution Sigma-Aldrich I4506 lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrument JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - small angle neutron instrument
Liquinox dish detergent Alconox - Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2O Sigma-Aldrich Product No.S9390 disodium phosphate heptahydrate salt
NaCl Sigma-Aldrich Product No.S9888 sodium chloride salt
NaH2PO4·H2O Sigma-Aldrich Product No. S9638 monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific Catalog number: ND-2000 NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment camera NeutronOptics, Grenoble NOG210222 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M - wax parafilm Bemis Parafilm M - 5259-04LC PM996 all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE Spectrometer JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - neutron spectrometer
SasView https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument FZ-Jülich - small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranes Thermo Scientific 88400-88405 Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis Cluster Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometer ORNL, Oak Ridge, TN, USA - neutron spectrometer
Sterile syringe filters VWR N.A. PN:28145-501 0.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS) SP Scientific Part Number 100004055 sample environment equipment
Urea -d4 Sigma-Aldrich Product No. 176087 deuterated Urea salt
Viscometer FZ-Jülich - falling ball viscometer

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References

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Ingegneria Numero 182 Scattering neutronico spin-eco neutronica soluzione proteica dinamica lenta movimenti del dominio proteico flessibilità proteica
Studio della dinamica delle proteine <em>tramite</em> spettroscopia eco-spin neutronica
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Stingaciu, L. R. Study of Protein… More

Stingaciu, L. R. Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy. J. Vis. Exp. (182), e61862, doi:10.3791/61862 (2022).

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