Summary
本プロトコルは、ヒトの健康に重要な役割を果たす2つのモデルタンパク質の構造および動態を調査するための方法を記載する。この技術は、ベンチトップの生物物理学的特性評価と中性子スピンエコー分光法を組み合わせて、タンパク質のドメイン間運動に関連する時間と長さのスケールでのダイナミクスにアクセスします。
Abstract
ほとんどの人体タンパク質の活性および機能は、タンパク質結晶構造内のサブドメイン全体の構成変化に関連している。結晶構造は、タンパク質の構造またはダイナミクスを記述する計算の基礎を構築しますが、ほとんどの場合、強い幾何学的制限があります。しかしながら、結晶構造からこれらの制限は溶液中には存在しない。溶液中のタンパク質の構造は、ピコ上のループまたはサブドメインのナノ秒時間スケール(すなわち、内部タンパク質ダイナミクス時間レジーム)への再配列のために結晶と異なり得る。本研究は、中性子散乱を用いて数十ナノ秒の時間スケールのスローモーションにどのようにアクセスできるかを記述している。特に、明確に定義された二次構造を欠く本質的に無秩序なタンパク質と古典的な抗体タンパク質である2つの主要なヒトタンパク質の動的特性評価は、中性子スピンエコー分光法(NSE)と幅広い実験室特性評価方法を組み合わせることによって対処されます。タンパク質ドメインダイナミクスに関するさらなる洞察は、実験中性子データを記述し、拡散性タンパク質運動と内部タンパク質運動の組み合わせの間のクロスオーバーを決定するための数学的モデリングを使用して達成された。NSEから得られた中間散乱機能への内部動的寄与の抽出は、様々な動きの時間スケールを含む、単一のタンパク質の機械的特性および混雑したタンパク質溶液中のほぼ自然な環境におけるタンパク質の柔らかさへのさらなるビジョンを可能にする。
Introduction
中性子によるソフトマターのダイナミクスの探査
タンパク質とペプチドの動的特性を調べることは生物物理学的研究の主要な部分であり、今日では幅広いエネルギーランドスケープにアクセスするために多くのよく開発された方法が存在します1。実験的に明らかにされたタンパク質のダイナミクスを生物学的機能に関連付けることは、複雑な数学的モデルとコンピュータ支援ダイナミクスシミュレーションを必要とする、はるかに困難な作業です。タンパク質運動の解析のための中性子分光法の重要性は、いくつかのよく受け入れられ、広く認められている研究1,2,3,4,5で強調されている。内部タンパク質ダイナミクスの多様なエネルギーランドスケープを探索する前に、ソフトマターの動的プロセスと中性子がそれらにアクセスする方法の簡単な概要が必要です。
同位体配置に対する中性子の感度と、それらがソフトマターと示す相互作用の種類により、中性子散乱は最も汎用性の高い調査技術の1つとなっています6。中性子がアクセスできる相関長スケールと相関時間は、核励起や原子振動から、等方性回転や拡散運動のような集団運動やゆっくりとした緩和プロセスまで、幅広いスペクトルがあります。散乱中性子のエネルギー移動を調べる場合、3つの主要な相互作用を区別することができます:サンプル中の入射中性子と粒子との間にエネルギー交換がない弾性散乱。中性子と粒子の間の大規模で定量化可能なエネルギー交換を伴う非弾性散乱;入射中性子エネルギーと比較して非常に小さなエネルギー移動を示す準弾性散乱の特異なケース1,7。これらの相互作用は、調査された材料に関する正確な情報を提供し、多種多様な中性子散乱技術の理論的基礎を形成する。
弾性散乱では、検出器は中性子の方向を回折パターンとして記録し、試料原子の互いに対する位置を示す。原子位置の相関に関する情報(すなわち、構造情報のみに関連する運動量伝達Qに関する積分強度 S( Q))が取得される。この原理は中性子回折8の基礎をなす。
複雑さは、サンプル材料の励起と内部変動のためにエネルギー移動がゼロでなくなったときに発生します。これは中性子分光法の基礎を形成し、散乱中性子はエネルギー移動Eと運動量伝達Qの両方の関数として調査される。動的および構造的情報が得られる。中性子分光法は、エネルギー移動(すなわち、サンプル散乱による中性子の速度変化、S(Q,ω) = S(Q,E)の動的構造因子とも呼ばれる)について、同じ積分強度S(Q)を測定する9。
材料からの散乱を計算するには、ペア相関関数7,10を使用する方が適切です。回折の場合、静的対相関関数 G(r) は、別の粒子の中心から所定の距離 r にある粒子の中心を見つける確率を与えます。分光法は、静的ペア相関関数を一般化し、散乱方程式にエネルギー/周波数/時間を含めます。対相関関数 G(r) は時間 G(r, t) の関数となり、これは別個の原子対相関関数 GN(R, T) と自己相関関数 GS(R, T) に分解されることがある。これらは、コヒーレント散乱を支配する原子の対相関運動と、非コヒーレント散乱を支配する自己相関の2種類の相関を記述している10。
コヒーレント散乱は「平均」からの散乱であり、散乱波の相対的な位相に依存する。小角散乱レジームでは、異なる散乱中心(異なる原子)からの散乱中性子波が建設的に干渉し(同様の相を有する)、原子の集団運動が強い強度増強で観察される。コヒーレント散乱は、本質的に、試料10中の全ての原子核からの単一の中性子の散乱を記述する。
異なる中心からの散乱中性子波の間に建設的な干渉が起こらなければ、単一の原子が時間的に続き、時刻t=0の原子の位置と時刻tの同じ原子との間に自己相関が観察される。したがって、原子の相対位置に関する情報は失われ、焦点は局所的な揺らぎにのみ集中する。局所的な変動による散乱は、一貫性のない散乱を支配します。非コヒーレント散乱は等方性であり、バックグラウンド信号に寄与し、そして信号対雑音10,11を劣化させる。
上記のすべてを組み合わせて、我々は4つの主要な中性子散乱プロセス10を区別します:(1)弾性コヒーレント(原子位置の相関を測定する)、(2)非弾性コヒーレント(原子の集団運動を測定する)、(3)弾性非コヒーレント(背景に寄与し、デバイ・ウォラー係数(DWF)によって散乱強度を減少させ、弾性非コヒーレント構造因子(EISF)を測定し、閉じ込められた幾何学における拡散運動の幾何学を記述し、 (4)非弾性非コヒーレント(単一原子ダイナミクスと自己相関を測定する)。
中性子が生物学でアクセスできるダイナミクスプロセスは、低周波の原子および分子振動の減衰、溶媒分子と生体表面との相互作用、巨大分子の水和層および閉じ込められた幾何学における拡散プロセスから、短距離の並進、回転、転動拡散運動、タンパク質ドメインおよびアロステリック運動1.タンパク質ダイナミクスを測定するための中性子法および機器の多様性は、入射または出射中性子ビームの無色化がどのように達成されるか、および散乱中性子のエネルギー分析がどのように実行されるかに基づいている。3軸から飛行時間、後方散乱、スピンエコー分光計まで、1 x 10-14秒から1 x 10-6秒(フェムト秒からマイクロ秒)12の間の特徴的な時間で動的プロセスを探索することができます。
オークリッジ国立研究所は、2つの有名な中性子源、スパレーション中性子源(SNS13)と高同位体フラックスリアクターHFIR14を備え、生体材料のダイナミクスを調査するための最高の分光計スイートの1つを備えています。最も雄弁な例のいくつかは、溶液16中の緑色蛍光タンパク質の周りの水和水の動的摂動またはいくつかのタンパク質17のサブピコ秒の集団振動を調査するためにSNS15で冷中性子チョッパー分光計(CNCS)を使用することを含む。非弾性中性子散乱調査の繰り返しの問題は、いくつかの生物学的プロセスが観察するには遅すぎるということです。中性子強度の大幅な損失につながる極端なセットアップがなければ、飛行時間分光計は10μeVのエネルギー分解能に制限され、最大時間スケールは〜200ps10,11に対応します。これは、タンパク質の大規模な動きを観察するには不十分です。したがって、後方散乱分光計のようなより高いエネルギー分解能を持つ機器がしばしば必要とされます。飛行時間と後方散乱技術を組み合わせることで、ヒドロキシル化樟脳18を触媒する酵素であるシトクロムP450cam(CYP101)の内部ダイナミクスの変化を調べるのに強力であることが証明されています。
SNS-BASIS19 の後方散乱分光器で測定された微視的拡散度は驚くほど明確に定義されており、中性子散乱によって研究された最初の生きた動物であるプラナリア扁平虫の水の拡散性(水和、細胞質、バルク状の水)と細胞成分の拡散度に分離することができた20.後方散乱は高分解能分光技術ですが、数μeV = 数ナノ秒に制限されていますが、生体材料の遅いダイナミクスは、原子位置やスピン配向の相関の生存時間としても現れます(例えば、緩和プロセス、10〜数百ナノ秒の時間範囲で定期的に発生します)。
中性子スピンエコー分光法(NSE)は、このような高分解能に達する唯一の中性子散乱技術です。他の中性子技術とは異なり、NSEは中性子の量子力学的相(磁気モーメント)を使用するため、ビームの非クロマト化を必要としません。磁気モーメントの操作は、広い中性子ビーム波長分布の使用を可能にするが、この技術は、1 x 10-4のオーダーの非常に小さな中性子速度変化に敏感である。NSEは、多くのタンパク質の溶液中のタンパク質の遅いダイナミクスを調査するために首尾よく使用されてきました。これらの多くの先駆的研究の中で、我々はブタ免疫グロブリン21のセグメント的柔軟性の研究を認める。Taqポリメラーゼ22における結合ドメイン運動;ドメインは、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ23の四量体において運動する;基質結合時のホスホグリセリン酸キナーゼの立体構造の変化3;Na+/H+交換調節補因子1(NHERF1)タンパク質におけるドメイン運動の活性化およびアロステリックシグナルの動的伝播4,24,25;水銀イオン還元酵素26のコンパクトな状態のダイナミクス;赤血球27におけるヘモグロビンの拡散とを含む。タンパク質ダイナミクスにおけるさらに最近の2つの研究は、エントロピースプリング28としてのヒト抗体免疫グロブリンG(IgG)の柔軟性と、本質的に障害のあるミエリン塩基性タンパク質(MBP)5のダイナミクスに対する溶媒寄与の特徴を明らかにした5。
本稿では、NSEの基本原理、徹底的なタンパク質ダイナミクス調査に推奨される複数の準備方法、ならびにSNS、SNS-NSEのNSE分光計におけるNSEデータ取得の方法論と実験プロトコルについて説明します。このプロトコルは、通常のヒト抗体タンパク質であるIgGと、本質的に障害のあるタンパク質MBPの2つのタンパク質を特徴付けます。生物物理学的意味合い、例の研究の関連性、および技術の限界について簡単に説明します。
NSE分光法、低速ダイナミクス測定のための方法
NSEは、中性子の飛行時間を利用して、試料中の中性子と原子との準弾性相互作用によるエネルギーの交換(分極の損失)を測定する偏光技術です。NSE分光法の中核には、(1)中性子スピンが磁気強度
に比例した周波数、すなわちLarmor周波数29で磁場内で歳差運動する能力、および(b)一連の無線周波パルス30を印加するときの偏光信号の操作および再集束を表すスピンエコーまたはハンエコーの2つの基本原理がある。
NSEプロセスの基本は、図1を使用していくつかの簡単なステップ6,11にまとめることができます。(1)線源(位置1)で生成された中性子ビームは、偏光(位置2)、誘導、輸送(位置3)され、NSE分光器の入口に到着し、そこで最初のπ半フリッパー(位置4)によって90°回転する。(2)偏光ビーム(例えば、中性子磁気モーメント)は、第1磁石の磁力線(第1歳差運動帯、位置5)に対して垂直になり、歳差運動を開始する。(3)磁石の端部では、中性子スピンは磁場強度と内部で過ごした飛行時間(基本的に中性子速度に反比例)に比例した一定の歳差運動角度を蓄積する。個々の中性子速度は、最初の歳差運動ゾーンの最後にある歳差運動角度内で符号化される。(4)サンプル位置に近いパイフリッパー(位置6)はスピンの向きを180°反転させ、歳差運動角の符号を変化させます。(5)中性子は試料の分子(7位)と相互作用し、散乱する。(6)散乱中性子は、第2歳差運動帯(位置8)に入り、歳差運動を行うが、逆向きになる。(7)別のπハーフフリッパー(位置9)を使用して、スピンの向きを水平方向に垂直から回転させる。これにより歳差運動が停止し、歳差運動角度φがcos(φ)に比例した偏光に変換されます。(8)分析装置(10位)は、1つの向きに基づいて中性子を選択する。試料との相互作用が弾力性であれば、中性子の速度は変化しません。中性子は、第1および第2の歳差運動帯で同じ時間を飛行し、蓄積された歳差運動角は完全に回復する。完全な偏光は、元の偏光のエコー(すなわち、スピンエコー)として検出器(位置11)に復元される。(9)しかし、NSEでは散乱は準弾性であるため、中性子と試料分子との間の小さなエネルギー交換は、試料による散乱後の中性子速度が異なる。速度が異なるため、中性子は第2歳差運動帯を飛行するのにさらに時間を費やし、歳差運動角を適切に回復させません。検出器上で部分分極が取り出され、スピン緩和による分極の損失は、中間散乱関数F(Q,t)であるスペクトル関数S(Q,ω)のコスフーリエ変換に比例する。(10) 関数 F(Q, t) の時間パラメータは歳差運動磁場強度に比例する。磁場強度の関数として偏光の損失をスキャンすると、サンプル内の動的プロセスに依存する緩和関数が得られます。
図1:SNS(SNS-NSE)のNSE分光器と、最も重要な機能コンポーネントを含む中性子飛行経路の概略図の写真。 右から左へ:1=中性子源;2 = チョッパー - ベンダー - 偏光子 - 二次シャッターシステム;3 = ビーム輸送ガイド;4 = 最初の90°スピンターンのpi/2フリッパー。5 = 最初の歳差運動ゾーン;6 = 180°スピンターンのためのパイフリッパー。7 = サンプル面積とサンプル環境(ここでは、クライオ炉が示されています)。8 = 第2の歳差運動ゾーン;9 = 2 回目の 90° スピンターンの pi/2 フリッパー。10 = アナライザー;11 = 検出器。(3 の部分、および 2 と 1 の部分は、シールドの内側の青い壁の後ろにあり、チョッパーは原子炉ベースの NSE の速度セレクターに置き換えられています)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
本研究は、通常のヒト抗体タンパク質IgGと、本質的に障害のあるMBPの2つのタンパク質を特徴付ける。凍結乾燥形態のタンパク質は、市販の供給源から入手した( 材料表を参照のこと)。
1. タンパク質サンプル調製
- 各固体試薬を重水(D2O)に秤量して溶解することにより、50 mM リン酸ナトリウム+0.1 M NaCl緩衝液を調製する( 材料表参照)。これは、IgG の重水素化バッファー溶媒です。
- 緩衝液のpHを6.6に調整する。
- 各固体成分を重水(D2O)に秤量して溶解することにより、20mMリン酸ナトリウム+6M尿素緩衝液を調製する。これはMBPのための重水素化緩衝液溶媒である。
- 緩衝液のpHを4.7に調整する。
- 0.2 μm の孔径フィルターを使用してバッファー溶媒をろ過します ( 材料表を参照)。
- 精製タンパク質凍結乾燥粉末を、各タンパク質の重水素化溶媒(ステップ1.1.-1.2)に高タンパク質濃度(〜50mg/mL)で秤量して溶解する。
- タンパク質溶液を3.5K MWCOの透析膜を備えた透析バスケットにロードし、ろ過した緩衝液に対して、MBPの場合は10°C、IgGの場合は25°Cで24時間透析し( 材料表を参照)、チューブをわずかに振って拡散勾配を作成します。
- 透析バッファーを使用してタンパク質溶液を一連の濃度(1、2、5、10、および50 mg/mL)で希釈します。
- ナノドロップ分光光度計を使用して正確な濃度を決定します( 材料表を参照)。
2. 動的光散乱(DLS)による予備サンプル特性評価
- 上記で調製した濃度系列(ステップ1.6.)から各タンパク質溶液80μLをDLS使い捨てセル( 材料表を参照)にロードし、拡散係数を決定し、10回以上の取得を平均化します。
- タンパク質濃度の関数として並進拡散係数をプロットし、ゼロ濃度まで外挿します。
- 濃度系列の各タンパク質溶液を粘度計のキャピラリーチューブにロードし( 材料表を参照)、動的粘度を測定します。
- タンパク質濃度の関数として測定された動的粘度をプロットし、ゼロ濃度まで外挿します。
注:DLS拡散をゼロ濃度に外挿すると、1つのタンパク質の並進拡散の値が得られます。動的粘度をゼロ濃度に外挿すると、緩衝溶液について実験的に測定された動的粘度値が得られなければならない。
3. 小角散乱(中性子線またはX線)の収集
- 小角中性子散乱(SANS)および/または小角X線散乱(SAXS)( 材料表を参照)を4つのタンパク質濃度(好ましくは2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、および50mg/mL)で測定する。
- タンパク質濃度によってSANSおよびSAXSスペクトルを正規化する。
- アンサンブル最適化31および/またはSasView32ソフトウェアを使用して、タンパク質フォームファクターP(Q)をSANSおよびSAXSスペクトルに適合させます。
- 各濃度について、SANSおよびSAXSシグナルをP(Q)で除算することにより、構造係数S(Q、c)を計算します。
注:NSE測定のサポートとして小角散乱データを測定および解釈する方法に興味がある読者は、参考文献23,28,31,32,33を徹底的に参照することをお勧めします。
4. NSEの測定
- 実験用にセットアップし、以下の手順に従ってサンプルをマウントします。
- タンパク質溶液の濃度、測定に必要な温度、および利用可能な溶液の量に基づいて、サンプルを装填するセルの厚さを選択します。
注:本研究では、40 mm x 30 mm x 4 mmのトップローダー透明石英容器を使用しました。 - リン酸塩を含まない食器用洗剤( 材料表を参照)、脱イオン水、および70%エタノールを交互にセルを繰り返し洗浄します。
- 対流オーブンで細胞を乾燥させます;石英セルの場合は80°Cを超えないでください。
- 4 mLのタンパク質溶液を細胞に負荷し、キャップで閉じます。ワックスフィルムまたはシーラント( 材料表を参照)を使用して、サンプルセルを密封します。
注:本研究では、十分な散乱強度を得るために、〜50mg/mLの4.8mL溶液を使用した。 - 4 mLの透析バッファーをタンパク質サンプルと同じ容器にロードし、密封します。
- 試料をビームラインに搬送し、シャッターを閉じ、分光計エンクロージャー洞窟領域34に入る。
- ネジと保持プレートを締めて、サンプルセルをアルミ製サンプルホルダーに取り付けます(図2、左パネル)。
注:すべてのサンプルに同じ測定プロトコルが必要であるため、2つのサンプルセルを同時に取り付けることができます。 - グラファイトサンプルおよび/またはAl2O3粉末サンプルをタンパク質サンプルと同じ容器にロードします。これらは、SNS-NSEビームラインサポートが提供する規格です。
- サンプルホルダーを温度強制システムの缶に静かにスライドさせて置きます(TFS、 材料表を参照)。
メモ:TFSはSNS-NSEで最も使用されるサンプル環境であり、所望の温度を達成するために乾燥空気をサンプルキャニスターに送り込みます(図2、中央および右側のパネル)。 - TFSの蓋を閉じ、TFSのインタラクティブ画面にアクセスして温度を所望の値に設定します。
- 中性子カメラ( 材料表を参照)を取り付けて、サンプルをビームにアライメントします。
- 計器筐体を掃除し、避難させ、ドアを閉め、ビームシャッターを開きます。
注:サンプルセルは、SNS-NSEビームラインサポートによって提供されます。利用可能なサンプルセルおよびサンプル環境ライブラリについては、SNS-NSEビームラインのウェブページ7、35を参照してください。
- タンパク質溶液の濃度、測定に必要な温度、および利用可能な溶液の量に基づいて、サンプルを装填するセルの厚さを選択します。
- 以下の手順に従って NSE データを収集します。
- 中性子カメラと4つの独立したサンプル開口部を使用して、中性子ビーム内のサンプルを整列させます。
- SNS−NSEデータ収集ソフトウェア36 を開き、所望の散乱角度および波長について回折スキャンを実行してサンプル統計を収集する。
- 各サンプルについて収集された統計に基づいて、補助機器科学者が提供する測定マクロを編集して、測定パラメータを設定します。
- コマンド プロンプターでプロトコル名を入力してスキャンを開始し、サンプルのエコーを取得します。
- スキャンを開始し、弾性リファレンスとバッファリングされた溶媒のエコーも取得します。サンプル交換のために間欠的なビームシャッター操作を行います。
図2:NSE測定システム 左パネル:アルミニウム(Al)サンプルホルダーにネジとプレートで取り付けられた石英容器内のタンパク質溶液サンプル。Alサンプルホルダーは、サンプル環境内に同時に2つのサンプルを取り付けることができます。中央パネル:温度強制システム(TFS)サンプルは、中性子ビームウィンドウが右側にあるサンプルステージに取り付けることができ、アライメントに使用される中性子カメラは左側に見えます。右パネル:2つのサンプルを含むサンプルホルダーをサンプルに入れると、シリコン(Si)ウィンドウで作業できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
5. NSEデータ削減
注:SNS-NSEには、ORNL Neutron Sciences Remote Analysis Cluster、クイックユーザーガイド、および組み込みのヘルプサポートで利用可能なDrSpine(スピンエコーのデータ削減)37,38という名前の専用ソフトウェアが装備されています。
- ORNLユーザー認証情報で中性子科学リモート分析クラスター( 材料表を参照)にログインし、 セッション開始 ボタンを押します。
- 以下の手順に従って、データ削減ソフトウェアをセットアップします。
- ユーザーディレクトリで、ターミナルウィンドウを開き、source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.shと入力します。
- 次に、「drspine_create_env.sh」と入力し ます。
- ホームディレクトリにデータ削減用のフォルダを作成し、提供されたスクリプトとマクロを共有ディレクトリからコピーします。
- それに応じて提供された縮小マクロを編集、名前変更、および保存します。
- コマンド・プロンプターで drspine と入力し、 Enter キーを押してソフトウェア削減環境を開始します。
- ステップ5.4で編集した「縮小マクロの名前」と入力します。ソフトウェア環境内のコマンドプロンプターで、 Enter キーを押します。
6. NSEデータフィッティング
- 支援するインスツルメンツサイエンティストが提供するPythonスクリプト「stapler-drspine.py」を、縮小されたファイルデータの名前で編集します。
注: Python スクリプトは、この計測器のユーザが自由に利用できます。 - 提供されたライブラリから収まるように関数を編集します。
- 編集したスクリプトの名前をコマンドプロンプターで「stapler-drspine.py」と入力し、 Enter キーを押して、縮小された NSE データの読み取り、適合、およびプロットを行います。
注: 計測器サイエンティストは、削減マクロのテンプレートと、NSE 削減データを読み取り、適合できる "stapler-drspine.py" Python スクリプトを提供します。最終的に削減されたNSEデータはASCII形式であり、さまざまな優先ソフトウェアで読み取ることができます。
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Representative Results
ヒト血清およびウシMBPタンパク質由来のIgGタンパク質を、D2O塩基緩衝液中で高濃度(〜50mg/mL)で再構成した。タンパク質は高濃度に溶解していたので、得られた溶液はタンパク質溶液をこみこんだ。NSEを用いて調査されたダイナミクスは、タンパク質が存在する混雑した環境(構造因子相互作用および流体力学効果)に苦しんでいる5,28,39。DLSは、クラウディング効果を説明するために各タンパク質の濃度系列について実施した。DLSによって測定された並進拡散係数のゼロ濃度への外挿は、単一のタンパク質の並進拡散の値をもたらす。タンパク質濃度の関数としての動的粘度も、流体力学的相互作用を説明するためにNSEの前に測定されなければならない。濃度の関数としての動的粘度のゼロ濃度への外挿では、調製した各タンパク質試料の緩衝液について実験的に測定できる値を得る必要がある。
濃縮溶液中のタンパク質の形状と構造は、NSE実験の前に評価され、タンパク質フォームファクターと構造因子の強度に関する洞察を得ました。小角散乱は、これらの調査に選択された方法であった。本研究では、溶液中のIgGタンパク質の構造立体構造をSAXSにより観察し、MBPの構造をSANSにより評価した。測定された散乱強度(Q)(ステップ3.3.-3.4.)は、フォームファクタP(Q)と構造ファクタS(Q,c)の間の積に比例し、粒子数(式1)5,28,39:
I (Q) = N ∙ P (Q) ∙S (Q, c) (1)
SAXSは、IgGについて0.154nmのX線波長を有するクラッキー型SAXS装置40で測定され、中性子波長4.5ÅのMBPについてSANS41で測定された。実験的な小角強度I(Q)はバックグラウンドと溶媒を補正し、溶液濃度によってスケーリングし、フォームファクタはアンサンブルモデリングEOMやSasView24,25,29,39,42,43などの自由に利用可能なソフトウェアパッケージを使用して計算されました。また、各タンパク質の構成因子は、式1から求めた。
本研究のために、NSE実験は、2つのスピンエコー分光計(図1のSNS−NSE装置34およびフェニックス−J−NSE装置44)を用いて実施された。入射波長は8 Å - 12 Åで、フーリエ時間は0.1 nsから tmax≤ 130 nsで、0.05 Å−1 - 0.2 Å−1 の間のいくつかのQ測定で130 ns≤測定された。2つの分光器の違いはNSE科学の理解において重要なポイントであり、原子炉の静的中性子源のためのいわゆる「古典的なスピンエコー」の古い概念と、脈動する中性子源のための新しい「飛行時間の概念」の両方を表しています。フェニックス-J-NSE分光計は、速度セレクタが特定の波長を選択する古典的なタイプのNSEです。中性子速度の変動を可能にするために、±10%の波長帯域幅が導入される。1回のスキャンに使用されるエネルギーバンドは非常に狭いにもかかわらず、高フラックスリアクター源のPhoenix-J-NSE分光計の状況により、空間ベクトルと相関時間範囲が比較的短い測定時間でカバーされます。SNS-NSE分光計は、新世代の超高解像度チョッパー中性子分光計で、分光器の位置に応じて、波長スパンが2 Å < λ < 14 Å、同時波長帯域幅が2.4 Å ~ 3.6 Åです。この広い帯域幅により、高いデータ収集効率が達成され、散乱角度の設定がほとんどなく、広い波ベクトル時間範囲をほぼギャップレスにカバーできます。SNS-NSEにおける波長帯域の選択は、4つのチョッパからなるチョッパシステムによって行われる。ここで説明するNSE分光器はいずれも、磁場の均質性が高い超伝導技術に基づく歳差運動場、漂遊場補正のための新しい最先端の磁場補正素子、および新しい偏光ベンダー41,42を持っています。
NSEスペクトルをMBPタンパク質については10°C、IgG1タンパク質については25°Cで測定した。NSEによって測定されたコヒーレント中間散乱強度I(Q,t)/I(Q,t = 0)は、調査された時間スケール内で起こるサンプル中のすべての動的プロセスの寄与結果である。これには、タンパク質内部ダイナミクス、全体的な並進拡散、回転拡散およびタンブリング拡散、およびタンパク質分子自体内のセグメント運動が含まれます。単純化されたモデルは、内部ダイナミクスと並進拡散と回転拡散が完全に分離された5,45,46,47,48であり、別々に特徴付けることができると仮定します。単一粒子の場合、コヒーレント散乱関数は積(式2)23,48として書くことができます。
F (Q, t) = Ftrans(Q, t) ∙F rot(Q, t) ∙Fint(Q, t) (2)
ここで、単一の剛体タンパク質の並進拡散項は、並進拡散係数DT(式3)23,48の指数関数である。
Ftrans(Q, t) = exp(−Q2∙ DT∙ t) (3)
高濃度のタンパク質の場合、翻訳拡散係数DTは、構造因子S(Q)および流体力学的関数HT(Q)によって記述される流体力学的相互作用によって定量されるタンパク質間相互作用によって影響される(式4)23,48:
D T(Q) = DT0 ∙HT(Q, c) / S(Q, c) (4)
式4において、DT0は、DLS測定値からゼロ濃度までの外挿拡散値である(ステップ2.HTは、HT = 1 -c∙ [η]として計算され、ここで、cはタンパク質濃度、[η]は[η]=(η - η 0)/η 0∙ c、η 0は測定された動粘度(ステップ2.3.-2.4.)で計算される固有粘度である。 構成因子S(Q,c)は、IgGタンパク質のSAXS測定およびMBPタンパク質のSANS測定から得られた。
図3は、IgGおよびMBPタンパク質についてNSEによって測定された中間 散乱関数I(Q,t)/ I(Q,t=0)の例を示す。短いフーリエ時間スケール<25nsで単純な拡散様緩和プロセスからの明確な偏差が観察され、NSEによるタンパク質内部ダイナミクスのアクセシビリティと、観察された動的プロセスを記述するためのより複雑なモデルの必要性を示した。
図3:IgGおよびMBPタンパク質のNSE緩和スペクトル。 ここでは、IgG データを単一指数関数だけで適合させて、より短いフーリエ時間での拡散からの偏差を明らかにしています。この偏差は、両方のタンパク質について観察された。対照的に、MBPデータは、Biehl45によって開発されたモデルによって適合された完全な緩和範囲でここに示されています。このモデルは、粒度の粗さを意味し、短い、中間の、長いフーリエ時間レジームの同時適合を可能にします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
したがって、散乱関数は、参考文献18、25、38、43、44、46に記載されているBiehlによって開発されたモデルを用いた両方のタンパク質の原子モデリングによって適合された。中間散乱関数は、計算負荷と時間を減らすために、全原子シミュレーションとは対照的に、数百個の個々の粒子に粗粒化することによって計算され、MMTK49ソフトウェアライブラリ(自由にアクセスできる)を使用して原子座標にアクセスし、タンパク質ドメインおよびフラグメントのトランス回転運動を実装した。両タンパク質の中間散乱関数計算の結果は、実験NSEデータと非常によく一致しており、長いフーリエ時間で観察される遅いダイナミクスは全体的な並進および回転拡散プロセスに起因する可能性があるが、短い時間スケールで観察される速いダイナミクスはタンパク質ドメインのダイナミクスに起因する可能性があることを証明した。
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Discussion
NSE分光法は、他の分光技術では生成できないタンパク質のダイナミクスのユニークで詳細なビューを提供します。長時間スケールでの測定は、ここに提示されているように、タンパク質の翻訳拡散と回転拡散の両方の観察を提供する。セグメントダイナミクスやその他の内部振動は、短時間スケールでコヒーレント散乱関数 S(Q, t)の強い減衰として現れ、全体的な拡散緩和プロセスから十分に分離されています。NSE技術の主な限界は、測定時間の延長と、良好な統計信号を取得するために必要な大量のサンプルです。これは、低濃度の移動種および寿命の短縮を示す関連する高分子系の測定に課題をもたらす可能性がある。
IgG の内部ダイナミクス
IgGタンパク質は、抗体に特異的なY字型構造を有し、柔軟なリンカーによって連結された3つの大きな断片によって近似することができる。このような構造について、調和ポテンシャルに存在する3つの大きな粒子の数学的モデルが仮定された。リンカーは、固定平衡位置を与えるがブラウン運動の一形態としての揺らぎを可能にする弾性ばねによって近似された。相対平衡28の周りの各断片について3つの自由度が許された。式2のFint(Q,t)で表される内部ダイナミクスは、オーンシュタイン・ユーレンベック過程50,51によって記述された。このモデルでは、潜在的なディップにおけるフラグメントの平均二乗変位、さまざまな動きのタイムスケール、摩擦、および発生する力定数を計算できます。内部運動の振幅は、各断片の異なる運動度を考慮して、通常モード解析によって近似された。モデルと結果として生じる数学的パラメータの広範な説明はここでは範囲外ですが、参考文献28で詳細に見つけることができます。IgGのこのケーススタディでは、内部ダイナミクスの明確なシグネチャが数ナノ秒のタイムスケールで観察されました。計算されたリンカーのばね定数は、現実的には、同様の長さのエントロピーばねに匹敵するように見える。観察された有効摩擦は、自由で結合していないIgG断片の摩擦に近いように思われる。既存の平衡仮説を検証し、異なる結合部位および結合特異性を示す平衡状態にあるIgGの「オープン」または「クローズド」配置が共存すると仮定した28。この情報は、抗体のメカニズムを理解し、その機械的挙動が生体適合性およびバイオアベイラビリティを改善するために使用できるかどうかを理解するのに関連している可能性がある。
MBP の内部ダイナミクス
MBP構造は、その柔軟なランダムコイルエンドで強力な伸張および曲げ運動を可能にするコンパクトな球状コアを有する。MBPダイナミクスは、内部摩擦28,39の付加の有無にかかわらず、柔軟なポリマーモデルを用いて解釈された。IgGの場合と同様に、MBPの内部ダイナミクスの観測はブラウン運動の理論内で調整することができ、運動の振幅が大きいほど、タンパク質鎖内の内部摩擦の影響で緩和時間が長くなります。運動の振幅は大きいが摩擦は小さくて緩和時間の増加は、同じオーンシュタイン・ウーレンベック法50,51のブラウン運動を高調波ポテンシャルで使用して記述することができる。振幅は大きいが緩和時間が遅い内部運動は、MBPが本来の状態から完全に変性すると、連鎖構成(二面体ポテンシャル)の復元力を低減し、局所的なエネルギー障壁を平滑化することによってアクティブになります。ネイティブおよび変性状態におけるMBP内部ダイナミクスの詳細な説明は、参考文献28、39にさらに見出すことができる。MBPの研究では、NSEを用いた調査により、ランダムコイルポリマーと球状タンパク質との間のタンパク質の中間コンパクト性を示す動的挙動が明らかになった。数ナノ秒の緩和速度を有する内部タンパク質ダイナミクスの有意な寄与は、低周波の集団伸張および曲げ運動によって支配された5。ポリマー理論の分解からのモデルによる天然MBPダイナミクスの記述は、タンパク質内部摩擦の大きな値のために提供された。変性MBPでは、タンパク質鎖内の内部摩擦が低減され、緩和スペクトルのポリマー鎖特性が優勢である。構造アンサンブル運動の高い柔軟性は、アクセス可能なタンパク質表面を増加させるのに役立ち、それによって異なる結合パートナーとの相互作用を容易にする可能性がある。
動的モデル
NSEは、生体高分子や分子サブユニットの低周波高調波運動を評価するという点で実験的にもユニークですが、中間散乱関数の解析には、さまざまな数学的モデルから導出された中性子スペクトルとの比較が必要です。ここで提示し、Biehl et al.28 によって開発された濃縮タンパク質溶液のモデルは、中間散乱関数が適切なモジュラー関数の畳み込みであり、ブラウン発振器が内部ダイナミクスを表す弾性ネットワーク近似を使用する。これは、タンパク質のセグメントダイナミクスを分析するための非常に数少ない利用可能なモデルの1つです。希薄タンパク質溶液のもう1つの十分に確立されたモデルは、Bu et al.52によって提案されたモデルであり、これは統計力学を使用し、複雑な適合または複数のパラメータを必要としない堅牢なモデルである。動的デカップリング近似に基づく同様のアプローチを、自己並進運動および内部運動53の和として有効な拡散を特徴付けるために、希薄化システムにも適用することができる。私たちの参考文献のいくつかは、これらのモデルとその限界に関する包括的なレポートを提供することができます。Fitter et al.1 および Liu et al.54 を強くお勧めします。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益および利益相反を宣言しません。原稿の内容は、著者が2019年から2021年の間に構造生物学学校におけるHANDS-Neutron散乱応用で発表した講義に基づいています。
Acknowledgments
この研究は、オークリッジ国立研究所が運営する科学ユーザー施設のDOEオフィスであるSpallation Neutron Source(BL-15、BL-6、生物学および化学研究所)のリソースを使用しました。この研究はまた、MLZ-FRM2原子炉ガルヒング(KWS-2、フェニックス-J-NSE)とドイツのフォルシュングツェントルム・ユーリッヒGmbHのJCNS1の資源も使用した。著者は、モデリングの支援とIgGとMBPタンパク質研究の両方への貢献についてRalf Biehl博士とAndreas Stadler博士、NSEデータ削減サポートにPiotr A. Żołnierczuk博士、SANS測定のサポートにChangwoo Do博士、SNS生化学ラボサポートでロンダ・ムーディ博士とケビン・ワイス博士に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine MBP protein solution | Sigma-Aldrich | M1891 | lyophilized powder reconstituted in D2O |
| D2O - heavy water | Sigma-Aldrich | Product No. 151882 | liquid |
| Dionized water | in house | - | for washing / cleanning cells |
| DLS instrument | Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich | - | dynamic light scattering instrument |
| Elastic scattering standards | SNS-NSE, ORNL | - | Al2O3 and Graphite powders |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 65350-M | 70% ethanol for cleaning cells |
| IgG protein solution | Sigma-Aldrich | I4506 | lyophilized powder reconstituted in D2O |
| KWS-2 instrument | JCNS outstation at the MLZ, Garching, Germany | - | small angle neutron instrument |
| Liquinox dish detergent | Alconox | - | Phosphate-free liquid lab glassware cleaner |
| Na2HPO4·7H2O | Sigma-Aldrich | Product No.S9390 | disodium phosphate heptahydrate salt |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Product No.S9888 | sodium chloride salt |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | Product No. S9638 | monosodium phosphate monohydrate salt |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Catalog number: ND-2000 | NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer |
| Neutron alignment camera | NeutronOptics, Grenoble | NOG210222 | 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor |
| Parafilm M - wax parafilm | Bemis | Parafilm M - 5259-04LC PM996 | all-purpose laboratory film in cardboard dispenser |
| Phoenix-J-NSE Spectrometer | JCNS outstation at the MLZ, Garching, Germany | - | neutron spectrometer |
| SasView | https://www.sasview.org/ | ||
| SAXSpace, Anton Paar instrument | FZ-Jülich | - | small angle x-ray instrument |
| Slide-A-Lyzer dialysis membranes | Thermo Scientific | 88400-88405 | Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO |
| SNS Remote Analysis Cluster | Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) | https://analysis.sns.gov | |
| SNS-NSE spectrometer | ORNL, Oak Ridge, TN, USA | - | neutron spectrometer |
| Sterile syringe filters | VWR | N.A. PN:28145-501 | 0.2 µm pore size filters |
| Temperature Forcing System (TFS) | SP Scientific | Part Number 100004055 | sample environment equipment |
| Urea -d4 | Sigma-Aldrich | Product No. 176087 | deuterated Urea salt |
| Viscometer | FZ-Jülich | - | falling ball viscometer |
References
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