Summary
본 프로토콜은 인간 건강에 중요한 역할을 하는 두 모델 단백질의 구조 및 역학을 조사하는 방법을 기술한다. 이 기술은 벤치 탑 생물 물리학 적 특성화와 중성자 스핀 에코 분광법을 결합하여 단백질 간 운동과 관련된 시간 및 길이 스케일의 역학에 액세스합니다.
Abstract
대부분의 인체 단백질의 활성 및 기능은 단백질 결정 구조 내에서 전체 하위 도메인의 구성 변화와 관련이 있습니다. 결정 구조는 단백질의 구조 또는 역학을 설명하는 모든 계산의 기초를 구축하며, 대부분의 경우 강력한 기하학적 제한이 있습니다. 그러나, 결정 구조로부터의 이러한 제한은 용액 내에 존재하지 않는다. 용액 중의 단백질의 구조는 피코 상의 루프 또는 서브도메인의 재배열로 인해 나노초 시간 스케일(즉, 내부 단백질 동역학 시간 체제)으로 인해 결정과 다를 수 있다. 본 연구는 중성자 산란을 사용하여 수십 나노초의 시간 척도에서 슬로우 모션에 어떻게 접근할 수 있는지를 설명한다. 특히, 잘 정의된 이차 구조와 고전적인 항체 단백질이 결여된 본질적으로 무질서한 단백질인 두 가지 주요 인간 단백질의 동적 특성화는 광범위한 실험실 특성화 방법과 결합된 중성자 스핀 에코 분광법(NSE)에 의해 해결됩니다. 단백질 도메인 역학에 대한 추가 통찰력은 실험 중성자 데이터를 설명하고 결합 된 확산 및 내부 단백질 운동 사이의 교차를 결정하기 위해 수학적 모델링을 사용하여 달성되었습니다. 다양한 움직임의 시간 척도를 포함하여 NSE로부터 얻은 중간 산란 기능에 대한 내부 동적 기여의 추출은 혼잡 한 단백질 용액에서 거의 자연 환경에서 단일 단백질의 기계적 특성과 단백질의 부드러움에 대한 추가 비전을 허용합니다.
Introduction
중성자를 이용한 연질 물질의 역학 조사
단백질과 펩티드의 동적 특성을 조사하는 것은 생물 물리학 연구의 주요 부분이며, 오늘날 광범위한 에너지 환경에 접근하기 위해 많은 잘 발달 된 방법이 존재합니다1. 실험적으로 밝혀진 단백질의 역학을 생물학적 기능과 관련시키는 것은 훨씬 더 어려운 작업이며, 복잡한 수학적 모델과 컴퓨터 지원 역학 시뮬레이션이 필요합니다. 단백질 운동의 분석을위한 중성자 분광법의 중요성은 널리 받아 들여지고 널리 인정 된 여러 연구에서 강조되었습니다 1,2,3,4,5. 내부 단백질 역학의 다양한 에너지 풍경을 탐구하기 전에, 연질 물질의 동적 과정에 대한 간략한 개요와 중성자가 어떻게 접근 할 수 있는지에 대한 간략한 개요가 필요합니다.
동위원소 구성에 대한 중성자의 민감도와 연질물질과의 상호 작용 유형은 중성자 산란을 가장 다양한 조사 기술 중 하나로 만듭니다6. 핵 여기 및 원자 진동에서부터 등방성 회전 및 확산 운동과 같은 느린 이완 과정에 이르기까지 중성자가 접근 할 수있는 상관 길이 척도와 상관 시간의 광범위한 스펙트럼이 있습니다. 흩어져있는 중성자를 에너지 전달을 조사 할 때, 세 가지 주요 상호 작용을 구별 할 수 있습니다 : 샘플에서 들어오는 중성자와 입자 사이에 에너지 교환이없는 탄성 산란; 중성자와 입자 사이의 크고 정량화 가능한 에너지 교환을 갖는 비탄성 산란; 및 입사 중성자 에너지 1,7에 비해 매우 작은 에너지 전달을 지정하는 준탄성 산란의 특이한 경우이다. 이러한 상호 작용은 조사 된 물질에 대한 정확한 정보를 제공하고 다양한 중성자 산란 기술의 이론적 기초를 형성합니다.
탄성 산란에서, 검출기는 중성자의 방향을 회절 패턴으로 기록하며, 이는 서로 상대적인 샘플 원자의 위치를 보여줍니다. 원자 위치의 상관 관계에 대한 정보가 획득됩니다 (즉, 구조 정보에만 관련된 운동량 전달 Q에 관한 통합 강도 S ( Q). 이 원리는 중성자 회절8의 기초를 형성한다.
복잡성은 샘플 재료의 여기 및 내부 변동으로 인해 에너지 전달이 더 이상 제로가 아닐 때 발생합니다. 이것은 중성자 분광법의 기초를 형성하며, 여기서 산란 중성자는 에너지 전달 E와 운동량 전달 Q의 함수로 조사됩니다. 동적 및 구조적 정보가 얻어집니다. 중성자 분광법은 에너지 전달을 위해 동일한 통합 강도 S(Q)를 측정합니다(즉, 샘플 산란으로 인한 중성자의 속도 변화, S(Q,ω) = S(Q, E), 이는 동적 구조 인자라고도 함)9.
재료로부터 산란을 계산하기 위해, 쌍 상관 함수 7,10을 사용하는 것이 더 적절하다. 회절의 경우, 정적 쌍 상관 함수 G(r)는 다른 입자의 중심으로부터 주어진 거리 r에서 입자의 중심을 찾을 확률을 제공합니다. 분광법은 정적 쌍 상관 함수를 일반화하고 산란 방정식에 에너지/주파수/시간을 포함합니다. 쌍 상관 함수 G(r)는 시간 G(r, t)의 함수가 되며, 이는 별개의 원자 쌍 상관 함수 GD(r, t) 및 자기 상관 함수 GS(r, t)로 분해될 수 있다. 이들은 두 가지 유형의 상관 관계를 설명합니다 : 일관된 산란을 지배하는 원자의 쌍 상관 운동과 일관성없는 산란10을 지배하는 자기 상관 관계.
일관된 산란은 "평균"으로부터의 산란이며 산란파의 상대적 위상에 달려 있습니다. 소각 산란 체제에서는 서로 다른 산란 중심 (다른 원자)에서 산란 된 중성자파가 건설적으로 간섭하고 (유사한 위상을 가짐) 원자의 집단 운동이 강한 강도 향상으로 관찰됩니다. 코히어런트 산란은 본질적으로 샘플10 내의 모든 핵으로부터 단일 중성자의 산란을 기술한다.
서로 다른 중심으로부터 산란된 중성자파 사이에 건설적인 간섭이 발생하지 않을 때, 단일 원자가 시간에 뒤따르고, 시간 t=0에서의 원자의 위치와 시간 t에서의 동일한 원자 사이의 자기-상관관계가 관찰된다. 따라서 원자의 상대적 위치에 대한 정보는 손실되고 초점은 국부적 인 변동에만 있습니다. 국소 변동으로 인한 산란은 일관성없는 산란을 지배합니다. 비일관성 산란은 등방성이며, 배경 신호에 기여하며, 신호 대 잡음(10,11)을 저하시킨다.
위의 모든 것을 결합하여 우리는 네 가지 주요 중성자 산란 과정을 구별합니다10 : (1) 탄성 일관성 (원자 위치의 상관 관계 측정), (2) 비탄성 일관성 (원자의 집단 운동 측정), (3) 탄성 불일치 (배경에 기여, Debye-Waller 요인 (DWF)에 의한 산란 강도 감소 및 탄성 불일치 구조 인자 (EISF)를 측정하여 제한된 기하학에서 확산 운동의 기하학을 설명하고, (4) 비탄성 일관성 (단일 원자 역학 및 자기 상관 관계 측정).
중성자가 생물학에서 접근할 수 있는 역학 과정은 저주파 원자 및 분자 진동의 감쇠, 용매 분자와 생체 표면의 상호작용, 거대분자와 제한된 기하학의 수화층에서의 확산 과정, 단거리 번역, 회전 및 텀블링 확산 운동, 단백질 도메인 및 알로스테릭 동작에 이르기까지 다양합니다1 . 단백질 역학을 측정하기위한 중성자 방법 및 장비의 광범위한 다양성은 입사 또는 나가는 중성자 빔의 무분화가 어떻게 달성되고 산란 된 중성자의 에너지 분석이 어떻게 수행되는지에 기반을두고 있습니다. 삼중 축에서 비행 시간, 후방 산란 및 스핀 에코 분광계에 이르기까지 1 x 10-14 초와 1 x 10-6 초 (펨토 초 ~ 마이크로 초)12 사이의 특성 시간으로 동적 프로세스를 탐색 할 수 있습니다.
오크 리지 국립 연구소는 두 개의 유명한 중성자 공급원 인 Spallation Neutron Source - SNS13 및 High Isotope Flux Reactor - HFIR14와 함께 바이오 재료의 역학을 조사하기위한 분광계의 최고의 스위트 룸 중 하나입니다. 가장 웅변적인 예들 중 일부는 용액16에서 녹색 형광 단백질 주위의 수화수의 동적 섭동 또는 몇몇 단백질(17)의 서브피코초 집단 진동을 조사하기 위해 SNS15에서 차가운 중성자 초퍼 분광계(CNCS)의 사용을 포함한다. 비탄성 중성자 산란 조사의 반복되는 문제는 일부 생물학적 과정이 관찰되기에는 너무 느리다는 것입니다. 중성자 강도의 엄청난 손실을 초래하는 극단적인 설정이 없다면, 비행 시간 분광계는 ~200ps 10,11의 최대 시간 스케일에 해당하는 10μeV 에너지 분해능으로 제한됩니다. 이것은 단백질의 대규모 움직임을 관찰하기에 충분하지 않습니다. 따라서 후방 산란 분광계와 같이 더 높은 에너지 분해능을 가진 장비가 종종 필요합니다. 비행 시간 및 후방 산란 기술을 결합하는 것은 히드록실 화 캄포어18을 촉매하는 효소인 시토크롬 P450cam(CYP101)의 내부 역학의 변화를 조사하는 데 강력한 것으로 입증되었습니다.
SNS-BASIS19 에서 후방 산란 분광계에 의해 측정된 현미경 확산도는 놀랍게도 잘 정의되었고, 물의 확산성(수화, 세포질 및 벌크 유사물)과 중성자 산란에 의해 연구된 최초의 살아있는 동물인 평면 편평충에서의 세포 구성성분의 확산성으로 분리될 수 있었다20 . 후방 산란은 고분해능 분광 기술이지만 수 μeV = 수 나노초로 제한되는 반면, 생체 재료의 느린 역학은 원자 위치 또는 스핀 배향 사이의 상관 관계의 생존 시간으로 나타납니다 (예 : 열 나노 초에서 수백 나노 초의 시간 범위에서 정기적으로 발생하는 이완 과정).
중성자 스핀 에코 분광법 (NSE)은 이러한 고해상도에 도달하는 유일한 중성자 산란 기술입니다. 다른 중성자 기술과는 달리, NSE는 자기 모멘트인 중성자의 양자 기계적 위상을 사용하기 때문에 빔의 무채색화를 필요로 하지 않습니다. 자기 모멘트의 조작은 광범위한 중성자 빔 파장 분포의 사용을 허용하는 반면, 기술은 1 x 10-4의 순서로 매우 작은 중성자 속도 변화에 민감합니다. NSE는 많은 단백질에 대한 용액에서 단백질의 느린 역학을 조사하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 많은 선구자 연구 중에서, 우리는 돼지 면역 글로불린21의 세그먼트 유연성에 대한 연구를 인정합니다. Taq 중합효소22에서 결합된 도메인 운동; 효모 알콜 탈수소효소23의 사량체에서의 도메인 운동; 기질 결합시 포스포글리세레이트 키나아제에서의 입체 형태 변화3; 도메인 운동의 활성화 및 Na+/H+ 교환 조절 보조인자 1 (NHERF1) 단백질 4,24,25에서의 알로스테릭 신호의 동적 전파; 수은 이온 환원효소26의 콤팩트한 상태의 역학; 적혈구에서 헤모글로빈의 확산27. 단백질 역학에 대한 최근의 두 가지 연구는 엔트로픽 스프링28로서의 인간 항체 면역 글로불린 G (IgG)의 유연성과 본질적으로 무질서한 미엘린 기본 단백질 (MBP)5의 역학에 기여하는 용매의 특성을 드러냈다.
본 기사에서는 NSE의 기본 원칙, 철저한 단백질 역학 조사에 권장되는 여러 가지 준비 방법, SNS, SNS-NSE의 NSE 분광계에서 NSE 데이터 수집을위한 방법론 및 실험 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 두 가지 단백질을 특징으로합니다 : IgG, 일반 인간 항체 단백질 및 본질적으로 무질서한 단백질 MBP. 생물 물리학 적 함의, 실시예의 연구 관련성 및 기술의 한계가 간략하게 논의됩니다.
NSE 분광법, 느린 역학 측정을위한 방법
NSE는 중성자 비행 시간을 사용하여 샘플에서 중성자와 원자 간의 준 탄성 상호 작용으로 인한 에너지 교환 (분극 손실)을 측정하는 편광 기술입니다. NSE 분광법의 핵심에는 두 가지 기본 원칙이 있습니다 : (1) 중성자 스핀이 자기 강도
에 비례하는 주파수, 즉 Larmor 주파수 (29)를 가진 자기장에서 세차하는 능력, (b) 일련의 고주파 펄스 (30)를 적용 할 때 편광 신호의 조작 및 재초점을 나타내는 스핀 에코 또는 한 에코.
NSE 프로세스의 기본 사항은 그림 1을 사용하여 몇 가지 간단한 단계 6,11로 요약할 수 있습니다. (1) 소스(위치 1)에 의해 생성된 중성자 빔은 편광되고(위치 2), 안내되고, 운반되고(위치 3), NSE 분광계의 입구에 도착하며, 여기서 첫 번째 파이-하프 플리퍼(위치 4)에 의해 90° 회전한다. (2) 편광 빔 (예를 들어, 중성자 자기 모멘트)은 첫 번째 자석의 자기장 라인 (첫 번째 세차 영역, 위치 5)에 수직이되어 세차하기 시작합니다. (3) 자석의 끝에서, 중성자 스핀은 자기장 강도와 내부에서 소비되는 비행 시간에 비례하는 특정 세차각을 축적한다(기본적으로 중성자 속도에 반비례한다). 개별 중성자 속도는 첫 번째 세차전 구역의 끝에서 세차각 각도 내에서 인코딩됩니다. (4) 샘플 위치에 가까우면 파이 플리퍼 (위치 6)는 스핀의 방향을 180 ° 반전시켜 세차 각도의 부호를 변경합니다. (5) 중성자는 샘플의 분자(위치 7)와 상호작용하여 산란된다. (6) 흩어져있는 중성자는 두 번째 세차 구역 (위치 8)에 들어가고 세차하지만 역방향이된다. (7) 또 다른 파이 하프 플리퍼 (위치 9)는 스핀의 방향을 수직에서 수평 방향으로 회전시키는 데 사용됩니다. 이것은 세차운동을 멈추게 할 것이고, 세차전 각도 φ을 cos(φ)에 비례하는 편광으로 변환시킬 것이다. (8) 분석기(위치 10)는 하나의 배향에 기초하여 중성자를 선택한다. 샘플과의 상호 작용이 탄력적이면 중성자의 속도는 변하지 않습니다. 중성자는 첫 번째와 두 번째 세차 구역에서 동일한 시간을 비행하며 누적 된 세차 각도가 완전히 회복됩니다. 전체 편광은 검출기(위치 11) 상에서 원래의 편광(즉, 스핀-에코)의 에코로서 복원된다. (9) 그러나 NSE에서는 산란이 준 탄성이므로 중성자와 샘플 분자 간의 작은 에너지 교환은 샘플에 의한 산란 후 다른 중성자 속도로 이어집니다. 속도가 다르기 때문에 중성자는 두 번째 세차 구역을 통해 비행하는 데 추가 시간을 보내고 세차 각도를 제대로 회복하지 못합니다. 부분 분극이 검출기 상에서 검색되고, 스핀 이완으로 인한 편광의 손실은 스펙트럼 함수 S(Q, ω), 중간 산란 함수 F(Q, t)의 cos-Fourier-변환에 비례한다. (10) 함수 F(Q, t)의 시간 파라미터는 세차전 자기장 강도에 비례한다. 자기장 강도의 함수로서 분극의 손실을 주사하는 것은 샘플 내의 동적 과정에 의존하는 이완 기능을 산출한다.
그림 1: SNS(SNS-NSE)에서의 NSE 분광계와 가장 중요한 기능성 성분을 사용한 중성자 비행 경로 회로도의 사진. 오른쪽에서 왼쪽으로: 1 = 중성자 소스; 2 = 초퍼-벤더-편광판-2차 셔터 시스템; 3 = 빔 수송 가이드; 4 = 처음 90° 스핀 턴에 대한 pi/2 플리퍼; 5 = 첫 번째 세차운동장; 6 = 180° 스핀 턴을 위한 파이 플리퍼; 7 = 샘플 영역 및 샘플 환경(여기서, 냉동로가 도시됨); 8 = 두 번째 세차 구역; 9 = 두 번째 90° 스핀 턴에 대한 pi/2 플리퍼; 10 = 분석기; 11 = 검출기. (3과 2와 1의 일부는 차폐 내부의 파란색 벽 뒤에 위치하며, 초퍼는 원자로 기반 NSE의 속도 선택기로 대체됩니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
본 연구는 두 가지 단백질을 특성화합니다 : 일반 인간 항체 단백질 IgG와 본질적으로 무질서한 MBP. 단백질의 동결건조된 형태는 상업적 공급원으로부터 수득되었다 ( 물질의 표 참조).
1. 단백질 시료 준비
- 각각의 고체 시약을 중수 (D2O)에 칭량하고 용해시켜 50 mM 인산나트륨 + 0.1 M NaCl 완충액을 제조하였다 ( 물질의 표 참조). 이것은 IgG에 대한 중수소화된 완충 용매이다.
- 완충용액의 pH를 6.6으로 조정한다.
- 각각의 고체 성분을 중수 (D2O)에 칭량하고 용해시켜20mM 인산나트륨 + 6 M 우레아 완충액을 제조하였다. 이것은 MBP에 대한 중수소화 된 완충 용매입니다.
- 완충용액의 pH를 4.7로 조정한다.
- 0.2 μm 기공 크기 필터를 사용하여 완충 용매 를 여과한다(표 참조).
- 정제된 단백질 동결건조된 분말을 각각의 단백질에 대한 중수소화된 용매에 계량하고 용해시킨다(단계 1.1.-1.2). 높은 단백질 농도(~50 mg/mL)에서.
- 단백질 용액을 3.5 K MWCO의 투석 막으로 투석 바스켓에 로딩하고, IgG에 대해 MBP 및 25°C에서 24°C에서 24시간 동안 여과된 완충액에 대해 투석하고(표 표 참조) 튜브를 약간 흔들어 확산 구배를 생성하였다.
- 투석 버퍼를 사용하여 단백질 용액을 일련의 농도로 희석하십시오 : 1, 2, 5, 10 및 50 mg / mL.
- Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 정확한 농도를 결정 하십시오 (재료 표 참조).
2. 동적 광산란(DLS)에 의한 예비 샘플 특성화
- 상기 제조된 농도 계열로부터 각 단백질 용액 80 μL를 로딩하고(단계 1.6.) DLS 일회용 세포( 표 자료 참조)에 넣고 확산 계수를 결정하고, 평균 10회 이상의 획득을 하였다.
- 번역 확산 계수를 단백질 농도의 함수로 플롯하고 제로 농도로 추정합니다.
- 농도 계열의 각 단백질 용액을 점도계의 모세관 튜브에 로딩하고 ( 재료 표 참조) 동적 점도를 측정하십시오.
- 단백질 농도의 함수로 측정된 동적 점도를 플롯하고 0 농도로 추정합니다.
참고: DLS 확산을 0 농도로 외삽하면 단일 단백질에 대한 번역 확산 값이 산출됩니다. 동적 점도를 제로 농도로 외삽하면 완충 용액에 대해 실험적으로 측정 된 동적 점도 값이 산출되어야합니다.
3. 소각 산란 (중성자 또는 X 선)의 수집
- 네 가지 단백질 농도, 바람직하게는 2mg/mL, 5mg/mL, 10mg/mL 및 50mg/mL에서 소각 중성자 산란(SANS) 및/또는 소각 x선 산란(SAXS)( 자료 표 참조)을 측정합니다.
- SANS 및 SAXS 스펙트럼을 단백질 농도에 따라 정규화합니다.
- 앙상블 최적화31 및/또는 SasView32 소프트웨어를 사용하여 단백질 폼 팩터 P(Q)를 SANS 및 SAXS 스펙트럼에 맞춥니다.
- 각 농도에 대해 SANS 및 SAXS 신호를 P(Q)로 나누어 구조 계수 S(Q, c)를 계산합니다.
참고: NSE 측정을 지원하기 위해 소각 산란 데이터를 측정하고 해석하는 방법에 관심이 있는 독자는 참고 문헌 23,28,31,32,33을 철저히 참조하는 것이 좋습니다.
4. NSE의 측정
- 실험을 설정하고 아래 단계에 따라 샘플을 탑재합니다.
- 단백질 용액의 농도, 측정에 필요한 온도 및 사용 가능한 용액의 양을 기준으로 샘플 로딩을 위한 세포의 두께를 선택합니다.
참고 : 본 연구는 40mm x 30mm x 4mm의 탑 로더 투명 석영 용기를 사용했습니다. - 세포를 반복적으로 청소하고, 인산염이 없는 접시 세제( 물질 표 참조), 탈이온수 및 70% 에탄올을 번갈아 가며 청소한다.
- 대류 오븐에서 세포를 건조시키고; 석영 세포에 대해 80°C를 초과하지 않는다.
- 4 mL의 단백질 용액을 세포에 넣고 캡으로 닫으십시오. 왁스 필름 또는 실란트( 표 참조)를 사용하여 샘플 셀을 밀봉합니다.
참고 : 본 연구에서는 충분한 산란 강도를 얻기 위해 ~ 50mg / mL의 용액 4.8 mL를 사용했습니다. - 투석 버퍼 4mL를 단백질 샘플과 동일한 용기에 넣고 밀봉합니다.
- 샘플을 빔라인으로 운반하고, 셔터를 닫고, 분광계 인클로저 동굴 영역(34)으로 진입한다.
- 나사와 고정 플레이트를 조여서 알루미늄 샘플 홀더에 샘플 셀을 장착합니다(그림 2, 왼쪽 패널).
참고: 모든 샘플에 대해 동일한 측정 프로토콜이 필요하다는 점을 감안할 때 두 개의 샘플 셀을 동시에 장착할 수 있습니다. - 흑연 샘플 및/또는 단백질 샘플과 동일한 용기에 로딩된Al2O3분말 샘플을 장착한다. 이들은 SNS-NSE 빔라인 지원에서 제공하는 표준입니다.
- 샘플 홀더를 온도 강제 시스템의 캔에 부드럽게 밀어 넣습니다(TFS, 재료 표 참조).
참고: TFS는 SNS-NSE에서 가장 많이 사용되는 샘플 환경이며 원하는 온도를 얻기 위해 건조한 공기를 시료 용기로 펌핑합니다(그림 2, 중간 및 오른쪽 패널). - TFS 덮개를 닫고 TFS의 대화식 화면에 액세스하여 온도를 원하는 값으로 설정합니다.
- 중성자 카메라( 재료 표 참조)를 장착하여 샘플을 빔에 정렬합니다.
- 계측기 인클로저를 청소하고, 대피하고, 문을 닫고, 빔 셔터를 엽니다.
참고: 샘플 셀은 SNS-NSE 빔라인 지원에 의해 제공됩니다. 사용 가능한 샘플 셀 및 샘플 환경 라이브러리에 대해서는 SNS-NSE 빔라인 웹 페이지 7,35를 참조하십시오.
- 단백질 용액의 농도, 측정에 필요한 온도 및 사용 가능한 용액의 양을 기준으로 샘플 로딩을 위한 세포의 두께를 선택합니다.
- 아래 단계에 따라 NSE 데이터를 수집합니다.
- 중성자 카메라와 네 개의 독립적인 샘플 조리개를 사용하여 중성자 빔에 샘플을 정렬합니다.
- SNS-NSE 데이터 수집 소프트웨어(36 )를 열고, 원하는 산란 각도 및 파장에 대한 회절 스캔을 실행하여 샘플 통계를 수집한다.
- 보조 계측기 과학자가 제공한 측정 매크로를 편집하여 각 샘플에 대해 수집된 통계를 기반으로 측정 파라미터를 설정합니다.
- 명령 프롬프트에서 프로토콜 이름을 입력하여 스캔을 시작하고 샘플에 대한 에코를 가져옵니다.
- 스캐닝을 시작하고 탄성 기준 및 완충된 용매에 대해서도 에코를 획득하십시오. 샘플 변경에 대해 간헐적 빔 셔터 작업을 수행합니다.
그림 2: NSE 측정 시스템. 왼쪽 패널 : 알루미늄 (Al) 샘플 홀더에 나사와 플레이트가 장착 된 석영 용기의 단백질 용액 샘플. Al 샘플 홀더는 샘플 환경 내에 두 개의 샘플을 동시에 장착할 수 있는 가능성을 제공합니다. 중간 패널: 온도 강제 시스템(TFS) 샘플은 중성자 빔 창이 오른쪽에 있는 샘플 스테이지에 장착할 수 있으며, 정렬에 사용되는 중성자 카메라는 왼쪽에 표시됩니다. 오른쪽 패널 : 두 개의 샘플이있는 샘플 홀더를 샘플에 배치하면 실리콘 (Si) 창으로 작업 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. NSE 데이터 감소
참고: SNS-NSE에는 ORNL 중성자 과학 원격 분석 클러스터에서 사용할 수 있는 DrSpine(스핀 에코에 대한 데이터 감소)37,38이라는 전용 소프트웨어, 빠른 사용 설명서 및 기본 제공 도움말 지원이 장착되어 있습니다.
- ORNL 사용자 자격 증명을 사용하여 Neutron Sciences 원격 분석 클러스터( 자료 표 참조)에 로그인하고 세션 시작 단추를 누릅니다.
- 아래 단계에 따라 데이터 감소 소프트웨어를 설정하십시오.
- 사용자 디렉토리에서 터미널 창을 열고 source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh를 입력합니다.
- 그런 다음 다음을 입력하십시오 : drspine_create_env.sh.
- 홈 디렉터리에서 데이터 감소를 위한 폴더를 만들고 공유 디렉터리에서 제공된 스크립트와 매크로를 복사합니다.
- 그에 따라 제공된 축소 매크로를 편집, 이름 바꾸기 및 저장합니다.
- 명령 프롬프트에서 drspine 을 입력하고 Enter 키를 눌러 소프트웨어 축소 환경을 시작합니다.
- 5.4단계에서 편집한 "축소 매크로의 이름"을 입력합니다. 소프트웨어 환경 내의 명령 프롬프트에서 Enter 키를 누릅니다.
6. NSE 데이터 피팅
- 보조 악기 과학자가 제공 한 파이썬 스크립트 "stapler-drspine.py"을 축소 된 파일 데이터의 이름으로 편집하십시오.
참고 : 파이썬 스크립트는 악기 사용자가 자유롭게 사용할 수 있습니다. - 제공된 라이브러리에서 맞게 함수를 편집합니다.
- 명령 프롬프트에서 편집된 스크립트의 이름을 "stapler-drspine.py"로 입력하고 Enter 키를 눌러 축소된 NSE 데이터를 읽고, 맞추고, 플롯합니다.
참고: 계측기 과학자는 축소 매크로와 NSE 축소 데이터를 읽고 맞출 수 있는 "stapler-drspine.py" 파이썬 스크립트에 대한 템플릿을 제공합니다. 최종 축소된 NSE 데이터는 ASCII 형식이며 다양한 기본 설정 소프트웨어에서 읽을 수 있습니다.
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Representative Results
인간 혈청 및 소 MBP 단백질로부터의 IgG 단백질은D2O-염기 완충액에서 고농도(~50mg/mL)로 재구성되었다. 단백질이 고농도로 용해되었기 때문에, 수득된 용액은 붐비는 단백질 용액이었다. NSE를 사용하여 조사된 역학은 단백질이 상주하는 혼잡한 환경(구조 인자 상호작용 및 유체역학 효과)5,28,39로 고통받고 있다. DLS는 크라우닝 효과를 설명하기 위해 각 단백질에 대한 농축 시리즈에서 수행되었다. DLS에 의해 측정된 번역 확산 계수의 농도를 제로로 외삽하면 단일 단백질에 대한 번역 확산의 값이 산출된다. 단백질 농도의 함수로서의 동적 점도는 또한 유체역학적 상호작용을 설명하기 위해 NSE 이전에 측정되어야 한다. 농도의 함수로서 동적 점도의 농도를 제로로 외삽하는 것은 각각의 제조된 단백질 샘플의 완충 용액에 대해 실험적으로 측정될 수 있는 값을 수득할 필요가 있다.
농축 용액에서 단백질의 모양과 구조는 NSE 실험 전에 평가되어 단백질 형태 인자와 단백질이 용액에서 어떻게 이동하는지에 영향을 줄 수있는 구조 인자의 강도에 대한 통찰력을 얻었습니다. 소각 산란은 이러한 조사를위한 선택 방법이었습니다. 본 연구에서, 용액 중의 IgG 단백질의 구조적 입체형태는 SAXS에 의해 관찰되었고, MBP의 구조는 SANS에 의해 평가되었다. 측정된 산란 강도(Q)(단계 3.3.-3.4)는 폼 팩터 P(Q)와 입자 수에 의해 가중된 구조 인자 S(Q,c) 사이의 곱(수학식 1)5,28,39에 비례한다:
I (Q) = N ∙ P (Q) ∙S (Q, c) (1)
SAXS는 IgG에 대해0.154 nm의 X선 파장을 갖는 크래키형 SAXS 기기(40)에서 측정되었고, SANS는 중성자 파장 4.5 Å를 갖는 MBP에 대해41을 측정하였다. 실험적인 소 각 강도 I(Q)는 배경 및 용매 보정, 용액 농도에 따라 스케일링되었으며, 폼 팩터는 Ensemble modeling-EOM 및 SasView24,25,29,39,42,43과 같은 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어 패키지를 사용하여 계산되었습니다. 또한, 각 단백질에 대한 구조 인자는 수학식 1로부터 구하였다.
본 연구를 위해, NSE 실험은 두 개의 스핀-에코 분광계, 즉 도 1의 SNS-NSE 계기(34)와 피닉스-J-NSE 계기(44)로 수행되었다. 8 Å - 12 Å 사이의 입사 파장을, 0.05 Å-1- 0.2 Å-1 사이의 여러 Q 측정에 대해 0.1 ns ≤tmax ≤ 130 ns 사이의 푸리에 시간을 가하여 측정하였다. 두 분광계의 차이점은 NSE 과학의 이해에 중요한 포인트이며, 원자로의 정적 중성자 소스에 대한 소위 "고전적인 스핀 에코"의 오래된 개념과 맥동 중성자 소스에 대한 새로운 "비행 시간 개념"을 나타냅니다. Phoenix-J-NSE 분광계는 속도 선택기가 특정 파장을 선택하는 고전적인 유형의 NSE입니다. 중성자 속도의 변화를 허용하기 위해 ±10% 파장 대역폭이 도입됩니다. 단일 스캔에 사용되는 매우 좁은 에너지 대역에도 불구하고, 고플럭스 반응기 소스에서 Phoenix-J-NSE 분광계의 상황은 공간 벡터와 상관 시간 범위가 비교적 짧은 측정 시간으로 커버되도록 보장합니다. SNS-NSE 분광계는 분광계의 위치에 따라 2 Å < λ < 14 Å의 파장 범위와 2.4 Å - 3.6 Å의 동시 파장 대역폭을 가진 새로운 세대의 초고해상도, 초고해상도, 초고분해능, 초퍼 중성자 분광계입니다. 이러한 넓은 대역폭으로 인해 높은 데이터 수집 효율성이 달성되어 산란 각도 설정이 거의 없는 넓은 웨이브 벡터 시간 범위의 거의 끊김 없는 커버리지가 가능합니다. SNS-NSE에서 파장대의 선택은 네 개의 초퍼로 구성된 초퍼 시스템에 의해 이루어진다. 여기서 논의된 NSE 분광계는 모두 높은 자기장 균질성을 갖는 초전도 기술, 빗나간 장 보정을 위한 새로운 최첨단 필드 보정 요소, 그리고 새로운 편광 벤더(41,42)를 기반으로 한 세차장을 가지고 있다.
NSE 스펙트럼을 MBP 단백질에 대해 10°C에서, IgG1 단백질에 대해 25°C에서 측정하였다. NSE에 의해 측정된 일관된 중간 산란 강도 I(Q, t)/I(Q, t=0)는 조사된 시간 척도 내에서 발생하는 샘플의 모든 동적 프로세스의 기여적 결과이다. 여기에는 내부 단백질 역학, 전체 번역 확산, 회전 및 텀블링 확산, 단백질 분자 자체 내의 세그먼트 운동이 포함됩니다. 단순화 된 모델은 내부 역학과 번역 및 회전 확산이 완전히 분리되어 있다고 가정합니다 5,45,46,47,48 및 별도로 특성화 될 수 있습니다. 단일 입자에 대해, 일관된 산란 함수는 생성물로서 기록될 수 있다(수학식 2)23,48:
F (Q, t) = F트랜스 (Q, t) ∙F rot (Q, t) ∙Fint (Q, t) (2)
여기서 단일 경질 단백질에 대한 번역 확산 항은 번역 확산 계수 DT(수학식 3)23,48의 지수 함수이다:
F트랜스(Q, t) = exp(−Q2∙ DT∙ t) (3)
다량의 단백질의 경우, 번역 확산 계수 DT는 단백질-단백질 상호작용에 의해 영향을 받고, 구조 인자 S(Q)에 의해 정량화되고, 유체역학 함수 HT(Q)에 의해 설명된 유체역학적 상호작용에 의해 정량화된다(수학식 4)23,48:
D T (Q) = DT0 ∙HT (Q, c) / S (Q, c) (4)
수학식 4에서,DT0은 DLS 측정치로부터 제로 농도로 외삽된 확산 값이다(단계 2.2.). HT는 HT=1-c∙[η]로 계산되고, 여기서 c는 단백질 농도이고, [η]는 [η] = (η - η 0)/η 0∙c에 의해 계산된 고유 점도이고, η0은 측정된 동적 점도이다(단계 2.3.-2.4.). 구조 인자 S(Q,c)를 MBP 단백질에 대한 IgG 단백질 및 SANS 측정에 대한 SAXS 측정으로부터 수득하였다.
도 3은 IgG 및 MBP 단백질에 대한 NSE에 의해 측정된 바와 같은 중간 산 란 기능 I(Q, t)/ I(Q, t=0)의 예를 표시한다. 간단한 확산과 같은 이완 과정으로부터의 명확한 편차가 짧은 푸리에 시간 척도 <25ns에서 관찰되었는데, 이는 NSE에 의한 단백질 내부 역학의 접근성과 관찰된 역학적 과정을 설명하기 위한 보다 복잡한 모델의 필요성을 나타낸다.
도 3: IgG 및 MBP 단백질에 대한 NSE 이완 스펙트럼. IgG 데이터는 더 짧은 푸리에 시간에서의 확산으로부터의 편차를 드러내기 위해 단일-지수 함수에 의해서만 적합됨으로써 여기에 도시되어 있다. 편차가 두 단백질 모두에 대해 관찰되었다. 대조적으로, MBP 데이터는 Biehl45에 의해 개발된 모델에 의해 적합해진 전체 이완 범위에서 여기에 도시된다. 이 모델은 거친 그레인팅을 의미하며 짧고 중간이며 긴 푸리에 시간 체계를 동시에 맞출 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
따라서, 산란 기능은 참고 문헌 18,25,38,43,44,46에 기재된 Biehl에 의해 개발된 모델을 사용하는 두 단백질의 원자 모델링에 의해 적합되었다. 중간 산란 함수는 모든 원자 시뮬레이션과 달리 수백 개의 개별 그레인으로 거친 그레인팅을 통해 계산 부하와 시간을 줄였으며 MMTK49 소프트웨어 라이브러리 (자유롭게 액세스 가능)를 사용하여 원자 좌표에 액세스하고 단백질 도메인 및 단편에서 회전 횡단 운동을 구현했습니다. 두 단백질에 대한 중간 산란 함수 계산의 결과는 실험 NSE 데이터와 매우 일치했으며 긴 푸리에 시간에 관찰 된 느린 역학이 전체 번역 및 회전 확산 과정에 기인 할 수 있음을 입증했으며, 짧은 시간 척도에서 관찰 된 빠른 역학은 단백질 도메인의 역학에 기인 할 수 있습니다.
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Discussion
NSE 분광법은 다른 분광학적 기술이 생산할 수 없는 단백질의 역학에 대한 독특하고 상세한 시각을 제공합니다. 연장된 시간 척도에 걸친 측정은 여기에 제시된 바와 같이 단백질의 번역 및 회전 확산 둘 다에 대한 관찰을 제공한다. 분절 역학 및 기타 내부 진동은 짧은 시간 규모에서 일관된 산란 함수 S(Q, t)의 강한 붕괴로 나타나며 전체 확산 완화 과정과 잘 분리되어 있습니다. NSE 기술의 주요 한계는 확장된 측정 시간과 우수한 통계 신호를 획득하는 데 필요한 큰 샘플 볼륨입니다. 이것은 낮은 농도의 이동 종과 감소 된 수명을 나타내는 관련 거대 분자 시스템을 측정하는 데 어려움을 제기 할 수 있습니다.
IgG의 내부 역학
IgG 단백질은 유연한 링커에 의해 연결된 세 개의 큰 단편에 의해 근사화될 수 있는 항체에 특이적인 Y자형 구조를 갖는다. 고조파 전위에 상주하는 세 개의 상당한 입자에 대한 수학적 모델이 이러한 종류의 구조에 대해 가정되었습니다. 링커는 고정 평형 위치를 제공하지만 브라운 운동의 한 형태로 변동을 허용하는 탄성 스프링에 의해 근사화되었습니다. 상대적 평형도(28) 주위의 각 단편에 대해 세 가지 자유도가 허용되었다. 수학식 2에서 Fint(Q, t)로 표현된 내부 역학은 Ornstein-Uhlenbeck 프로세스50,51에 의해 설명되었다. 이 모델을 사용하면 전위 딥에서 조각의 평균 제곱 변위, 다양한 동작의 시간 척도, 마찰 및 발생하는 힘 상수를 계산할 수 있습니다. 내부 동작의 진폭은 각 조각에 대해 서로 다른 운동 정도를 고려하여 일반 모드 분석에 의해 근사화되었습니다. 모델 및 결과 수학적 파라미터에 대한 광범위한 설명은 여기서 범위를 벗어나지만 참조28에서 자세히 찾을 수 있습니다. IgG에 대한 이 사례 연구에서, 내부 역학의 명확한 시그니처가 수 나노초의 시간 척도에서 관찰되었다. 링커의 계산된 스프링 상수는 유사한 길이의 엔트로피 스프링과 현실적으로 비교할 수 있는 것으로 보인다. 관찰된 효과적인 마찰은 자유 결합되지 않은 IgG 단편의 마찰에 가까운 것으로 보인다. 기존의 평형 가설은 상이한 결합 부위 및 결합 특이성28을 나타내는 평형에 있는 IgGs의 공존하는 "개방" 또는 "폐쇄된" 구성을 가정하여 검증되었다. 이 정보는 항체의 역학을 이해하고 기계적 거동이 생체 적합성 및 생체 이용률을 향상시키는 데 사용될 수 있는지 여부와 관련이있을 수 있습니다.
MBP의 내부 역학
MBP 구조는 유연한 랜덤 코일 끝으로 강한 스트레칭 및 굽힘 동작을 허용하는 컴팩트 한 구상 코어를 가지고 있습니다. MBP 역학은 내부 마찰28,39의 첨가 유무에 관계없이 유연한 중합체 모델을 사용하여 해석되었다. IgG의 경우에서와 같이, MBP의 내부 역학에 대한 관찰은 브라운 운동 이론 내에서 조화 될 수 있으며, 여기서 운동의 진폭이 클수록 단백질 사슬 내의 내부 마찰의 영향으로 더 긴 이완 시간이 발생합니다. 더 큰 진폭의 움직임으로 증가하지만 더 작은 마찰로 증가 된 이완 시간은 고조파 전위에서 브라운 운동의 동일한 Ornstein-Uhlenbeck 프로세스 50,51을 사용하여 설명 할 수 있습니다. 진폭은 크지 만 이완 시간이 느린 내부 동작은 체인 구성의 복원력 (이면체 전위)을 줄이고 지역 에너지 장벽을 부드럽게함으로써 MBP가 원래 상태에서 완전히 변성 될 때 활성화됩니다. 천연 및 변성 상태에서의 MBP 내부 역학에 대한 상세한 설명은 참고문헌28,39에서 추가로 찾을 수 있다. MBP의 연구에서, NSE를 사용한 조사는 무작위 코일 폴리머와 구상 단백질 사이의 단백질의 중간 소형화를 가리키는 동적 행동을 밝혀냈다. 수 나노초의 이완 속도를 갖는 내부 단백질 역학의 유의한 기여는 저주파 집단 스트레칭 및 굽힘 운동5에 의해 지배되었다. 폴리머 이론 붕괴로부터의 모델에 의한 네이티브 MBP 역학에 대한 설명은 단백질 내부 마찰의 큰 가치로 인해 제공되었다. 변성 MBP에서, 단백질 사슬 내의 내부 마찰은 감소되고, 이완 스펙트럼의 중합체 사슬 특성이 우세하다. 구조적 앙상블 동작의 높은 유연성은 접근 가능한 단백질 표면을 증가시켜 다른 결합 파트너와의 상호 작용을 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다.
동적 모델
기술로서의 NSE는 생물학적 거대 분자 및 분자 서브 유닛의 저주파 고조파 운동을 평가하는 데있어 실험적으로 독특하지만, 중간 산란 기능을 분석하려면 다양한 수학적 모델에서 파생 된 중성자 스펙트럼과의 비교가 필요합니다. 여기에 제시되고 집중 단백질 솔루션을 위해 Biehl et al.28 에 의해 개발 된 모델은 중간 산란 기능이 적절한 모듈 식 기능의 컨볼루션이고 브라운 발진기가 내부 역학을 나타내는 탄성 네트워크 근사를 사용합니다. 이것은 단백질의 분절 역학을 분석하기위한 몇 안되는 모델 중 하나입니다. 묽은 단백질 솔루션에 대한 또 다른 잘 확립 된 모델은 Bu et al.52가 제안한 모델로, 통계 역학을 사용하고 복잡한 적합이나 여러 매개 변수를 필요로하지 않는 강력한 모델입니다. 동적 디커플링 근사에 기초한 유사한 접근법이 또한 자기 번역 및 내부 운동(53)의 합으로서 효과적인 확산을 특성화하기 위해 희석 시스템에 적용될 수 있다. 우리의 참고 문헌 중 일부는 이러한 모델과 그 한계에 대한 포괄적 인보고를 제공 할 수 있습니다. Fitter et al.1 및 Liu et al.54를 강력히 권장합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이나 이해 상충이 없음을 선언합니다. 원고의 내용은 저자가 2019-2021 년 사이에 구조 생물학 학교의 HANDS-Neutron Scattering Applications에서 발표 한 강의를 기반으로합니다.
Acknowledgments
이 연구는 Oak Ridge National Laboratory가 운영하는 과학 사용자 시설의 DOE 사무소 인 Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, Biology and Chemistry labs)의 자원을 사용했습니다. 이 연구는 또한 MLZ-FRM2 원자로 Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE)과 독일 Forschungszentrum Jülich GmbH의 JCNS1에서 자원을 사용했습니다. 저자는 Ralf Biehl 박사와 Andreas Stadler 박사가 모델링에 도움을 주고 IgG와 MBP 단백질 연구에 기여한 공로를 인정하고, NSE 데이터 감소 지원을 위한 Piotr A. Żołnierczuk 박사, SANS 측정 지원을 위한 Changwoo Do 박사, SNS 생화학 실험실 지원을 위한 Rhonda Moody와 Kevin Weiss 박사를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine MBP protein solution | Sigma-Aldrich | M1891 | lyophilized powder reconstituted in D2O |
| D2O - heavy water | Sigma-Aldrich | Product No. 151882 | liquid |
| Dionized water | in house | - | for washing / cleanning cells |
| DLS instrument | Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich | - | dynamic light scattering instrument |
| Elastic scattering standards | SNS-NSE, ORNL | - | Al2O3 and Graphite powders |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 65350-M | 70% ethanol for cleaning cells |
| IgG protein solution | Sigma-Aldrich | I4506 | lyophilized powder reconstituted in D2O |
| KWS-2 instrument | JCNS outstation at the MLZ, Garching, Germany | - | small angle neutron instrument |
| Liquinox dish detergent | Alconox | - | Phosphate-free liquid lab glassware cleaner |
| Na2HPO4·7H2O | Sigma-Aldrich | Product No.S9390 | disodium phosphate heptahydrate salt |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Product No.S9888 | sodium chloride salt |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | Product No. S9638 | monosodium phosphate monohydrate salt |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Catalog number: ND-2000 | NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer |
| Neutron alignment camera | NeutronOptics, Grenoble | NOG210222 | 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor |
| Parafilm M - wax parafilm | Bemis | Parafilm M - 5259-04LC PM996 | all-purpose laboratory film in cardboard dispenser |
| Phoenix-J-NSE Spectrometer | JCNS outstation at the MLZ, Garching, Germany | - | neutron spectrometer |
| SasView | https://www.sasview.org/ | ||
| SAXSpace, Anton Paar instrument | FZ-Jülich | - | small angle x-ray instrument |
| Slide-A-Lyzer dialysis membranes | Thermo Scientific | 88400-88405 | Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO |
| SNS Remote Analysis Cluster | Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) | https://analysis.sns.gov | |
| SNS-NSE spectrometer | ORNL, Oak Ridge, TN, USA | - | neutron spectrometer |
| Sterile syringe filters | VWR | N.A. PN:28145-501 | 0.2 µm pore size filters |
| Temperature Forcing System (TFS) | SP Scientific | Part Number 100004055 | sample environment equipment |
| Urea -d4 | Sigma-Aldrich | Product No. 176087 | deuterated Urea salt |
| Viscometer | FZ-Jülich | - | falling ball viscometer |
References
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