Summary
Denne protokollen beskriver metoder for å undersøke strukturen og dynamikken til to modellproteiner som har en viktig rolle i menneskers helse. Teknikken kombinerer benk-topp biofysisk karakterisering med nøytronspinn ekkospektroskopi for å få tilgang til dynamikken på tids- og lengdeskalaer som er relevante for proteininterdomainbevegelser.
Abstract
De fleste menneskekroppsproteiners aktivitet og funksjonalitet er relatert til konfigurasjonsendringer av hele underdomener i proteinkrystallstrukturen. Krystallstrukturene bygger grunnlaget for enhver beregning som beskriver strukturen eller dynamikken til et protein, mesteparten av tiden med sterke geometriske begrensninger. Disse begrensningene fra krystallstrukturen er imidlertid ikke til stede i løsningen. Strukturen av proteinene i løsningen kan avvike fra krystallet på grunn av omorganiseringer av løkker eller underdomener på pico til nanosekund tidsskala (dvs. det interne proteindynamikktidsregimet). Det nåværende arbeidet beskriver hvordan sakte bevegelser på tidsskalaer på flere titalls nanosekunder kan nås ved hjelp av nøytronspredning. Spesielt er den dynamiske karakteriseringen av to store humane proteiner, et iboende uordnet protein som mangler en veldefinert sekundær struktur og et klassisk antistoffprotein, adressert ved nøytronspinnekkospektroskopi (NSE) kombinert med et bredt spekter av laboratoriekarakteriseringsmetoder. Ytterligere innsikt i proteindomenedynamikk ble oppnådd ved hjelp av matematisk modellering for å beskrive eksperimentelle nøytrondata og bestemme krysningen mellom kombinert diffusive og interne proteinbevegelser. Ekstraksjonen av det interne dynamiske bidraget til den mellomliggende spredningsfunksjonen oppnådd fra NSE, inkludert tidsskalaen for de forskjellige bevegelsene, tillater ytterligere syn på de mekaniske egenskapene til enkeltproteiner og mykheten til proteiner i deres nesten naturlige miljø i den overfylte proteinløsningen.
Introduction
Sonderingsdynamikk av myk materie med nøytroner
Å undersøke de dynamiske egenskapene til proteiner og peptider er en stor del av biofysisk forskning, og det finnes i dag mange velutviklede metoder for å få tilgang til et bredt spekter av energilandskap. Å relatere den eksperimentelt avslørte dynamikken til proteinene til deres biologiske funksjon er en langt vanskeligere oppgave, som krever komplekse matematiske modeller og datastøttede dynamikksimuleringer. Betydningen av nøytronspektroskopi for analyse av proteinbevegelser har blitt understreket i flere godt mottatte og anerkjente studier 1,2,3,4,5. Før du utforsker det mangfoldige energilandskapet for intern proteindynamikk, er det nødvendig med en kort oversikt over de dynamiske prosessene i myk materie og hvordan nøytroner kan få tilgang til dem.
Nøytronenes følsomhet overfor isotopisk konfigurasjon og typen interaksjoner de viser med myk materie, gjør nøytronspredning til en av de mest allsidige undersøkelsesteknikkene6. Det er et bredt spekter av korrelasjonslengdeskalaer og korrelasjonstider som nøytroner kan få tilgang til, fra kjernefysiske eksitasjoner og atomvibrasjoner til kollektive bevegelser og langsomme avslapningsprosesser som isotropiske rotasjoner og diffusive bevegelser. Når man undersøker de spredte nøytronene for deres energioverføring, kan tre hovedinteraksjoner skilles: den elastiske spredningen, der det ikke er energiutveksling mellom innkommende nøytron og partikkel i prøven; den uelastiske spredningen, med en stor, kvantifiserbar energiutveksling mellom nøytron og partikkel; og det særegne tilfellet av kvasi-elastisk spredning som betegner en svært liten energioverføring sammenlignet med den innfallende nøytronenergien 1,7. Disse interaksjonene gir presis informasjon om det undersøkte materialet og danner det teoretiske grunnlaget for et bredt spekter av nøytronspredningsteknikker.
I elastisk spredning registrerer detektoren retningene til nøytronene som et diffraksjonsmønster, som viser posisjonen til prøveatomene i forhold til hverandre. Informasjon om korrelasjonene mellom atomposisjoner er anskaffet (dvs. integrert intensitet S (Q) angående momentumoverføringen Q, som gjelder strukturell informasjon alene). Dette prinsippet danner grunnlaget for nøytrondiffraksjon8.
Kompleksitet oppstår når energioverføringen ikke lenger er null på grunn av eksitasjoner og interne svingninger i prøvematerialet. Dette danner grunnlaget for nøytronspektroskopi, der de spredte nøytronene undersøkes som en funksjon av både energioverføringen E og momentumoverføringen Q. Dynamisk og strukturell informasjon oppnås. Nøytronspektroskopi måler den samme integrerte intensiteten S (Q) for energioverføring (dvs. hastighetsendring av nøytronene på grunn av prøvespredning, S (Q, ω) = S (Q, E), som også refereres til som den dynamiske strukturfaktoren) 9.
For å beregne spredningen fra et materiale er det mer tilstrekkelig å bruke parkorrelasjonsfunksjonen 7,10. I diffraksjonstilfellet gir den statiske parkorrelasjonsfunksjonen G (r) sannsynligheten for å finne sentrum av en partikkel i en gitt avstand r fra sentrum av en annen partikkel. Spektroskopien generaliserer den statiske parkorrelasjonsfunksjonen og inkluderer energi/ frekvens / tid i spredningsligningen. Parkorrelasjonsfunksjonen G(r) blir en funksjon av tid G(r, t), som kan dekomponeres i en distinkt atomparkorrelasjonsfunksjon GD(r, t), og en selvkorrelasjonsfunksjon GS(r, t). Disse beskriver to typer korrelasjoner: parkorrelerte bevegelser av atomer som styrer den sammenhengende spredningen, og selvkorrelasjon som styrer den usammenhengendespredningen 10.
Koherent spredning er spredningen fra "gjennomsnittet" og avhenger av den relative fasen av de spredte bølgene. I det små vinkelspredningsregimet forstyrrer de spredte nøytronbølgene fra forskjellige spredningssentre (forskjellige atomer) konstruktivt (har lignende faser), og atomenes kollektive bevegelse observeres med sterk intensitetsforbedring. Koherent spredning beskriver i hovedsak spredningen av et enkelt nøytron fra alle kjernene i prøven10.
Når det ikke oppstår noen konstruktiv interferens mellom de spredte nøytronbølgene fra forskjellige sentre, følges et enkelt atom i tid, og selvkorrelasjonen mellom atomets posisjon på tid t = 0 og det samme atomet på tidspunktet t observeres. Dermed går informasjonen om atomenes relative posisjoner tapt, og fokuset er bare på lokale svingninger. Spredning fra lokale svingninger styrer usammenhengende spredning. Usammenhengende spredning er isotropisk, bidrar til bakgrunnssignalet og forringer signal-til-støy10,11.
Ved å kombinere alt det ovennevnte skiller vi fire store nøytronspredningsprosesser10: (1) elastisk koherent (måler korrelasjonene til atomposisjoner), (2) uelastisk koherent (måler kollektive bevegelser av atomer), (3) elastisk usammenhengende (bidrar til bakgrunnen, reduserer spredningsintensiteten ved Debye-Waller-faktor (DWF) og måler elastisk usammenhengende strukturfaktor (EISF), som beskriver geometrien til diffusive bevegelser i begrenset geometri, og (4) uelastisk usammenhengende (måler enkeltatomdynamikk og selvkorrelasjon).
Dynamikkprosesser som nøytroner kan få tilgang til i biologi spenner fra demping av lavfrekvente atom- og molekylære vibrasjoner, samspillet mellom løsningsmiddelmolekyler og biooverflater og diffusjonsprosesser i hydreringslaget av makromolekyler og begrenset geometri, til kortdistanse translasjonelle, rotasjons- og tumblingdiffusjonive bevegelser, og proteindomener og allosteriske bevegelser1 . Det store mangfoldet av nøytronmetoder og instrumenter for måling av proteindynamikk er basert på hvordan akromatiseringen av hendelsen eller den utgående nøytronstrålen oppnås og hvordan energianalysen av de spredte nøytronene utføres. Fra trippelakse til flytid, backscattering og spinn-ekko-spektrometre kan man utforske dynamiske prosesser med karakteristiske tider mellom 1 x 10-14 s og 1 x 10-6 s (femtosekund til mikrosekunder)12.
Oak Ridge National Laboratory, med sine to anerkjente nøytronkilder, Spallation Neutron Source - SNS13 og High Isotope Flux Reactor - HFIR14, har en av de beste suitene med spektrometre for å undersøke dynamikk i biomaterialer. Noen av de mest veltalende eksemplene inkluderer bruken av det kalde nøytronhakkerspektrometeret (CNCS) ved SNS15 for å undersøke dynamisk forstyrrelse av hydreringsvann rundt grønt fluorescerende protein i løsning16 eller subpikosekund kollektive vibrasjoner av flere proteiner17. Et tilbakevendende problem med uelastiske nøytronspredningsundersøkelser er at noen biologiske prosesser er for sakte til å bli observert. Uten ekstreme oppsett som fører til et stort tap av nøytronintensitet, er flytidsspektrometre begrenset til 10 μeV energioppløsning, tilsvarende en maksimal tidsskala på ~ 200 ps10,11. Dette er ikke tilstrekkelig til å observere store bevegelser i proteiner. Derfor er det ofte behov for instrumenter med høyere energioppløsning som backscattering-spektrometrene. Å kombinere time-of-flight og backscattering-teknikkene har vist seg å være kraftig for å undersøke endringen i den interne dynamikken til Cytochrome P450cam (CYP101), et enzym som katalyserer hydroksylerings kamfer18.
Mikroskopisk diffusivitet målt ved backscattering-spektrometeret ved SNS-BASIS19 var overraskende godt definert og kunne skilles i diffusiviteten til vann (hydrering, cytoplasmatisk og bulklignende vann) og diffusiviteten til cellebestanddeler i planariske flatorm, det første levende dyret som ble studert ved nøytronspredning20 . Backscattering er en høyoppløselig spektroskopisk teknikk, men den er også begrenset til flere μeV = flere nanosekunder, mens den langsomme dynamikken i biomaterialer også manifesterer seg som overlevelsestiden for korrelasjon mellom atomposisjon eller spinnorientering (f.eks. Avslapningsprosesser, som regelmessig skjer i tidsområdet ti til hundrevis av nanosekunder).
Nøytron spinn ekko spektroskopi (NSE) er den eneste nøytronspredningsteknikken som når så høy oppløsning. I motsetning til andre nøytronteknikker krever NSE ikke akromatisering av strålen siden den bruker den kvantemekaniske fasen til nøytronene, som er deres magnetiske øyeblikk. Manipuleringen av magnetiske øyeblikk tillater bruk av en bred nøytronstrålebølgelengdefordeling, mens teknikken er følsom for svært små nøytronhastighetsendringer i størrelsesorden 1 x 10-4. NSE har med hell blitt brukt til å undersøke den langsomme dynamikken til proteiner i løsning for mange proteiner. Blant disse mange pionerstudiene anerkjenner vi studiet av segmentfleksibiliteten til grisimmunoglobulin21; de koblede domenebevegelsene i Taq-polymerase22; domenebevegelsene i tetrameren av gjæralkohol dehydrogenase23; endringen av konformasjon i fosfoglyseratkinase ved substratbinding3; aktivering av domenebevegelser og dynamisk forplantning av allosteriske signaler i Na+/H+ utvekslingsregulatorisk kofaktor 1 (NHERF1) protein 4,24,25; dynamikken i en kompakt tilstand av kvikksølvionreduktase26; og diffusjonen av hemoglobin i røde blodlegemer27. To nyere studier i proteindynamikk har eksponert fleksibiliteten til humant antistoff Immunoglobulin G (IgG) som en entropisk fjær28 og egenskapene til løsemiddelbidrag til dynamikken til indre uordnet myelin basisk protein (MBP)5.
Denne artikkelen forklarer de grunnleggende prinsippene for NSE, de mange forberedende metodene som anbefales for en grundig proteindynamikkundersøkelse, samt metodikken og den eksperimentelle protokollen for NSE-datainnsamling ved NSE-spektrometeret ved SNS, SNS-NSE. Protokollen karakteriserer to proteiner: IgG, et vanlig humant antistoffprotein, og det indre uordnede proteinet MBP. De biofysiske implikasjonene, forskningsrelevansen til eksemplene og begrensningene i teknikken diskuteres kort.
NSE-spektroskopi, metoden for langsomme dynamikkmålinger
NSE er en polarisert teknikk som bruker nøytrontid for å måle utveksling av energi (tap av polarisasjon) på grunn av den kvasi-elastiske interaksjonen mellom nøytroner og atomer i en prøve. Kjernen i NSE-spektroskopi ligger to grunnleggende prinsipper: (1) nøytronspinnets evne til å presesere i magnetfeltet med en frekvens proporsjonal med magnetisk styrke 
, nemlig Larmor-frekvensen29, og (b) spinn-ekkoet eller Hann-ekkoet, som representerer manipulering og refokusering av polarisasjonssignalet ved bruk av en serie radiofrekvenspulser30.
Det grunnleggende i NSE-prosessen kan oppsummeres i noen få enkle trinn 6,11 ved hjelp av figur 1. (1) Nøytronstrålen produsert av kilden (posisjon 1) polariseres (posisjon 2), styres og transporteres (posisjon 3), og kommer til inngangen til NSE-spektrometeret, hvor den roteres med 90 ° av den første pi-halvflipperen (posisjon 4). (2) Den polariserte strålen (f.eks. nøytronmagnetiske øyeblikk) blir vinkelrett på den første magnetens magnetfeltlinjer (første presesjonssone, posisjon 5) og begynner å presesere. (3) På slutten av magneten akkumulerer nøytronspinn en viss presesjonsvinkel proporsjonal med magnetfeltstyrken og flytiden som brukes inne (i utgangspunktet omvendt proporsjonal med nøytronhastigheten). De individuelle nøytronhastighetene er kodet innenfor presesjonsvinkelen på slutten av den første presesjonssonen. (4) Nær prøveposisjonen reverserer pi-flipperen (posisjon 6) retningen til spinnet med 180 °, og endrer tegnet på presesjonsvinkelen. (5) Nøytronene interagerer med prøvens molekyler (posisjon 7) og blir spredt. (6) De spredte nøytronene kommer inn og preseserer i den andre presesjonssonen (posisjon 8), men blir reversert orientert. (7) En annen pi-halv flipper (posisjon 9) brukes til å rotere orienteringen av spinnet fra vinkelrett til horisontal retning. Dette vil stoppe presesjonen, oversette presesjonsvinkelen φ til polarisasjon proporsjonal med cos (φ). (8) Analysatoren (posisjon 10) velger nøytronene basert på en orientering. Hvis interaksjonen med prøven er elastisk, vil nøytronets hastighet ikke endres. Nøytronene vil bruke like mye tid på å fly i første og andre presesjonssone, og de akkumulerte presesjonsvinklene blir fullstendig gjenvunnet. Den fulle polarisasjonen gjenopprettes på detektoren (posisjon 11) som et ekko av den opprinnelige polarisasjonen (dvs. spinn-ekko). (9) I NSE er imidlertid spredningen kvasi-elastisk, så en liten energiutveksling mellom nøytroner og prøvemolekyler fører til forskjellige nøytronhastigheter etter spredning av prøven. På grunn av de forskjellige hastighetene vil nøytronene bruke ekstra tid på å fly gjennom den andre presesjonssonen og vil ikke ha gjenopprettet presesjonsvinkelen på riktig måte. En partiell polarisasjon hentes på detektoren, og tapet av polarisasjon på grunn av spinnavslapping er proporsjonalt med cos-Fourier-transformasjonen av spektralfunksjonen S(Q, ω), den mellomliggende spredningsfunksjonen F(Q, t). (10) Tidsparameteren for funksjonen F(Q, t) er proporsjonal med presesjonens magnetfeltstyrke. Skanning av tap av polarisasjon som en funksjon av magnetfeltstyrke gir derfor en avslapningsfunksjon som avhenger av de dynamiske prosessene i prøven.
Figur 1: Fotografi av NSE-spektrometeret ved SNS (SNS-NSE) og nøytronfluebane skjematisk med de viktigste funksjonelle komponentene. Fra høyre til venstre: 1 = nøytronkilde; 2 = choppers-bender-polarizer-sekundær lukkersystem; 3 = stråletransport guider; 4 = pi/2 flipper for første 90° spinn-sving; 5 = første presesjonssone; 6 = pi flipper for 180 ° spin-turn; 7 = prøveområde og prøvemiljø (her vises kryoovnen); 8 = andre presesjonssone; 9 = pi/2 flipper for andre 90° spinn-sving; 10 = analysator; 11 = detektor. (Merk at deler av 3, samt 2 og 1, ligger bak den blå veggen inne i skjermingen; helikoptrene erstattes av en hastighetsvelger for reaktorbasert NSE). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det nåværende arbeidet karakteriserer to proteiner: et vanlig humant antistoffprotein IgG, og det indre uordnede MBP. Den lyofiliserte formen av proteinene ble oppnådd fra kommersielle kilder (se Materialtabell).
1. Fremstilling av proteinprøver
- Klargjør en 50 mM natriumfosfat + 0,1 M NaCl-buffer ved å veie og oppløse de respektive faste reagensene i tungtvann (D2O) (se materialtabell). Dette er det deutererte bufferløsningsmidlet for IgG.
- Juster pH i bufferløsningen til 6,6.
- Forbered en 20 mM natriumfosfat + 6 M ureabuffer ved å veie og oppløse de respektive faste komponentene i tungtvann (D2O). Dette er det deutererte bufferløsningsmidlet for MBP.
- Juster pH-verdien til bufferløsningen til 4,7.
- Filtrer bufferløsningsmidlene ved hjelp av 0,2 μm porestørrelsesfiltre (se materialtabell).
- Vei og løs opp de rensede proteinlyofiliserte pulverene i de deutererte løsningsmidlene for de respektive proteinene (trinn 1.1.-1.2.) ved høy proteinkonsentrasjon (~50 mg/ml).
- Last proteinoppløsningen i dialyskurver med dialysemembraner på 3,5 K MWCO, og dialyser mot den filtrerte bufferen i 24 timer ved 10 °C for MBP og 25 °C for IgG (se materialtabell) ved å riste litt på rørene for å skape en diffusjonsgradient.
- Fortynn proteinoppløsningen ved hjelp av dialysebufferen i en rekke konsentrasjoner: 1, 2, 5, 10 og 50 mg / ml.
- Bestem de nøyaktige konsentrasjonene ved hjelp av et Nanodrop-spektrofotometer (se materialtabell).
2. Foreløpig prøvekarakterisering ved dynamisk lysspredning (DLS)
- Last 80 μL av hver proteinløsning fra konsentrasjonsserien fremstilt ovenfor (trinn 1.6.) inn i DLS engangscelle (se materialtabell) og bestem diffusjonskoeffisientene, i gjennomsnitt over 10 oppkjøp.
- Plot de translasjonelle diffusjonskoeffisientene som en funksjon av proteinkonsentrasjon og ekstrapoler til null konsentrasjon.
- Last hver proteinløsning fra konsentrasjonsserien inn i kapillærrørene til et viskosimeter (se materialtabell) og mål den dynamiske viskositeten.
- Plot de dynamiske viskositetene målt som en funksjon av proteinkonsentrasjon og ekstrapoler til null konsentrasjon.
MERK: Ekstrapoleringen av DLS-diffusjon til nullkonsentrasjon gir verdien av translasjonsdiffusjon for ett enkelt protein. Ekstrapoleringen av dynamisk viskositet til null konsentrasjon må gi den dynamiske viskositetsverdien målt eksperimentelt for bufferløsningen.
3. Samling av småvinkelspredning (nøytron eller røntgen)
- Mål småvinklet nøytronspredning (SANS) og/eller småvinkel røntgenspredning (SAXS) (se materialtabell) på fire proteinkonsentrasjoner, fortrinnsvis 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml og 50 mg/ml.
- Normaliser SANS- og SAXS-spektra etter proteinkonsentrasjon.
- Tilpass proteinformfaktoren P(Q) til SANS- og SAXS-spektrene ved hjelp av programvaren Ensemble Optimization31 og/eller SasView32 .
- Beregn strukturfaktor S(Q, c) ved å dele SANS- og SAXS-signalet med P(Q) for hver konsentrasjon.
MERK: Lesere som er interessert i hvordan man måler og tolker småvinkelspredningsdata som støtte for NSE-målinger, oppfordres til å konsultere referansene 23,28,31,32,33 grundig.
4. Måling av NSE
- Konfigurer eksperimentet, og monter prøven ved å følge trinnene nedenfor.
- Velg tykkelsen på cellen for prøvebelastning basert på konsentrasjonen av proteinoppløsningen, temperaturen som trengs for måling, og mengden løsning som er tilgjengelig.
MERK: Denne studien brukte topplaster gjennomsiktige kvartsbeholdere på 40 mm x 30 mm x 4 mm. - Rengjør cellen gjentatte ganger, vekslende mellom fosfatfritt oppvaskmiddel (se materialtabell), avionisert vann og 70% etanol.
- Tørk cellen i konveksjonsovnen; ikke overstige 80 °C for kvartscellene.
- Legg 4 ml proteinoppløsning inn i cellen og lukk med caps. Bruk voksfilm eller et hvilket som helst tetningsmiddel (se materialtabell) for å forsegle prøvecellene.
MERK: I denne studien ble 4,8 ml oppløsning ved ~50 mg/ml brukt for å oppnå tilstrekkelig spredningsintensitet. - Legg 4 ml dialysebuffer i en identisk beholder som proteinprøven og forseglingen.
- Transportprøver til strålelinjen, lukk lukkeren og gå inn i spektrometerkapslingshulen34.
- Monter prøvecellen på aluminiumsprøveholderen ved å stramme skruene og holdeplatene (figur 2, venstre panel).
MERK: Man kan montere to prøveceller samtidig, gitt at samme måleprotokoll er nødvendig for alle prøver. - Monter grafittprøven og/eller Al2O3 pulverprøven lastet i en identisk beholder som proteinprøven. Dette er standarder levert av SNS-NSE strålelinjestøtte.
- Plasser prøveholderen ved å skyve den forsiktig inn i boksen til temperaturpådrivsystemet (TFS, se Materialtabell).
MERK: TFS er det mest brukte prøvemiljøet ved SNS-NSE og pumper tørr luft inn i prøvebeholderen for å oppnå ønsket temperatur (figur 2, midtre og høyre paneler). - Lukk TFS-lokket og sett temperaturen til ønsket verdi ved å gå til den interaktive skjermen på TFS.
- Monter nøytronkameraet (se materialtabell) for justering av prøvene til strålen.
- Fei instrumentkabinettet, evakuer, lukk dørene og åpne strålelukkeren.
MERK: Prøveceller leveres av SNS-NSE-strålelinjestøtten. For tilgjengelige prøveceller og prøvemiljøbiblioteket, se SNS-NSE beamline nettside 7,35.
- Velg tykkelsen på cellen for prøvebelastning basert på konsentrasjonen av proteinoppløsningen, temperaturen som trengs for måling, og mengden løsning som er tilgjengelig.
- Samle inn NSE-dataene ved å følge trinnene nedenfor.
- Juster prøven i nøytronstrålen ved hjelp av nøytronkameraet og de fire uavhengige prøveåpningene.
- Åpne SNS-NSE datainnsamlingsprogramvare36 og samle prøvestatistikk ved å kjøre diffraksjonsskanninger for de ønskede spredningsvinklene og bølgelengden.
- Definer måleparametrene basert på statistikken som samles inn for hvert utvalg, ved å redigere målemakroene fra den assisterende instrumentforskeren.
- Begynn å skanne ved å skrive inn protokollnavnet ved ledeteksten og hente ekko for prøven.
- Begynn å skanne og skaff ekko også for den elastiske referansen og det bufrede løsningsmidlet. Utfør intermitterende strålelukkerdrift for prøveendringen.
Figur 2: NSE målesystem. Venstre panel: proteinoppløsningsprøver i kvartsbeholder montert med skruer og plater på aluminium (Al) prøveholderen. Al-prøveholderen gir mulighet til å montere to prøver samtidig inne i prøvemiljøet. Midtpanel: Prøven på temperaturfordrivsystemet (TFS) kan monteres på prøvetrinnet nøytronstrålevinduet er til høyre, mens nøytronkameraet som brukes til justering er synlig på venstre side. Høyre panel: Plassering av prøveholderen med to prøver i prøven kan fungere med silisium (Si) vinduer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Reduksjon av NSE-data
MERK: SNS-NSE er utstyrt med en dedikert programvare som heter DrSpine (datareduksjon for spin-echo)37,38 tilgjengelig på ORNL Neutron Sciences Remote Analysis Cluster, en rask brukerhåndbok og innebygd hjelpestøtte.
- Logg på Neutron Sciences Remote Analysis Cluster (se Materialliste) med ORNL-brukerlegitimasjonen, og trykk på Start økt-knappen .
- Konfigurer datareduksjonsprogramvaren ved å følge trinnene nedenfor.
- I brukerkatalogen åpner du et terminalvindu og skriver: kilde / SNS / programvare / nse / etc / setup_nse.sh.
- Deretter skriver du inn: drspine_create_env.sh.
- Opprett en mappe for datareduksjon i hjemmekatalogen, og kopier de angitte skriptene og makroene fra den delte katalogen.
- Rediger, gi nytt navn til og lagre reduksjonsmakroen som er angitt tilsvarende.
- Skriv drspine ved ledeteksten og trykk enter for å starte programvarereduksjonsmiljøet.
- Skriv inn "navnet på reduksjonsmakroen" redigert i trinn 5.4. i ledeteksten i programvaremiljøet og trykk Enter.
6. Tilpasning av NSE-data
- Rediger python-skriptet "stapler-drspine.py", levert av den assisterende instrumentforskeren, med navnene på de reduserte fildataene.
MERK: Python-skriptet er fritt tilgjengelig for brukere av instrumentet. - Rediger funksjonen slik at den passer fra biblioteket som følger med.
- Skriv inn navnet på det redigerte skriptet "stapler-drspine.py" ved ledeteksten og trykk Enter for å lese, tilpasse og plotte reduserte NSE-data.
MERK: Instrumentforskeren vil gi en mal for reduksjonsmakroen og "stapler-drspine.py" python-skriptet som kan lese og passe NSE-reduserte data. De endelige reduserte NSE-dataene er i ASCII-format og kan leses av ulike foretrukne programvarer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IgG-protein fra humant serum og MBP-proteiner fra storfe ble rekonstituert ved høye konsentrasjoner (~50 mg/ml) i D2O-basebuffere. Siden proteinene ble oppløst i høye konsentrasjoner, var de oppnådde løsningene overfylte proteinløsninger. Dynamikken som undersøkes ved bruk av NSE lider av det overfylte miljøet som proteinene befinner seg i (strukturfaktorinteraksjoner og hydrodynamiske effekter)5,28,39. DLS ble utført på en konsentrasjonsserie for hvert protein for å ta hensyn til trengselseffekter. Ekstrapoleringen til null konsentrasjon av translasjonsdiffusjonskoeffisientene målt ved DLS gir verdien av translasjonsdiffusjon for et enkelt protein. Den dynamiske viskositeten som en funksjon av proteinkonsentrasjonen må også måles før NSE for å ta hensyn til de hydrodynamiske interaksjonene. Ekstrapoleringen til nullkonsentrasjon av de dynamiske viskositetene som en funksjon av konsentrasjonen må gi verdien som eksperimentelt kan måles for bufferoppløsningen til hver fremstilte proteinprøve.
Formen og strukturen til proteiner i konsentrert løsning ble vurdert før et NSE-eksperiment for å få innsikt i proteinformfaktoren og styrken til strukturfaktoren, noe som kan påvirke hvordan proteinene beveger seg i løsning. Småvinkelspredning var den foretrukne metoden for disse undersøkelsene. I denne studien ble den strukturelle konformasjonen av IgG-protein i oppløsning observert av SAXS, og strukturen til MBP ble vurdert av SANS. Spredningsintensiteten (Q) målt (trinn 3.3.-3.4.) er proporsjonal med produktet mellom formfaktor P(Q) og strukturfaktoren S(Q,c) vektet med antall partikler (ligning 1)5,28,39:
I (Q) = N ∙ P (Q) ∙S (Q, c) (1)
SAXS ble målt på et Saxs-instrument av Kratky-type40 med en røntgenbølgelengde på 0,154 nm for IgG, og SANS ble målt41 for MBP med en nøytronbølgelengde på 4,5 Å. De eksperimentelle småvinkelintensitetene I (Q) ble bakgrunns- og løsningsmiddelkorrigert, skalert etter løsningskonsentrasjon, og formfaktoren ble beregnet ved hjelp av fritt tilgjengelige programvarepakker som Ensemble modeling-EOM og SasView 24,25,29,39,42,43. Videre ble strukturfaktoren for hvert protein oppnådd fra ligning 1.
For denne studien ble NSE-eksperimentene utført med to spinn-ekko-spektrometre: SNS-NSE-instrumentet34 i figur 1 og Phoenix-J-NSE-instrumentet44. Innfallsbølgelengder mellom 8 Å - 12 Å, med Fourier-ganger mellom 0,1 ns ≤ tmax ≤ 130 ns for flere Q-målinger mellom 0,05 Å−1- 0,2 Å−1, ble målt. Forskjellen mellom de to spektrometrene er et viktig punkt i forståelsen av NSE-vitenskapen, og de representerer både det gamle konseptet med et såkalt "klassisk spinnekko" for den statiske nøytronkilden til en reaktor og det nye "time-of-flight-konseptet" for den pulserende nøytronkilden. Phoenix-J-NSE-spektrometeret er en NSE av klassisk type, der en hastighetsvelger velger en bestemt bølgelengde. For å tillate variasjoner i nøytronhastighetene introduseres en ±10% bølgelengdebåndbredde. Til tross for det svært smale energibåndet som brukes til en enkelt skanning, sikrer situasjonen til Phoenix-J-NSE-spektrometeret ved en høy fluksreaktorkilde at romvektor- og korrelasjonstidsintervaller dekkes i relativt korte måletider. SNS-NSE-spektrometeret er den nye generasjonen, ultrahøyoppløselige, nøytronspektrometer, med et bølgelengdespenn på 2 Å < λ < 14 Å og en samtidig bølgelengdebåndbredde på 2,4 Å - 3,6 Å, avhengig av spektrometerets posisjon. På grunn av denne brede båndbredden oppnås høy datainnsamlingseffektivitet, noe som gir nesten gapløs dekning av et bredt bølgevektortidsområde med bare få spredningsvinkelinnstillinger. Valget av bølgelengdebånd i SNS-NSE er laget av et helikoptersystem bestående av fire helikoptre. Begge NSE-spektrometrene som diskuteres her, har presesjonsfelt basert på superledende teknologi med høy magnetfelthomogenitet, nye toppmoderne feltkorreksjonselementer for bortkommen feltkorreksjoner og nye polariserende benders41,42.
NSE-spektrene ble målt ved 10 °C for MBP-protein og 25 °C for IgG1-protein. Den sammenhengende mellomliggende spredningsintensiteten I (Q, t) / I (Q, t = 0) målt ved NSE er det bidragende resultatet av alle de dynamiske prosessene i prøven som skjer innenfor den undersøkte tidsskalaen. Dette inneholder den interne proteindynamikken, den generelle translasjonsdiffusjonen, rotasjons- og tumblingdiffusjonen og segmentbevegelsene i selve proteinmolekylet. En forenklet modell forutsetter at den interne dynamikken og translasjons- og rotasjonsdiffusjonene er helt frakoblet 5,45,46,47,48 og kan karakteriseres separat. For enkeltpartikkelen kan den sammenhengende spredningsfunksjonen skrives som produktet (ligning 2)23,48:
F (Q, t) = Ftrans(Q, t) ∙Frot(Q, t) ∙Fint(Q, t) (2)
hvor translasjonsdiffusjonsbetegnelsen for et enkelt stivt protein er en eksponentiell funksjon av translasjonsdiffusjonskoeffisienten DT (ligning 3)23,48:
Ftrans(Q, t) = exp(−Q2∙ DT∙ t) (3)
For store konsentrasjoner av proteiner påvirkes translasjonsdiffusjonskoeffisienten DT av protein-protein-interaksjoner, kvantifisert av strukturfaktoren S(Q) og av hydrodynamiske interaksjoner beskrevet ved den hydrodynamiske funksjonen HT(Q) (ligning 4)23,48:
DT(Q) = DT0 ∙HT(Q, c) / S(Q, c) (4)
I ligning 4 er DT0 den ekstrapolerte diffusjonsverdien til null konsentrasjon fra DLS-målingene (trinn 2.2.). HT beregnes som HT = 1 -c∙ [η], hvor c er proteinkonsentrasjonen, [η] er den iboende viskositeten beregnet av [η] = (η - η0) / η0 ∙ c, og η0 er den målte dynamiske viskositeten (trinn 2.3.-2.4.). Strukturfaktoren S(Q, c) ble hentet fra SAXS-målinger for IgG-proteinet og SANS-målinger for MBP-proteinet.
Figur 3 viser eksempler på mellomliggende spredningsfunksjoner I(Q, t) / I(Q, t = 0), målt ved NSE for IgG- og MBP-proteiner. Et klart avvik fra en enkel diffusjonslignende relaksasjonsprosess ble observert på den korte Fourier-tidsskalaen, <25 ns, noe som indikerer tilgjengeligheten av proteinintern dynamikk ved NSE og behovet for en mer kompleks modell for å beskrive de observerte dynamiske prosessene.
Figur 3: NSE-relaksasjonsspektra for IgG- og MBP-proteiner. IgG-dataene er vist her montert bare ved en enkelt eksponentiell funksjon for å avsløre avviket fra diffusjon ved kortere Fourier-tider. Avviket ble observert for begge proteiner. I motsetning til dette er MBP-dataene vist her i hele avslapningsområdet, montert av modellen utviklet avBiehl45. Modellen innebærer grovkorning og muliggjør samtidig tilpasning av korte, mellomliggende og lange Fourier-tidsregimer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Derfor ble spredningsfunksjonene utstyrt ved atommodellering av begge proteiner ved hjelp av modeller utviklet av Biehl, beskrevet i referansene 18,25,38,43,44,46. Den mellomliggende spredningsfunksjonen ble beregnet ved grovkorning til et par hundre individuelle korn, i motsetning til all-atom simulering, for å redusere beregningsbelastning og tid, og MMTK49-programvarebiblioteket (fritt tilgjengelig) ble brukt til å få tilgang til atomkoordinater og implementere transrotasjonsbevegelser på proteindomener og fragmenter. Resultatene av den mellomliggende spredningsfunksjonsberegningen for begge proteinene var i utmerket samsvar med de eksperimentelle NSE-dataene og viste at den langsommere dynamikken observert ved lange Fourier-tider kan tilskrives de samlede translasjons- og rotasjonsdiffusjonsprosessene, mens den raske dynamikken observert på korte tidsskalaer kan tilskrives dynamikken til proteindomener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NSE-spektroskopi gir en unik og detaljert oversikt over dynamikken til proteiner, som andre spektroskopiske teknikker ikke kan produsere. Målinger over en lengre tidsskala gir observasjoner av både proteinenes translasjons- og rotasjonsdiffusjon, som presentert her. Segmentdynamikken og andre interne svingninger avslører seg som et sterkt forfall av den sammenhengende spredningsfunksjonen S (Q, t) på kort tidsskala og er godt skilt fra de generelle diffusjonelle avslapningsprosessene. De viktigste begrensningene i NSE-teknikken er den utvidede måletiden og de store prøvevolumene som trengs for å oppnå et godt statistisk signal. Dette kan være en utfordring for å måle relevante makromolekylære systemer som viser lave konsentrasjoner av de mobile artene og redusert levetid.
Intern dynamikk i IgG
IgG-protein har en Y-formet struktur som er spesifikk for antistoffer som kan tilnærmes med tre store fragmenter forbundet med fleksible linkere. En matematisk modell av tre betydelige partikler bosatt i harmonisk potensial ble antatt for denne typen struktur. Linkerne ble tilnærmet av elastiske fjærer som gir en fast likevektsposisjon, men tillater svingninger som en form for brownsk bevegelse. Tre frihetsgrader ble tillatt for hvert fragment rundt den relativelikevekten 28. Den interne dynamikken representert ved Fint(Q, t) i ligning 2 ble beskrevet ved Ornstein-Uhlenbeck-prosessen50,51. Modellen tillater beregning av gjennomsnittlig kvadratforskyvning av fragmentene i potensiell dukkert, tidsskalaen for forskjellige bevegelser, friksjonen og kraftkonstantene som oppstår. Amplituden til den indre bevegelsen ble tilnærmet ved normalmodusanalyse, med tanke på forskjellige bevegelsesgrader for hvert fragment. En omfattende beskrivelse av modellen og de resulterende matematiske parametrene er ute av omfang her, men finnes i detalj i referanse28. I denne casestudien av IgG ble det observert en klar signatur av den interne dynamikken på tidsskalaen på flere nanosekunder. Den beregnede fjærkonstanten til linkeren ser ut til å være realistisk sammenlignbar med en entropisk fjær av tilsvarende lengde. Den observerte effektive friksjonen synes nær friksjonen til et fritt ubundet IgG-fragment. Den eksisterende likevektshypotesen ble validert, med antatte sameksisterende "åpne" eller "lukkede" konfigurasjoner av IgG-er som er i likevekt som viser forskjellige bindingssteder og bindingsspesifisiteter28. Denne informasjonen kan være relevant for å forstå mekanikken til antistoffer og om den mekaniske oppførselen kan brukes til å forbedre biokompatibilitet og biotilgjengelighet.
Intern dynamikk i MBP
MBP-strukturen har en kompakt kulekjerne som tillater sterke strekk- og bøyebevegelser med sine fleksible tilfeldige spoleender. MBP-dynamikken ble tolket ved hjelp av fleksible polymermodeller med og uten tillegg av intern friksjon28,39. Som i tilfellet med IgG, kan observasjonene av den interne dynamikken til MBP forenes innenfor teorien om brownsk bevegelse, der en større bevegelsesamplitude resulterer i lengre avslapningstid med påvirkninger fra den indre friksjonen i proteinkjeden. Den økte avslapningstiden med en større amplitude av bevegelser, men mindre friksjon kan beskrives ved å bruke den samme Ornstein-Uhlenbeck-prosessen50,51 av brownsk bevegelse i et harmonisk potensial. Interne bevegelser med store amplituder, men langsomme avslapningstider, blir aktive ved full denaturering av MBP fra sin opprinnelige tilstand ved å redusere gjenopprettingskreftene i kjedekonfigurasjonen (dihedralpotensialer) og ved å jevne ut de lokale energibarrierene. Detaljerte beskrivelser av MBPs interne dynamikk i opprinnelig og denaturert tilstand finnes videre i referansene28,39. I studien av MBP viste undersøkelsen ved bruk av NSE en dynamisk oppførsel som peker mot mellomliggende kompaktitet av proteinet mellom tilfeldige spolepolymerer og kuleformede proteiner. Det betydelige bidraget av intern proteindynamikk med en avslapningshastighet på flere nanosekunder ble styrt av lavfrekvente kollektive strekk- og bøyebevegelser5. Beskrivelse av den opprinnelige MBP-dynamikken ved modeller fra polymerteorinedbrytning ble gitt på grunn av en stor verdi av proteinintern friksjon. I denaturert MBP reduseres den interne friksjonen i proteinkjeden, og polymerkjedekarakteren til avslapningsspekteret hersker. Den høye fleksibiliteten til de strukturelle ensemblebevegelsene kan bidra til å øke den tilgjengelige proteinoverflaten, og dermed lette samspillet med forskjellige bindingspartnere.
Dynamiske modeller
Mens NSE som en teknikk er eksperimentelt unik for å vurdere lavfrekvente harmoniske bevegelser i biologiske makromolekyler og molekylære underenheter, krever analysen av den mellomliggende spredningsfunksjonen en sammenligning med nøytronspektra avledet fra forskjellige matematiske modeller. Modellen som presenteres her og utvikles av Biehl et al.28 for konsentrerte proteinløsninger, bruker en elastisk nettverkstilnærming, der den mellomliggende spredningsfunksjonen er en konvolusjon av riktige modulære funksjoner, og brownske oscillatorer representerer den interne dynamikken. Dette er en av de svært få tilgjengelige modellene for å analysere segmentdynamikken til proteiner. En annen veletablert modell for fortynnede proteinløsninger er modellen foreslått av Bu et al.52, som er en robust modell som bruker statistisk mekanikk og ikke krever komplekse tilpasninger eller flere parametere. En lignende tilnærming basert på dynamisk frakoblingstilnærming kan også brukes på fortynnede systemer for å karakterisere den effektive diffusjonen som en sum av selvtranslasjonelle og interne bevegelser53. Flere av våre referanser kan gi omfattende rapportering om disse modellene og deres begrensninger. Vi anbefaler på det sterkeste et al.1 og Liu et al.54.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser og ingen interessekonflikter. Manuskriptets innhold er basert på foredraget forfatteren presenterte i HANDS-Neutron Scattering Applications in Structural Biology School mellom 2019-2021.
Acknowledgments
Denne forskningen brukte ressurser på Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, biologi og kjemi laboratorier), et DOE Office of the Science User Facility som drives av Oak Ridge National Laboratory. Denne forskningen brukte også ressurser ved MLZ-FRM2-reaktoren Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) og JCNS1 ved Forschungszentrum Jülich GmbH, Tyskland. Forfatteren anerkjenner Dr. Ralf Biehl og Dr. Andreas Stadler for deres hjelp med modellering og deres bidrag til både IgG og MBP proteiner forskning, Dr. Piotr A. Żołnierczuk for NSE data reduksjon støtte, Dr. Changwoo Do for støtte med SANS målinger, og Rhonda Moody og Dr. Kevin Weiss for SNS biokjemi lab støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine MBP protein solution | Sigma-Aldrich | M1891 | lyophilized powder reconstituted in D2O |
| D2O - heavy water | Sigma-Aldrich | Product No. 151882 | liquid |
| Dionized water | in house | - | for washing / cleanning cells |
| DLS instrument | Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich | - | dynamic light scattering instrument |
| Elastic scattering standards | SNS-NSE, ORNL | - | Al2O3 and Graphite powders |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 65350-M | 70% ethanol for cleaning cells |
| IgG protein solution | Sigma-Aldrich | I4506 | lyophilized powder reconstituted in D2O |
| KWS-2 instrument | JCNS outstation at the MLZ, Garching, Germany | - | small angle neutron instrument |
| Liquinox dish detergent | Alconox | - | Phosphate-free liquid lab glassware cleaner |
| Na2HPO4·7H2O | Sigma-Aldrich | Product No.S9390 | disodium phosphate heptahydrate salt |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Product No.S9888 | sodium chloride salt |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | Product No. S9638 | monosodium phosphate monohydrate salt |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Catalog number: ND-2000 | NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer |
| Neutron alignment camera | NeutronOptics, Grenoble | NOG210222 | 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor |
| Parafilm M - wax parafilm | Bemis | Parafilm M - 5259-04LC PM996 | all-purpose laboratory film in cardboard dispenser |
| Phoenix-J-NSE Spectrometer | JCNS outstation at the MLZ, Garching, Germany | - | neutron spectrometer |
| SasView | https://www.sasview.org/ | ||
| SAXSpace, Anton Paar instrument | FZ-Jülich | - | small angle x-ray instrument |
| Slide-A-Lyzer dialysis membranes | Thermo Scientific | 88400-88405 | Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO |
| SNS Remote Analysis Cluster | Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) | https://analysis.sns.gov | |
| SNS-NSE spectrometer | ORNL, Oak Ridge, TN, USA | - | neutron spectrometer |
| Sterile syringe filters | VWR | N.A. PN:28145-501 | 0.2 µm pore size filters |
| Temperature Forcing System (TFS) | SP Scientific | Part Number 100004055 | sample environment equipment |
| Urea -d4 | Sigma-Aldrich | Product No. 176087 | deuterated Urea salt |
| Viscometer | FZ-Jülich | - | falling ball viscometer |
References
- Fitter, J., Gutberlet, T., Katsaras, J. Neutron Scattering in Biology: Techniques and Applications. , New York. (2006).
- Stadler, A., Monkenbusch, M., Biehl, R., Richter, D., Ollivier, J. Neutron spin-echo and TOF reveals protein dynamics in solution. Journal of the Physical Society of Japan. 82, (2013).
- Inoue, R. Large domain fluctuations on 50-ns timescale enable catalytic activity in phosphoglycerate kinase. Biophysical Journal. 99 (7), 2309-2317 (2010).
- Callaway, D. J. E., et al. Controllable activation of nanoscale dynamics in a disordered protein alters binding kinetics. Journal of Molecular Biology. 429 (7), 987-998 (2017).
- Stingaciu, L. R., Biehl, R., Changwoo, D., Richter, D., Stadler, A. M. Reduced internal friction by osmolyte interaction in intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (1), 292-296 (2020).
- Monkenbusch, M., Richter, D. High resolution neutron spectroscopy-a tool for the investigation of dynamics of polymers and soft matter. Comptes Rendus Physique. , (2007).
- Richter, D., Monkenbusch, M., Schwahn, D. Neutron Scattering. Polymer Science: A Comprehensive Reference, 10 Volume Set. , (2012).
- Wilson, C. C. Single Crystal Neutron Diffraction From Molecular Materials. , World Scientific. Singapore. (2000).
- Marshall, W. Theory of thermal neutron scattering. , Oxford University Press. (1971).
- Roger Pynn Introduction & Neutron Scattering "Theory". , Available from: https://neutrons.ornl.gov/sites/default/files/intro_to_neutron_scattering.pdf (2004).
- Richter, D. Neutron scattering in polymer physics. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 22-29 (2000).
- Harroun, T. A., Wignall, G. D., Katsaras, J. Neutron scattering for biology. Neutron Scattering in Biology. , (2006).
- SNS. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/sna (2020).
- HFIR. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/hfir (2020).
- CNCS. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/cncs (2020).
- Perticaroli, S., et al. Description of hydration water in protein (green fluorescent protein) solution. Journal of the American Chemical Society. 139 (3), 1098-1105 (2017).
- Perticaroli, S., Nickels, J. D., Ehlers, G., Sokolov, A. P. Rigidity, secondary structure, and the universality of the boson peak in proteins. Biophysical Journal. 106 (12), 2667-2674 (2014).
- Miao, Y., et al. Coupled flexibility change in cytochrome p450cam substrate binding determined by neutron scattering, NMR, and molecular dynamics simulation. Biophysical Journal. 103 (10), 2167-2176 (2012).
- Mamontov, E., Zamponi, M., Hammons, S., Keener, W. S., Hagen, M., Herwig, K. W. BASIS: A new backscattering spectrometer at the SNS. Neutron News. 19 (3), 22-24 (2008).
- Mamontov, E. Microscopic diffusion processes measured in living planarians. Scientific Reports. 9, 8708 (2018).
- Alpert, Y., Cser, L., Faragó, B., Franěk, F., Mezei, F., Ostanevich, Y. M. Segmental flexibility in pig immunoglobulin G studied by neutron spin-echo technique. Biopolymers. 24 (9), 1769-1784 (1985).
- Bu, Z., Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D., Callaway, D. J. E. Coupled protein domain motion in Taq polymerase revealed by neutron spin-echo spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (49), 17646-17651 (2005).
- Biehl, R., et al. Direct observation of correlated interdomain motion in alcohol dehydrogenase. Physical Review Letters. 101, 138102 (2008).
- Farago, B., Li, J., Cornilescu, G., Callaway, D. J. E., Bu, Z. Activation of nanoscale allosteric protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Journal. 99 (10), 3473-3482 (2010).
- Bu, Z., Callaway, D. J. E. Dynamic propagation of long-range allosteric signals by nanoscale protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Journal. 100 (3), 223 (2011).
- Hong, L., et al. Structure and dynamics of a compact state of a multidomain protein, the mercuric ion reductase. Biophysical Journal. 107 (2), 393-400 (2014).
- Longeville, S., Stingaciu, L. -R. Hemoglobin diffusion and the dynamics of oxygen capture by red blood cells. Scientific Reports. 7, 10448 (2017).
- Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring. Scientific Reports. 6, 22148 (2016).
- Hahn, E. L. Nuclear induction due to free larmor precession. Physical Review. 77, 297 (1950).
- Hahn, E. L. Spin echoes. Physical Review. 80, 580 (1950).
- Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735-1782 (2003).
- Sasview. , Available from: https://www.sasview.org (2020).
- Zhao, J. K., Gao, C. Y., Liu, D. The extended Q-range small-angle neutron scattering diffractometer at the SNS. Journal of Applied Crystallography. 43, 5 PART 1 1068-1077 (2010).
- Ohl, M., et al. The high-resolution neutron spin-echo spectrometer for the SNS with τ ≥ 1 µs. Physica B: Condensed Matter. 350, 147-150 (2004).
- SNS-NSE web page. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/nse (2022).
- Ohl, M., et al. The spin-echo spectrometer at the Spallation Neutron Source (SNS). Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 696, 85-99 (2012).
- Zolnierczuk, P. A., Holderer, O., Pasini, S., Kozielewski, T., Stingaciu, L. R., Monkenbusch, M. Efficient data extraction from neutron time-of-flight spin-echo raw data. Journal of Applied Crystallography. 52 (5), 1022-1034 (2019).
- Dr Spine hub. , Available from: https://jugit.fz-juelich.de/nse/drspine (2022).
- Stadler, A. M., et al. Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), (2014).
- FZJ. , Available from: https://www.fz-juelich.de/portal/EN/AboutUs (2022).
- KWS2. , Available from: https://miz-garching.de/kws-2 (2022).
- Moorhouse, M., Barry, P. The protein databank. Bioinformatics Biocomputing and Perl. , (2005).
- Tria, G., Mertens, H. D. T., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (2), 207-217 (2015).
- Holderer, O., Monkenbusch, M., Schätzler, R., Kleines, H., Westerhausen, W., Richter, D. The JCNS neutron spin-echo spectrometer J-NSE at the FRM II. Measurement Science and Technology. 90 (4), 043107 (2008).
- Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D. Exploring internal protein dynamics by neutron spin echo spectroscopy. Soft Matter. 7 (4), 1299-1307 (2011).
- Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring. Scientific Reports. 6, 22148 (2016).
- Stadler, A. M., et al. Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6987-6994 (2014).
- Biehl, R., Richter, D. Slow internal protein dynamics in solution. Journal of Physics: Condensed Matter. 26 (50), 503103 (2014).
- Hinsen, K. The molecular modeling toolkit: A new approach to molecular simulations. Journal of Computational Chemistry. 21 (2), 79-85 (2000).
- Uhlenbeck, G. E., Ornstein, L. S. On the theory of the Brownian motion. Physical Review. 36 (5), 823 (1930).
- Wang, M. C., Uhlenbeck, G. E. On the theory of the Brownian motion II. Reviews of Modern Physics. 17, 323 (1945).
- Callaway, D. J. E., Bu, Z. Nanoscale protein domain motion and long-range allostery in signaling proteins-a view from neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Reviews. 7 (2), 165-174 (2015).
- Liu, Y. Intermediate scattering function for macromolecules in solution probed by neutron spin echo. Physical Review E. 95, 020501 (2017).
- Liu, Y. Short-time dynamics of proteins in solutions studied by neutron spin echo. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 42, 147-156 (2019).
