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Engineering

Estudo da Dinâmica da Proteína via Espectroscopia de Eco de Neutron Spin

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/61862
Automatic Translation
1
1NSD, Oak Ridge National Laboratory

Summary

O presente protocolo descreve métodos para investigar a estrutura e a dinâmica de duas proteínas modelo que têm um papel importante na saúde humana. A técnica combina caracterização biofísica de bancada com espectroscopia de eco de giro de nêutrons para acessar a dinâmica em escalas de tempo e comprimento relevantes para movimentos interdomínios proteicos.

Abstract

A atividade e funcionalidade da maioria das proteínas do corpo humano estão relacionadas a mudanças configurais de subdomínios inteiros dentro da estrutura cristalina proteica. As estruturas cristalinas constroem a base para qualquer cálculo que descreva a estrutura ou dinâmica de uma proteína, na maioria das vezes com fortes restrições geométricas. No entanto, essas restrições da estrutura cristalina não estão presentes na solução. A estrutura das proteínas na solução pode diferir do cristal devido a rearranjos de laços ou subdomínios no pico para escala de tempo nanossegundo (ou seja, o regime de tempo da dinâmica proteica interna). O presente trabalho descreve como as câmeras lentas em escalas de tempo de várias dezenas de nanossegundos podem ser acessadas usando dispersão de nêutrons. Em particular, a caracterização dinâmica de duas grandes proteínas humanas, uma proteína intrinsecamente desordenada que carece de uma estrutura secundária bem definida e uma proteína de anticorpos clássicos, é abordada pela espectroscopia de eco de spin de nêutrons (NSE) combinada com uma ampla gama de métodos de caracterização laboratorial. Mais insights sobre a dinâmica do domínio proteico foram obtidos usando modelagem matemática para descrever os dados experimentais de nêutrons e determinar o cruzamento entre movimentos difusivos combinados e proteicos internos. A extração da contribuição dinâmica interna para a função de dispersão intermediária obtida da NSE, incluindo a escala de tempo dos diversos movimentos, permite maior visão nas propriedades mecânicas de proteínas únicas e na maciez das proteínas em seu ambiente quase natural na solução de proteínas lotadas.

Introduction

Dinâmica de sondagem de matéria macia com nêutrons
Investigar as propriedades dinâmicas de proteínas e peptídeos é uma parte importante da pesquisa biofísica, e muitos métodos bem desenvolvidos existem hoje para acessar uma ampla gama de paisagens energéticas1. Relacionar a dinâmica experimentalmente revelada das proteínas à sua função biológica é uma tarefa muito mais difícil, exigindo modelos matemáticos complexos e simulações dinâmicas auxiliadas por computador. A importância da espectroscopia de nêutrons para a análise de movimentos proteicos tem sido enfatizada em diversos estudos bem recebidos e amplamente reconhecidos 1,2,3,4,5. Antes de explorar a paisagem energética diversificada da dinâmica interna de proteínas, uma breve visão geral dos processos dinâmicos em matéria suave e como os nêutrons podem acessá-los é necessária.

A sensibilidade dos nêutrons à configuração isotópica e o tipo de interações que exibem com matéria macia faz da dispersão de nêutrons uma das técnicas de investigação mais versáteis6. Há um amplo espectro de escalas de comprimento de correlação e tempos de correlação que os nêutrons podem acessar, desde excitações nucleares e vibrações atômicas até movimentos coletivos e processos de relaxamento lentos, como rotações isotrópicas e movimentos difusivos. Ao investigar os nêutrons dispersos para sua transferência de energia, três interações principais podem ser distinguidas: a dispersão elástica, na qual não há troca de energia entre nêutrons e partículas de entrada na amostra; a dispersão inelástica, com uma grande troca de energia quantificável entre nêutrons e partículas; e o caso peculiar de dispersão quase elástica que designa uma transferência de energia muito pequena em comparação com o incidente de energia de nêutrons 1,7. Essas interações dão informações precisas sobre o material investigado e formam a base teórica de uma ampla variedade de técnicas de dispersão de nêutrons.

Em dispersão elástica, o detector registra as direções dos nêutrons como um padrão de difração, que mostra a posição dos átomos amostrais em relação um ao outro. Informações sobre as correlações das posições atômicas são adquiridas (ou seja, intensidade integrada S(Q) relativa à transferência de impulso Q, que diz respeito apenas à informação estrutural). Este princípio forma a base da difração de nêutrons8.

A complexidade surge quando a transferência de energia não é mais zero devido a excitações e flutuações internas no material amostral. Isso forma a base da espectroscopia de nêutrons, na qual os nêutrons dispersos são investigados em função tanto da transferência de energia E quanto da transferência de impulso Q. Informações dinâmicas e estruturais são obtidas. A espectroscopia de nêutrons mede a mesma intensidade integrada S(Q) para transferência de energia (ou seja, mudança de velocidade dos nêutrons devido à dispersão amostral, S(Q,ω) = S(Q, E), que também é referido como o fator de estrutura dinâmica)9.

Para calcular a dispersão de um material, é mais adequado usar a função de correlação do par 7,10. No caso da difração, a função de correlação do par estático G(r) dá a probabilidade de encontrar o centro de uma partícula a uma determinada distância r do centro de outra partícula. A espectroscopia generaliza a função de correlação do par estático e inclui energia/frequência/tempo na equação de dispersão. A função de correlação de par G(r) torna-se uma função do tempo G(r, t), que pode ser decomposta em uma função de correlação de par de átomos distinta GD(r, t), e uma função de auto-correlação GS(r, t). Estes descrevem dois tipos de correlações: movimentos correlacionados por pares de átomos que regem a dispersão coerente, e a auto-correlação que rege a dispersão incoerente10.

A dispersão coerente é a dispersão da "média" e depende da fase relativa das ondas dispersas. No regime de dispersão de pequenos ângulos, as ondas de nêutrons dispersas de diferentes centros de dispersão (diferentes átomos) interferem construtivamente (têm fases semelhantes), e o movimento coletivo dos átomos é observado com forte aumento de intensidade. A dispersão coerente descreve essencialmente a dispersão de um único nêutron de todos os núcleos da amostra10.

Quando não ocorre interferência construtiva entre as ondas de nêutrons dispersas de diferentes centros, um único átomo é seguido no tempo, e a auto-correlação entre a posição do átomo no momento t = 0 e o mesmo átomo no momento em que t é observado. Assim, as informações sobre as posições relativas dos átomos são perdidas, e o foco está apenas nas flutuações locais. A dispersão das flutuações locais rege a dispersão incoerente. A dispersão incoerente é isotrópica, contribui para o sinal de fundo e degrada o sinal-para-ruído10,11.

Combinando todos os processos acima, distinguimos quatro grandes processos de dispersão de nêutrons10: (1) elástico coerente (mede as correlações das posições atômicas), (2) inelástico coerente (mede movimentos coletivos de átomos), (3) elástico incoerente (contribui para o fundo, reduz a intensidade de dispersão pelo fator Debye-Waller (DWF) e mede o fator de estrutura incoerente elástico (EISF), descrevendo a geometria dos movimentos difusivos na geometria confinada, e (4) incoerentes inelesses (mede dinâmica de átomo único e auto correlação).

Os processos dinâmicos que os nêutrons podem acessar na biologia vão desde o amortecimento de vibrações atômicas e moleculares de baixa frequência, a interação de moléculas de solventes com bio-superfícies e processos de difusão na camada de hidratação de macromoléculas e geometria confinada, até movimentos translacionais, rotacionais e difusivos de curto alcance, e domínios proteicos e movimentos alotéricos1 . A ampla diversidade de métodos e instrumentos de nêutrons para medir a dinâmica proteica baseia-se na forma como a acromatização do feixe de nêutrons incidente ou saída é alcançada e como a análise energética dos nêutrons dispersos é realizada. De eixo triplo a espectrômetros de retorno e spin-echo, pode-se explorar processos dinâmicos com tempos característicos entre 1 x 10-14 s e 1 x 10-6 s (femtosegundos a microsegundos)12.

Oak Ridge National Laboratory, com suas duas renomadas fontes de nêutrons, a Fonte de Nêutrons Spallation - SNS13 e o Reator de Fluxo de Alto Isótopo - HFIR14, tem uma das melhores suítes de espectrômetros para investigar dinâmicas em bioquímicos. Alguns dos exemplos mais eloquentes incluem o uso do espectrômetro de helicóptero de nêutrons frio (CNCS) no SNS15 para investigar a perturbação dinâmica da água de hidratação em torno da proteína fluorescente verde na solução16 ou as vibrações coletivas sub-picosegundos de várias proteínas17. Um problema recorrente das investigações inelásticas de dispersão de nêutrons é que alguns processos biológicos são muito lentos para serem observados. Sem configurações extremas que levam a uma enorme perda de intensidade de nêutrons, os espectrômetros de tempo de voo são limitados à resolução de energia de 10 μeV, correspondendo a uma escala de tempo máxima de ~200 ps10,11. Isso não é suficiente para observar movimentos em larga escala em proteínas. Portanto, instrumentos com maior resolução de energia, como os espectrômetros de backscattering, são frequentemente necessários. A combinação das técnicas de tempo de voo e backscattering tem se mostrado poderosa para investigar a mudança na dinâmica interna do Cytochrome P450cam (CYP101), uma enzima que catalisa a cânfora de hidroxiagem18.

A difusividade microscópica medida pelo espectrômetro de backscattering no SNS-BASE19 foi surpreendentemente bem definida e poderia ser separada na difusividade da água (hidratação, citoplasmático e água a granel) e a difusividade dos constituintes celulares em flatworms planárias, o primeiro animal vivo a ser estudado pela dispersão de nêutrons20 . Backscattering é uma técnica espectroscópica de alta resolução, mas também é limitada a vários μeV = vários nanossegundos, enquanto a dinâmica lenta em biomateriais também se manifesta como o tempo de sobrevivência da correlação entre posição atômica ou orientações de spin (por exemplo, processos de relaxamento, que acontecem regularmente na faixa de tempo de dez a centenas de nanossegundos).

A espectroscopia de eco de giro de nêutrons (NSE) é a única técnica de dispersão de nêutrons a atingir tal alta resolução. Ao contrário de outras técnicas de nêutrons, a NSE não requer acromatização do feixe, pois usa a fase mecânica quântica dos nêutrons, que são seus momentos magnéticos. A manipulação de momentos magnéticos permite o uso de uma ampla distribuição de comprimento de onda de feixe de nêutrons, enquanto a técnica é sensível a pequenas mudanças de velocidade de nêutrons na ordem de 1 x 10-4. A NSE tem sido usada com sucesso para investigar a lenta dinâmica das proteínas em solução para muitas proteínas. Entre esses muitos estudos pioneiros, reconhecemos o estudo da flexibilidade segmental da imunoglobulinasuína 21; os movimentos de domínio acoplado na polimerase Taq22; os movimentos de domínio no tetramer do álcool levedura desidrogenase23; a alteração da conformação na quinase fosfoglicerato sobre a ligação do substrato3; a ativação dos movimentos de domínio e a propagação dinâmica de sinais aluséricos na proteína de cofactor regulatório de câmbio Na+/H+ 1 (NHERF1) 4,24,25; a dinâmica de um estado compacto de redução de íons mercuricos26; e a difusão da hemoglobina em glóbulos vermelhos27. Dois estudos mais recentes em dinâmica proteica expuseram a flexibilidade do anticorpo humano Imunoglobulina G (IgG) como uma mola entropica28 e as características da contribuição do solvente para a dinâmica da proteína básica de mielina intrinsecamente desordenada (MBP)5.

O presente artigo explica os princípios básicos da NSE, os múltiplos métodos preparatórios recomendados para uma investigação minuciosa da dinâmica proteica, bem como a metodologia e o protocolo experimental para aquisição de dados NSE no espectrômetro NSE na SNS, SNS-NSE. O protocolo caracteriza duas proteínas: IgG, uma proteína de anticorpos humanos regular, e a proteína intrinsecamente desordenada MBP. As implicações biofísicas, a relevância da pesquisa dos exemplos e as limitações da técnica são discutidas brevemente.

Espectroscopia NSE, o método para medições dinâmicas lentas
NSE é uma técnica polarizada que usa o tempo de voo de nêutrons para medir a troca de energia (perda de polarização) devido à interação quase elástica entre nêutrons e átomos em uma amostra. No núcleo da espectroscopia NSE estão dois princípios básicos: (1) a capacidade do giro de nêutrons para precess no campo magnético com uma frequência proporcional à força Equation 1magnética , ou seja, a frequência larmor29, e (b) o spin-echo ou Hann echo, representando a manipulação e refoco do sinal de polarização ao aplicar uma série de pulsos de radiofrequência30.

O básico do processo NSE pode ser resumido em algumas etapas simples 6,11 usando a Figura 1. (1) O feixe de nêutrons produzido pela fonte (posição 1) é polarizado (posição 2), guiado e transportado (posição 3), e chega à entrada do espectrômetro NSE, onde é girado por 90° pela primeira nadadeira pi-half (posição 4). (2) O feixe polarizado (por exemplo, momentos magnéticos de nêutrons) torna-se perpendicular às linhas de campo magnético do primeiro ímã (primeira zona de pré-cessão, posição 5) e começa a precess. (3) No final do ímã, os giros de nêutrons acumulam um certo ângulo de pré-cessão proporcional à força do campo magnético e ao tempo de voo gasto no interior (basicamente inversamente proporcional à velocidade de nêutrons). As velocidades individuais de nêutrons são codificadas dentro de seu ângulo de precessão no final da primeira zona de precessão. (4) Perto da posição da amostra, o pi-flipper (posição 6) inverte a orientação da rotação em 180°, alterando o sinal do ângulo de precessão. (5) Os nêutrons interagem com as moléculas da amostra (posição 7) e ficam dispersos. (6) Os nêutrons dispersos entram e precess na segunda zona de pré-cessão (posição 8), mas tornam-se orientados para a inversão. (7) Outra nadadeira pi-half (posição 9) é usada para girar a orientação do giro do perpendicular à direção horizontal. Isso impedirá a precessão, traduzindo o ângulo de precessão φ em polarização proporcional à cos(φ). (8) O analisador (posição 10) seleciona os nêutrons com base em uma orientação. Se a interação com a amostra for elástica, a velocidade do nêutron não mudará. Os nêutrons passarão um tempo idêntico voando na primeira e segunda zonas de pré-cessão, e os ângulos acumulados de precessão estão totalmente recuperados. A polarização completa é restaurada no detector (posição 11) como um eco da polarização original (ou seja, spin-echo). (9) No entanto, em NSE, a dispersão é quase elástica, de modo que uma pequena troca de energia entre nêutrons e moléculas de amostras leva a diferentes velocidades de nêutrons após a dispersão pela amostra. Devido às diferentes velocidades, os nêutrons passarão um tempo adicional voando pela segunda zona de pré-cessão e não terão recuperado adequadamente seu ângulo de precessão. Uma polarização parcial é recuperada no detector, e a perda de polarização devido ao relaxamento do giro é proporcional à transformação cos-Fourier da função espectral S(Q, ω), a função de dispersão intermediária F(Q, t). (10) O parâmetro de tempo da função F(Q, t) é proporcional à força do campo magnético de pré-cessão. A varredura da perda de polarização em função da força do campo magnético rende, portanto, uma função de relaxamento que depende dos processos dinâmicos dentro da amostra.

Figure 1
Figura 1: Fotografia do espectrômetro NSE no SNS (SNS-NSE) e esquema de caminho de mosca de nêutrons com os componentes funcionais mais importantes. Da direita para a esquerda: 1 = fonte de nêutrons; 2 = sistema de obturadores-bender-bender-polarizador-secundário; 3 = guias de transporte de vigas; 4 = flipper pi/2 para o primeiro giro de 90°; 5 = primeira zona de pré-cessão; 6 = flipper pi para giro de 180°; 7 = área amostral e ambiente amostral (aqui, mostra-se o crio-forno); 8 = segunda zona de pré-cessão; 9 = pi/2 flipper para o segundo giro de 90°; 10 = analisador; 11 = detector. (Observe que as porções de 3, bem como 2 e 1 , estão situadas atrás da parede azul dentro da blindagem; os helicópteros são substituídos por um seletor de velocidade para NSE baseado em reator). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

O presente trabalho caracteriza duas proteínas: uma proteína de anticorpos humanos regular IgG, e a MBP intrinsecamente desordenada. A forma liofilizada das proteínas foi obtida a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação da amostra de proteína

  1. Prepare um fosfato de sódio de 50 mM + tampão de NaCl de 0,1 M, pesando e dissolvendo os respectivos reagentes sólidos em água pesada (D2O) (ver Tabela de Materiais). Este é o solvente tampão deuterado para IgG.
    1. Ajuste o pH da solução tampão para 6.6.
  2. Prepare um fosfato de sódio de 20 mM + tampão de ureia de 6 M pesando e dissolvendo os respectivos componentes sólidos em água pesada (D2O). Este é o solvente tampão deuterado para MBP.
    1. Ajuste o pH da solução tampão para 4.7.
  3. Filtre os solventes tampão usando filtros de tamanho de poros de 0,2 μm (ver Tabela de Materiais).
  4. Pesar e dissolver os pós liofilizados de proteínas purificadas nos solventes deuterados para as respectivas proteínas (Etapas 1.1.-1.2.) em alta concentração proteica (~50 mg/mL).
  5. Carregue a solução proteica em cestos de diálise com membranas de diálise de 3,5 K MWCO, e dique contra o tampão filtrado por 24h a 10 °C para MBP e 25 °C para IgG (ver Tabela de Materiais) sacudindo ligeiramente os tubos para criar um gradiente de difusão.
  6. Diluir a solução proteica utilizando o tampão de diálise em uma série de concentrações: 1, 2, 5, 10 e 50 mg/mL.
  7. Determine as concentrações exatas usando um espectrômetro nanodrop (ver Tabela de Materiais).

2. Caracterização preliminar da amostra por dispersão dinâmica de luz (DLS)

  1. Carregue 80 μL de cada solução proteica da série de concentração preparada acima (Passo 1.6.) na célula descartável DLS (ver Tabela de Materiais) e determine os coeficientes de difusão, com média superior a 10 aquisições.
  2. Traçar os coeficientes de difusão translacional em função da concentração proteica e extrapolar para concentração zero.
  3. Carregue cada solução proteica da série de concentração nos tubos capilares de um viscometro (ver Tabela de Materiais) e meça a viscosidade dinâmica.
  4. Traçar as viscosidades dinâmicas medidas em função da concentração proteica e extrapolar para concentração zero.
    NOTA: A extrapolação da difusão do DLS para concentração zero produz o valor da difusão translacional para uma única proteína. A extrapolação da viscosidade dinâmica para a concentração zero deve produzir o valor dinâmico de viscosidade medido experimentalmente para a solução tampão.

3. Coleta de dispersão de pequenos ângulos (nêutrons ou raio-x)

  1. Meça a dispersão de nêutrons de pequeno ângulo (SANS) e/ou dispersão de raios-X de pequeno ângulo (SAXS) (ver Tabela de Materiais) em quatro concentrações proteicas, de preferência 2 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL e 50 mg/mL.
  2. Normalize os espectros SANS e SAXS por concentração de proteínas.
  3. Ajuste o fator de forma proteica P(Q) no espectro SANS e SAXS usando a otimização do conjunto31 e/ou o software SasView32 .
  4. Calcule o fator estrutura S(Q, c) dividindo o sinal SANS e SAXS com P(Q) para cada concentração.
    NOTA: Os leitores interessados em medir e interpretar dados de dispersão de pequenos ângulos como suporte às medições nse são encorajados a consultar minuciosamente as referências 23,28,31,32,33.

4. Medição de NSE

  1. Configure-se para o experimento e monte a amostra seguindo os passos abaixo.
    1. Selecione a espessura da célula para carregamento amostral com base na concentração da solução proteica, na temperatura necessária para a medição e na quantidade de solução disponível.
      NOTA: O presente estudo utilizou recipientes de quartzo transparentes de 40 mm x 30 mm x 4 mm.
    2. Limpe a célula repetidamente, alternando entre detergente de prato livre de fosfato (ver Tabela de Materiais), água deionizada e 70% etanol.
    3. Seque a célula no forno de convecção; não exceda 80 °C para as células de quartzo.
    4. Carregue 4 mL de solução proteica na célula e feche com tampas. Use filme de cera ou qualquer selante (ver Tabela de Materiais) para selar as células da amostra.
      NOTA: No presente estudo, foram utilizados 4,8 mL de solução a ~50 mg/mL para obter intensidade de dispersão suficiente.
    5. Carregue 4 mL de tampão de diálise em um recipiente idêntico à amostra e vedação de proteínas.
    6. Transporte amostras para a linha de feixe, feche o obturador e entre na área da caverna do gabinete do espectrômetro34.
    7. Monte a célula amostra no suporte da amostra de alumínio apertando os parafusos e as placas de retenção (Figura 2, painel esquerdo).
      NOTA: Pode-se montar duas células amostrais ao mesmo tempo, dado que o mesmo protocolo de medição é necessário para todas as amostras.
    8. Monte a amostra de grafite e/ou Al2O3 amostra de pó carregada em um recipiente idêntico à amostra de proteína. Estes são padrões fornecidos pelo suporte de linha de vigas SNS-NSE.
    9. Coloque o suporte da amostra deslizando-o suavemente na lata do sistema de força de temperatura (TFS, consulte Tabela de Materiais).
      NOTA: O TFS é o ambiente amostral mais utilizado no SNS-NSE e bombeia ar seco no recipiente de amostra para atingir a temperatura desejada (Figura 2, painéis médios e direito).
    10. Feche a tampa TFS e defina a temperatura ao valor desejado acessando a tela interativa do TFS.
    11. Monte a câmera de nêutrons (ver Tabela de Materiais) para o alinhamento das amostras ao feixe.
    12. Varrer o compartimento do instrumento, evacuar, fechar as portas e abrir o obturador.
      NOTA: As células amostrais são fornecidas pelo suporte de feixe SNS-NSE. Para células de amostra disponíveis e a biblioteca de ambientes de amostra, consulte a página webde feixe SNS-NSE 7,35.
  2. Colete os dados nse seguindo as etapas abaixo.
    1. Alinhe a amostra no feixe de nêutrons usando a câmera de nêutrons e as quatro aberturas de amostra independentes.
    2. Abra o software de coleta de dados SNS-NSE36 e colete estatísticas de amostra executando varreduras de difração para os ângulos de dispersão desejados e comprimento de onda.
    3. Configure os parâmetros de medição com base nas estatísticas coletadas para cada amostra, editando as macros de medição fornecidas pelo Cientista de Instrumentos Auxiliares.
    4. Comece a digitalizar digitando o nome do protocolo no prompter de comando e adquira ecos para a amostra.
    5. Comece a digitalizar e adquira ecos também para a referência elástica e o solvente tamponado. Realize a operação do obturador intermitente para a troca da amostra.

Figure 2
Figura 2: Sistema de medição NSE. Painel esquerdo: amostras de solução proteica em recipiente de quartzo montado com parafusos e placas no suporte de amostra de alumínio (Al). O porta-amostras Al oferece a possibilidade de montar duas amostras simultaneamente dentro do ambiente amostral. Painel médio: A amostra do sistema de força de temperatura (TFS) pode ser montada no estágio da amostra a janela do feixe de nêutrons está à direita, enquanto a câmera de nêutrons usada para alinhamento é visível no lado esquerdo. Painel direito: colocar o suporte de amostra com duas amostras na amostra pode funcionar com janelas de silicone (Si). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Redução de dados da NSE

NOTA: O SNS-NSE está equipado com um software dedicado chamado DrSpine (redução de dados para spin-echo)37,38 disponível no OrNL Neutron Sciences Remote Analysis Cluster, um Guia de Usuário Rápido e suporte de ajuda incorporado.

  1. Faça login no Cluster de Análise Remota da Neutron Sciences (ver Tabela de Materiais) com as credenciais do usuário ORNL e pressione o botão Sessão de Lançamento .
  2. Configure o software de redução de dados seguindo as etapas abaixo.
    1. No diretório do usuário, abra uma janela e tipo de terminal: fonte/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh.
    2. Em seguida, digite: drspine_create_env.sh.
  3. Crie uma pasta para a redução de dados no diretório inicial e copie os scripts e macros fornecidos do diretório compartilhado.
  4. Editar, renomear e salvar a macro de redução fornecida em conformidade.
  5. Digite o drspine no prompter de comando e pressione enter para iniciar o ambiente de redução de software.
  6. Digite "o nome da macro de redução" editado no Passo 5.4. no prompter de comando dentro do ambiente de software e pressione Enter.

6. Montagem de dados NSE

  1. Edite o script python "stapler-drspine.py", fornecido pelo Assistente Cientista de Instrumentos, com os nomes dos dados de arquivo reduzidos.
    NOTA: O script python está livremente disponível para os usuários do instrumento.
  2. Edite a função para caber na biblioteca fornecida.
  3. Digite o nome do script editado "stapler-drspine.py" no prompter de comando e pressione Enter para ler, encaixar e plotar dados NSE reduzidos.
    NOTA: O Instrument Scientist fornecerá um modelo para a macro de redução e o script python "stapler-drspine.py" que pode ler e encaixar dados reduzidos da NSE. Os dados nse reduzidos finais estão no formato ASCII e podem ser lidos por vários softwares preferidos.

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Representative Results

A proteína IgG do soro humano e das proteínas MBP bovinas foram reconstituídas em altas concentrações (~50 mg/mL) em buffers d2base O. Como as proteínas foram dissolvidas em altas concentrações, as soluções obtidas foram soluções de proteínas lotadas. A dinâmica investigada utilizando NSE sofre do ambiente lotado em que as proteínas residem (interações de fatores estruturais e efeitos hidrodinâmicos)5,28,39. O DLS foi realizado em uma série de concentração para cada proteína para explicar os efeitos de aglomeração. A extrapolação para concentração zero dos coeficientes de difusão translacional medidos pelo DLS produz o valor da difusão translacional para uma única proteína. A viscosidade dinâmica em função da concentração proteica também deve ser medida antes da NSE para explicar as interações hidrodinâmicas. A extrapolação para concentração zero das viscosidades dinâmicas em função da concentração precisa produzir o valor que pode ser medido experimentalmente para a solução tampão de cada amostra de proteína preparada.

A forma e a estrutura das proteínas em solução concentrada foram avaliadas antes de qualquer experimento NSE para obter insights sobre o fator de forma proteica e a força do fator estrutura, o que pode influenciar a forma como as proteínas se movem na solução. A dispersão de pequenos ângulos foi o método de escolha para essas investigações. No presente estudo, a conformação estrutural da proteína IgG na solução foi observada pelo SAXS, e a estrutura do MBP foi avaliada pela SANS. A intensidade de dispersão (Q) medida (Etapas 3.3.-3.4.) é proporcional ao produto entre o fator de forma P(Q) e o fator de estrutura S(Q,c) ponderado pelo número de partículas (Equação 1)5,28,39:

I (Q) = N ∙ P (Q) ∙S (Q, c) (1)

O SAXS foi medido em um instrumento SAXS do tipo Kratky40 com um comprimento de onda de raios-X de 0,154 nm para IgG, e SANS foi medido41 para MBP com um comprimento de onda de nêutrons de 4,5 Å. As intensidades experimentais de pequeno ângulo I(Q) foram corrigidas em fundo e solventes, dimensionadas pela concentração da solução, e o fator de forma foi calculado usando pacotes de software livremente disponíveis como Ensemble modeling-EOM e SasView 24,25,29,39,42,43. Além disso, o fator estrutura para cada proteína foi obtido a partir da Equação 1.

Para o presente estudo, os experimentos NSE foram realizados com dois espectrômetros de spin-echo: o instrumento SNS-NSE34 na Figura 1 e o instrumento Phoenix-J-NSE44. Comprimentos de onda incidentes entre 8 Å - 12 Å, com fourier vezes entre 0,1 ns ≤ tmax ≤ 130 ns para várias medidas Q entre 0,05 Å−1-0.2 Å−1, foram medidos. A diferença entre os dois espectrômetros é um ponto vital na compreensão da ciência NSE, e eles representam tanto o antigo conceito de um chamado "clássico spin echo" para a fonte estática de nêutrons de um reator e o novo "conceito de tempo de voo" para a fonte pulsante de nêutrons. O espectrômetro Phoenix-J-NSE é um NSE de tipo clássico, no qual um seletor de velocidade seleciona um comprimento de onda particular. Para permitir variações nas velocidades de nêutrons, uma largura de banda de comprimento de onda de ±10% é introduzida. Apesar da faixa de energia muito estreita usada para uma única varredura, a situação do espectrômetro Phoenix-J-NSE em uma fonte de reator de alto fluxo garante que os intervalos de tempo de vetor espacial e correlações sejam cobertos em tempos de medição relativamente curtos. O espectrômetro SNS-NSE é o espectrômetro de nêutrons de nova geração, ultra-alta resolução, com um comprimento de onda de 2 Å < λ < 14 Å e uma largura de banda de comprimento de onda simultânea de 2,4 Å - 3,6 Å, dependendo da posição do espectrômetro. Devido a essa ampla largura de banda, a alta eficiência de coleta de dados é realizada, permitindo uma cobertura quase sem falhas de uma ampla faixa de tempo de vetores de ondas com apenas poucas configurações de ângulo de dispersão. A seleção da banda de comprimento de onda no SNS-NSE é feita por um sistema de helicóptero composto por quatro helicópteros. Ambos os espectrômetros NSE aqui discutidos têm campos de precessão baseados em tecnologia de supercondutores com alta homogeneidade de campo magnético, novos elementos de correção de campo de última geração para correções de campo perdidos e novos dobradores polarizadores41,42.

Os espectros NSE foram medidos a 10 °C para proteína MBP e 25 °C para proteína IgG1. A intensidade de dispersão intermediária coerente I(Q, t) / I(Q, t = 0) medida pela NSE é o resultado contribuinte de todos os processos dinâmicos da amostra que acontecem dentro da escala de tempo investigada. Isso contém a dinâmica da proteína interna, a difusão translacional global, a difusão rotacional e de queda, e os movimentos segmentais dentro da própria molécula proteica. Um modelo simplificado pressupõe que a dinâmica interna e as difusões translacionais e rotacionais são totalmente dissociadas 5,45,46,47,48 e podem ser caracterizadas separadamente. Para a partícula única, a função de dispersão coerente pode ser escrita como o produto (Equação 2)23,48:

F (Q, t) = Ftrans(Q, t) ∙Frot (Q, t) ∙Fint(Q, t) (2)

onde o termo de difusão translacional para uma única proteína rígida é uma função exponencial do coeficiente de difusão translacional DT (Equação 3)23,48:

Ftrans(Q, t) = exp (−Q2∙ DT∙ t) (3)

Para grandes concentrações de proteínas, o coeficiente de difusão translacional DT é influenciado por interações proteína-proteína, quantificadas pelo fator estrutura S(Q) e por interações hidrodinâmicas descritas pela função hidrodinâmica HT(Q) (Equação 4)23,48:

DT(Q) = DT0 ∙HT(Q, c) / S(Q, c) (4)

Na Equação 4, DT0 é o valor de difusão extrapolada para concentração zero das medidas DLS (Passo 2.2.). HT é calculado como HT = 1 -c∙ [η], onde c é a concentração proteica, [η] é a viscosidade intrínseca calculada por [η] = (η - η0) /η0 ∙ c, e η0 é a viscosidade dinâmica medida (Passos 2.3.-2.4.). O fator estrutura S(Q, c) foi obtido a partir de medições de SAXS para as medições de proteína IgG e SANS para a proteína MBP.

A Figura 3 exibe exemplos de funções de dispersão intermediárias I(Q, t) / I(Q, t = 0), medida por NSE para proteínas IgG e MBP. Um claro desvio de um simples processo de relaxamento semelhante à difusão foi observado na curta escala de tempo de Fourier, <25 ns, indicando a acessibilidade da dinâmica interna proteica pela NSE e a necessidade de um modelo mais complexo para descrever os processos dinâmicos observados.

Figure 3
Figura 3: Espectro de relaxamento NSE para proteínas IgG e MBP. Os dados do IgG são mostrados aqui equipados apenas por uma função única-exponencial para revelar o desvio da difusão em tempos mais curtos de Fourier. O desvio foi observado para ambas as proteínas. Em contraste, os dados do MBP são mostrados aqui na faixa de relaxamento completo, equipada pelo modelo desenvolvido pelaBiehl45. O modelo implica granulação grosseira e permite o ajuste simultâneo de regimes de tempo curto, intermediário e longo Fourier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Portanto, as funções de dispersão foram montadas pela modelagem atômica de ambas as proteínas utilizando modelos desenvolvidos pela Biehl, descritos em referências 18,25,38,43,44,46. A função de dispersão intermediária foi calculada por grãos grosseiros para algumas centenas de grãos individuais, em oposição à simulação de todos os átomos, para reduzir a carga e o tempo computacionais, e a biblioteca de software MMTK49 (livremente acessível) foi usada para acessar coordenadas atômicas e implementar movimentos trans-rotacionais em domínios e fragmentos protecionais. Os resultados do cálculo da função de dispersão intermediária para ambas as proteínas concordaram com os dados experimentais da NSE e comprovaram que a dinâmica mais lenta observada em longos tempos de Fourier pode ser atribuída aos processos globais de difusão translacional e rotacional, enquanto a dinâmica rápida observada em escalas de curto prazo pode ser atribuída à dinâmica dos domínios proteicos.

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Discussion

A espectroscopia NSE oferece uma visão única e detalhada da dinâmica das proteínas, que outras técnicas espectroscópicas não podem produzir. Medições em uma escala de tempo estendida fornecem observações da difusão translacional e rotacional das proteínas, conforme apresentado aqui. A dinâmica segmentar e outras oscilações internas revelam-se como uma forte decadência da função de dispersão coerente S(Q, t) em uma escala de tempo curto e estão bem separados dos processos gerais de relaxamento difusivo. As principais limitações da técnica NSE são o tempo de medição estendido e os grandes volumes amostrais necessários para adquirir um bom sinal estatístico. Isso pode representar um desafio para medir sistemas macromoleculares relevantes que exibem baixas concentrações das espécies móveis e vidas reduzidas.

Dinâmica interna do IgG
A proteína IgG tem uma estrutura em forma de Y específica para anticorpos que podem ser aproximados por três grandes fragmentos conectados por linkers flexíveis. Um modelo matemático de três partículas consideráveis residentes em potencial harmônico foi assumido para este tipo de estrutura. Os linkers foram aproximados por molas elásticas que dão uma posição de equilíbrio fixo, mas permitem flutuações como uma forma de movimento browniano. Três graus de liberdade foram permitidos para cada fragmento em torno do equilíbrio relativo28. A dinâmica interna representada por Fint (Q, t) na Equação 2 foi descrita pelo processo Ornstein-Uhlenbeck50,51. O modelo permite o cálculo do deslocamento quadrado médio dos fragmentos no mergulho potencial, a escala de tempo de diferentes movimentos, o atrito e as constantes de força que ocorrem. A amplitude do movimento interno foi aproximada pela análise de modos normais, considerando diferentes graus de movimento para cada fragmento. Uma extensa descrição do modelo e dos parâmetros matemáticos resultantes está fora de alcance aqui, mas pode ser encontrada em detalhes na referência28. Neste estudo de caso do IgG, observou-se uma clara assinatura da dinâmica interna na escala de tempo de vários nanossegundos. A constante calculada de mola do linker parece ser realisticamente comparável a uma mola entropica de comprimento semelhante. O atrito eficaz observado parece próximo ao atrito de um fragmento IgG livre e sem limites. A hipótese de equilíbrio pré-existente foi validada, com configurações "abertas" ou "fechadas" assumidas de IgGs que estão em equilíbrio exibindo diferentes locais de vinculação e especificidades vinculantes28. Essas informações podem ser relevantes para a compreensão da mecânica dos anticorpos e se esse comportamento mecânico pode ser usado para melhorar a biocompatibilidade e a biodisponibilidade.

Dinâmica interna do MBP
A estrutura MBP possui um núcleo globular compacto que permite movimentos fortes de alongamento e dobra com suas extremidades de bobina aleatórias flexíveis. A dinâmica do MBP foi interpretada utilizando modelos flexíveis de polímeros com e sem a adição de atrito interno28,39. Como no caso do IgG, as observações da dinâmica interna do MBP podem ser conciliadas dentro da teoria do movimento browniano, no qual uma maior amplitude de movimento resulta em maior tempo de relaxamento com influências do atrito interno dentro da cadeia proteica. O tempo de relaxamento aumentado com uma amplitude maior de movimentos, mas atrito menor pode ser descrito usando o mesmo processo Ornstein-Uhlenbeck50,51 de movimento browniano em um potencial harmônico. Movimentos internos com grandes amplitudes, mas tempos lentos de relaxamento tornam-se ativos após a desnaturação total do MBP de seu estado natal, reduzindo as forças restauradoras da configuração da cadeia (potenciais diedrais) e suavizando as barreiras energéticas locais. Descrições detalhadas da dinâmica interna do MBP no estado nativo e desnaturado podem ser encontradas ainda em referências28,39. No estudo da MBP, a investigação utilizando NSE revelou um comportamento dinâmico apontando para a compactação intermediária da proteína entre polímeros de bobinas aleatórias e proteínas globulares. A contribuição significativa da dinâmica proteica interna com uma taxa de relaxamento de vários nanossegundos foi regida por movimentos de alongamento coletivo de baixa frequência e dobra5. A descrição da dinâmica nativa do MBP por modelos de quebra da teoria do polímero foi fornecida devido a um grande valor de atrito interno proteico. No MBP desnaturado, o atrito interno dentro da cadeia proteica é reduzido, e o caráter da cadeia de polímeros do espectro de relaxamento prevalece. A alta flexibilidade dos movimentos estruturais do conjunto pode ajudar a aumentar a superfície proteica acessível, facilitando assim a interação com diferentes parceiros de ligação.

Modelos dinâmicos
Embora a NSE como técnica seja experimentalmente única na avaliação de movimentos harmônicos de baixa frequência em macromoléculas biológicas e subunidades moleculares, a análise da função de dispersão intermediária requer uma comparação com espectros de nêutrons derivados de vários modelos matemáticos. O modelo aqui apresentado e desenvolvido por Biehl et al.28 para soluções de proteína concentrada utiliza uma aproximação de rede elástica, na qual a função de dispersão intermediária é uma convolução de funções modulares adequadas, e osciladores brownianos representam a dinâmica interna. Este é um dos poucos modelos disponíveis para analisar a dinâmica segmental das proteínas. Outro modelo bem estabelecido para soluções proteicas diluídas é o modelo proposto por Bu et al.52, que é um modelo robusto que utiliza mecânica estatística e não requer ajustes complexos ou múltiplos parâmetros. Uma abordagem semelhante baseada na aproximação de dissociação dinâmica também pode ser aplicada a sistemas diluídos para caracterizar a difusão efetiva como uma soma de movimentos auto-translacionais e internos53. Várias de nossas referências podem fornecer relatórios abrangentes sobre esses modelos e suas limitações. Recomendamos fortemente Fitter et al.1 e Liu et al.54.

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Disclosures

O autor declara que não há interesses financeiros concorrentes e nenhum conflito de interesses. O conteúdo do manuscrito é baseado na palestra que o autor apresentou na HANDS-Neutron Scattering Applications in Structural Biology School entre 2019-2021.

Acknowledgments

Esta pesquisa utilizou recursos nos laboratórios de Neutron Da Spallation (BL-15, BL-6, Biologia e Química), um DoE Office of the Science User Facility operado pelo Laboratório Nacional de Oak Ridge. Esta pesquisa também utilizou recursos no reator MLZ-FRM2 Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) e no JCNS1 em Forschungszentrum Jülich GmbH, Alemanha. O autor reconhece o Dr. Ralf Biehl e o Dr. Andreas Stadler por sua ajuda na modelagem e sua contribuição para a pesquisa de proteínas IgG e MBP, Dr. Piotr A. Żołnierczuk para suporte à redução de dados NSE, Dr. Changwoo Do para apoio com medições sans, e Rhonda Moody e Dr. Kevin Weiss para suporte labry bioquímico SNS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine MBP protein solution Sigma-Aldrich M1891 lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O - heavy water Sigma-Aldrich Product No. 151882 liquid
Dionized water in house - for washing / cleanning cells
DLS instrument Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich - dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standards SNS-NSE, ORNL - Al2O3  and Graphite powders
Ethanol Sigma-Aldrich 65350-M 70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solution Sigma-Aldrich I4506 lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrument JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - small angle neutron instrument
Liquinox dish detergent Alconox - Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2O Sigma-Aldrich Product No.S9390 disodium phosphate heptahydrate salt
NaCl Sigma-Aldrich Product No.S9888 sodium chloride salt
NaH2PO4·H2O Sigma-Aldrich Product No. S9638 monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific Catalog number: ND-2000 NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment camera NeutronOptics, Grenoble NOG210222 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M - wax parafilm Bemis Parafilm M - 5259-04LC PM996 all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE Spectrometer JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - neutron spectrometer
SasView https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument FZ-Jülich - small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranes Thermo Scientific 88400-88405 Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis Cluster Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometer ORNL, Oak Ridge, TN, USA - neutron spectrometer
Sterile syringe filters VWR N.A. PN:28145-501 0.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS) SP Scientific Part Number 100004055 sample environment equipment
Urea -d4 Sigma-Aldrich Product No. 176087 deuterated Urea salt
Viscometer FZ-Jülich - falling ball viscometer

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References

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Estudo da Dinâmica da Proteína <em>via</em> Espectroscopia de Eco de Neutron Spin
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