Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Исследование динамики белка с помощью нейтронной спиновой эхо-спектроскопии

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/61862
Automatic Translation
1
1NSD, Oak Ridge National Laboratory

Summary

Настоящий протокол описывает методы исследования структуры и динамики двух модельных белков, которые играют важную роль в здоровье человека. Метод сочетает в себе настольную биофизическую характеристику с нейтронной спиновой эхо-спектроскопией для доступа к динамике во временных и длинных масштабах, имеющих отношение к междоменным движениям белка.

Abstract

Активность и функциональность большинства белков человеческого организма связаны с конфигурационными изменениями целых поддоменов в кристаллической структуре белка. Кристаллические структуры создают основу для любого расчета, который описывает структуру или динамику белка, в большинстве случаев с сильными геометрическими ограничениями. Однако эти ограничения от кристаллической структуры отсутствуют в растворе. Структура белков в растворе может отличаться от кристаллической из-за перестановок петель или поддоменов на шкале времени пико к наносекунде (т.е. временному режиму внутренней динамики белка). Настоящая работа описывает, как медленные движения на временных масштабах в несколько десятков наносекунд могут быть доступны с помощью рассеяния нейтронов. В частности, динамическая характеристика двух основных человеческих белков, внутренне неупорядоченного белка, который не имеет четко определенной вторичной структуры и классического белка антитела, решается с помощью нейтронной спиновой эхо-спектроскопии (NSE) в сочетании с широким спектром лабораторных методов характеристики. Дальнейшее понимание динамики белкового домена было достигнуто с использованием математического моделирования для описания экспериментальных данных нейтронов и определения пересечения между комбинированными диффузными и внутренними движениями белка. Извлечение внутреннего динамического вклада в промежуточную функцию рассеяния, полученного из NSE, включая временную шкалу различных движений, позволяет дополнительно увидеть механические свойства отдельных белков и мягкость белков в их почти естественной среде в переполненном белковом растворе.

Introduction

Зондирующая динамика мягкого вещества с нейтронами
Исследование динамических свойств белков и пептидов является важной частью биофизических исследований, и сегодня существует множество хорошо разработанных методов для доступа к широкому спектру энергетических ландшафтов1. Соотнесение экспериментально выявленной динамики белков с их биологической функцией является гораздо более сложной задачей, требующей сложных математических моделей и компьютерного моделирования динамики. Важность нейтронной спектроскопии для анализа движений белка была подчеркнута в нескольких хорошо принятых и широко признанных исследованиях 1,2,3,4,5. Прежде чем исследовать разнообразный энергетический ландшафт внутренней динамики белка, требуется краткий обзор динамических процессов в мягкой материи и того, как нейтроны могут получить к ним доступ.

Чувствительность нейтронов к изотопной конфигурации и тип взаимодействий, которые они проявляют с мягким веществом, делает рассеяние нейтронов одним из наиболее универсальных методов исследования6. Существует широкий спектр шкал длин корреляции и времени корреляции, к которым могут получить доступ нейтроны, от ядерных возбуждений и атомных колебаний до коллективных движений и медленных процессов релаксации, таких как изотропные вращения и диффузионные движения. При исследовании рассеянных нейтронов на предмет их переноса энергии можно выделить три основных взаимодействия: упругое рассеяние, при котором отсутствует энергообмен между входящим нейтроном и частицей в образце; неупругое рассеяние с большим, поддающимся количественной оценке энергетическим обменом между нейтроном и частицей; и своеобразный случай квазиупругого рассеяния, обозначающий очень малый перенос энергии по сравнению с падающей энергией нейтронов 1,7. Эти взаимодействия дают точную информацию об исследуемом материале и составляют теоретическую основу широкого спектра методов рассеяния нейтронов.

При упругом рассеянии детектор записывает направления нейтронов как дифракционную картину, которая показывает положение атомов образца относительно друг друга. Получена информация о корреляциях атомных положений (т.е. интегральная интенсивность S(Q) относительно переноса импульса Q, относящаяся только к структурной информации). Этот принцип лежит в основе дифракции нейтронов8.

Сложность возникает, когда передача энергии больше не равна нулю из-за возбуждений и внутренних флуктуаций в материале образца. Это составляет основу нейтронной спектроскопии, в которой рассеянные нейтроны исследуются как функция как переноса энергии E , так и переноса импульса Q. Получена динамическая и структурная информация. Нейтронная спектроскопия измеряет одинаковую интегральную интенсивность S(Q) для передачи энергии (т.е. изменение скорости нейтронов из-за рассеяния образцов, S(Q,ω) = S(Q, E), что также называется коэффициентом динамической структуры)9.

Для расчета рассеяния из материала более адекватно использовать парную корреляционную функцию 7,10. В дифракционном случае статическая парная корреляционная функция G(r) дает вероятность нахождения центра частицы на заданном расстоянии r от центра другой частицы. Спектроскопия обобщает статическую парную корреляционную функцию и включает энергию/частоту/время в уравнение рассеяния. Парная корреляционная функция G(r) становится функцией времени G(r, t), которая может быть разложена на отдельную корреляционную функцию пары атомов GD(r, t) и самокорреляционную функцию GS(r, t). Они описывают два типа корреляций: парно-коррелированные движения атомов, которые управляют когерентным рассеянием, и самокорреляция, которая управляет некогерентным рассеянием10.

Когерентное рассеяние является рассеянием от «среднего» и зависит от относительной фазы рассеянных волн. В малоугловом режиме рассеяния рассеянные нейтронные волны от разных центров рассеяния (разных атомов) конструктивно взаимодействуют (имеют сходные фазы), а коллективное движение атомов наблюдается с сильным усилением интенсивности. Когерентное рассеяние по существу описывает рассеяние одного нейтрона от всех ядер в образце10.

Когда между рассеянными нейтронными волнами из разных центров не возникает конструктивной интерференции, во времени следует один атом, и наблюдается самокорреляция между положением атома в момент времени t = 0 и того же атома в момент времени t. Таким образом, информация об относительных положениях атомов теряется, а фокус делается только на локальных флуктуациях. Рассеяние от локальных флуктуаций управляет некогерентным рассеянием. Некогерентное рассеяние изотропно, способствует фоновому сигналу и ухудшает сигнал-шум10,11.

Объединив все вышеперечисленное, мы выделяем четыре основных процесса рассеяния нейтронов10: (1) упругий когерентный (измеряет корреляции атомных положений), (2) неупругий когерентный (измеряет коллективные движения атомов), (3) упругий некогерентный (способствует фону, уменьшает интенсивность рассеяния на коэффициент Дебая-Уоллера (DWF) и измеряет коэффициент упругой некогерентной структуры (EISF), описывая геометрию диффузионных движений в замкнутой геометрии, и (4) неупругий некогерентный (измеряет динамику одного атома и самокорреляцию).

Динамические процессы, к которым нейтроны могут получить доступ в биологии, варьируются от демпфирования низкочастотных атомных и молекулярных колебаний, взаимодействия молекул растворителей с биоповерхностями и диффузионных процессов в гидратационном слое макромолекул и ограниченной геометрии до прямых поступательных, вращательных и кувыркающихся диффузных движений, белковых доменов и аллостерических движений1 . Широкое разнообразие нейтронных методов и приборов для измерения динамики белка основано на том, как достигается ахроматизация падающего или исходящего пучка нейтронов и как выполняется энергетический анализ рассеянных нейтронов. От трехосевых до спектрометров времени полета, обратного рассеяния и спин-эхо можно исследовать динамические процессы с характерным временем от 1 х 10-14 с до 1 х 10-6 с (фемтосекунды до микросекунд)12.

Национальная лаборатория Оук-Ридж с двумя известными источниками нейтронов, источником нейтронов Spallation - SNS13 и реактором с высоким изотопным потоком - HFIR14, имеет один из лучших наборов спектрометров для исследования динамики в биоматериалах. Некоторые из наиболее красноречивых примеров включают использование спектрометра холодного нейтронного измельчителя (CNCS) в SNS15 для исследования динамического возмущения гидратационной воды вокруг зеленого флуоресцентного белка в растворе16 или субпикосекундных коллективных колебаний нескольких белков17. Повторяющаяся проблема исследований неупругого рассеяния нейтронов заключается в том, что некоторые биологические процессы слишком медленны, чтобы их можно было наблюдать. Без экстремальных установок, которые приводят к огромной потере интенсивности нейтронов, спектрометры времени пролета ограничены разрешением энергии 10 мкЭВ, что соответствует максимальной шкале времени ~ 200 пс10,11. Этого недостаточно для наблюдения крупномасштабных движений в белках. Поэтому часто требуются приборы с более высоким энергетическим разрешением, такие как спектрометры обратного рассеяния. Сочетание методов времени полета и обратного рассеяния оказалось мощным для исследования изменения внутренней динамики цитохрома P450cam (CYP101), фермента, который катализирует гидроксилирование камфоры18.

Микроскопическая диффузия, измеренная спектрометром обратного рассеяния в SNS-BASIS19 , была удивительно хорошо определена и могла быть разделена на диффузионность воды (гидратационная, цитоплазматическая и объемная вода) и диффузионность клеточных компонентов у плоских плоских червей, первого живого животного, изучаемого рассеянием нейтронов20 . Обратное рассеяние является спектроскопическим методом с высоким разрешением, но оно также ограничено несколькими мкэВ = несколькими наносекундами, в то время как медленная динамика в биоматериалах также проявляется как время выживания корреляции между положением атома или ориентацией спина (например, релаксационные процессы, которые регулярно происходят в диапазоне времени от десяти до сотен наносекунд).

Нейтронная спиновая эхо-спектроскопия (NSE) является единственным методом рассеяния нейтронов, достигающим такого высокого разрешения. В отличие от других нейтронных методов, NSE не требует ахроматизации пучка, поскольку использует квантово-механическую фазу нейтронов, которая является их магнитными моментами. Манипулирование магнитными моментами позволяет использовать широкое распределение длин волн пучка нейтронов, при этом методика чувствительна к очень малым изменениям скорости нейтронов порядка 1 х 10-4. NSE был успешно использован для исследования медленной динамики белков в растворе для многих белков. Среди этих многочисленных новаторских исследований мы признаем изучение сегментарной гибкости иммуноглобулина свиней21; связанные доменные движения в Taq полимеразе22; доменные движения в тетрамере дрожжевого спиртдегидрогеназы23; изменение конформации в фосфоглицераткиназе при связывании субстрата3; активация доменных движений и динамическое распространение аллостерических сигналов в белке регуляторного кофактора обмена Na+/H+ 1 (NHERF1) 4,24,25; динамика компактного состояния ртутной ионредуктазы26; и диффузия гемоглобина в эритроцитах27. Два более поздних исследования в области динамики белка выявили гибкость антитела человека Иммуноглобулина G (IgG) в качестве энтропийного источника28 и характеристики вклада растворителя в динамику внутренне неупорядоченного основного белка миелина (MBP)5.

В настоящей статье объясняются основные принципы NSE, множественные подготовительные методы, рекомендуемые для тщательного исследования динамики белка, а также методология и экспериментальный протокол сбора данных NSE на спектрометре NSE в SNS, SNS-NSE. Протокол характеризует два белка: IgG, обычный белок антител человека, и внутренне неупорядоченный белок MBP. Биофизические последствия, исследовательская актуальность примеров и ограничения метода обсуждаются кратко.

NSE спектроскопия, метод измерения медленной динамики
NSE - это поляризованный метод, который использует нейтронное время пролета для измерения обмена энергией (потери поляризации) из-за квазиупругого взаимодействия между нейтронами и атомами в образце. В основе спектроскопии NSE лежат два основных принципа: (1) способность спина нейтрона прецессировать в магнитном поле с частотой, пропорциональной магнитной силе, а именно частоте Equation 1Лармора29, и (б) спин-эхо или эхо Ханна, представляющее собой манипулирование и перефокусировку поляризационного сигнала при подаче серии радиочастотных импульсов30.

Основы процесса NSE можно резюмировать в нескольких простых шагах 6,11, используя рисунок 1. (1) Пучок нейтронов, создаваемый источником (положение 1), поляризован (положение 2), направляется и транспортируется (положение 3) и поступает на вход в спектрометр NSE, где он поворачивается на 90° первым пи-полуфлаппером (положение 4). (2) Поляризованный пучок (например, магнитные моменты нейтронов) становится перпендикулярным линиям магнитного поля первого магнита (первая зона прецессии, положение 5) и начинает прецессировать. (3) На конце магнита спины нейтронов накапливают определенный угол прецессии, пропорциональный напряженности магнитного поля и времени полета, проведенному внутри (в основном обратно пропорционален скорости нейтрона). Отдельные скорости нейтронов кодируются в пределах угла прецессии в конце первой зоны прецессии. (4) Вблизи положения образца пи-флиппер (положение 6) меняет ориентацию спина на 180°, изменяя знак угла прецессии. (5) Нейтроны взаимодействуют с молекулами образца (позиция 7) и рассеиваются. (6) Рассеянные нейтроны входят и прецессируют во второй зоне прецессии (позиция 8), но становятся обратно ориентированными. (7) Другой пи-полуплащ (положение 9) используется для поворота ориентации спина от перпендикулярного к горизонтальному направлению. Это остановит прецессию, переводя угол прецессии φ в поляризацию, пропорциональную cos(φ). (8) Анализатор (позиция 10) выбирает нейтроны на основе одной ориентации. Если взаимодействие с образцом упругое, скорость нейтрона не изменится. Нейтроны будут проводить одинаковое количество времени, пролетая в первой и второй зонах прецессии, а накопленные углы прецессии полностью восстанавливаются. Полная поляризация восстанавливается на детекторе (позиция 11) как эхо исходной поляризации (т.е. спин-эхо). (9) Однако в NSE рассеяние является квазиупругим, поэтому небольшой обмен энергией между нейтронами и молекулами образца приводит к различным скоростям нейтронов после рассеяния образцом. Из-за различных скоростей нейтроны проведут дополнительное время, пролетая через вторую зону прецессии, и не смогут должным образом восстановить свой угол прецессии. На детекторе извлекается частичная поляризация, а потеря поляризации из-за спиновой релаксации пропорциональна кос-фурье-преобразованию спектральной функции S(Q, ω), промежуточной функции рассеяния F(Q, t). (10) Параметр времени функции F(Q, t) пропорционален напряженности магнитного поля прецессии. Сканирование потери поляризации в зависимости от напряженности магнитного поля дает, следовательно, релаксационную функцию, которая зависит от динамических процессов внутри образца.

Figure 1
Рисунок 1: Фотография спектрометра NSE в SNS (SNS-NSE) и схемы траектории полета нейтронов с наиболее важными функциональными компонентами. Справа налево: 1 = источник нейтронов; 2 = система измельчителей-бендеров-поляризаторов-вторичных затворов; 3 = направляющие для транспортировки луча; 4 = пи/2 флиппера для первого вращения на 90°; 5 = первая зона прецессии; 6 = пи-флиппер для вращения на 180°; 7 = площадь образца и среда отбора проб (здесь показана криопечь); 8 = вторая зона прецессии; 9 = пи/2 флиппера для второго вращения на 90°; 10 = анализатор; 11 = детектор. (Обратите внимание, что части 3, а также 2 и 1 расположены за синей стеной внутри экранирования; измельчители заменены селектором скорости для NSE на основе реактора). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Настоящая работа характеризует два белка: обычный белок антител человека IgG и внутренне неупорядоченный MBP. Лиофилизированную форму белков получали из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).

1. Пробоподготовка белка

  1. Приготовьте буфер 50 мМ фосфата натрия + 0,1 М NaCl путем взвешивания и растворения соответствующих твердых реагентов в тяжелой воде (D2O) (см. Таблицу материалов). Это дейтерированный буферный растворитель для IgG.
    1. Отрегулируйте рН буферного раствора до 6,6.
  2. Приготовьте буфер 20 мМ фосфата натрия + 6 М мочевины путем взвешивания и растворения соответствующих твердых компонентов в тяжелой воде (D2O). Это дейтерированный буферный растворитель для MBP.
    1. Отрегулируйте рН буферного раствора до 4,7.
  3. Фильтруйте буферные растворители с помощью фильтров размером пор 0,2 мкм (см. Таблицу материалов).
  4. Взвешивают и растворяют очищенные белковые лиофилизированные порошки в дейтерированных растворителях для соответствующих белков (этапы 1.1.-1.2.) при высокой концентрации белка (~50 мг/мл).
  5. Загрузите белковый раствор в диализные корзины с диализными мембранами 3,5 К MWCO и диализуйте против фильтрованного буфера в течение 24 ч при 10 °C для MBP и 25 °C для IgG (см. Таблицу материалов) путем слегкаго встряхивания трубок для создания диффузионного градиента.
  6. Разбавляют белковый раствор с помощью диализного буфера в ряде концентраций: 1, 2, 5, 10 и 50 мг/мл.
  7. Определите точные концентрации с помощью спектрофотометра Nanodrop (см. Таблицу материалов).

2. Предварительная характеристика образца динамическим рассеянием света (DLS)

  1. Загрузите 80 мкл каждого белкового раствора из серии концентраций, приготовленной выше (этап 1.6.), в одноразовую ячейку DLS (см. Таблицу материалов) и определите коэффициенты диффузии, в среднем более 10 приобретений.
  2. Построить коэффициенты поступательной диффузии как функцию концентрации белка и экстраполировать на нулевую концентрацию.
  3. Загрузите каждый белковый раствор из серии концентраций в капиллярные трубки вискозиметра (см. Таблицу материалов) и измерьте динамическую вязкость.
  4. График динамической вязкости, измеренной как функция концентрации белка и экстраполируемой до нулевой концентрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экстраполяция диффузии DLS до нулевой концентрации дает значение трансляционной диффузии для одного единственного белка. Экстраполяция динамической вязкости до нулевой концентрации должна давать динамическое значение вязкости, измеренное экспериментально для буферного раствора.

3. Коллекция малоуглового рассеяния (нейтронного или рентгеновского)

  1. Измерьте малоугловое рассеяние нейтронов (SANS) и/или малоугловое рентгеновское рассеяние (SAXS) (см. Таблицу материалов) на четырех концентрациях белка, предпочтительно 2 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл и 50 мг/мл.
  2. Нормализуют спектры SANS и SAXS по концентрации белка.
  3. Подгонка форм-фактора белка P(Q) к спектрам SANS и SAXS с помощью оптимизации ансамбля31 и/или программного обеспечения SasView32 .
  4. Рассчитайте структурный коэффициент S(Q, c), разделив сигнал SANS и SAXS на P(Q) для каждой концентрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Читателям, заинтересованным в том, как измерять и интерпретировать данные малоуглового рассеяния в качестве поддержки измерений NSE, рекомендуется тщательно ознакомиться со ссылками 23,28,31,32,33.

4. Измерение NSE

  1. Настройте эксперимент и подключите образец, выполнив следующие действия.
    1. Выберите толщину ячейки для загрузки образца на основе концентрации белкового раствора, температуры, необходимой для измерения, и количества доступного раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании использовались прозрачные кварцевые контейнеры верхнего погрузчика размером 40 мм х 30 мм х 4 мм.
    2. Очищайте ячейку многократно, чередуя безфосфатное средство для мытья посуды (см. Таблицу материалов), деионизированную воду и 70% этанол.
    3. Высушите ячейку в конвекционной печи; не превышают 80 °C для кварцевых ячеек.
    4. Загрузите в клетку 4 мл белкового раствора и закройте колпачками. Используйте восковую пленку или любой герметик (см. Таблицу материалов) для герметизации клеток образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании для получения достаточной интенсивности рассеяния использовалось 4,8 мл раствора при ~50 мг/мл.
    5. Загрузите 4 мл диализного буфера в тот же контейнер, что и образец белка и уплотнение.
    6. Транспортируйте образцы к линии луча, закройте затвор и войдите в зону34 пещеры в корпусе спектрометра.
    7. Установите ячейку образца на алюминиевый держатель образца, затянув винты и удерживающие пластины (рисунок 2, левая панель).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно установить две пробные ячейки одновременно, учитывая, что для всех образцов необходим один и тот же протокол измерения.
    8. Установите образец графита и/или образец порошка Al2O3 , загруженный в контейнер, идентичный образцу белка. Это стандарты, обеспечиваемые поддержкой линии луча SNS-NSE.
    9. Поместите держатель образца, осторожно вставив его в банку системы температурного воздействия (TFS, см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: TFS является наиболее используемой средой для отбора проб в SNS-NSE и закачивает сухой воздух в контейнер для образцов для достижения желаемой температуры (рисунок 2, средняя и правая панели).
    10. Закройте крышку TFS и установите температуру на требуемое значение, открыв интерактивный экран TFS.
    11. Установите нейтронную камеру (см. Таблицу материалов) для выравнивания образцов по пучку.
    12. Подметите корпус прибора, отсоедините, закройте двери и откройте балочный затвор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы ячеек обеспечиваются поддержкой линии луча SNS-NSE. Доступные образцы ячеек и библиотека образцов среды см. на веб-странице 7,35 линии луча SNS-NSE.
  2. Соберите данные NSE, выполнив следующие действия.
    1. Выровняйте образец в пучке нейтронов с помощью нейтронной камеры и четырех независимых апертур образца.
    2. Откройте программное обеспечение для сбора данных SNS-NSE36 и соберите статистику выборки, выполнив дифракционное сканирование для требуемых углов рассеяния и длины волны.
    3. Настройте параметры измерения на основе статистики, собранной для каждого образца, отредактировав макросы измерения, предоставленные помощником Специалиста по приборам.
    4. Начните сканирование, введя имя протокола в командной строке и получив эхо для образца.
    5. Начните сканирование и получите эхо также для упругого эталона и буферизованного растворителя. Выполните прерывистую операцию затвора луча для замены образца.

Figure 2
Рисунок 2: Измерительная система NSE. Левая панель: образцы белкового раствора в кварцевом контейнере, установленном с винтами и пластинами на алюминиевом (Al) держателе образца. Держатель для образцов Al обеспечивает возможность одновременного монтажа двух образцов в среде отбора проб. Средняя панель: Образец системы температурного воздействия (TFS) может быть установлен на стадии образца, окно нейтронного пучка находится справа, в то время как нейтронная камера, используемая для выравнивания, видна с левой стороны. Правая панель: размещение держателя образца с двумя образцами в образце может работать с кремниевыми (Si) окнами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Сокращение данных NSE

ПРИМЕЧАНИЕ: SNS-NSE оснащен специальным программным обеспечением под названием DrSpine (уменьшение данных для спин-эха)37,38, доступным в кластере удаленного анализа ORNL Neutron Sciences, кратким руководством пользователя и встроенной справочной поддержкой.

  1. Войдите в кластер удаленного анализа Neutron Sciences (см. Таблицу материалов) с учетными данными пользователя ORNL и нажмите кнопку Запустить сеанс .
  2. Настройте программное обеспечение для уменьшения объема данных, выполнив следующие действия.
    1. В каталоге пользователя откройте окно терминала и введите: source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh.
    2. Далее введите: drspine_create_env.sh.
  3. Создайте папку для сокращения данных в домашнем каталоге и скопируйте предоставленные сценарии и макросы из общего каталога.
  4. Отредактируйте, переименуйте и сохраните макрос сокращения, предоставленный соответствующим образом.
  5. Введите drspine в командной строке и нажмите клавишу ВВОД , чтобы запустить среду сокращения программного обеспечения.
  6. Введите "имя макроса сокращения", отредактированное на шаге 5.4. в командной строке в программной среде и нажмите клавишу ВВОД.

6. Подгонка данных NSE

  1. Отредактируйте скрипт python "stapler-drspine.py", предоставленный помощником Instrument Scientist, с именами уменьшенных данных файла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт python находится в свободном доступе для пользователей инструмента.
  2. Отредактируйте функцию в соответствии с предоставленной библиотекой.
  3. Введите в командной строке имя редактируемого сценария "stapler-drspine.py" и нажмите клавишу ВВОД , чтобы прочитать, подогнать и отобразить уменьшенные данные NSE.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Instrument Scientist предоставит шаблон для макроса уменьшения и скрипта python "stapler-drspine.py", который может считывать и подгонять уменьшенные данные NSE. Окончательные сокращенные данные NSE представлены в формате ASCII и могут быть прочитаны различным предпочтительным программным обеспечением.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Белок IgG из человеческой сыворотки и бычьих белков MBP был восстановлен в высоких концентрациях (~ 50 мг / мл) в буферахD2O-основания. Поскольку белки растворяли в высоких концентрациях, полученные растворы представляли собой переполненные белковые растворы. Динамика, исследованная с использованием NSE, страдает от переполненной среды, в которой находятся белки (структурные факторные взаимодействия и гидродинамические эффекты)5,28,39. DLS выполняли на серии концентраций для каждого белка, чтобы учесть эффекты скученности. Экстраполяция на нулевую концентрацию коэффициентов трансляционной диффузии, измеренных DLS, дает значение трансляционной диффузии для одного белка. Динамическая вязкость в зависимости от концентрации белка также должна быть измерена до NSE для учета гидродинамических взаимодействий. Экстраполяция на нулевую концентрацию динамических вязкостей в зависимости от концентрации должна дать значение, которое может быть экспериментально измерено для буферного раствора каждого подготовленного образца белка.

Форма и структура белков в концентрированном растворе оценивались перед любым экспериментом NSE, чтобы получить представление о форм-факторе белка и силе структурного фактора, которые могут влиять на то, как белки движутся в растворе. Малоугловое рассеяние было методом выбора для этих исследований. В настоящем исследовании структурная конформация белка IgG в растворе наблюдалась SAXS, а структура MBP оценивалась SANS. Измеренная интенсивность рассеяния (Q) (этапы 3.3.-3.4.) пропорциональна произведению между форм-фактором P(Q) и структурным фактором S(Q,c), взвешенным по количеству частиц (уравнение 1)5,28,39:

I (Q) = N ∙ P (Q) ∙ S (Q, c) (1)

SAXS был измерен на приборе SAXS типа Kratky40 с длиной волны рентгеновского излучения 0,154 нм для IgG, а SANS был измерен41 для MBP с длиной волны нейтрона 4,5 Å. Экспериментальные малоугловые интенсивности I(Q) были скорректированы фоном и растворителем, масштабированы концентрацией раствора, а форм-фактор был рассчитан с использованием свободно доступных пакетов программного обеспечения, таких как Ensemble modeling-EOM и SasView 24,25,29,39,42,43. Далее структурный фактор для каждого белка был получен из уравнения 1.

Для настоящего исследования эксперименты NSE проводились с двумя спин-эхо-спектрометрами: инструментом SNS-NSE34 на рисунке 1 и инструментом Phoenix-J-NSE44. Были измерены длины волн падающих между 8 Å - 12 Å, с временем Фурье между 0,1 нс ≤ tmax ≤ 130 нс для нескольких измерений Q между 0,05 Å−1- 0,2 Å−1. Разница между двумя спектрометрами является жизненно важным моментом в понимании науки NSE, и они представляют собой как старую концепцию так называемого «классического спинового эха» для статического источника нейтронов реактора, так и новую «концепцию времени пролета» для пульсирующего источника нейтронов. Спектрометр Phoenix-J-NSE представляет собой NSE классического типа, в котором селектор скорости выбирает определенную длину волны. Чтобы разрешить вариации скоростей нейтронов, вводится полоса пропускания длин волн ±10%. Несмотря на очень узкую энергетическую полосу, используемую для одного сканирования, положение спектрометра Phoenix-J-NSE на источнике реактора с высоким потоком обеспечивает пространственно-векторные и корреляционные временные диапазоны, охватываемые относительно коротким временем измерения. Спектрометр SNS-NSE представляет собой нейтронный спектрометр нового поколения со сверхвысоким разрешением с диапазоном длин волн 2 Å < λ < 14 Å и одновременной полосой волн 2,4 Å - 3,6 Å, в зависимости от положения спектрометра. Благодаря такой широкой полосе пропускания достигается высокая эффективность сбора данных, что позволяет практически беззазорно охватывать широкий волновой векторный временной диапазон с небольшими настройками угла рассеяния. Выбор диапазона длин волн в SNS-NSE производится измельчительной системой, состоящей из четырех измельчителей. Оба спектрометра NSE, обсуждаемые здесь, имеют прецессионные поля, основанные на сверхпроводящей технологии с высокой однородностью магнитного поля, новые современные элементы коррекции поля для коррекции блуждающего поля и новые поляризационные изгибы41,42.

Спектры NSE были измерены при 10 °C для белка MBP и 25 °C для белка IgG1. Когерентная промежуточная интенсивность рассеяния I(Q, t)/I(Q, t = 0), измеренная NSE, является способствующим результатом всех динамических процессов в образце, которые происходят в пределах исследуемой временной шкалы. Он содержит внутреннюю динамику белка, общую трансляционную диффузию, вращательную и кувыркающуюся диффузию и сегментарные движения внутри самой белковой молекулы. Упрощенная модель предполагает, что внутренняя динамика и поступательная и вращательная диффузии полностью разъединены 5,45,46,47,48 и могут быть охарактеризованы отдельно. Для одиночной частицы когерентная функция рассеяния может быть записана как произведение (Уравнение 2)23,48:

F (Q, t) = Fтранс(Q, t) ∙Frot(Q, t) ∙Fint(Q, t) (2)

где член трансляционной диффузии для одного жесткого белка является экспоненциальной функцией коэффициента трансляционной диффузии DT (уравнение 3)23,48:

Fтранс(Q, t) = exp(−Q2∙ DT∙ t) (3)

Для больших концентраций белков на коэффициент трансляционной диффузии DT влияют белково-белковые взаимодействия, количественно определяемые структурным фактором S(Q) и гидродинамическими взаимодействиями, описанными гидродинамической функцией HT(Q) (уравнение 4)23,48:

DT(Q) = DT0 ∙HT(Q, c) / S(Q, c) (4)

В уравнении 4 DT0 представляет собой экстраполированное значение диффузии до нулевой концентрации из измерений DLS (шаг 2.2.). HT вычисляется как HT = 1 -c∙ [η], где c - концентрация белка, [η] - внутренняя вязкость, рассчитанная по [η] = (η - η0) /η0 ∙ c, а η0 - измеренная динамическая вязкость (этапы 2.3.-2.4.). Структурный фактор S(Q, c) был получен из измерений SAXS для белка IgG и измерений SANS для белка MBP.

На рисунке 3 показаны примеры промежуточных функций рассеяния I(Q, t) / I(Q, t = 0), измеренных NSE для белков IgG и MBP. Явное отклонение от простого диффузионно-подобного релаксационного процесса наблюдалось на короткой шкале времени Фурье, <25 нс, что указывает на доступность внутренней динамики белка по NSE и необходимость более сложной модели для описания наблюдаемых динамических процессов.

Figure 3
Рисунок 3: Спектры релаксации NSE для белков IgG и MBP. Данные IgG показаны здесь только с помощью одноэкспоненциальной функции, чтобы выявить отклонение от диффузии в более короткие разы Фурье. Отклонение наблюдалось для обоих белков. Напротив, данные MBP показаны здесь в полном релаксационном диапазоне, установленном моделью, разработаннойBiehl45. Модель подразумевает крупнозернистость и позволяет одновременно подгонять короткий, промежуточный и длинный режимы времени Фурье. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Поэтому функции рассеяния были установлены атомарным моделированием обоих белков с использованием моделей, разработанных Билем, описанных в ссылках 18,25,38,43,44,46. Промежуточная функция рассеяния была рассчитана методом крупнозернистости до пары сотен отдельных зерен, в отличие от полноатомного моделирования, для уменьшения вычислительной нагрузки и времени, а библиотека программного обеспечения MMTK49 (свободно доступная) использовалась для доступа к атомным координатам и осуществления трансвращательных движений на белковых доменах и фрагментах. Результаты расчета промежуточной функции рассеяния для обоих белков были в отличном согласии с экспериментальными данными NSE и доказали, что более медленная динамика, наблюдаемая в длительное время Фурье, может быть отнесена к общим процессам трансляционной и ротационной диффузии, в то время как быстрая динамика, наблюдаемая в коротких временных масштабах, может быть отнесена к динамике белковых доменов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Спектроскопия NSE дает уникальное и подробное представление о динамике белков, которое другие спектроскопические методы не могут дать. Измерения в расширенном масштабе времени обеспечивают наблюдения как за поступательной, так и за ротационной диффузией белков, как представлено здесь. Сегментарная динамика и другие внутренние колебания проявляются в виде сильного распада когерентной функции рассеяния S(Q, t) в коротком временном масштабе и хорошо отделены от общих диффузионных релаксационных процессов. Основными ограничениями метода NSE являются увеличенное время измерения и большие объемы выборки, необходимые для получения хорошего статистического сигнала. Это может создать проблему для измерения соответствующих макромолекулярных систем, которые демонстрируют низкие концентрации подвижных видов и сокращают время жизни.

Внутренняя динамика IgG
Белок IgG имеет Y-образную структуру, специфичную для антител, которая может быть аппроксимирована тремя крупными фрагментами, соединенными гибкими линкерами. Для такого рода структур была предложена математическая модель трех значительных частиц, находящихся в гармоническом потенциале. Линкеры были аппроксимированы упругими пружинами, которые дают фиксированное равновесное положение, но допускают флуктуации как форму броуновского движения. Для каждого фрагмента вокруг относительного равновесия28 было разрешено три степени свободы. Внутренняя динамика, представленная Fint(Q, t) в уравнении 2, была описана процессом Орнштейна-Уленбека50,51. Модель позволяет рассчитать среднее квадратическое смещение осколков в потенциальном погружении, шкалу времени различных движений, трение и константы силы, которые происходят. Амплитуда внутреннего движения аппроксимировала анализом нормальных режимов, учитывая различные степени движения для каждого фрагмента. Подробное описание модели и результирующих математических параметров выходит за рамки применения здесь, но подробно можно найти в ссылке28. В этом тематическом исследовании IgG наблюдалась четкая сигнатура внутренней динамики на временной шкале в несколько наносекунд. Рассчитанная постоянная пружины линкера представляется реально сопоставимой с энтропийной пружиной аналогичной длины. Наблюдаемое эффективное трение кажется близким к трению свободного несвязанного фрагмента IgG. Ранее существовавшая гипотеза равновесия была подтверждена, с предполагаемыми сосуществующими «открытыми» или «закрытыми» конфигурациями IgG, которые находятся в равновесии, демонстрируя различные сайты связывания и особенности связывания28. Эта информация может иметь отношение к пониманию механики антител и того, может ли это механическое поведение быть использовано для улучшения биосовместимости и биодоступности.

Внутренняя динамика ПМБ
Структура MBP имеет компактное шаровое ядро, которое позволяет сильно растягивать и изгибать движения с его гибкими случайными концами катушки. Динамика MBP интерпретировалась с использованием гибких полимерных моделей с добавлением и без добавления внутреннего трения28,39. Как и в случае с IgG, наблюдения внутренней динамики MBP могут быть согласованы в рамках теории броуновского движения, в которой большая амплитуда движения приводит к более длительному времени релаксации с влиянием внутреннего трения внутри белковой цепи. Увеличенное время релаксации с большей амплитудой движений, но меньшим трением может быть описано с помощью того же процесса Орнштейна-Уленбека50,51 броуновского движения в гармоническом потенциале. Внутренние движения с большими амплитудами, но медленным временем релаксации становятся активными при полной денатурации MBP из его родного состояния за счет уменьшения восстанавливающих сил конфигурации цепи (диэдральных потенциалов) и сглаживания локальных энергетических барьеров. Подробные описания внутренней динамики MBP в нативном и денатурированном состоянии можно найти далее в ссылках28,39. При изучении MBP исследование с использованием NSE выявило динамическое поведение, указывающее на промежуточную компактность белка между случайными спиральными полимерами и глобулярными белками. Значительный вклад внутренней динамики белка со скоростью релаксации в несколько наносекунд определялся низкочастотными коллективными растягивающими и изгибающими движениями5. Описание динамики нативного MBP по моделям из теории разрушения полимеров было дано за счет большого значения внутреннего трения белка. В денатурированном MBP внутреннее трение внутри белковой цепи уменьшается, и преобладает полимерный цепной характер спектра релаксации. Высокая гибкость движений структурного ансамбля может помочь увеличить доступную поверхность белка, тем самым облегчая взаимодействие с различными партнерами по связыванию.

Динамические модели
В то время как NSE как метод экспериментально уникален в оценке низкочастотных гармонических движений в биологических макромолекулах и молекулярных субъединицах, анализ промежуточной функции рассеяния требует сравнения со спектрами нейтронов, полученными из различных математических моделей. Модель, представленная здесь и разработанная Biehl et al.28 для концентрированных белковых растворов, использует приближение упругой сети, в котором промежуточная функция рассеяния представляет собой свертку собственных модульных функций, а броуновские осцилляторы представляют внутреннюю динамику. Это одна из немногих доступных моделей для анализа сегментарной динамики белков. Другой хорошо зарекомендовавшей себя моделью для растворов разбавленных белков является модель, предложенная Bu et al.52, которая является надежной моделью, использующей статистическую механику и не требующей сложных припадков или множественных параметров. Аналогичный подход, основанный на динамическом приближении разъединения, может быть также применен к разбавленным системам для характеристики эффективной диффузии как суммы самотрансляционных и внутренних движений53. Некоторые из наших справочников могут предоставить исчерпывающую информацию об этих моделях и их ограничениях. Мы настоятельно рекомендуем Fitter et al.1 и Liu et al.54.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Автор заявляет об отсутствии конкурирующих финансовых интересов и отсутствии конфликта интересов. Содержание рукописи основано на лекции автора, представленной в Hands-Neutron Scattering Applications in Structural Biology School between 2019-2021.

Acknowledgments

В этом исследовании использовались ресурсы в Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, Biology and Chemistry labs), Офисе научного пользовательского центра Министерства энергетики США, управляемом Национальной лабораторией Оук-Ридж. В этом исследовании также использовались ресурсы реактора MLZ-FRM2 Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) и JCNS1 в Forschungszentrum Jülich GmbH, Германия. Автор благодарит д-ра Ральфа Биля и д-ра Андреаса Штадлера за их помощь в моделировании и их вклад в исследования белков IgG и MBP, д-ра Петра А. Жолнерчука за поддержку сокращения данных NSE, д-ра Чангву До за поддержку измерений SANS и Ронду и д-ра Кевина Вайса за поддержку лаборатории биохимии SNS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine MBP protein solution Sigma-Aldrich M1891 lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O - heavy water Sigma-Aldrich Product No. 151882 liquid
Dionized water in house - for washing / cleanning cells
DLS instrument Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich - dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standards SNS-NSE, ORNL - Al2O3  and Graphite powders
Ethanol Sigma-Aldrich 65350-M 70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solution Sigma-Aldrich I4506 lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrument JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - small angle neutron instrument
Liquinox dish detergent Alconox - Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2O Sigma-Aldrich Product No.S9390 disodium phosphate heptahydrate salt
NaCl Sigma-Aldrich Product No.S9888 sodium chloride salt
NaH2PO4·H2O Sigma-Aldrich Product No. S9638 monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific Catalog number: ND-2000 NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment camera NeutronOptics, Grenoble NOG210222 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M - wax parafilm Bemis Parafilm M - 5259-04LC PM996 all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE Spectrometer JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - neutron spectrometer
SasView https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument FZ-Jülich - small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranes Thermo Scientific 88400-88405 Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis Cluster Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometer ORNL, Oak Ridge, TN, USA - neutron spectrometer
Sterile syringe filters VWR N.A. PN:28145-501 0.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS) SP Scientific Part Number 100004055 sample environment equipment
Urea -d4 Sigma-Aldrich Product No. 176087 deuterated Urea salt
Viscometer FZ-Jülich - falling ball viscometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fitter, J., Gutberlet, T., Katsaras, J. Neutron Scattering in Biology: Techniques and Applications. , New York. (2006).
  2. Stadler, A., Monkenbusch, M., Biehl, R., Richter, D., Ollivier, J. Neutron spin-echo and TOF reveals protein dynamics in solution. Journal of the Physical Society of Japan. 82, (2013).
  3. Inoue, R. Large domain fluctuations on 50-ns timescale enable catalytic activity in phosphoglycerate kinase. Biophysical Journal. 99 (7), 2309-2317 (2010).
  4. Callaway, D. J. E., et al. Controllable activation of nanoscale dynamics in a disordered protein alters binding kinetics. Journal of Molecular Biology. 429 (7), 987-998 (2017).
  5. Stingaciu, L. R., Biehl, R., Changwoo, D., Richter, D., Stadler, A. M. Reduced internal friction by osmolyte interaction in intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (1), 292-296 (2020).
  6. Monkenbusch, M., Richter, D. High resolution neutron spectroscopy-a tool for the investigation of dynamics of polymers and soft matter. Comptes Rendus Physique. , (2007).
  7. Richter, D., Monkenbusch, M., Schwahn, D. Neutron Scattering. Polymer Science: A Comprehensive Reference, 10 Volume Set. , (2012).
  8. Wilson, C. C. Single Crystal Neutron Diffraction From Molecular Materials. , World Scientific. Singapore. (2000).
  9. Marshall, W. Theory of thermal neutron scattering. , Oxford University Press. (1971).
  10. Roger Pynn Introduction & Neutron Scattering "Theory". , Available from: https://neutrons.ornl.gov/sites/default/files/intro_to_neutron_scattering.pdf (2004).
  11. Richter, D. Neutron scattering in polymer physics. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 22-29 (2000).
  12. Harroun, T. A., Wignall, G. D., Katsaras, J. Neutron scattering for biology. Neutron Scattering in Biology. , (2006).
  13. SNS. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/sna (2020).
  14. HFIR. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/hfir (2020).
  15. CNCS. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/cncs (2020).
  16. Perticaroli, S., et al. Description of hydration water in protein (green fluorescent protein) solution. Journal of the American Chemical Society. 139 (3), 1098-1105 (2017).
  17. Perticaroli, S., Nickels, J. D., Ehlers, G., Sokolov, A. P. Rigidity, secondary structure, and the universality of the boson peak in proteins. Biophysical Journal. 106 (12), 2667-2674 (2014).
  18. Miao, Y., et al. Coupled flexibility change in cytochrome p450cam substrate binding determined by neutron scattering, NMR, and molecular dynamics simulation. Biophysical Journal. 103 (10), 2167-2176 (2012).
  19. Mamontov, E., Zamponi, M., Hammons, S., Keener, W. S., Hagen, M., Herwig, K. W. BASIS: A new backscattering spectrometer at the SNS. Neutron News. 19 (3), 22-24 (2008).
  20. Mamontov, E. Microscopic diffusion processes measured in living planarians. Scientific Reports. 9, 8708 (2018).
  21. Alpert, Y., Cser, L., Faragó, B., Franěk, F., Mezei, F., Ostanevich, Y. M. Segmental flexibility in pig immunoglobulin G studied by neutron spin-echo technique. Biopolymers. 24 (9), 1769-1784 (1985).
  22. Bu, Z., Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D., Callaway, D. J. E. Coupled protein domain motion in Taq polymerase revealed by neutron spin-echo spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (49), 17646-17651 (2005).
  23. Biehl, R., et al. Direct observation of correlated interdomain motion in alcohol dehydrogenase. Physical Review Letters. 101, 138102 (2008).
  24. Farago, B., Li, J., Cornilescu, G., Callaway, D. J. E., Bu, Z. Activation of nanoscale allosteric protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Journal. 99 (10), 3473-3482 (2010).
  25. Bu, Z., Callaway, D. J. E. Dynamic propagation of long-range allosteric signals by nanoscale protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Journal. 100 (3), 223 (2011).
  26. Hong, L., et al. Structure and dynamics of a compact state of a multidomain protein, the mercuric ion reductase. Biophysical Journal. 107 (2), 393-400 (2014).
  27. Longeville, S., Stingaciu, L. -R. Hemoglobin diffusion and the dynamics of oxygen capture by red blood cells. Scientific Reports. 7, 10448 (2017).
  28. Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring. Scientific Reports. 6, 22148 (2016).
  29. Hahn, E. L. Nuclear induction due to free larmor precession. Physical Review. 77, 297 (1950).
  30. Hahn, E. L. Spin echoes. Physical Review. 80, 580 (1950).
  31. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735-1782 (2003).
  32. Sasview. , Available from: https://www.sasview.org (2020).
  33. Zhao, J. K., Gao, C. Y., Liu, D. The extended Q-range small-angle neutron scattering diffractometer at the SNS. Journal of Applied Crystallography. 43, 5 PART 1 1068-1077 (2010).
  34. Ohl, M., et al. The high-resolution neutron spin-echo spectrometer for the SNS with τ ≥ 1 µs. Physica B: Condensed Matter. 350, 147-150 (2004).
  35. SNS-NSE web page. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/nse (2022).
  36. Ohl, M., et al. The spin-echo spectrometer at the Spallation Neutron Source (SNS). Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 696, 85-99 (2012).
  37. Zolnierczuk, P. A., Holderer, O., Pasini, S., Kozielewski, T., Stingaciu, L. R., Monkenbusch, M. Efficient data extraction from neutron time-of-flight spin-echo raw data. Journal of Applied Crystallography. 52 (5), 1022-1034 (2019).
  38. Dr Spine hub. , Available from: https://jugit.fz-juelich.de/nse/drspine (2022).
  39. Stadler, A. M., et al. Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), (2014).
  40. FZJ. , Available from: https://www.fz-juelich.de/portal/EN/AboutUs (2022).
  41. KWS2. , Available from: https://miz-garching.de/kws-2 (2022).
  42. Moorhouse, M., Barry, P. The protein databank. Bioinformatics Biocomputing and Perl. , (2005).
  43. Tria, G., Mertens, H. D. T., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (2), 207-217 (2015).
  44. Holderer, O., Monkenbusch, M., Schätzler, R., Kleines, H., Westerhausen, W., Richter, D. The JCNS neutron spin-echo spectrometer J-NSE at the FRM II. Measurement Science and Technology. 90 (4), 043107 (2008).
  45. Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D. Exploring internal protein dynamics by neutron spin echo spectroscopy. Soft Matter. 7 (4), 1299-1307 (2011).
  46. Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring. Scientific Reports. 6, 22148 (2016).
  47. Stadler, A. M., et al. Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6987-6994 (2014).
  48. Biehl, R., Richter, D. Slow internal protein dynamics in solution. Journal of Physics: Condensed Matter. 26 (50), 503103 (2014).
  49. Hinsen, K. The molecular modeling toolkit: A new approach to molecular simulations. Journal of Computational Chemistry. 21 (2), 79-85 (2000).
  50. Uhlenbeck, G. E., Ornstein, L. S. On the theory of the Brownian motion. Physical Review. 36 (5), 823 (1930).
  51. Wang, M. C., Uhlenbeck, G. E. On the theory of the Brownian motion II. Reviews of Modern Physics. 17, 323 (1945).
  52. Callaway, D. J. E., Bu, Z. Nanoscale protein domain motion and long-range allostery in signaling proteins-a view from neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Reviews. 7 (2), 165-174 (2015).
  53. Liu, Y. Intermediate scattering function for macromolecules in solution probed by neutron spin echo. Physical Review E. 95, 020501 (2017).
  54. Liu, Y. Short-time dynamics of proteins in solutions studied by neutron spin echo. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 42, 147-156 (2019).

Tags

Инженерия Выпуск 182 Рассеяние нейтронов спин-эхо нейтронов белковый раствор медленная динамика движения белкового домена гибкость белка
Исследование динамики белка с <em>помощью</em> нейтронной спиновой эхо-спектроскопии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stingaciu, L. R. Study of Protein… More

Stingaciu, L. R. Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy. J. Vis. Exp. (182), e61862, doi:10.3791/61862 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter