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Engineering

Estudio de la dinámica de proteínas a través de la espectroscopia de eco de espín de neutrones

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/61862
Automatic Translation
1
1NSD, Oak Ridge National Laboratory

Summary

El presente protocolo describe métodos para investigar la estructura y la dinámica de dos proteínas modelo que tienen un papel importante en la salud humana. La técnica combina la caracterización biofísica de sobremesa con la espectroscopia de eco de espín de neutrones para acceder a la dinámica en escalas de tiempo y longitud relevantes para los movimientos entre dominios de proteínas.

Abstract

La actividad y funcionalidad de la mayoría de las proteínas del cuerpo humano están relacionadas con cambios de configuración de subdominios completos dentro de la estructura cristalina de la proteína. Las estructuras cristalinas construyen la base para cualquier cálculo que describa la estructura o dinámica de una proteína, la mayoría de las veces con fuertes restricciones geométricas. Sin embargo, estas restricciones de la estructura cristalina no están presentes en la solución. La estructura de las proteínas en la solución puede diferir del cristal debido a los reordenamientos de bucles o subdominios en la escala de tiempo de pico a nanosegundo (es decir, el régimen de tiempo de dinámica interna de proteínas). El presente trabajo describe cómo se puede acceder a cámaras lentas en escalas de tiempo de varias decenas de nanosegundos utilizando la dispersión de neutrones. En particular, la caracterización dinámica de dos proteínas humanas principales, una proteína intrínsecamente desordenada que carece de una estructura secundaria bien definida y una proteína de anticuerpo clásica, se aborda mediante espectroscopia de eco de espín de neutrones (NSE) combinada con una amplia gama de métodos de caracterización de laboratorio. Se lograron más conocimientos sobre la dinámica del dominio de las proteínas utilizando modelos matemáticos para describir los datos experimentales de neutrones y determinar el cruce entre los movimientos difusivos e internos combinados de las proteínas. La extracción de la contribución dinámica interna a la función de dispersión intermedia obtenida de NSE, incluida la escala de tiempo de los diversos movimientos, permite una mayor visión de las propiedades mecánicas de las proteínas individuales y la suavidad de las proteínas en su entorno casi natural en la solución de proteína abarrotada.

Introduction

Dinámica de sondeo de la materia blanda con neutrones
La investigación de las propiedades dinámicas de las proteínas y los péptidos es una parte importante de la investigación biofísica, y hoy en día existen muchos métodos bien desarrollados para acceder a una amplia gama de paisajes energéticos1. Relacionar la dinámica revelada experimentalmente de las proteínas con su función biológica es una tarea mucho más difícil, que requiere modelos matemáticos complejos y simulaciones dinámicas asistidas por computadora. La importancia de la espectroscopia de neutrones para el análisis de los movimientos de las proteínas ha sido enfatizada en varios estudios bien recibidos y ampliamente reconocidos 1,2,3,4,5. Antes de explorar el diverso panorama energético de la dinámica interna de proteínas, se requiere una breve descripción de los procesos dinámicos en la materia blanda y cómo los neutrones pueden acceder a ellos.

La sensibilidad de los neutrones a la configuración isotópica y el tipo de interacciones que muestran con la materia blanda hace que la dispersión de neutrones sea una de las técnicas de investigación más versátiles6. Existe un amplio espectro de escalas de longitud de correlación y tiempos de correlación a los que los neutrones pueden acceder, desde excitaciones nucleares y vibraciones atómicas hasta movimientos colectivos y procesos de relajación lentos como rotaciones isotrópicas y movimientos difusivos. Al investigar los neutrones dispersos para su transferencia de energía, se pueden distinguir tres interacciones principales: la dispersión elástica, en la que no hay intercambio de energía entre el neutrón entrante y la partícula en la muestra; la dispersión inelástica, con un gran intercambio de energía cuantificable entre neutrones y partículas; y el peculiar caso de la dispersión cuasielástica que designa una transferencia de energía muy pequeña en comparación con la energía neutrónica incidente 1,7. Estas interacciones proporcionan información precisa sobre el material investigado y forman la base teórica de una amplia variedad de técnicas de dispersión de neutrones.

En la dispersión elástica, el detector registra las direcciones de los neutrones como un patrón de difracción, que muestra la posición de los átomos de muestra entre sí. Se adquiere información sobre las correlaciones de las posiciones atómicas (es decir, la intensidad integrada S (Q) con respecto a la transferencia de momento Q, que se refiere solo a la información estructural). Este principio constituye la base de la difracción de neutrones8.

La complejidad surge cuando la transferencia de energía ya no es cero debido a excitaciones y fluctuaciones internas en el material de la muestra. Esto forma la base de la espectroscopia de neutrones, en la que los neutrones dispersos se investigan en función tanto de la transferencia de energía E como de la transferencia de momento Q. Se obtiene información dinámica y estructural. La espectroscopia de neutrones mide la misma intensidad integrada S(Q) para la transferencia de energía (es decir, el cambio de velocidad de los neutrones debido a la dispersión de la muestra, S(Q,ω) = S(Q, E), que también se conoce como el factor de estructura dinámica)9.

Para calcular la dispersión a partir de un material, es más adecuado utilizar la función de correlación de pares 7,10. En el caso de difracción, la función de correlación de pares estáticos G(r) da la probabilidad de encontrar el centro de una partícula a una distancia dada r del centro de otra partícula. La espectroscopia generaliza la función de correlación de pares estáticos e incluye energía/frecuencia/tiempo en la ecuación de dispersión. La función de correlación de pares G(r) se convierte en una función del tiempo G(r, t), que puede descomponerse en una función de correlación de pares de átomos distinta GD(r, t), y una función de autocorrelación GS(r, t). Estos describen dos tipos de correlaciones: movimientos correlacionados por pares de átomos que gobiernan la dispersión coherente y autocorrelación que gobierna la dispersión incoherente10.

La dispersión coherente es la dispersión de "la media" y depende de la fase relativa de las ondas dispersas. En el régimen de dispersión de ángulo pequeño, las ondas de neutrones dispersas de diferentes centros de dispersión (diferentes átomos) interfieren constructivamente (tienen fases similares), y el movimiento colectivo de los átomos se observa con una fuerte mejora de intensidad. La dispersión coherente describe esencialmente la dispersión de un solo neutrón de todos los núcleos de la muestra10.

Cuando no se produce ninguna interferencia constructiva entre las ondas de neutrones dispersas de diferentes centros, se sigue un solo átomo en el tiempo, y se observa la autocorrelación entre la posición del átomo en el tiempo t = 0 y el mismo átomo en el tiempo t. Por lo tanto, la información sobre las posiciones relativas de los átomos se pierde, y el enfoque está solo en las fluctuaciones locales. La dispersión de las fluctuaciones locales gobierna la dispersión incoherente. La dispersión incoherente es isotrópica, contribuye a la señal de fondo y degrada la señal a ruido10,11.

Combinando todo lo anterior, distinguimos cuatro procesos principales de dispersión de neutrones10: (1) coherente elástico (mide las correlaciones de las posiciones atómicas), (2) coherente inelástico (mide los movimientos colectivos de los átomos), (3) elástico incoherente (contribuye al fondo, reduce la intensidad de dispersión por el factor de Debye-Waller (DWF) y mide el factor de estructura incoherente elástica (EISF), describiendo la geometría de los movimientos difusivos en geometría confinada, y (4) incoherente inelástica (mide la dinámica de un solo átomo y la autocorrelación).

Los procesos dinámicos a los que los neutrones pueden acceder en biología van desde la amortiguación de vibraciones atómicas y moleculares de baja frecuencia, la interacción de moléculas de solvente con biosuperficies y procesos de difusión en la capa de hidratación de macromoléculas y geometría confinada, hasta movimientos difusivos de traslación, rotación y caída de corto alcance, y dominios de proteínas y movimientos alostéricos1 . La amplia diversidad de métodos e instrumentos de neutrones para medir la dinámica de las proteínas se basa en cómo se logra la acromatización del haz de neutrones incidente o saliente y cómo se realiza el análisis energético de los neutrones dispersos. Desde el triple eje hasta el tiempo de vuelo, la retrodispersión y los espectrómetros de espín-eco, se pueden explorar procesos dinámicos con tiempos característicos entre 1 x 10-14 s y 1 x 10-6 s (femtosegundos a microsegundos)12.

El Laboratorio Nacional de Oak Ridge, con sus dos fuentes de neutrones de renombre, la Fuente de Neutrones de Espalación - SNS13 y el Reactor de Alto Flujo de Isótopos - HFIR14, tiene uno de los mejores conjuntos de espectrómetros para investigar la dinámica en biomateriales. Algunos de los ejemplos más elocuentes incluyen el uso del espectrómetro de picador de neutrones fríos (CNCS) en SNS15 para investigar la perturbación dinámica del agua de hidratación alrededor de la proteína fluorescente verde en la solución16 o las vibraciones colectivas sub-picosegundos de varias proteínas17. Un problema recurrente de las investigaciones de dispersión de neutrones inelásticos es que algunos procesos biológicos son demasiado lentos para ser observados. Sin configuraciones extremas que conduzcan a una gran pérdida de intensidad de neutrones, los espectrómetros de tiempo de vuelo están limitados a una resolución de energía de 10 μeV, lo que corresponde a una escala de tiempo máxima de ~ 200 ps10,11. Esto no es suficiente para observar movimientos a gran escala en las proteínas. Por lo tanto, a menudo se necesitan instrumentos con una mayor resolución de energía, como los espectrómetros de retrodispersión. La combinación de las técnicas de tiempo de vuelo y retrodispersión ha demostrado ser poderosa para investigar el cambio en la dinámica interna del citocromo P450cam (CYP101), una enzima que cataliza la hidroxilación alcanfor18.

La difusividad microscópica medida por el espectrómetro de retrodispersión en SNS-BASIS19 estaba sorprendentemente bien definida y podía separarse en la difusividad del agua (hidratación, citoplasmática y agua a granel) y la difusividad de los constituyentes celulares en gusanos planos planarios, el primer animal vivo que se estudió mediante dispersión de neutrones20 . La retrodispersión es una técnica espectroscópica de alta resolución, pero también se limita a varios μeV = varios nanosegundos, mientras que la dinámica lenta en los biomateriales también se manifiesta como el tiempo de supervivencia de la correlación entre la posición atómica o las orientaciones de espín (por ejemplo, procesos de relajación, que ocurren regularmente en el rango de tiempo de diez a cientos de nanosegundos).

La espectroscopia de eco de espín de neutrones (NSE) es la única técnica de dispersión de neutrones que alcanza una resolución tan alta. A diferencia de otras técnicas de neutrones, NSE no requiere la acromatización del haz, ya que utiliza la fase mecánica cuántica de los neutrones, que son sus momentos magnéticos. La manipulación de momentos magnéticos permite el uso de una amplia distribución de longitud de onda del haz de neutrones, mientras que la técnica es sensible a cambios de velocidad de neutrones muy pequeños del orden de 1 x 10-4. NSE se ha utilizado con éxito para investigar la dinámica lenta de las proteínas en solución para muchas proteínas. Entre estos muchos estudios pioneros, reconocemos el estudio de la flexibilidad segmentaria de la inmunoglobulina porcina21; los movimientos de dominio acoplado en la polimerasaTaq 22; los movimientos del dominio en el tetrámero de levadura alcohol deshidrogenasa23; el cambio de conformación en la fosfoglicerato quinasa sobre la unión al sustrato3; la activación de los movimientos de dominio y la propagación dinámica de señales alostéricas en la proteína 4,24,25 del cofactor regulador del intercambio Na+/H+ (NHERF1); la dinámica de un estado compacto de iones mercúricos reductasa26; y la difusión de hemoglobina en los glóbulos rojos27. Dos estudios más recientes en dinámica de proteínas han expuesto la flexibilidad del anticuerpo humano Inmunoglobulina G (IgG) como primavera entrópica28 y las características de la contribución de disolventes a la dinámica de la proteína básica de mielina intrínsecamente desordenada (MBP)5.

El presente artículo explica los principios básicos de NSE, los múltiples métodos preparatorios recomendados para una investigación exhaustiva de la dinámica de proteínas, así como la metodología y el protocolo experimental para la adquisición de datos de NSE en el espectrómetro NSE en SNS, SNS-NSE. El protocolo caracteriza dos proteínas: IgG, una proteína de anticuerpos humanos regulares, y la proteína intrínsecamente desordenada MBP. Las implicaciones biofísicas, la relevancia de la investigación de los ejemplos y las limitaciones de la técnica se discuten brevemente.

Espectroscopia NSE, el método para mediciones de dinámica lenta
NSE es una técnica polarizada que utiliza el tiempo de vuelo de neutrones para medir el intercambio de energía (pérdida de polarización) debido a la interacción cuasi-elástica entre neutrones y átomos en una muestra. En el núcleo de la espectroscopia NSE se encuentran dos principios básicos: (1) la capacidad del espín de neutrones para precesar en el campo magnético con una frecuencia proporcional a la fuerza Equation 1magnética, a saber, la frecuencia de Larmor29, y (b) el espín-eco o eco de Hann, que representa la manipulación y reenfoque de la señal de polarización al aplicar una serie de pulsos de radiofrecuencia30.

Los conceptos básicos del proceso NSE se pueden resumir en unos sencillos pasos 6,11 utilizando la Figura 1. (1) El haz de neutrones producido por la fuente (posición 1) es polarizado (posición 2), guiado y transportado (posición 3), y llega a la entrada del espectrómetro NSE, donde se gira 90° por la primera aleta pi-half (posición 4). (2) El haz polarizado (por ejemplo, momentos magnéticos de neutrones) se vuelve perpendicular a las líneas del campo magnético del primer imán (primera zona de precesión, posición 5) y comienza a precesar. (3) Al final del imán, los espines de neutrones acumulan un cierto ángulo de precesión proporcional a la intensidad del campo magnético y al tiempo de vuelo pasado en su interior (básicamente inversamente proporcional a la velocidad del neutrón). Las velocidades de neutrones individuales están codificadas dentro de su ángulo de precesión al final de la primera zona de precesión. (4) Cerca de la posición de la muestra, el pi-flipper (posición 6) invierte la orientación del espín en 180°, cambiando el signo del ángulo de precesión. (5) Los neutrones interactúan con las moléculas de la muestra (posición 7) y se dispersan. (6) Los neutrones dispersos entran y precesan en la segunda zona de precesión (posición 8) pero se orientan hacia atrás. (7) Se utiliza otra aleta pi-half (posición 9) para girar la orientación del giro de perpendicular a la dirección horizontal. Esto detendrá la precesión, traduciendo el ángulo de precesión φ en polarización proporcional a cos(φ). (8) El analizador (posición 10) selecciona los neutrones en función de una orientación. Si la interacción con la muestra es elástica, la velocidad del neutrón no cambiará. Los neutrones pasarán una cantidad idéntica de tiempo volando en la primera y segunda zonas de precesión, y los ángulos de precesión acumulados se recuperan por completo. La polarización completa se restaura en el detector (posición 11) como un eco de la polarización original (es decir, espín-eco). (9) Sin embargo, en NSE, la dispersión es cuasi elástica, por lo que un pequeño intercambio de energía entre neutrones y moléculas de muestra conduce a diferentes velocidades de neutrones después de la dispersión por la muestra. Debido a las diferentes velocidades, los neutrones pasarán un tiempo adicional volando a través de la segunda zona de precesión y no habrán recuperado adecuadamente su ángulo de precesión. Se recupera una polarización parcial en el detector, y la pérdida de polarización debido a la relajación del espín es proporcional a la transformada cos-Fourier de la función espectral S(Q, ω), la función de dispersión intermedia F(Q, t). (10) El parámetro de tiempo de la función F(Q, t) es proporcional a la intensidad del campo magnético de precesión. El escaneo de la pérdida de polarización en función de la intensidad del campo magnético produce, por lo tanto, una función de relajación que depende de los procesos dinámicos dentro de la muestra.

Figure 1
Figura 1: Fotografía del espectrómetro NSE en SNS (SNS-NSE) y esquema de trayectoria de vuelo de neutrones con los componentes funcionales más importantes. De derecha a izquierda: 1 = fuente de neutrones; 2 = choppers-bender-polarizador-sistema de obturador secundario; 3 = guías de transporte de vigas; 4 = pi/2 flipper para el primer giro de 90°; 5 = primera zona de precesión; 6 = pi flipper para 180° spin-turn; 7 = área de muestra y entorno de muestra (aquí, se muestra el crio-horno); 8 = segunda zona de precesión; 9 = pi/2 flipper para el segundo giro de 90°; 10 = analizador; 11 = detector. (Tenga en cuenta que las porciones de 3, así como 2 y 1, están situadas detrás de la pared azul dentro del blindaje; los helicópteros se reemplazan por un selector de velocidad para NSE basado en reactores). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

El presente trabajo caracteriza dos proteínas: una proteína igG de anticuerpos humanos regulares y la MBP intrínsecamente desordenada. La forma liofilizada de las proteínas se obtuvo de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación de muestras de proteínas

  1. Prepare un tampón de fosfato de sodio de 50 mM + 0,1 M de NaCl pesando y disolviendo los reactivos sólidos respectivos en agua pesada (D2O) (ver Tabla de Materiales). Este es el disolvente tampón deuterado para IgG.
    1. Ajuste el pH de la solución tampón a 6.6.
  2. Prepare un tampón de fosfato de sodio de 20 mM + 6 M de urea pesando y disolviendo los respectivos componentes sólidos en agua pesada (D2O). Este es el disolvente tampón deuterado para MBP.
    1. Ajuste el pH de la solución tampón a 4.7.
  3. Filtre los disolventes tampón utilizando filtros de tamaño de poro de 0,2 μm (consulte la Tabla de materiales).
  4. Pesar y disolver los polvos liofilizados de proteínas purificadas en los disolventes deuterados para las proteínas respectivas (Pasos 1.1.-1.2.) a alta concentración de proteínas (~50 mg/ml).
  5. Cargue la solución proteica en cestas de diálisis con membranas de diálisis de 3,5 K MWCO, y dialice contra el tampón filtrado durante 24 h a 10 °C para MBP y 25 °C para IgG (ver Tabla de materiales) agitando ligeramente los tubos para crear un gradiente de difusión.
  6. Diluya la solución proteica utilizando el tampón de diálisis en una serie de concentraciones: 1, 2, 5, 10 y 50 mg/ml.
  7. Determine las concentraciones exactas utilizando un espectrofotómetro Nanodrop (ver Tabla de Materiales).

2. Caracterización preliminar de la muestra por dispersión dinámica de la luz (DLS)

  1. Cargue 80 μL de cada solución proteica de la serie de concentración preparada anteriormente (Paso 1.6.) en la célula desechable DLS (ver Tabla de Materiales) y determine los coeficientes de difusión, con un promedio de más de 10 adquisiciones.
  2. Trazar los coeficientes de difusión traslacional en función de la concentración de proteínas y extrapolar a concentración cero.
  3. Cargue cada solución proteica de la serie de concentración en los tubos capilares de un viscosímetro (consulte la Tabla de materiales) y mida la viscosidad dinámica.
  4. Trazar las viscosidades dinámicas medidas en función de la concentración de proteínas y extrapolarlas a concentración cero.
    NOTA: La extrapolación de la difusión dlS a la concentración cero produce el valor de la difusión traslacional para una sola proteína. La extrapolación de la viscosidad dinámica a la concentración cero debe arrojar el valor de viscosidad dinámica medido experimentalmente para la solución tampón.

3. Recolección de dispersión de ángulo pequeño (neutrón o rayos X)

  1. Mida la dispersión de neutrones de ángulo pequeño (SANS) y/o la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) (consulte la Tabla de materiales) en cuatro concentraciones de proteínas, preferiblemente 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml y 50 mg/ml.
  2. Normalizar los espectros SANS y SAXS por concentración de proteínas.
  3. Ajuste el factor de forma de proteína P(Q) a los espectros SANS y SAXS utilizando el software de optimizaciónde conjunto 31 y/o SasView32 .
  4. Calcule el factor de estructura S(Q, c) dividiendo la señal SANS y SAXS con P(Q) para cada concentración.
    NOTA: Se recomienda a los lectores interesados en cómo medir e interpretar los datos de dispersión de ángulo pequeño como soporte para las mediciones de NSE que consulten a fondo las referencias 23,28,31,32,33.

4. Medición de NSE

  1. Configure el experimento y monte el ejemplo siguiendo los pasos que se indican a continuación.
    1. Seleccione el grosor de la celda para la carga de la muestra en función de la concentración de la solución de proteína, la temperatura necesaria para la medición y la cantidad de solución disponible.
      NOTA: El presente estudio utilizó contenedores de cuarzo transparente de cargador superior de 40 mm x 30 mm x 4 mm.
    2. Limpie la célula repetidamente, alternando entre detergente para platos sin fosfato (consulte la Tabla de materiales), agua desionizada y etanol al 70%.
    3. Seque la celda en el horno de convección; no exceda de 80 °C para las celdas de cuarzo.
    4. Cargue 4 ml de solución de proteína en la célula y cierre con tapas. Use una película de cera o cualquier sellador (consulte la Tabla de materiales) para sellar las celdas de la muestra.
      NOTA: En el presente estudio, se utilizaron 4,8 ml de solución a ~50 mg/ml para obtener una intensidad de dispersión suficiente.
    5. Cargue 4 ml de tampón de diálisis en un recipiente idéntico al de la muestra de proteína y el sello.
    6. Transporte muestras a la línea de haz, cierre el obturador y entre en el área de la cueva del recinto del espectrómetro34.
    7. Monte la celda de muestra en el portamuestras de aluminio apretando los tornillos y las placas de sujeción (Figura 2, panel izquierdo).
      NOTA: Se pueden montar dos celdas de muestra al mismo tiempo, dado que se necesita el mismo protocolo de medición para todas las muestras.
    8. Monte la muestra de grafito y/o la muestra de polvo Al2O3 cargada en un recipiente idéntico al de la muestra de proteína. Estos son estándares proporcionados por el soporte de línea de haz SNS-NSE.
    9. Coloque el soporte de la muestra deslizándolo suavemente en la lata del sistema de forzamiento de temperatura (TFS, consulte tabla de materiales).
      NOTA: TFS es el entorno de muestra más utilizado en SNS-NSE y bombea aire seco al recipiente de muestra para alcanzar la temperatura deseada (Figura 2, paneles central y derecho).
    10. Cierre la tapa del TFS y ajuste la temperatura al valor deseado accediendo a la pantalla interactiva del TFS.
    11. Monte la cámara de neutrones (consulte la Tabla de materiales) para la alineación de las muestras con el haz.
    12. Barrer la carcasa del instrumento, evacuar, cerrar las puertas y abrir el obturador de viga.
      NOTA: Las celdas de muestra son proporcionadas por el soporte de línea de haz SNS-NSE. Para conocer las celdas de muestra disponibles y la biblioteca del entorno de muestra, consulte la página web 7,35 de la línea de haz SNS-NSE.
  2. Recopile los datos de NSE siguiendo los pasos a continuación.
    1. Alinee la muestra en el haz de neutrones utilizando la cámara de neutrones y las cuatro aberturas de muestra independientes.
    2. Abra el software de recopilación de datos SNS-NSE36 y recopile estadísticas de muestra ejecutando escaneos de difracción para los ángulos de dispersión y la longitud de onda deseados.
    3. Configure los parámetros de medición en función de las estadísticas recopiladas para cada muestra editando las macros de medición proporcionadas por el científico de instrumentos asistente.
    4. Comience a escanear escribiendo el nombre del protocolo en el símbolo del sistema y adquiera ecos para la muestra.
    5. Comience a escanear y adquiera ecos también para la referencia elástica y el disolvente tamponado. Realice una operación intermitente de obturador de haz para el cambio de muestra.

Figure 2
Figura 2: Sistema de medición NSE. Panel izquierdo: muestras de solución proteica en recipiente de cuarzo montado con tornillos y placas en el portamuestras de aluminio (Al). El portamuestras Al ofrece la posibilidad de montar dos muestras simultáneamente dentro del entorno de la muestra. Panel central: La muestra del sistema de forzamiento de temperatura (TFS) se puede montar en la etapa de muestra, la ventana del haz de neutrones está a la derecha, mientras que la cámara de neutrones utilizada para la alineación es visible en el lado izquierdo. Panel derecho: colocar el portamuestras con dos muestras en la muestra puede funcionar con ventanas de silicio (Si). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Reducción de datos de NSE

NOTA: SNS-NSE está equipado con un software dedicado llamado DrSpine (reducción de datos para spin-echo)37,38 disponible en el clúster de análisis remoto de ORNL Neutron Sciences, una Guía rápida del usuario y soporte de ayuda incorporado.

  1. Inicie sesión en neutron Sciences Remote Analysis Cluster (consulte tabla de materiales) con las credenciales de usuario de ORNL y pulse el botón Iniciar sesión .
  2. Configure el software de reducción de datos siguiendo los pasos a continuación.
    1. En el directorio de usuario, abra una ventana de terminal y escriba: source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh.
    2. A continuación, escriba: drspine_create_env.sh.
  3. Cree una carpeta para la reducción de datos en el directorio principal y copie los scripts y macros proporcionados desde el directorio compartido.
  4. Edite, cambie el nombre y guarde la macro de reducción proporcionada en consecuencia.
  5. Escriba drspine en el símbolo del sistema y presione Entrar para iniciar el entorno de reducción de software.
  6. Escriba "el nombre de la macro de reducción" editado en el paso 5.4. en el símbolo del sistema dentro del entorno de software y presione Entrar.

6. Ajuste de datos NSE

  1. Edite el script de Python "stapler-drspine.py", proporcionado por el científico de instrumentos asistente, con los nombres de los datos de archivo reducidos.
    NOTA: El script de Python está disponible gratuitamente para los usuarios del instrumento.
  2. Edite la función para que se ajuste desde la biblioteca proporcionada.
  3. Escriba el nombre del script editado "stapler-drspine.py" en el símbolo del sistema y presione Entrar para leer, ajustar y trazar datos NSE reducidos.
    NOTA: El Científico de Instrumentos proporcionará una plantilla para la macro de reducción y el script python "stapler-drspine.py" que puede leer y ajustarse a los datos reducidos de NSE. Los datos finales de NSE reducidos están en formato ASCII y pueden ser leídos por varios programas preferidos.

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Representative Results

La proteína IgG de las proteínas MBP humanas y bovinas se reconstituyó a altas concentraciones (~ 50 mg / ml) en tampones de base O D2. Dado que las proteínas se disolvieron en altas concentraciones, las soluciones obtenidas fueron soluciones de proteínas abarrotadas. La dinámica investigada con NSE adolece del ambiente abarrotado en el que residen las proteínas (interacciones de factores de estructura y efectos hidrodinámicos)5,28,39. DLS se realizó en una serie de concentración para cada proteína para tener en cuenta los efectos de hacinamiento. La extrapolación a concentración cero de los coeficientes de difusión traslacional medidos por DLS arroja el valor de difusión traslacional para una sola proteína. La viscosidad dinámica en función de la concentración de proteínas también debe medirse antes de la NSE para tener en cuenta las interacciones hidrodinámicas. La extrapolación a concentración cero de las viscosidades dinámicas en función de la concentración debe producir el valor que se puede medir experimentalmente para la solución tampón de cada muestra de proteína preparada.

La forma y la estructura de las proteínas en solución concentrada se evaluaron antes de cualquier experimento de NSE para obtener información sobre el factor de forma de la proteína y la fuerza del factor de estructura, lo que podría influir en cómo se mueven las proteínas en solución. La dispersión de ángulo pequeño fue el método de elección para estas investigaciones. En el presente estudio, la conformación estructural de la proteína IgG en solución fue observada por SAXS, y la estructura de MBP fue evaluada por SANS. La intensidad de dispersión (Q) medida (Pasos 3.3.-3.4.) es proporcional al producto entre el factor de forma P(Q) y el factor de estructura S(Q,c) ponderado por el número de partículas (Ecuación 1)5,28,39:

I (Q) = N ∙ P (Q) ∙S (Q, c) (1)

SAXS se midió en un instrumento SAXS de tipo Kratky40 con una longitud de onda de rayos X de 0,154 nm para IgG, y SANS se midió41 para MBP con una longitud de onda de neutrones de 4,5 Å. Las intensidades experimentales de ángulo pequeño I(Q) fueron corregidas en segundo plano y con disolvente, escaladas por concentración de solución, y el factor de forma se calculó utilizando paquetes de software disponibles gratuitamente como Ensemble modeling-EOM y SasView 24,25,29,39,42,43. Además, el factor de estructura para cada proteína se obtuvo de la Ecuación 1.

Para el presente estudio, los experimentos NSE se realizaron con dos espectrómetros de espín-eco: el instrumento SNS-NSE34 en la Figura 1 y el instrumento Phoenix-J-NSE44. Se midieron longitudes de onda incidentes entre 8 Å - 12 Å, con tiempos de Fourier entre 0,1 ns ≤ tmáximo ≤ 130 ns para varias mediciones Q entre 0,05 Å−1- 0,2 Å−1. La diferencia entre los dos espectrómetros es un punto vital en la comprensión de la ciencia de NSE, y representan tanto el viejo concepto de un llamado "eco de espín clásico" para la fuente de neutrones estáticos de un reactor como el nuevo "concepto de tiempo de vuelo" para la fuente de neutrones pulsantes. El espectrómetro Phoenix-J-NSE es un NSE de tipo clásico, en el que un selector de velocidad selecciona una longitud de onda particular. Para permitir variaciones en las velocidades de los neutrones, se introduce un ancho de banda de longitud de onda ±10%. A pesar de la banda de energía muy estrecha utilizada para un solo escaneo, la situación del espectrómetro Phoenix-J-NSE en una fuente de reactor de alto flujo garantiza que los rangos de tiempo de vector espacial y correlaciones se cubran en tiempos de medición relativamente cortos. El espectrómetro SNS-NSE es el espectrómetro de neutrones choppers de nueva generación, de ultra alta resolución, con un lapso de longitud de onda de 2 Å < λ < 14 Å y un ancho de banda de longitud de onda simultánea de 2.4 Å - 3.6 Å, dependiendo de la posición del espectrómetro. Debido a este amplio ancho de banda, se logra una alta eficiencia de recopilación de datos, lo que permite una cobertura casi ilimitada de un amplio rango de tiempo de vector de onda con solo unos pocos ajustes de ángulo de dispersión. La selección de la banda de longitud de onda en el SNS-NSE se realiza mediante un sistema de helicóptero que consta de cuatro helicópteros. Ambos espectrómetros NSE discutidos aquí tienen campos de precesión basados en tecnología superconductora con alta homogeneidad del campo magnético, nuevos elementos de corrección de campo de última generación para correcciones de campo perdido y nuevos dobladores polarizadores41,42.

Los espectros NSE se midieron a 10 °C para la proteína MBP y a 25 °C para la proteína IgG1. La intensidad de dispersión intermedia coherente I(Q, t) / I(Q, t = 0) medida por NSE es el resultado contributivo de todos los procesos dinámicos en la muestra que ocurren dentro de la escala de tiempo investigada. Esto contiene la dinámica interna de la proteína, la difusión traslacional general, la difusión rotacional y de caída, y los movimientos segmentarios dentro de la propia molécula de proteína. Un modelo simplificado asume que la dinámica interna y las difusiones traslacional y rotacional están totalmente desacopladas 5,45,46,47,48 y pueden caracterizarse por separado. Para la partícula única, la función de dispersión coherente se puede escribir como el producto (Ecuación 2)23,48:

F (Q, t) = Ftrans(Q, t) ∙Frot(Q, t) ∙Fint(Q, t) (2)

donde el término de difusión traslacional para una sola proteína rígida es una función exponencial del coeficiente de difusión traslacional DT (Ecuación 3)23,48:

Ftrans(Q, t) = exp(−Q2∙ DT∙ t) (3)

Para grandes concentraciones de proteínas, el coeficiente de difusión traslacional DT está influenciado por las interacciones proteína-proteína, cuantificadas por el factor de estructura S(Q) y por las interacciones hidrodinámicas descritas por la función hidrodinámica HT(Q) (Ecuación 4)23,48:

DT(Q) = DT0 ∙HT(Q, c) / S(Q, c) (4)

En la ecuación 4, DT0 es el valor de difusión extrapolado a concentración cero de las mediciones DLS (Paso 2.2.). HT se calcula como HT = 1 -c∙ [η], donde c es la concentración de proteínas, [η] es la viscosidad intrínseca calculada por [η] = (η - η0) /η0 ∙ c, y η0 es la viscosidad dinámica medida (Pasos 2.3.-2.4.). El factor de estructura S(Q, c) se obtuvo de las mediciones SAXS para la proteína IgG y sanS para la proteína MBP.

La Figura 3 muestra ejemplos de funciones de dispersión intermedia I(Q, t) / I(Q, t = 0), medidas por NSE para proteínas IgG y MBP. Se observó una clara desviación de un proceso de relajación simple similar a la difusión en la escala de tiempo de Fourier corta, <25 ns, lo que indica la accesibilidad de la dinámica interna de la proteína por NSE y la necesidad de un modelo más complejo para describir los procesos dinámicos observados.

Figure 3
Figura 3: Espectros de relajación NSE para proteínas IgG y MBP. Los datos de IgG se muestran aquí ajustados solo por una función exponencial única para revelar la desviación de la difusión en tiempos de Fourier más cortos. La desviación se observó para ambas proteínas. Por el contrario, los datos de MBP se muestran aquí en el rango de relajación completa, ajustado por el modelo desarrollado porBiehl 45. El modelo implica grano grueso y permite el ajuste simultáneo de regímenes de tiempo de Fourier cortos, intermedios y largos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Por lo tanto, las funciones de dispersión se ajustaron mediante el modelado atómico de ambas proteínas utilizando modelos desarrollados por Biehl, descritos en las referencias 18,25,38,43,44,46. La función de dispersión intermedia se calculó mediante grano grueso a un par de cientos de granos individuales, a diferencia de la simulación de todos los átomos, para reducir la carga y el tiempo computacionales, y la biblioteca de software MMTK49 (de libre acceso) se utilizó para acceder a las coordenadas atómicas e implementar movimientos trans-rotacionales en dominios y fragmentos de proteínas. Los resultados del cálculo de la función de dispersión intermedia para ambas proteínas estuvieron en excelente acuerdo con los datos experimentales de NSE y demostraron que la dinámica más lenta observada en tiempos largos de Fourier se puede atribuir a los procesos generales de difusión traslacional y rotacional, mientras que la dinámica rápida observada en escalas de tiempo cortas se puede atribuir a la dinámica de los dominios de proteínas.

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Discussion

La espectroscopia NSE ofrece una visión única y detallada de la dinámica de las proteínas, que otras técnicas espectroscópicas no pueden producir. Las mediciones a lo largo de una escala de tiempo extendida proporcionan observaciones de la difusión traslacional y rotacional de las proteínas, como se presenta aquí. La dinámica segmentaria y otras oscilaciones internas se revelan como una fuerte desintegración de la función de dispersión coherente S(Q, t) en una escala de tiempo corta y están bien separadas de los procesos generales de relajación de difusión. Las principales limitaciones de la técnica NSE son el tiempo de medición extendido y los grandes volúmenes de muestra necesarios para adquirir una buena señal estadística. Esto puede plantear un desafío para medir los sistemas macromoleculares relevantes que exhiben bajas concentraciones de las especies móviles y vidas útiles reducidas.

Dinámica interna de IgG
La proteína IgG tiene una estructura en forma de Y específica para los anticuerpos que puede ser aproximada por tres grandes fragmentos conectados por enlazadores flexibles. Se asumió un modelo matemático de tres partículas considerables que residen en potencial armónico para este tipo de estructura. Los enlazadores fueron aproximados por resortes elásticos que dan una posición de equilibrio fija pero permiten fluctuaciones como una forma de movimiento browniano. Se permitieron tres grados de libertad para cada fragmento alrededor del equilibrio relativo28. La dinámica interna representada por Fint(Q, t) en la Ecuación 2 fue descrita por el proceso de Ornstein-Uhlenbeck50,51. El modelo permite el cálculo del desplazamiento cuadrático medio de los fragmentos en la caída potencial, la escala de tiempo de diferentes movimientos, la fricción y las constantes de fuerza que se producen. La amplitud del movimiento interno se aproximó mediante el análisis de modos normales, considerando diferentes grados de movimiento para cada fragmento. Una extensa descripción del modelo y los parámetros matemáticos resultantes está fuera del alcance aquí, pero se puede encontrar en detalle en la referencia28. En este estudio de caso de IgG, se observó una clara firma de la dinámica interna en la escala de tiempo de varios nanosegundos. La constante de resorte calculada del enlazador parece ser realistamente comparable a un resorte entrópico de longitud similar. La fricción efectiva observada parece cercana a la fricción de un fragmento de IgG libre no unido. Se validó la hipótesis de equilibrio preexistente, asumiendo configuraciones coexistentes "abiertas" o "cerradas" de IgGs que están en equilibrio exhibiendo diferentes sitios de unión y especificidades de unión28. Esta información puede ser relevante para comprender la mecánica de los anticuerpos y si ese comportamiento mecánico se puede utilizar para mejorar la biocompatibilidad y la biodisponibilidad.

Dinámica interna de MBP
La estructura MBP tiene un núcleo globular compacto que permite fuertes movimientos de estiramiento y flexión con sus extremos de bobina aleatorios flexibles. La dinámica MBP se interpretó utilizando modelos de polímeros flexibles con y sin la adición de fricción interna28,39. Al igual que en el caso de IgG, las observaciones de la dinámica interna de MBP pueden reconciliarse dentro de la teoría del movimiento browniano, en la que una mayor amplitud de movimiento resulta en un tiempo de relajación más largo con influencias de la fricción interna dentro de la cadena de proteínas. El aumento del tiempo de relajación con una mayor amplitud de movimientos pero menor fricción se puede describir utilizando el mismo proceso de Ornstein-Uhlenbeck50,51 del movimiento browniano en un potencial armónico. Los movimientos internos con grandes amplitudes pero tiempos de relajación lentos se activan tras la desnaturalización completa de MBP de su estado nativo al reducir las fuerzas de restauración de la configuración de la cadena (potenciales diedros) y al suavizar las barreras energéticas locales. Las descripciones detalladas de la dinámica interna de MBP en el estado nativo y desnaturalizado se pueden encontrar en las referencias28,39. En el estudio de MBP, la investigación utilizando NSE reveló un comportamiento dinámico que apunta hacia la compacidad intermedia de la proteína entre polímeros de bobina aleatoria y proteínas globulares. La contribución significativa de la dinámica de proteínas internas con una tasa de relajación de varios nanosegundos se rigió por movimientos colectivos de estiramiento y flexión de baja frecuencia5. La descripción de la dinámica MBP nativa por modelos de ruptura de la teoría de polímeros se proporcionó debido a un gran valor de fricción interna de la proteína. En el MBP desnaturalizado, la fricción interna dentro de la cadena de proteínas se reduce y prevalece el carácter de cadena polimérica del espectro de relajación. La alta flexibilidad de los movimientos del conjunto estructural podría ayudar a aumentar la superficie de la proteína accesible, facilitando así la interacción con diferentes socios de unión.

Modelos dinámicos
Mientras que la NSE como técnica es experimentalmente única en la evaluación de movimientos armónicos de baja frecuencia en macromoléculas biológicas y subunidades moleculares, el análisis de la función de dispersión intermedia requiere una comparación con espectros de neutrones derivados de varios modelos matemáticos. El modelo aquí presentado y desarrollado por Biehl et al.28 para soluciones de proteínas concentradas utiliza una aproximación de red elástica, en la que la función de dispersión intermedia es una convolución de funciones modulares adecuadas, y los osciladores brownianos representan la dinámica interna. Este es uno de los pocos modelos disponibles para analizar la dinámica segmentaria de las proteínas. Otro modelo bien establecido para soluciones proteicas diluidas es el modelo propuesto por Bu et al.52, que es un modelo robusto que utiliza mecánica estadística y no requiere ajustes complejos ni múltiples parámetros. Un enfoque similar basado en la aproximación dinámica de desacoplamiento también se puede aplicar a los sistemas diluidos para caracterizar la difusión efectiva como una suma de movimientos autorreduccionales e internos53. Varias de nuestras referencias pueden proporcionar informes completos sobre estos modelos y sus limitaciones. Recomendamos encarecidamente Fitter et al.1 y Liu et al.54.

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Disclosures

El autor declara que no hay intereses financieros contrapuestos ni conflictos de intereses. El contenido del manuscrito se basa en la conferencia que el autor presentó en hands-neutron scattering Applications in Structural Biology School entre 2019-2021.

Acknowledgments

Esta investigación utilizó recursos en la Fuente de Neutrones de Espalación (BL-15, BL-6, laboratorios de Biología y Química), una Oficina del DOE de la Instalación de Usuarios de Ciencia operada por el Laboratorio Nacional de Oak Ridge. Esta investigación también utilizó recursos en el reactor MLZ-FRM2 Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) y el JCNS1 en Forschungszentrum Jülich GmbH, Alemania. El autor reconoce al Dr. Ralf Biehl y al Dr. Andreas Stadler por su ayuda con el modelado y su contribución a la investigación de proteínas IgG y MBP, al Dr. Piotr A. Żołnierczuk por el apoyo a la reducción de datos de NSE, al Dr. Changwoo Do por su apoyo con las mediciones de SANS, y a Rhonda Moody y al Dr. Kevin Weiss por el apoyo del laboratorio de bioquímica de SNS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine MBP protein solution Sigma-Aldrich M1891 lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O - heavy water Sigma-Aldrich Product No. 151882 liquid
Dionized water in house - for washing / cleanning cells
DLS instrument Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich - dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standards SNS-NSE, ORNL - Al2O3  and Graphite powders
Ethanol Sigma-Aldrich 65350-M 70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solution Sigma-Aldrich I4506 lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrument JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - small angle neutron instrument
Liquinox dish detergent Alconox - Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2O Sigma-Aldrich Product No.S9390 disodium phosphate heptahydrate salt
NaCl Sigma-Aldrich Product No.S9888 sodium chloride salt
NaH2PO4·H2O Sigma-Aldrich Product No. S9638 monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific Catalog number: ND-2000 NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment camera NeutronOptics, Grenoble NOG210222 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M - wax parafilm Bemis Parafilm M - 5259-04LC PM996 all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE Spectrometer JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - neutron spectrometer
SasView https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument FZ-Jülich - small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranes Thermo Scientific 88400-88405 Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis Cluster Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometer ORNL, Oak Ridge, TN, USA - neutron spectrometer
Sterile syringe filters VWR N.A. PN:28145-501 0.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS) SP Scientific Part Number 100004055 sample environment equipment
Urea -d4 Sigma-Aldrich Product No. 176087 deuterated Urea salt
Viscometer FZ-Jülich - falling ball viscometer

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References

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Ingeniería Número 182 Dispersión de neutrones espín-eco de neutrones solución de proteínas dinámica lenta movimientos de dominios de proteínas flexibilidad de proteínas
Estudio de la dinámica de <em>proteínas a través de</em> la espectroscopia de eco de espín de neutrones
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Stingaciu, L. R. Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy. J. Vis. Exp. (182), e61862, doi:10.3791/61862 (2022).

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