Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Studie av proteindynamik via neutronspinnekospektroskopi

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/61862
Automatic Translation
1
1NSD, Oak Ridge National Laboratory

Summary

Föreliggande protokoll beskriver metoder för att undersöka strukturen och dynamiken hos två modellproteiner som har en viktig roll för människors hälsa. Tekniken kombinerar biofysisk karakterisering med neutronspinneko-spektroskopi för att komma åt dynamiken vid tids- och längdskalor som är relevanta för proteininterdomainrörelser.

Abstract

De flesta mänskliga kroppsproteiners aktivitet och funktionalitet är relaterade till konfigurationsförändringar av hela underdomäner inom proteinkristallstrukturen. Kristallstrukturerna bygger grunden för varje beräkning som beskriver strukturen eller dynamiken hos ett protein, för det mesta med starka geometriska begränsningar. Dessa begränsningar från kristallstrukturen är emellertid inte närvarande i lösningen. Strukturen hos proteinerna i lösningen kan skilja sig från kristallen på grund av omarrangemang av slingor eller underdomäner på pico till nanosekund tidsskala (dvs den interna proteindynamikens tidsregim). Det aktuella arbetet beskriver hur slow motions på tidsskalor på flera tiotals nanosekunder kan nås med hjälp av neutronspridning. I synnerhet behandlas den dynamiska karakteriseringen av två stora humana proteiner, ett inneboende oordnat protein som saknar en väldefinierad sekundär struktur och ett klassiskt antikroppsprotein, med neutronspinnekospektroskopi (NSE) kombinerat med ett brett spektrum av laboratoriekarakteriseringsmetoder. Ytterligare insikter i proteindomändynamik uppnåddes med hjälp av matematisk modellering för att beskriva experimentella neutrondata och bestämma korsningen mellan kombinerade diffusiva och interna proteinrörelser. Extraktionen av det interna dynamiska bidraget till den mellanliggande spridningsfunktionen erhållen från NSE, inklusive tidsskalan för de olika rörelserna, möjliggör ytterligare syn på de mekaniska egenskaperna hos enskilda proteiner och mjukheten hos proteiner i deras nästan naturliga miljö i den trånga proteinlösningen.

Introduction

Sonderingsdynamik av mjuk materia med neutroner
Att undersöka de dynamiska egenskaperna hos proteiner och peptider är en stor del av den biofysiska forskningen, och många välutvecklade metoder finns idag för att komma åt ett brett spektrum av energilandskap1. Att relatera den experimentellt avslöjade dynamiken hos proteinerna till deras biologiska funktion är en mycket svårare uppgift som kräver komplexa matematiska modeller och datorstödda dynamiksimuleringar. Neutronspektroskopins betydelse för analys av proteinrörelser har betonats i flera väl mottagna och allmänt erkända studier 1,2,3,4,5. Innan du utforskar det olika energilandskapet för intern proteindynamik krävs en kort översikt över de dynamiska processerna i mjuk materia och hur neutroner kan komma åt dem.

Neutronernas känslighet för isotopkonfiguration och den typ av interaktioner de visar med mjuk materia gör neutronspridning till en av de mest mångsidiga undersökningsteknikerna6. Det finns ett brett spektrum av korrelationslängdsskalor och korrelationstider som neutroner kan komma åt, från kärnexcitationer och atomvibrationer till kollektiva rörelser och långsamma avslappningsprocesser som isotropa rotationer och diffusiva rörelser. När man undersöker de spridda neutronerna för deras energiöverföring kan tre huvudinteraktioner särskiljas: den elastiska spridningen, där det inte finns något energiutbyte mellan inkommande neutron och partikel i provet; den oelastiska spridningen, med ett stort, kvantifierbart energiutbyte mellan neutron och partikel; och det märkliga fallet med kvasielastisk spridning som betecknar en mycket liten energiöverföring jämfört med den infallande neutronenergin 1,7. Dessa interaktioner ger exakt information om det undersökta materialet och utgör den teoretiska grunden för en mängd olika neutronspridningstekniker.

Vid elastisk spridning registrerar detektorn neutronernas riktningar som ett diffraktionsmönster, vilket visar provatomernas position i förhållande till varandra. Information om korrelationerna mellan atompositioner förvärvas (dvs integrerad intensitet S(Q) avseende momentumöverföringen Q, som avser enbart strukturell information). Denna princip utgör grunden för neutrondiffraktion8.

Komplexitet uppstår när energiöverföringen inte längre är noll på grund av excitationer och inre fluktuationer i provmaterialet. Detta ligger till grund för neutronspektroskopi, där de spridda neutronerna undersöks som en funktion av både energiöverföringen E och momentumöverföringen Q. Dynamisk och strukturell information erhålls. Neutronspektroskopi mäter samma integrerade intensitet S(Q) för energiöverföring (dvs. hastighetsförändring av neutronerna på grund av provspridning, S(Q,ω) = S(Q, E), som också kallas den dynamiska strukturfaktorn)9.

För att beräkna spridningen från ett material är det mer lämpligt att använda parkorrelationsfunktionen 7,10. I diffraktionsfallet ger den statiska parkorrelationsfunktionen G(r) sannolikheten att hitta mitten av en partikel på ett givet avstånd r från mitten av en annan partikel. Spektroskopin generaliserar den statiska parkorrelationsfunktionen och inkluderar energi/frekvens/tid i spridningsekvationen. Parkorrelationsfunktionen G(r) blir en funktion av tiden G(r, t), som kan sönderdelas i en distinkt atomparkorrelationsfunktion GD(r, t) och en självkorrelationsfunktion GS(r, t). Dessa beskriver två typer av korrelationer: parkorrelerade rörelser av atomer som styr den koherenta spridningen och självkorrelation som styr den osammanhängande spridningen10.

Koherent spridning är spridningen från "genomsnittet" och beror på den relativa fasen av de spridda vågorna. I spridningsregimen med liten vinkel stör de spridda neutronvågorna från olika spridningscentra (olika atomer) konstruktivt (har liknande faser), och atomernas kollektiva rörelse observeras med stark intensitetsförbättring. Koherent spridning beskriver väsentligen spridningen av en enda neutron från alla kärnor i provet10.

När ingen konstruktiv interferens inträffar mellan de spridda neutronvågorna från olika centra följs en enda atom i tid och självkorrelationen mellan atomens position vid tiden t = 0 och samma atom vid tiden t observeras. Således förloras informationen om atomernas relativa positioner, och fokus ligger endast på lokala fluktuationer. Spridning från lokala fluktuationer styr osammanhängande spridning. Osammanhängande spridning är isotrop, bidrar till bakgrundssignalen och försämrarsignal-bruset 10,11.

Genom att kombinera alla ovanstående skiljer vi fyra stora neutronspridningsprocesser10: (1) elastisk koherent (mäter korrelationerna mellan atompositioner), (2) oelastisk koherent (mäter atomers kollektiva rörelser), (3) elastisk osammanhängande (bidrar till bakgrunden, minskar spridningsintensiteten med Debye-Waller-faktor (DWF) och mäter elastisk osammanhängande strukturfaktor (EISF), som beskriver geometrin för diffusiva rörelser i begränsad geometri, och (4) oelastisk osammanhängande (mäter enatomdynamik och självkorrelation).

Dynamikprocesser som neutroner kan komma åt i biologi sträcker sig från dämpning av lågfrekventa atom- och molekylära vibrationer, interaktionen mellan lösningsmedelsmolekyler och bioytor och diffusionsprocesser i hydratiseringsskiktet av makromolekyler och begränsad geometri, till kortdistans translationella, roterande och tumlande diffusiva rörelser och proteindomäner och allosteriska rörelser1 . Den stora mångfalden av neutronmetoder och instrument för att mäta proteindynamik baseras på hur akromatiseringen av den infallande eller utgående neutronstrålen uppnås och hur energianalysen av de spridda neutronerna utförs. Från trippelaxel till flygtid, backscattering och spin-echo-spektrometrar kan man utforska dynamiska processer med karakteristiska tider mellan 1 x 10-14 s och 1 x 10-6 s (femtosekunder till mikrosekunder)12.

Oak Ridge National Laboratory, med sina två kända neutronkällor, Spallation Neutron Source - SNS13 och High Isotope Flux Reactor - HFIR14, har en av de bästa sviterna av spektrometrar för att undersöka dynamik i biomaterial. Några av de mest vältaliga exemplen inkluderar användningen av den kalla neutronhackspektrometern (CNCS) vid SNS15 för att undersöka den dynamiska störningen av hydratiseringsvatten runt grönt fluorescerande protein i lösning16 eller de subpikosekunds kollektiva vibrationerna hos flera proteiner17. Ett återkommande problem med oelastiska neutronspridningsundersökningar är att vissa biologiska processer är för långsamma för att kunna observeras. Utan extrema inställningar som leder till en enorm förlust av neutronintensitet är flygtidsspektrometrar begränsade till 10 μeV energiupplösning, vilket motsvarar en maximal tidsskala på ~ 200 ps10,11. Detta är inte tillräckligt för att observera storskaliga rörelser i proteiner. Därför behövs ofta instrument med högre energiupplösning som bakåtspridningsspektrometrarna. Att kombinera time-of-flight och backscattering-tekniker har visat sig vara kraftfullt för att undersöka förändringen i den inre dynamiken hos Cytochrome P450cam (CYP101), ett enzym som katalyserar hydroxyleringskavfern18.

Mikroskopisk diffusivitet mätt med backscatteringsspektrometern vid SNS-BASIS19 var förvånansvärt väldefinierad och kunde separeras i diffusiviteten hos vatten (hydrering, cytoplasmatisk och bulkliknande vatten) och diffusiviteten hos cellbeståndsdelar i planariska plattmaskar, det första levande djuret som studerades genom neutronspridning20 . Backscattering är en högupplöst spektroskopisk teknik, men den är också begränsad till flera μeV = flera nanosekunder, medan den långsamma dynamiken i biomaterial också manifesteras som överlevnadstiden för korrelation mellan atomposition eller spinnorienteringar (t.ex. avslappningsprocesser, som regelbundet händer i tidsintervallet tio till hundratals nanosekunder).

Neutronspinneko spektroskopi (NSE) är den enda neutronspridningstekniken som når så hög upplösning. Till skillnad från andra neutrontekniker kräver NSE inte akromatisering av strålen eftersom den använder neutronernas kvantmekaniska fas, vilket är deras magnetiska ögonblick. Manipuleringen av magnetiska ögonblick möjliggör användning av en bred neutronstrålevåglängdsfördelning, medan tekniken är känslig för mycket små neutronhastighetsförändringar i storleksordningen 1 x 10-4. NSE har framgångsrikt använts för att undersöka den långsamma dynamiken hos proteiner i lösning för många proteiner. Bland dessa många pionjärstudier erkänner vi studien av segmentflexibiliteten hos grisimmunoglobulin21; de kopplade domänrörelserna i Taq-polymeras22; domänrörelserna i tetrameren av jästalkoholdehydrogenas23; förändringen av konformationen i fosfoglyceratkinas vid substratbindning3; aktivering av domänrörelser och dynamisk förökning av allosteriska signaler i Na+/H+ utbytesreglerande kofaktor 1 (NHERF1) protein 4,24,25; dynamiken i ett kompakt tillstånd av kvicksilverjonreduktas26; och diffusion av hemoglobin i röda blodkroppar27. Två nyare studier inom proteindynamik har avslöjat flexibiliteten hos humant antikroppsimmunglobulin G (IgG) som en entropisk fjäder28 och egenskaperna hos lösningsmedelsbidrag till dynamiken hos inneboende oordnat myelinbasprotein (MBP)5.

Den här artikeln förklarar de grundläggande principerna för NSE, de flera förberedande metoder som rekommenderas för en grundlig proteindynamikundersökning, samt metodiken och det experimentella protokollet för NSE-datainsamling vid NSE-spektrometern vid SNS, SNS-NSE. Protokollet karakteriserar två proteiner: IgG, ett vanligt humant antikroppsprotein, och det inneboende oordnade proteinet MBP. De biofysiska implikationerna, exemplens forskningsrelevans och teknikens begränsningar diskuteras kortfattat.

NSE-spektroskopi, metoden för långsam dynamikmätning
NSE är en polariserad teknik som använder neutron-flygtid för att mäta utbytet av energi (förlust av polarisation) på grund av den kvasielastiska interaktionen mellan neutroner och atomer i ett prov. Kärnan i NSE-spektroskopi ligger två grundläggande principer: (1) neutronspinnets förmåga att precessa i magnetfältet med en frekvens som är proportionell mot magnetisk styrka Equation 1, nämligen Larmor-frekvensen29, och (b) spinn-ekot eller Hann-ekot, som representerar manipulering och omfokusering av polarisationssignalen vid applicering av en serie radiofrekvenspulser30.

Grunderna i NSE-processen kan sammanfattas i några enkla steg 6,11 med hjälp av figur 1. (1) Neutronstrålen som produceras av källan (position 1) polariseras (position 2), styrs och transporteras (position 3) och anländer till ingången till NSE-spektrometern, där den roteras med 90 ° av den första pi-halva flippern (position 4). (2) Den polariserade strålen (t.ex. neutronmagnetiska ögonblick) blir vinkelrät mot den första magnetens magnetfältlinjer (första precessionszonen, position 5) och börjar precessa. (3) I slutet av magneten ackumulerar neutronspinn en viss precessionsvinkel som är proportionell mot magnetfältstyrkan och flygtiden som spenderas inuti (i princip omvänt proportionell mot neutronhastigheten). De enskilda neutronhastigheterna kodas inom sin precessionsvinkel i slutet av den första precessionszonen. (4) Nära provpositionen vänder pi-flippern (position 6) rotationsorienteringen med 180 °, vilket ändrar tecknet på precessionsvinkeln. (5) Neutronerna interagerar med provets molekyler (position 7) och sprids. (6) De spridda neutronerna kommer in och föregår i den andra precessionszonen (position 8) men blir omvända. (7) En annan pi-halv flipper (position 9) används för att rotera rotationsorienteringen från vinkelrätt mot horisontell riktning. Detta kommer att stoppa precessionen, översätta precessionsvinkeln φ till polarisering proportionell mot cos (φ). (8) Analysatorn (position 10) väljer neutronerna baserat på en orientering. Om interaktionen med provet är elastisk kommer neutronens hastighet inte att förändras. Neutronerna kommer att spendera lika mycket tid på att flyga i de första och andra precessionszonerna, och de ackumulerade precessionsvinklarna återvinns helt. Den fulla polarisationen återställs på detektorn (position 11) som ett eko av den ursprungliga polarisationen (dvs spin-echo). (9) I NSE är dock spridningen kvasielastisk, så ett litet energiutbyte mellan neutroner och provmolekyler leder till olika neutronhastigheter efter spridning av provet. På grund av de olika hastigheterna kommer neutronerna att spendera ytterligare tid på att flyga genom den andra precessionszonen och kommer inte att ha återhämtat sin precessionsvinkel ordentligt. En partiell polarisation hämtas på detektorn, och förlusten av polarisation på grund av spinnavslappning är proportionell mot cos-Fourier-transformen av spektralfunktionen S(Q, ω), den mellanliggande spridningsfunktionen F(Q, t). (10) Tidsparametern för funktionen F(Q, t) är proportionell mot precessionens magnetfältstyrka. Skanning av förlusten av polarisation som en funktion av magnetfältstyrkan ger därför en avslappningsfunktion som beror på de dynamiska processerna i provet.

Figure 1
Figur 1: Fotografi av NSE-spektrometern vid SNS (SNS-NSE) och neutronflugvägsschematiskt med de viktigaste funktionella komponenterna. Från höger till vänster: 1 = neutronkälla; 2 = choppers-bender-polarisator-sekundär slutarsystem; 3 = stråltransportstyrningar; 4 = pi/2 flipper för första 90° spin-turn; 5 = första precessionszonen; 6 = pi flipper för 180° spin-turn; 7 = provarea och provmiljö (här visas kryougnen); 8 = andra precessionszonen; 9 = pi/2 flipper för andra 90° spin-turn; 10 = analysator; 11 = detektor. (Observera att delar av 3, samt 2 och 1 ,är placerade bakom den blå väggen inuti avskärmningen; hackarna ersätts av en hastighetsväljare för reaktorbaserad NSE). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Det nuvarande arbetet kännetecknar två proteiner: ett vanligt humant antikroppsprotein IgG och det inneboende oordnade MBP. Den frystorkade formen av proteinerna erhölls från kommersiella källor (se materialtabell).

1. Beredning av proteinprov

  1. Bered en 50 mM natriumfosfat + 0,1 M NaCl-buffert genom att väga och lösa upp respektive fasta reagens i tungt vatten (D2O) (se materialtabell). Detta är det deutererade buffertlösningsmedlet för IgG.
    1. Justera buffertlösningens pH till 6,6.
  2. Bered en 20 mM natriumfosfat + 6 M ureabuffert genom att väga och lösa upp respektive fasta komponenter i tungt vatten (D2O). Detta är det deutererade buffertlösningsmedlet för MBP.
    1. Justera buffertlösningens pH till 4,7.
  3. Filtrera buffertlösningsmedlen med filter med 0,2 μm porstorlek (se materialtabell).
  4. Väg och lös upp de renade proteinet frystorkade pulver i de deutererade lösningsmedlen för respektive proteiner (steg 1.1.-1.2.) vid hög proteinkoncentration (~ 50 mg / ml).
  5. Ladda proteinlösningen i dialyskorgar med dialysmembran på 3,5 K MWCO och dialysera mot den filtrerade bufferten i 24 timmar vid 10 °C för MBP och 25 °C för IgG (se materialtabell) genom att skaka rören något för att skapa en diffusionsgradient.
  6. Späd proteinlösningen med hjälp av dialysbufferten i en serie koncentrationer: 1, 2, 5, 10 och 50 mg/ml.
  7. Bestäm de exakta koncentrationerna med hjälp av en Nanodrop-spektrofotometer (se materialtabell).

2. Preliminär provkarakterisering genom dynamisk ljusspridning (DLS)

  1. Ladda 80 μL av varje proteinlösning från koncentrationsserien som framställts ovan (steg 1.6) i DLS-engångscellen (se materialtabell) och bestäm diffusionskoefficienterna, i genomsnitt över 10 förvärv.
  2. Plotta de translationella diffusionskoefficienterna som en funktion av proteinkoncentrationen och extrapolera till nollkoncentration.
  3. Ladda varje proteinlösning från koncentrationsserien i kapillärrören i en viskosimeter (se materialtabell) och mät den dynamiska viskositeten.
  4. Plotta de dynamiska viskositeterna mätt som en funktion av proteinkoncentrationen och extrapolera till nollkoncentration.
    OBS: Extrapoleringen av DLS-diffusion till nollkoncentration ger värdet av translationell diffusion för ett enda protein. Extrapoleringen av dynamisk viskositet till nollkoncentration måste ge det dynamiska viskositetsvärde som mäts experimentellt för buffertlösningen.

3. Samling av småvinkelspridning (neutron eller röntgen)

  1. Mät neutronspridning med liten vinkel (SANS) och/eller röntgenspridning med liten vinkel (SAXS) (se materialtabell) på fyra proteinkoncentrationer, helst 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml och 50 mg/ml.
  2. Normalisera SANS- och SAXS-spektra genom proteinkoncentration.
  3. Anpassa proteinformfaktorn P(Q) till SANS- och SAXS-spektra med hjälp av programvaran Ensemble Optimization31 och/eller SasView32 .
  4. Beräkna strukturfaktorn S(Q, c) genom att dividera SANS- och SAXS-signalen med P(Q) för varje koncentration.
    OBS: Läsare som är intresserade av hur man mäter och tolkar spridningsdata med liten vinkel som stöd för NSE-mätningar uppmuntras att noggrant konsultera referenserna 23,28,31,32,33.

4. Mätning av NSE

  1. Konfigurera för experimentet och montera exemplet enligt stegen nedan.
    1. Välj cellens tjocklek för provbelastning baserat på koncentrationen av proteinlösningen, temperaturen som behövs för mätning och mängden tillgänglig lösning.
      OBS: I den aktuella studien användes transparenta kvartsbehållare med topplastare på 40 mm x 30 mm x 4 mm.
    2. Rengör cellen upprepade gånger och växla mellan fosfatfritt diskmedel (se materialtabell), avjoniserat vatten och 70% etanol.
    3. Torka cellen i konvektionsugnen; inte överstiga 80 °C för kvartscellerna.
    4. Ladda 4 ml proteinlösning i cellen och stäng med lock. Använd vaxfilm eller något tätningsmedel (se materialtabell) för att försegla provcellerna.
      OBS: I den aktuella studien användes 4,8 ml lösning vid ~50 mg/ml för att erhålla tillräcklig spridningsintensitet.
    5. Ladda 4 ml dialysbuffert i en identisk behållare som proteinprovet och försegla.
    6. Transportera prover till strålröret, stäng slutaren och gå in i spektrometerhöljets grottområde34.
    7. Montera provcellen på aluminiumprovhållaren genom att dra åt skruvarna och hållplattorna (bild 2, vänster panel).
      OBS: Man kan montera två provceller samtidigt, med tanke på att samma mätprotokoll behövs för alla prover.
    8. Montera grafitprovet och/ellerAl2O3-pulverprovet laddat i en identisk behållare som proteinprovet. Dessa är standarder som tillhandahålls av SNS-NSE-strålrörsstödet.
    9. Placera provhållaren genom att försiktigt skjuta in den i burken på temperaturtvingningssystemet (TFS, se materialtabell).
      TFS är den mest använda provmiljön vid SNS-NSE och pumpar torr luft in i provbehållaren för att uppnå önskad temperatur (figur 2, mitt- och högerpaneler).
    10. Stäng TFS-locket och ställ in temperaturen till önskat värde genom att öppna den interaktiva skärmen på TFS.
    11. Montera neutronkameran (se materialtabell) för inriktning av proverna till strålen.
    12. Svep instrumenthöljet, evakuera, stäng dörrarna och öppna strålluckan.
      OBS: Provceller tillhandahålls av SNS-NSE-strålrörsstödet. För tillgängliga exempelceller och exempelmiljöbiblioteket, se SNS-NSE-strålrörets webbsida 7,35.
  2. Samla in NSE-data enligt stegen nedan.
    1. Rikta in provet i neutronstrålen med hjälp av neutronkameran och de fyra oberoende provöppningarna.
    2. Öppna SNS-NSE-datainsamlingsprogramvaran36 och samla in provstatistik genom att köra diffraktionsskanningar för önskade spridningsvinklar och våglängd.
    3. Ställ in mätparametrarna baserat på den statistik som samlats in för varje prov genom att redigera mätmakronen som tillhandahålls av den assisterande instrumentforskaren.
    4. Börja skanna genom att skriva protokollnamnet i kommandotolken och hämta ekon för exemplet.
    5. Börja skanna och skaffa ekon också för den elastiska referensen och det buffrade lösningsmedlet. Utför intermittent strålluckaoperation för provbytet.

Figure 2
Figur 2: NSE-mätsystem. Vänster panel: proteinlösningsprover i kvartsbehållare monterad med skruvar och plattor på aluminium (Al) provhållaren. Al-provhållaren erbjuder möjligheten att montera två prover samtidigt inuti provmiljön. Mittpanel: Tfs-provet (Temperature Forcing System) kan monteras i provsteget neutronstrålefönstret är till höger, medan neutronkameran som används för inriktning är synlig på vänster sida. Höger panel: att placera provhållaren med två prover i provet kan fungera med kisel (Si) fönster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

5. Minskning av NSE-data

OBS: SNS-NSE är utrustad med en dedikerad programvara som heter DrSpine (datareduktion för spin-echo)37,38 tillgänglig på ORNL Neutron Sciences Remote Analysis Cluster, en snabb användarhandbok och inbyggt hjälpstöd.

  1. Logga in på Neutron Sciences Remote Analysis Cluster (se materialtabell) med ORNL-användaruppgifterna och tryck på knappen Starta session .
  2. Ställ in programvaran för datareduktion enligt stegen nedan.
    1. Öppna ett terminalfönster i användarkatalogen och skriv: source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh.
    2. Skriv sedan: drspine_create_env.sh.
  3. Skapa en mapp för datareduktionen i hemkatalogen och kopiera de angivna skripten och makrona från den delade katalogen.
  4. Redigera, byt namn på och spara det angivna reduktionsmakrot i enlighet med detta.
  5. Skriv drspine vid kommandotolken och tryck på enter för att starta programvarureduceringsmiljön.
  6. Skriv "namnet på reduktionsmakron" redigerat i steg 5.4. i kommandotolken i programvarumiljön och tryck på Enter.

6. Anpassning av NSE-data

  1. Redigera python-skriptet "stapler-drspine.py", som tillhandahålls av den assisterande instrumentforskaren, med namnen på de reducerade fildata.
    PYTHON-skriptet är fritt tillgängligt för användare av instrumentet.
  2. Redigera funktionen så att den passar från det tillhandahållna biblioteket.
  3. Skriv namnet på det redigerade skriptet "stapler-drspine.py" i kommandotolken och tryck på Retur för att läsa, passa och rita reducerade NSE-data.
    OBS: Instrumentforskaren kommer att tillhandahålla en mall för reduktionsmakron och pythonskriptet "stapler-drspine.py" som kan läsa och passa NSE-reducerade data. De slutliga reducerade NSE-data är i ASCII-format och kan läsas av olika föredragna program.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

IgG-protein från humant serum och bovint MBP-proteiner rekonstituerades vid höga koncentrationer (~ 50 mg / ml) iD2O-basbuffertar. Eftersom proteinerna löstes i höga koncentrationer var de erhållna lösningarna trånga proteinlösningar. Dynamiken som undersöks med NSE lider av den trånga miljön som proteinerna befinner sig i (strukturfaktorinteraktioner och hydrodynamiska effekter)5,28,39. DLS utfördes på en koncentrationsserie för varje protein för att ta hänsyn till trängseleffekter. Extrapoleringen till nollkoncentration av de translationella diffusionskoefficienterna uppmätta med DLS ger värdet av translationell diffusion för ett enda protein. Den dynamiska viskositeten som en funktion av proteinkoncentrationen måste också mätas före NSE för att ta hänsyn till de hydrodynamiska interaktionerna. Extrapoleringen till nollkoncentration av de dynamiska viskositeterna som en funktion av koncentrationen måste ge det värde som experimentellt kan mätas för buffertlösningen för varje berett proteinprov.

Formen och strukturen hos proteiner i koncentrerad lösning utvärderades före något NSE-experiment för att få insikter om proteinformfaktorn och styrkan hos strukturfaktorn, vilket kan påverka hur proteinerna rör sig i lösning. Småvinkelspridning var den metod som valdes för dessa undersökningar. I den aktuella studien observerades den strukturella konformationen av IgG-protein i lösning av SAXS, och strukturen hos MBP bedömdes av SANS. Den uppmätta spridningsintensiteten (Q) (steg 3.3.-3.4) är proportionell mot produkten mellan formfaktorn P(Q) och strukturfaktorn S(Q,c) viktad med antalet partiklar (ekvation 1)5,28,39:

I (Q) = N ∙ P (Q) ∙S (Q, c) (1)

SAXS mättes på ett SAXS-instrument av Kratky-typ40 med en röntgenvåglängd på 0,154 nm för IgG, och SANS mättes41 för MBP med en neutronvåglängd på 4,5 Å. De experimentella småvinkelintensiteterna I(Q) var bakgrunds- och lösningsmedelskorrigerade, skalade efter lösningskoncentration, och formfaktorn beräknades med hjälp av fritt tillgängliga programvarupaket som Ensemble modeling-EOM och SasView 24,25,29,39,42,43. Vidare erhölls strukturfaktorn för varje protein från ekvation 1.

För den aktuella studien utfördes NSE-experimenten med två spin-eko-spektrometrar: SNS-NSE-instrumentet34 i figur 1 och Phoenix-J-NSE-instrumentet44. Infallande våglängder mellan 8 Å - 12 Å, med Fourier gånger mellan 0,1 ns ≤ tmax ≤ 130 ns för flera Q-mätningar mellan 0,05 Å−1- 0,2 Å−1, mättes. Skillnaden mellan de två spektrometrarna är en viktig punkt i förståelsen av NSE-vetenskapen, och de representerar både det gamla konceptet med ett så kallat "klassiskt spinneko" för den statiska neutronkällan i en reaktor och det nya "time-of-flight-konceptet" för den pulserande neutronkällan. Phoenix-J-NSE-spektrometern är en NSE av klassisk typ, där en hastighetsväljare väljer en viss våglängd. För att tillåta variationer i neutronhastigheterna införs en ±10% våglängdsbandbredd. Trots det mycket smala energibandet som används för en enda skanning säkerställer situationen för Phoenix-J-NSE-spektrometern vid en högflödesreaktorkälla att rymdvektor- och korrelationstidsintervall täcks i relativt korta mättider. SNS-NSE-spektrometern är den nya generationens, ultrahögupplösta, choppers neutronspektrometer, med ett våglängdsspann på 2 Å < λ < 14 Å och en samtidig våglängdsbandbredd på 2,4 Å - 3,6 Å, beroende på spektrometerns position. På grund av denna breda bandbredd uppnås hög datainsamlingseffektivitet, vilket möjliggör nästan gaplös täckning av ett brett vågvektortidsintervall med endast få spridningsvinkelinställningar. Valet av våglängdsband i SNS-NSE görs av ett choppersystem bestående av fyra choppers. Båda NSE-spektrometrarna som diskuteras här har precessionsfält baserade på supraledande teknik med hög magnetfälthomogenitet, nya toppmoderna fältkorrigeringselement för ströfältkorrigeringar och nya polariserande böjare41,42.

NSE-spektra mättes vid 10 °C för MBP-protein och 25 °C för IgG1-protein. Den koherenta mellanliggande spridningsintensiteten I(Q, t) / I(Q, t = 0) uppmätt med NSE är det bidragande resultatet av alla dynamiska processer i provet som sker inom den undersökta tidsskalan. Detta innehåller den interna proteindynamiken, den totala translationella diffusionen, rotations- och tumlingsdiffusionen och segmentrörelserna inom själva proteinmolekylen. En förenklad modell förutsätter att den interna dynamiken och de translationella och rotationsmässiga diffusionerna är helt frikopplade 5,45,46,47,48 och kan karakteriseras separat. För den enskilda partikeln kan den koherenta spridningsfunktionen skrivas som produkten (ekvation 2)23,48:

F (Q, t) = Ftrans(Q, t) ∙Frot(Q, t) ∙Fint(Q, t) (2)

där translationell diffusionstermen för ett enda styvt protein är en exponentiell funktion av den translationella diffusionskoefficienten DT (ekvation 3)23,48:

Ftrans(Q, t) = exp(−Q2∙ DT∙ t) (3)

För stora koncentrationer av proteiner påverkas den translationella diffusionskoefficienten DT av protein-proteininteraktioner, kvantifierade av strukturfaktorn S(Q) och av hydrodynamiska interaktioner beskrivna med den hydrodynamiska funktionen HT(Q) (ekvation 4)23,48:

DT(Q) = DT0 ∙HT(Q, c) / S(Q, c) (4)

I ekvation 4 är DT0 det extrapolerade diffusionsvärdet till nollkoncentration från DLS-mätningarna (steg 2.2). HT beräknas som HT = 1 -c∙ [η], där c är proteinkoncentrationen, [η] är den inneboende viskositeten beräknad med [η] = (η - η0) / η0 ∙ c och η0 är den uppmätta dynamiska viskositeten (steg 2.3.-2.4.). Strukturfaktorn S(Q, c) erhölls från SAXS-mätningar för IgG-protein- och SANS-mätningar för MBP-proteinet.

Figur 3 visar exempel på mellanliggande spridningsfunktioner I(Q, t) / I(Q, t = 0), mätt med NSE för IgG- och MBP-proteiner. En tydlig avvikelse från en enkel diffusionsliknande avslappningsprocess observerades på den korta Fourier-tidsskalan, <25 ns, vilket indikerar tillgängligheten av proteinintern dynamik av NSE och behovet av en mer komplex modell för att beskriva de observerade dynamiska processerna.

Figure 3
Figur 3: NSE-avslappningsspektra för IgG- och MBP-proteiner. IgG-data visas här anpassade bara av en enda exponentiell funktion för att avslöja avvikelsen från diffusion vid kortare Fourier-tider. Avvikelsen observerades för båda proteinerna. Däremot visas MBP-data här i full-relaxation-serien, anpassad av modellen utvecklad avBiehl45. Modellen innebär grovkornighet och möjliggör samtidig passning av korta, mellanliggande och långa Fourier-tidsregimer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Därför monterades spridningsfunktionerna genom atommodellering av båda proteinerna med hjälp av modeller utvecklade av Biehl, beskrivna i referenserna 18,25,38,43,44,46. Den mellanliggande spridningsfunktionen beräknades genom grovkornighet till ett par hundra enskilda korn, i motsats till allatomsimulering, för att minska beräkningsbelastningen och tiden, och MMTK49-programvarubiblioteket (fritt tillgängligt) användes för att komma åt atomkoordinater och implementera transrotationsrörelser på proteindomäner och fragment. Resultaten av den mellanliggande spridningsfunktionsberäkningen för båda proteinerna överensstämde utmärkt med experimentella NSE-data och visade att den långsammare dynamiken som observerades vid långa Fourier-tider kan hänföras till de övergripande translationella och rotationsdiffusionsprocesserna, medan den snabba dynamiken som observerats vid korta tidsskalor kan hänföras till dynamiken hos proteindomäner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NSE-spektroskopi ger en unik och detaljerad bild av proteinernas dynamik, som andra spektroskopiska tekniker inte kan producera. Mätningar över en längre tidsskala ger observationer av både proteinernas translationella och rotationsdiffusion, som presenteras här. Segmentdynamiken och andra interna svängningar avslöjar sig som ett starkt sönderfall av den koherenta spridningsfunktionen S(Q, t) på en kort tidsskala och är väl separerade från de övergripande diffusionsavslappningsprocesserna. De viktigaste begränsningarna med NSE-tekniken är den förlängda mättiden och de stora provvolymer som behövs för att få en bra statistisk signal. Detta kan utgöra en utmaning för att mäta relevanta makromolekylära system som uppvisar låga koncentrationer av den mobila arten och minskad livslängd.

Intern dynamik i IgG
IgG-protein har en Y-formad struktur som är specifik för antikroppar som kan approximeras med tre stora fragment förbundna med flexibla länkar. En matematisk modell av tre betydande partiklar som bor i harmonisk potential antogs för denna typ av struktur. Länkarna approximerades med elastiska fjädrar som ger en fast jämviktsposition men tillåter fluktuationer som en form av brunisk rörelse. Tre frihetsgrader tilläts för varje fragment runt den relativa jämvikten28. Den interna dynamiken representerad av Fint(Q, t) i ekvation 2 beskrevs av Ornstein-Uhlenbeck-processen50,51. Modellen möjliggör beräkning av den genomsnittliga kvadratförskjutningen av fragmenten i det potentiella doppet, tidsskalan för olika rörelser, friktionen och kraftkonstanterna som uppstår. Amplituden för den inre rörelsen approximerades genom normallägesanalys, med tanke på olika rörelsegrader för varje fragment. En omfattande beskrivning av modellen och de resulterande matematiska parametrarna omfattas inte här men kan hittas i detalj i referens28. I denna fallstudie av IgG observerades en tydlig signatur av den interna dynamiken på tidsskalan för flera nanosekunder. Den beräknade fjäderkonstanten för länkaren verkar vara realistiskt jämförbar med en entropisk fjäder av liknande längd. Den observerade effektiva friktionen verkar nära friktionen hos ett fritt obundet IgG-fragment. Den redan existerande jämviktshypotesen validerades, med antagna samexisterande "öppna" eller "slutna" konfigurationer av IgG som är i jämvikt som uppvisar olika bindningsställen och bindningsspecificiteter28. Denna information kan vara relevant för att förstå antikroppars mekanik och om det mekaniska beteendet kan användas för att förbättra biokompatibilitet och biotillgänglighet.

Intern dynamik i MBP
MBP-strukturen har en kompakt klotformad kärna som möjliggör starka sträcknings- och böjningsrörelser med sina flexibla slumpmässiga spoländar. MBP-dynamiken tolkades med hjälp av flexibla polymermodeller med och utan tillsats av inre friktion28,39. Som i fallet med IgG kan observationerna av MBP: s inre dynamik förenas inom teorin om brownsk rörelse, där en större amplitud av rörelse resulterar i längre avslappningstid med influenser från den inre friktionen i proteinkedjan. Den ökade avslappningstiden med en större amplitud av rörelser men mindre friktion kan beskrivas med samma Ornstein-Uhlenbeck-process50,51 av brownsk rörelse i en harmonisk potential. Interna rörelser med stora amplituder men långsamma avslappningstider blir aktiva vid full denaturering av MBP från dess ursprungliga tillstånd genom att minska återställningskrafterna för kedjekonfiguration (dihedrala potentialer) och genom att jämna ut de lokala energibarriärerna. Detaljerade beskrivningar av MBP: s interna dynamik i det ursprungliga och denaturerade tillståndet finns vidare i referenser28,39. I studien av MBP avslöjade undersökningen med NSE ett dynamiskt beteende som pekar mot mellanliggande kompaktitet hos proteinet mellan slumpmässiga spolpolymerer och globulära proteiner. Det signifikanta bidraget från inre proteindynamik med en avslappningshastighet på flera nanosekunder styrdes av lågfrekventa kollektiva sträcknings- och böjningsrörelser5. Beskrivning av den ursprungliga MBP-dynamiken genom modeller från polymerteorins nedbrytning tillhandahölls på grund av ett stort värde av proteinintern friktion. I denaturerad MBP reduceras den inre friktionen i proteinkedjan och polymerkedjekaraktären hos avslappningsspektrumet råder. Den höga flexibiliteten hos de strukturella ensemblerörelserna kan bidra till att öka den tillgängliga proteinytan och därmed underlätta interaktionen med olika bindningspartners.

Dynamiska modeller
Medan NSE som teknik är experimentellt unik för att bedöma lågfrekventa harmoniska rörelser i biologiska makromolekyler och molekylära underenheter, kräver analysen av den mellanliggande spridningsfunktionen en jämförelse med neutronspektra härledda från olika matematiska modeller. Modellen som presenteras här och utvecklas av Biehl et al.28 för koncentrerade proteinlösningar använder en elastisk nätverks approximation, där den mellanliggande spridningsfunktionen är en faltning av korrekta modulära funktioner och brownska oscillatorer representerar den inre dynamiken. Detta är en av de få tillgängliga modellerna för att analysera proteinernas segmentdynamik. En annan väletablerad modell för utspädda proteinlösningar är den modell som föreslagits av Bu et al.52, som är en robust modell som använder statistisk mekanik och inte kräver komplexa passningar eller flera parametrar. Ett liknande tillvägagångssätt baserat på dynamisk frikopplings approximation kan också tillämpas på utspädda system för att karakterisera den effektiva diffusionen som en summa av självtranslationella och interna rörelser53. Flera av våra referenser kan ge omfattande rapportering om dessa modeller och deras begränsningar. Vi rekommenderar starkt Fitter et al.1 och Liu et al.54.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författaren förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen och inga intressekonflikter. Manuskriptets innehåll bygger på den föreläsning som författaren höll i HANDS-Neutron Scattering Applications in Structural Biology School mellan 2019-2021.

Acknowledgments

Denna forskning använde resurser vid Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, Biology and Chemistry labs), ett DOE-kontor för Science User Facility som drivs av Oak Ridge National Laboratory. Denna forskning använde också resurser vid MLZ-FRM2-reaktorn Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) och JCNS1 vid Forschungszentrum Jülich GmbH, Tyskland. Författaren erkänner Dr. Ralf Biehl och Dr. Andreas Stadler för deras hjälp med modellering och deras bidrag till både IgG- och MBP-proteinforskning, Dr. Piotr A. Żołnierczuk för NSE-datareduktionsstöd, Dr. Changwoo Do för stöd med SANS-mätningar och Rhonda Moody och Dr. Kevin Weiss för SNS-biokemilabbstöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine MBP protein solution Sigma-Aldrich M1891 lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O - heavy water Sigma-Aldrich Product No. 151882 liquid
Dionized water in house - for washing / cleanning cells
DLS instrument Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich - dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standards SNS-NSE, ORNL - Al2O3  and Graphite powders
Ethanol Sigma-Aldrich 65350-M 70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solution Sigma-Aldrich I4506 lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrument JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - small angle neutron instrument
Liquinox dish detergent Alconox - Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2O Sigma-Aldrich Product No.S9390 disodium phosphate heptahydrate salt
NaCl Sigma-Aldrich Product No.S9888 sodium chloride salt
NaH2PO4·H2O Sigma-Aldrich Product No. S9638 monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific Catalog number: ND-2000 NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment camera NeutronOptics, Grenoble NOG210222 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M - wax parafilm Bemis Parafilm M - 5259-04LC PM996 all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE Spectrometer JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - neutron spectrometer
SasView https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument FZ-Jülich - small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranes Thermo Scientific 88400-88405 Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis Cluster Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometer ORNL, Oak Ridge, TN, USA - neutron spectrometer
Sterile syringe filters VWR N.A. PN:28145-501 0.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS) SP Scientific Part Number 100004055 sample environment equipment
Urea -d4 Sigma-Aldrich Product No. 176087 deuterated Urea salt
Viscometer FZ-Jülich - falling ball viscometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fitter, J., Gutberlet, T., Katsaras, J. Neutron Scattering in Biology: Techniques and Applications. , New York. (2006).
  2. Stadler, A., Monkenbusch, M., Biehl, R., Richter, D., Ollivier, J. Neutron spin-echo and TOF reveals protein dynamics in solution. Journal of the Physical Society of Japan. 82, (2013).
  3. Inoue, R. Large domain fluctuations on 50-ns timescale enable catalytic activity in phosphoglycerate kinase. Biophysical Journal. 99 (7), 2309-2317 (2010).
  4. Callaway, D. J. E., et al. Controllable activation of nanoscale dynamics in a disordered protein alters binding kinetics. Journal of Molecular Biology. 429 (7), 987-998 (2017).
  5. Stingaciu, L. R., Biehl, R., Changwoo, D., Richter, D., Stadler, A. M. Reduced internal friction by osmolyte interaction in intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (1), 292-296 (2020).
  6. Monkenbusch, M., Richter, D. High resolution neutron spectroscopy-a tool for the investigation of dynamics of polymers and soft matter. Comptes Rendus Physique. , (2007).
  7. Richter, D., Monkenbusch, M., Schwahn, D. Neutron Scattering. Polymer Science: A Comprehensive Reference, 10 Volume Set. , (2012).
  8. Wilson, C. C. Single Crystal Neutron Diffraction From Molecular Materials. , World Scientific. Singapore. (2000).
  9. Marshall, W. Theory of thermal neutron scattering. , Oxford University Press. (1971).
  10. Roger Pynn Introduction & Neutron Scattering "Theory". , Available from: https://neutrons.ornl.gov/sites/default/files/intro_to_neutron_scattering.pdf (2004).
  11. Richter, D. Neutron scattering in polymer physics. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 22-29 (2000).
  12. Harroun, T. A., Wignall, G. D., Katsaras, J. Neutron scattering for biology. Neutron Scattering in Biology. , (2006).
  13. SNS. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/sna (2020).
  14. HFIR. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/hfir (2020).
  15. CNCS. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/cncs (2020).
  16. Perticaroli, S., et al. Description of hydration water in protein (green fluorescent protein) solution. Journal of the American Chemical Society. 139 (3), 1098-1105 (2017).
  17. Perticaroli, S., Nickels, J. D., Ehlers, G., Sokolov, A. P. Rigidity, secondary structure, and the universality of the boson peak in proteins. Biophysical Journal. 106 (12), 2667-2674 (2014).
  18. Miao, Y., et al. Coupled flexibility change in cytochrome p450cam substrate binding determined by neutron scattering, NMR, and molecular dynamics simulation. Biophysical Journal. 103 (10), 2167-2176 (2012).
  19. Mamontov, E., Zamponi, M., Hammons, S., Keener, W. S., Hagen, M., Herwig, K. W. BASIS: A new backscattering spectrometer at the SNS. Neutron News. 19 (3), 22-24 (2008).
  20. Mamontov, E. Microscopic diffusion processes measured in living planarians. Scientific Reports. 9, 8708 (2018).
  21. Alpert, Y., Cser, L., Faragó, B., Franěk, F., Mezei, F., Ostanevich, Y. M. Segmental flexibility in pig immunoglobulin G studied by neutron spin-echo technique. Biopolymers. 24 (9), 1769-1784 (1985).
  22. Bu, Z., Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D., Callaway, D. J. E. Coupled protein domain motion in Taq polymerase revealed by neutron spin-echo spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (49), 17646-17651 (2005).
  23. Biehl, R., et al. Direct observation of correlated interdomain motion in alcohol dehydrogenase. Physical Review Letters. 101, 138102 (2008).
  24. Farago, B., Li, J., Cornilescu, G., Callaway, D. J. E., Bu, Z. Activation of nanoscale allosteric protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Journal. 99 (10), 3473-3482 (2010).
  25. Bu, Z., Callaway, D. J. E. Dynamic propagation of long-range allosteric signals by nanoscale protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Journal. 100 (3), 223 (2011).
  26. Hong, L., et al. Structure and dynamics of a compact state of a multidomain protein, the mercuric ion reductase. Biophysical Journal. 107 (2), 393-400 (2014).
  27. Longeville, S., Stingaciu, L. -R. Hemoglobin diffusion and the dynamics of oxygen capture by red blood cells. Scientific Reports. 7, 10448 (2017).
  28. Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring. Scientific Reports. 6, 22148 (2016).
  29. Hahn, E. L. Nuclear induction due to free larmor precession. Physical Review. 77, 297 (1950).
  30. Hahn, E. L. Spin echoes. Physical Review. 80, 580 (1950).
  31. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735-1782 (2003).
  32. Sasview. , Available from: https://www.sasview.org (2020).
  33. Zhao, J. K., Gao, C. Y., Liu, D. The extended Q-range small-angle neutron scattering diffractometer at the SNS. Journal of Applied Crystallography. 43, 5 PART 1 1068-1077 (2010).
  34. Ohl, M., et al. The high-resolution neutron spin-echo spectrometer for the SNS with τ ≥ 1 µs. Physica B: Condensed Matter. 350, 147-150 (2004).
  35. SNS-NSE web page. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/nse (2022).
  36. Ohl, M., et al. The spin-echo spectrometer at the Spallation Neutron Source (SNS). Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 696, 85-99 (2012).
  37. Zolnierczuk, P. A., Holderer, O., Pasini, S., Kozielewski, T., Stingaciu, L. R., Monkenbusch, M. Efficient data extraction from neutron time-of-flight spin-echo raw data. Journal of Applied Crystallography. 52 (5), 1022-1034 (2019).
  38. Dr Spine hub. , Available from: https://jugit.fz-juelich.de/nse/drspine (2022).
  39. Stadler, A. M., et al. Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), (2014).
  40. FZJ. , Available from: https://www.fz-juelich.de/portal/EN/AboutUs (2022).
  41. KWS2. , Available from: https://miz-garching.de/kws-2 (2022).
  42. Moorhouse, M., Barry, P. The protein databank. Bioinformatics Biocomputing and Perl. , (2005).
  43. Tria, G., Mertens, H. D. T., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (2), 207-217 (2015).
  44. Holderer, O., Monkenbusch, M., Schätzler, R., Kleines, H., Westerhausen, W., Richter, D. The JCNS neutron spin-echo spectrometer J-NSE at the FRM II. Measurement Science and Technology. 90 (4), 043107 (2008).
  45. Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D. Exploring internal protein dynamics by neutron spin echo spectroscopy. Soft Matter. 7 (4), 1299-1307 (2011).
  46. Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring. Scientific Reports. 6, 22148 (2016).
  47. Stadler, A. M., et al. Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6987-6994 (2014).
  48. Biehl, R., Richter, D. Slow internal protein dynamics in solution. Journal of Physics: Condensed Matter. 26 (50), 503103 (2014).
  49. Hinsen, K. The molecular modeling toolkit: A new approach to molecular simulations. Journal of Computational Chemistry. 21 (2), 79-85 (2000).
  50. Uhlenbeck, G. E., Ornstein, L. S. On the theory of the Brownian motion. Physical Review. 36 (5), 823 (1930).
  51. Wang, M. C., Uhlenbeck, G. E. On the theory of the Brownian motion II. Reviews of Modern Physics. 17, 323 (1945).
  52. Callaway, D. J. E., Bu, Z. Nanoscale protein domain motion and long-range allostery in signaling proteins-a view from neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Reviews. 7 (2), 165-174 (2015).
  53. Liu, Y. Intermediate scattering function for macromolecules in solution probed by neutron spin echo. Physical Review E. 95, 020501 (2017).
  54. Liu, Y. Short-time dynamics of proteins in solutions studied by neutron spin echo. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 42, 147-156 (2019).

Tags

Teknik Utgåva 182 Neutronspridning neutronspinn-eko proteinlösning långsam dynamik proteindomänrörelser proteinflexibilitet
Studie av proteindynamik <em>via</em> neutronspinnekospektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stingaciu, L. R. Study of Protein… More

Stingaciu, L. R. Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy. J. Vis. Exp. (182), e61862, doi:10.3791/61862 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter