Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Nötron Spin Yankı Spektroskopisi ile Protein Dinamiğinin İncelenmesi

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/61862
Automatic Translation
1
1NSD, Oak Ridge National Laboratory

Summary

Bu protokol, insan sağlığında önemli bir role sahip olan iki model proteinin yapısını ve dinamiklerini araştırmak için kullanılan yöntemleri açıklamaktadır. Bu teknik, protein etki alanları arası hareketlerle ilgili zaman ve uzunluk ölçeklerindeki dinamiklere erişmek için tezgah üstü biyofiziksel karakterizasyonu nötron spin eko spektroskopisi ile birleştirir.

Abstract

Çoğu insan vücudu proteininin aktivitesi ve işlevselliği, protein kristal yapısı içindeki tüm alt alanların konfigürasyonel değişiklikleri ile ilgilidir. Kristal yapılar, çoğu zaman güçlü geometrik kısıtlamalarla bir proteinin yapısını veya dinamiklerini tanımlayan herhangi bir hesaplamanın temelini oluşturur. Bununla birlikte, kristal yapıdan gelen bu kısıtlamalar çözeltide mevcut değildir. Çözeltideki proteinlerin yapısı, piko-nanosaniye zaman ölçeğindeki döngülerin veya alt alanların yeniden düzenlenmesi nedeniyle kristalden farklı olabilir (yani, iç protein dinamiği zaman rejimi). Bu çalışma, onlarca nanosaniyelik zaman ölçeklerindeki yavaş hareketlere nötron saçılması kullanılarak nasıl erişilebileceğini açıklamaktadır. Özellikle, iki ana insan proteininin, iyi tanımlanmış bir ikincil yapıya ve klasik bir antikor proteinine sahip olmayan, özünde düzensiz bir proteinin dinamik karakterizasyonu, çok çeşitli laboratuvar karakterizasyon yöntemleriyle birlikte nötron spin eko spektroskopisi (NSE) ile ele alınmaktadır. Deneysel nötron verilerini tanımlamak ve kombine difüzyon ve iç protein hareketleri arasındaki geçişi belirlemek için matematiksel modelleme kullanılarak protein etki alanı dinamikleri hakkında daha fazla bilgi elde edildi. Çeşitli hareketlerin zaman çizelgesi de dahil olmak üzere NSE'den elde edilen ara saçılma fonksiyonuna iç dinamik katkının ekstraksiyonu, tek proteinlerin mekanik özelliklerine ve kalabalık protein çözeltisindeki neredeyse doğal ortamlarında proteinlerin yumuşaklığına daha fazla görüş sağlar.

Introduction

Yumuşak maddenin nötronlarla sondalama dinamikleri
Proteinlerin ve peptitlerin dinamik özelliklerini araştırmak, biyofiziksel araştırmanın önemli bir parçasıdır ve günümüzde çok çeşitli enerji manzaralarına erişmek için birçok iyi geliştirilmiş yöntembulunmaktadır 1. Proteinlerin deneysel olarak ortaya çıkan dinamiklerini biyolojik işlevleriyle ilişkilendirmek, karmaşık matematiksel modeller ve bilgisayar destekli dinamik simülasyonları gerektiren çok daha zor bir iştir. Protein hareketlerinin analizi için nötron spektroskopisinin önemi, iyi karşılanan ve yaygın olarak tanınan birkaç çalışmada vurgulanmıştır 1,2,3,4,5. İç protein dinamiklerinin çeşitli enerji manzarasını keşfetmeden önce, yumuşak maddedeki dinamik süreçlere ve nötronların bunlara nasıl erişebileceğine dair kısa bir genel bakış gereklidir.

Nötronların izotopik konfigürasyona duyarlılığı ve yumuşak madde ile gösterdikleri etkileşimlerin türü, nötron saçılımını en çok yönlü araştırma tekniklerinden biri haline getirir6. Nötronların erişebileceği geniş bir korelasyon uzunluğu ölçekleri ve korelasyon süreleri spektrumu vardır, nükleer uyarımlardan ve atomik titreşimlerden kolektif hareketlere ve izotropik rotasyonlar ve difüzif hareketler gibi yavaş gevşeme süreçlerine kadar. Dağınık nötronları enerji transferleri için araştırırken, üç ana etkileşim ayırt edilebilir: numunede gelen nötron ve parçacık arasında enerji alışverişinin olmadığı elastik saçılma; nötron ve parçacık arasında büyük, ölçülebilir bir enerji değişimi ile elastik olmayan saçılma; ve olay nötron enerjisine kıyasla çok küçük bir enerji transferini gösteren tuhaf yarı-elastik saçılma durumu 1,7. Bu etkileşimler, araştırılan malzeme hakkında kesin bilgi verir ve çok çeşitli nötron saçılma tekniklerinin teorik temelini oluşturur.

Elastik saçılmada, dedektör nötronların yönlerini, örnek atomların birbirlerine göre konumunu gösteren bir kırınım paterni olarak kaydeder. Atomik konumların korelasyonları hakkında bilgi edinilir (yani, yalnızca yapısal bilgiyle ilgili olan momentum transferi Q ile ilgili entegre yoğunluk S ( Q). Bu ilke nötron kırınımının temelini oluşturur8.

Karmaşıklık, numune malzemesindeki uyarılmalar ve iç dalgalanmalar nedeniyle enerji transferi artık sıfır olmadığında ortaya çıkar. Bu, dağınık nötronların hem enerji transferi E hem de momentum transferi Q'nun bir fonksiyonu olarak araştırıldığı nötron spektroskopisinin temelini oluşturur. Dinamik ve yapısal bilgiler elde edilir. Nötron spektroskopisi, enerji transferi için aynı entegre yoğunluk S(Q)'yu ölçer (yani, numune saçılması nedeniyle nötronların hız değişimi, S(Q,ω) = S(Q, E), dinamik yapı faktörü olarak da adlandırılır)9.

Bir malzemeden saçılımı hesaplamak için, 7,10 çift korelasyon fonksiyonunu kullanmak daha yeterlidir. Kırınım durumunda, statik çift korelasyon fonksiyonu G(r), bir parçacığın merkezini başka bir parçacığın merkezinden belirli bir mesafe r'de bulma olasılığını verir. Spektroskopi, statik çift korelasyon fonksiyonunu genelleştirir ve saçılma denklemine enerji / frekans / zaman içerir. Çift korelasyon fonksiyonu G(r), ayrı bir atom çifti korelasyon fonksiyonu G D(r, t) ve bir öz-korelasyon fonksiyonu G S(r, t) olarak ayrıştırılabilen G(r, t) zamanının bir fonksiyonu haline gelir. Bunlar iki tür korelasyonu tanımlar: tutarlı saçılımı yöneten atomların çift korelasyonlu hareketleri ve tutarsız saçılımı yöneten kendi kendine korelasyon10.

Tutarlı saçılma, "ortalama" dan saçılmadır ve dağınık dalgaların göreceli fazına bağlıdır. Küçük açılı saçılma rejiminde, farklı saçılma merkezlerinden (farklı atomlar) gelen saçılan nötron dalgaları yapıcı bir şekilde müdahale eder (benzer fazlara sahiptir) ve atomların kolektif hareketi güçlü yoğunluk artışı ile gözlenir. Tutarlı saçılma esas olarak örnek10'daki tüm çekirdeklerden tek bir nötronun saçılmasını tanımlar.

Farklı merkezlerden gelen dağınık nötron dalgaları arasında yapıcı bir girişim meydana gelmediğinde, zaman içinde tek bir atom takip edilir ve atomun t = 0 zamanındaki konumu ile t zamanındaki aynı atom arasındaki öz korelasyon gözlenir. Böylece, atomların göreceli konumları hakkındaki bilgiler kaybolur ve odak noktası sadece yerel dalgalanmalardır. Yerel dalgalanmalardan kaynaklanan saçılma, tutarsız saçılımı yönetir. Tutarsız saçılma izotropiktir, arka plan sinyaline katkıda bulunur ve sinyalden gürültüye 10,11'i bozar.

Yukarıdakilerin hepsini birleştirerek, dört ana nötron saçılma işlemini ayırt ediyoruz10: (1) elastik tutarlı (atomik konumların korelasyonlarını ölçer), (2) elastik olmayan tutarlı (atomların kolektif hareketlerini ölçer), (3) elastik tutarsız (arka plana katkıda bulunur, Debye-Waller faktörü (DWF) ile saçılma yoğunluğunu azaltır ve sınırlı geometrideki difüzyon hareketlerinin geometrisini tanımlayan elastik tutarsız yapı faktörünü (EISF) ölçer, ve (4) elastik tutarsız (tek atom dinamiklerini ve kendi kendine korelasyonu ölçer).

Nötronların biyolojide erişebileceği dinamik süreçler, düşük frekanslı atomik ve moleküler titreşimlerin sönümlenmesinden, çözücü moleküllerinin biyo-yüzeylerle etkileşiminden ve makromoleküllerin hidrasyon tabakasındaki difüzyon işlemlerinden ve sınırlı geometriden, kısa menzilli translasyonel, rotasyonel ve yuvarlanan difüzyon hareketlerine ve protein alanlarına ve allosterik hareketlere kadaruzanır1 . Protein dinamiklerini ölçmek için nötron yöntemlerinin ve araçlarının geniş çeşitliliği, olayın veya giden nötron ışınının akromatizasyonunun nasıl elde edildiğine ve dağınık nötronların enerji analizinin nasıl yapıldığına dayanmaktadır. Üç eksenden uçuş zamanına, geri saçılmaya ve spin-echo spektrometrelerine kadar, 1 x 10-14 s ile 1 x 10-6 s (femtosaniyelerden mikrosaniyelere)12 arasındaki karakteristik sürelere sahip dinamik süreçler keşfedilebilir.

Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı, iki ünlü nötron kaynağı olan Spallation Neutron Source - SNS13 ve High Isotop Flux Reactor - HFIR14 ile, biyo-malzemelerdeki dinamikleri araştırmak için en iyi spektrometre paketlerinden birine sahiptir. En anlamlı örneklerden bazıları, SNS15'teki soğuk nötron kıyıcı spektrometresinin (CNCS), çözelti16'daki yeşil floresan proteini etrafındaki hidrasyon suyunun dinamik pertürbasyonunu veya birkaç proteinin pikosaniye altı kolektif titreşimlerini araştırmak için kullanılmasıdır17. Elastik olmayan nötron saçılma araştırmalarının tekrarlayan bir problemi, bazı biyolojik süreçlerin gözlemlenemeyecek kadar yavaş olmasıdır. Büyük bir nötron yoğunluğu kaybına yol açan aşırı kurulumlar olmadan, uçuş süresi spektrometreleri, ~ 200 ps 10,11'lik maksimum zaman ölçeğine karşılık gelen10 μeV enerji çözünürlüğü ile sınırlıdır. Bu, proteinlerdeki büyük ölçekli hareketleri gözlemlemek için yeterli değildir. Bu nedenle, geri saçılma spektrometreleri gibi daha yüksek enerji çözünürlüğüne sahip cihazlara sıklıkla ihtiyaç duyulur. Uçuş süresi ve geri saçılma tekniklerini birleştirmek, hidroksilasyon kafuru18'i katalize eden bir enzim olan Sitokrom P450cam'ın (CYP101) iç dinamiklerindeki değişimi araştırmak için güçlü olduğunu kanıtlamıştır.

SNS-BASIS19'daki geri saçılma spektrometresi tarafından ölçülen mikroskobik difüzyon şaşırtıcı derecede iyi tanımlanmıştır ve suyun difüzyonuna (hidrasyon, sitoplazmik ve toplu benzeri su) ve nötron saçılması ile incelenen ilk canlı hayvan olan planarian yassı solucanlardaki hücre bileşenlerinin difüzyonuna ayrılabilir20 . Geri saçılma yüksek çözünürlüklü spektroskopik bir tekniktir, ancak aynı zamanda birkaç μeV = birkaç nanosaniye ile sınırlıdır, biyomalzemelerdeki yavaş dinamikler aynı zamanda atomik konum veya spin oryantasyonları arasındaki korelasyonun hayatta kalma süresi olarak da kendini gösterir (örneğin, on ila yüzlerce nanosaniye zaman aralığında düzenli olarak gerçekleşen gevşeme süreçleri).

Nötron spin eko spektroskopisi (NSE), bu kadar yüksek çözünürlüğe ulaşan tek nötron saçılma tekniğidir. Diğer nötron tekniklerinin aksine, NSE, nötronların manyetik momentleri olan kuantum mekanik fazını kullandığı için ışının akromatizasyonunu gerektirmez. Manyetik momentlerin manipülasyonu, geniş bir nötron ışını dalga boyu dağılımının kullanılmasına izin verirken, teknik 1 x 10-4 sırasına göre çok küçük nötron hızı değişikliklerine duyarlıdır. NSE, birçok protein için çözeltideki proteinlerin yavaş dinamiklerini araştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Bu birçok öncü çalışma arasında, domuz immünoglobulin21'in segmental esnekliğinin incelenmesini kabul ediyoruz; Taq polimeraz22'deki birleştirilmiş alan hareketleri; maya alkol dehidrogenaz23'ün tetramerindeki etki alanı hareketleri; substrat bağlanması üzerine fosfogliserat kinazdaki konformasyonun değişmesi3; alan hareketlerinin aktivasyonu ve Na+/H+ değişim düzenleyici kofaktör 1 (NHERF1) proteini4,24,25'teki allosterik sinyallerin dinamik yayılımı; merkürik iyon redüktaz26'nın kompakt bir durumunun dinamiği; ve hemoglobinin kırmızı kan hücrelerinde difüzyonu27. Protein dinamiği üzerine yapılan iki yeni çalışma, insan antikoru İmmünoglobulin G'nin (IgG) entropik bir yay28 olarak esnekliğini ve çözücünün içsel olarak bozulmuş miyelin bazik proteininin (MBP) dinamiklerine katkısının özelliklerini ortaya koymuştur5.

Bu makalede, NSE'nin temel ilkeleri, kapsamlı bir protein dinamiği araştırması için önerilen çoklu hazırlık yöntemleri ve ayrıca SNS, SNS-NSE'deki NSE spektrometresinde NSE veri toplama metodolojisi ve deneysel protokolü açıklanmaktadır. Protokol iki proteini karakterize eder: IgG, normal bir insan antikor proteini ve özünde düzensiz protein MBP. Biyofiziksel etkileri, örneklerin araştırma ile ilgisi ve tekniğin sınırlamaları kısaca tartışılmıştır.

NSE spektroskopisi, yavaş dinamik ölçümleri için yöntem
NSE, bir numunedeki nötronlar ve atomlar arasındaki yarı-elastik etkileşim nedeniyle enerji değişimini (polarizasyon kaybı) ölçmek için nötron uçuş süresini kullanan polarize bir tekniktir. NSE spektroskopisinin özünde iki temel ilke yatmaktadır: (1) nötron spininin manyetik alanda manyetik kuvvetle Equation 1orantılı bir frekansla presese kabiliyeti, yani Larmor frekansı29 ve (b) bir dizi radyofrekans darbesi uygulanırken polarizasyon sinyalinin manipülasyonunu ve yeniden odaklanmasını temsil eden spin-echo veya Hann echo30.

NSE sürecinin temelleri, Şekil 1 kullanılarak birkaç basit adımda 6,11 olarak özetlenebilir. (1) Kaynak tarafından üretilen nötron ışını (konum 1) polarize edilir (konum 2), yönlendirilir ve taşınır (konum 3) ve NSE spektrometresinin girişine ulaşır, burada ilk pi-yarı palet (konum 4) tarafından 90 ° döndürülür. (2) Polarize ışın (örneğin, nötron manyetik momentleri) ilk mıknatısın manyetik alan çizgilerine (ilk presesyon bölgesi, pozisyon 5) dik hale gelir ve presese başlar. (3) Mıknatısın sonunda, nötron dönüşleri, manyetik alan kuvveti ve içeride harcanan uçuş süresi ile orantılı olarak belirli bir presesyon açısı biriktirir (temel olarak nötron hızıyla ters orantılıdır). Bireysel nötron hızları, ilk presesyon bölgesinin sonundaki presesyon açıları içinde kodlanır. (4) Numune konumuna yakın olan pi-palet (konum 6), presesyon açısının işaretini değiştirerek spinin yönünü 180 ° tersine çevirir. (5) Nötronlar numunenin molekülleriyle etkileşime girer (konum 7) ve dağılır. (6) Dağınık nötronlar ikinci presesyon bölgesine (pozisyon 8) girer ve presese girer, ancak ters yönelimli hale gelir. (7) Spin yönünü dikten yatay yöne döndürmek için başka bir pi-yarım palet (konum 9) kullanılır. Bu, presesyon açısını φ cos(φ) ile orantılı polarizasyona çevirerek presesyonu durduracaktır. (8) Analizör (konum 10) nötronları bir yöne göre seçer. Numune ile etkileşim elastik ise, nötronun hızı değişmeyecektir. Nötronlar, birinci ve ikinci presesyon bölgelerinde uçmak için aynı miktarda zaman harcayacak ve biriken presesyon açıları tamamen geri kazanılacaktır. Tam polarizasyon, dedektörde (pozisyon 11) orijinal polarizasyonun (yani spin-echo) bir yankısı olarak geri yüklenir. (9) Bununla birlikte, NSE'de saçılma yarı-elastiktir, bu nedenle nötronlar ve numune molekülleri arasındaki küçük bir enerji değişimi, numune tarafından saçıldıktan sonra farklı nötron hızlarına yol açar. Farklı hızlar nedeniyle, nötronlar ikinci presesyon bölgesinden uçmak için ek bir zaman harcayacak ve presesyon açılarını düzgün bir şekilde geri kazanamayacaktır. Dedektör üzerinde kısmi bir polarizasyon alınır ve spin gevşemesine bağlı polarizasyon kaybı, spektral fonksiyon S(Q, ω), ara saçılma fonksiyonu F(Q, t)'nin cos-Fourier dönüşümü ile orantılıdır. (10) F(Q, t) fonksiyonunun zaman parametresi, presesyon manyetik alan kuvveti ile orantılıdır. Polarizasyon kaybının manyetik alan kuvvetinin bir fonksiyonu olarak taranması, bu nedenle, numune içindeki dinamik süreçlere bağlı bir gevşeme fonksiyonu verir.

Figure 1
Resim 1: SNS'DE (SNS-NSE) NSE SPEKTROMETRESININ VE EN ÖNEMLI FONKSIYONEL BILEŞENLERLE NÖTRON SINEK YOLU ŞEMASıNıN FOTOĞRAFı. Sağdan sola: 1 = nötron kaynağı; 2 = doğrayıcılar-bükücü-polarizör-ikincil deklanşör sistemi; 3 = kiriş taşıma kılavuzları; İlk 90° spin-turn için 4 = pi/2 palet; 5 = ilk presesyon bölgesi; 6 = 180 ° spin-turn için pi flipper; 7 = numune alanı ve numune ortamı (burada, kriyo-fırın gösterilmiştir); 8 = ikinci presesyon bölgesi; İkinci 90° spin-turn için 9 = pi/2 palet; 10 = analizör; 11 = dedektör. (3'ün yanı sıra 2 ve 1'in bölümlerinin ekranlamanın içindeki mavi duvarın arkasında yer aldığını unutmayın; Kıyıcılar, reaktör tabanlı NSE için bir hız seçici ile değiştirilir). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışma iki proteini karakterize ediyor: düzenli bir insan antikor proteini IgG ve özünde düzensiz MBP. Proteinlerin liyofilize formu ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Protein numunesi hazırlama

  1. İlgili katı reaktifleri ağır suda (D2O) tartarak ve çözerek 50 mM sodyum fosfat + 0,1 M NaCl tamponu hazırlayın (bkz. Bu, IgG için deuterated tampon çözücüsüdür.
    1. Tampon çözeltisinin pH'ını 6,6'ya ayarlayın.
  2. İlgili katı bileşenleri tartarak ve ağır suda(D 2O) çözerek 20 mM sodyum fosfat + 6 M üre tamponu hazırlayın. Bu, MBP için deuterated tampon çözücüsüdür.
    1. Tampon çözeltisinin pH'ını 4,7'ye ayarlayın.
  3. Tampon çözücüleri 0,2 μm gözenek boyutunda filtreler kullanarak filtreleyin (bkz.
  4. Saflaştırılmış protein liyofilize tozlarını, ilgili proteinler için deuterated çözücülerde tartın ve çözün (Adım 1.1.-1.2.) yüksek protein konsantrasyonunda (~ 50 mg / mL).
  5. Protein çözeltisini 3,5 K MWCO'luk diyaliz membranlarına sahip diyaliz sepetlerine yükleyin ve bir difüzyon gradyanı oluşturmak için tüpleri hafifçe sallayarak MBP için 10 °C'de ve IgG için 25 °C'de filtrelenmiş tampona karşı 24 saat boyunca diyaliz yapın ( bkz.
  6. Diyaliz tamponunu kullanarak protein çözeltisini bir dizi konsantrasyonda seyreltin: 1, 2, 5, 10 ve 50 mg / mL.
  7. Bir Nanodrop spektrofotometresi kullanarak kesin konsantrasyonları belirleyin (bkz.

2. Dinamik ışık saçılması (DLS) ile ön numune karakterizasyonu

  1. Yukarıda hazırlanan konsantrasyon serisinden (Adım 1.6.) her bir protein çözeltisinin 80 μL'sini DLS tek kullanımlık hücresine yükleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve ortalama 10'dan fazla kazanım elde ederek difüzyon katsayılarını belirleyin.
  2. Translasyonel difüzyon katsayılarını protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizin ve sıfır konsantrasyona ekstrapolat yapın.
  3. Her protein çözeltisini konsantrasyon serisinden bir viskozitörün kılcal tüplerine yükleyin ( bakınız Malzeme Tablosu) ve dinamik viskoziteyi ölçün.
  4. Protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak ölçülen dinamik viskoziteleri çizin ve sıfır konsantrasyona ekstrapolat yapın.
    NOT: DLS difüzyonunun sıfır konsantrasyona ekstrapolasyonu, tek bir protein için translasyonel difüzyon değerini verir. Dinamik viskozitenin sıfır konsantrasyona ekstrapolasyonu, tampon çözeltisi için deneysel olarak ölçülen dinamik viskozite değerini vermelidir.

3. Küçük açılı saçılmanın toplanması (nötron veya x-ışını)

  1. Küçük açılı nötron saçılımını (SANS) ve / veya küçük açılı x-ışını saçılımını (SAXS) ( Malzeme Tablosuna bakınız) dört protein konsantrasyonunda, tercihen 2 mg / mL, 5 mg / mL, 10 mg / mL ve 50 mg / mL'de ölçün.
  2. SANS ve SAXS spektrumlarını protein konsantrasyonu ile normalleştirin.
  3. Topluluk optimizasyonu31 ve/veya SasView32 yazılımını kullanarak protein form faktörü P(Q)'yu SANS ve SAXS spektrumlarına takın.
  4. SANS ve SAXS sinyalini her konsantrasyon için P(Q) ile bölerek S(Q, c) yapı faktörünü hesaplayın.
    NOT: NSE ölçümleri için destek olarak küçük açılı saçılma verilerinin nasıl ölçüleceği ve yorumlanacağı ile ilgilenen okuyucuların, 23,28,31,32,33 referanslarına iyice başvurmaları önerilir.

4. NSE ölçümü

  1. Deneme için kurulum yapın ve aşağıdaki adımları izleyerek örneği bağlayın.
    1. Protein çözeltisinin konsantrasyonuna, ölçüm için gereken sıcaklığa ve mevcut çözelti miktarına bağlı olarak numune yükleme için hücrenin kalınlığını seçin.
      NOT: Bu çalışmada 40 mm x 30 mm x 4 mm'lik üstten yükleyici şeffaf kuvars kaplar kullanılmıştır.
    2. Hücreyi, fosfatsız bulaşık deterjanı ( bakınız Malzeme Tablosu), deiyonize su ve% 70 etanol arasında geçiş yaparak tekrar tekrar temizleyin.
    3. Hücreyi konveksiyon fırınında kurutun; kuvars hücreleri için 80 °C'yi geçmemelidir.
    4. Hücreye 4 mL protein çözeltisi yükleyin ve kapaklarla kapatın. Numune hücrelerini kapatmak için balmumu filmi veya herhangi bir sızdırmazlık maddesi kullanın (bkz.
      NOT: Bu çalışmada, yeterli saçılma yoğunluğunu elde etmek için ~ 50 mg / mL'de 4.8 mL çözelti kullanılmıştır.
    5. 4 mL diyaliz tamponunu protein numunesi ve conta ile aynı kaba yükleyin.
    6. Örnekleri ışın çizgisine taşıyın, deklanşörü kapatın ve spektrometre muhafaza mağara alanına girin34.
    7. Numune hücresini, vidaları ve tutma plakalarını sıkarak alüminyum numune tutucu üzerine monte edin (Şekil 2, sol panel).
      NOT: Tüm numuneler için aynı ölçüm protokolünün gerekli olması koşuluyla, aynı anda iki numune hücresi monte edilebilir.
    8. Grafit numunesini ve/veya Al2O3 toz numunesini, protein numunesi ile aynı kaba yüklenmiş olarak monte edin. Bunlar SNS-NSE ışın hattı desteği tarafından sağlanan standartlardır.
    9. Numune tutucuyu yavaşça sıcaklık zorlama sisteminin kutusuna kaydırarak yerleştirin (TFS, bkz.
      NOT: TFS, SNS-NSE'de en çok kullanılan numune ortamıdır ve istenen sıcaklığı elde etmek için numune kabına kuru hava pompalar (Şekil 2, orta ve sağ paneller).
    10. TFS kapağını kapatın ve TFS'nin etkileşimli ekranına erişerek sıcaklığı istenen değere ayarlayın.
    11. Örneklerin ışına hizalanması için nötron kamerayı takın (bkz.
    12. Cihaz muhafazasını süpürün, boşaltın, kapıları kapatın ve kiriş deklanşörünü açın.
      NOT: Örnek hücreler SNS-NSE ışın hattı desteği ile sağlanır. Mevcut örnek hücreler ve örnek ortam kitaplığı için lütfen SNS-NSE beamline web sayfası 7,35'e bakın.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek NSE verilerini toplayın.
    1. Nötron kamerasını ve dört bağımsız örnek açıklığını kullanarak numuneyi nötron ışınında hizalayın.
    2. SNS-NSE veri toplama yazılımı36'yı açın ve istenen saçılma açıları ve dalga boyu için kırınım taramaları çalıştırarak örnek istatistikler toplayın.
    3. Yardımcı Alet Bilimcisi tarafından sağlanan ölçüm makrolarını düzenleyerek her numune için toplanan istatistiklere dayanarak ölçüm parametrelerini ayarlayın.
    4. Komut istemine protokol adını yazarak taramaya başlayın ve örnek için yankılar alın.
    5. Taramaya başlayın ve elastik referans ve tamponlanmış çözücü için de yankılar elde edin. Numune değişimi için aralıklı ışın deklanşör işlemi gerçekleştirin.

Figure 2
Şekil 2: NSE ölçüm sistemi. Sol panel: alüminyum (Al) numune tutucu üzerine vida ve plakalarla monte edilmiş kuvars kapta protein çözeltisi numuneleri. Al numune tutucu, numune ortamına aynı anda iki numune monte etme imkanı sunar. Orta panel: Sıcaklık zorlama sistemi (TFS) örneği, nötron ışını penceresinin sağda olduğu örnekleme aşamasına monte edilebilirken, hizalama için kullanılan nötron kamerası sol tarafta görülebilir. Sağ panel: Numune tutucuyu iki numune ile numuneye yerleştirmek, silikon (Si) pencerelerle çalışabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. NSE veri azaltma

NOT: SNS-NSE, ORNL Neutron Sciences Uzaktan Analiz Kümesi'nde bulunan DrSpine (spin-echo için veri azaltma)37,38 adlı özel bir yazılım, Hızlı Kullanım Kılavuzu ve yerleşik yardım desteği ile donatılmıştır.

  1. Neutron Sciences Remote Analysis Cluster'da (bkz. Malzeme Tablosu) ORNL kullanıcı kimlik bilgileriyle oturum açın ve Oturumu Başlat düğmesine basın.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek veri azaltma yazılımını kurun.
    1. Kullanıcı dizininde bir terminal penceresi açın ve şunu yazın: source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh.
    2. Ardından, şunu yazın: drspine_create_env.sh.
  3. Giriş dizininde veri azaltma için bir klasör oluşturun ve sağlanan komut dosyalarını ve makroları paylaşılan dizinden kopyalayın.
  4. Uygun şekilde sağlanan azaltma makrosunu düzenleyin, yeniden adlandırın ve kaydedin.
  5. Komut istemine drspine yazın ve yazılım azaltma ortamını başlatmak için enter tuşuna basın.
  6. Adım 5.4'te düzenlenen "azaltma makrosunun adı" yazın. yazılım ortamındaki komut istemine gidin ve Enter tuşuna basın.

6. NSE veri uydurma

  1. Yardımcı Instrument Scientist tarafından sağlanan "stapler-drspine.py" python betiğini, azaltılmış dosya verilerinin adlarıyla düzenleyin.
    NOT: Python betiği, cihazın kullanıcıları tarafından ücretsiz olarak kullanılabilir.
  2. İşlevi, sağlanan kitaplıktan sığacak şekilde düzenleyin.
  3. Komut istemine "stapler-drspine.py" adlı düzenlenmiş komut dosyasının adını yazın ve azaltılmış NSE verilerini okumak, sığdırmak ve çizmek için Enter tuşuna basın.
    NOT: Instrument Scientist, NSE azaltılmış verilerini okuyabilen ve sığdırabilen indirgeme makrosu ve "stapler-drspine.py" python komut dosyası için bir şablon sağlayacaktır. Son azaltılmış NSE verileri ASCII formatındadır ve tercih edilen çeşitli yazılımlar tarafından okunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İnsan serumu ve sığır MBP proteinlerinden elde edilen IgG proteini,D2O-baz tamponlarında yüksek konsantrasyonlarda (~ 50 mg / mL) yeniden oluşturuldu. Proteinler yüksek konsantrasyonlarda çözündüğü için, elde edilen çözeltiler kalabalık protein çözeltileriydi. NSE kullanılarak araştırılan dinamikler, proteinlerin içinde bulunduğu kalabalık ortamdan muzdariptir (yapı faktörü etkileşimleri ve hidrodinamik etkiler)5,28,39. DLS, kalabalıklaşma etkilerini hesaba katmak için her protein için bir konsantrasyon serisi üzerinde gerçekleştirildi. DLS tarafından ölçülen translasyonel difüzyon katsayılarının sıfır konsantrasyonuna ekstrapolasyonu, tek bir protein için translasyonel difüzyon değerini verir. Protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak dinamik viskozite, hidrodinamik etkileşimleri hesaba katmak için NSE'den önce de ölçülmelidir. Konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak dinamik viskozitelerin sıfır konsantrasyonuna ekstrapolasyonunun, hazırlanan her protein numunesinin tampon çözeltisi için deneysel olarak ölçülebilecek değeri vermesi gerekir.

Konsantre çözeltideki proteinlerin şekli ve yapısı, proteinlerin çözelti içinde nasıl hareket ettiğini etkileyebilecek protein form faktörü ve yapı faktörünün gücü hakkında fikir edinmek için herhangi bir NSE deneyinden önce değerlendirilmiştir. Küçük açılı saçılma bu araştırmalar için tercih edilen yöntemdi. Bu çalışmada IgG proteininin solüsyondaki yapısal konformasyonu SAXS tarafından gözlemlenmiş ve MBP'nin yapısı SANS tarafından değerlendirilmiştir. Ölçülen saçılma yoğunluğu (Q) (Adım 3.3.-3.4.), P(Q) form faktörü ile S(Q,c) yapı faktörü arasındaki çarpımla orantılıdır (Denklem 1)5,28,39:

I (Q) = N ∙ P (Q) ∙S (Q, c) (1)

SAXS, IgG için0.154 nm X-ışını dalga boyuna sahip bir Kratky tipi SAXS cihazı 40 üzerinde ölçüldü ve SANS, 4.5 şnötron dalga boyuna sahip MBP için41 ölçüldü. Deneysel küçük açılı yoğunluklar I (Q), çözelti konsantrasyonuna göre ölçeklendirilmiş, arka plan ve çözücü düzeltilmiş ve form faktörü, Ensemble modelleme-EOM ve SasView24,25,29,39,42,43 gibi serbestçe kullanılabilen yazılım paketleri kullanılarak hesaplanmıştır. Ayrıca, her protein için yapı faktörü Denklem 1'den elde edilmiştir.

Bu çalışma için, NSE deneyleri iki spin-eko spektrometresi ile gerçekleştirildi: Şekil 1'deki SNS-NSE cihazı34 ve Phoenix-J-NSE cihazı44. 8 ş- 12 şarasındaki olay dalga boyları, 0.05 Å−1 - 0.2 Å−1 arasındaki birkaç Q ölçümü için 0.1 ns ≤ tmax ≤ 130 ns arasında Fourier kez ölçüldü. İki spektrometre arasındaki fark, NSE biliminin anlaşılmasında hayati bir noktadır ve hem bir reaktörün statik nötron kaynağı için "klasik spin ekosu" olarak adlandırılan eski kavramı hem de titreşen nötron kaynağı için yeni "uçuş zamanı konseptini" temsil eder. Phoenix-J-NSE spektrometresi, bir hız seçicinin belirli bir dalga boyunu seçtiği klasik tip bir NSE'dir. Nötron hızlarındaki değişikliklere izin vermek için,% ±10'luk bir dalga boyu bant genişliği tanıtıldı. Tek bir tarama için kullanılan çok dar enerji bandına rağmen, Phoenix-J-NSE spektrometresinin yüksek akı reaktör kaynağındaki durumu, uzay-vektör ve korelasyon zaman aralıklarının nispeten kısa ölçüm sürelerinde ele alınmasını sağlar. SNS-NSE spektrometresi, spektrometrenin konumuna bağlı olarak 2 ş< λ < 14 şdalga boyu açıklığına ve 2.4 ş- 3.6 şeşzamanlı dalga boyu bant genişliğine sahip yeni nesil, ultra yüksek çözünürlüklü, kıyılayıcılar nötron spektrometresidir. Bu geniş bant genişliği sayesinde, yalnızca birkaç saçılma açısı ayarıyla geniş bir dalga-vektör zaman aralığının neredeyse aralıksız bir şekilde kapsanmasını sağlayan yüksek veri toplama verimliliği elde edilir. SNS-NSE'deki dalga boyu bandının seçimi, dört doğrayıcıdan oluşan bir kıyıcı sistemi tarafından yapılır. Burada tartışılan her iki NSE spektrometresi, yüksek manyetik alan homojenliğine sahip süper iletken teknolojiye, başıboş alan düzeltmeleri için yeni son teknoloji alan düzeltme elemanlarına ve yeni polarize bükücülere dayanan presesyon alanlarına sahiptir41,42.

NSE spektrumları, MBP proteini için 10 ° C'de ve IgG1 proteini için 25 ° C'de ölçüldü. NSE tarafından ölçülen tutarlı ara saçılma yoğunluğu I(Q, t) / I(Q, t = 0), incelenen zaman ölçeğinde meydana gelen numunedeki tüm dinamik süreçlerin katkısal sonucudur. Bu, iç protein dinamiklerini, genel translasyonel difüzyonu, rotasyonel ve yuvarlanan difüzyonu ve protein molekülünün içindeki segmental hareketleri içerir. Basitleştirilmiş bir model, iç dinamiklerin ve translasyonel ve rotasyonel difüzyonların5,45,46,47,48 tamamen ayrıldığını ve ayrı ayrı karakterize edilebileceğini varsayar. Tek parçacık için, tutarlı saçılma fonksiyonu ürün olarak yazılabilir (Denklem 2)23,48:

F (Q, t) = Ftrans(Q, t) ∙F çürüklüğü(Q, t) ∙Fint(Q, t) (2)

burada tek bir rijit protein için translasyonel difüzyon terimi, translasyonel difüzyon katsayısı DT'nin üstel bir fonksiyonudur (Denklem 3)23,48:

Ftrans(Q, t) = exp(−Q2∙ DT∙ t) (3)

Büyük protein konsantrasyonları için, translasyonel difüzyon katsayısı DT, S (Q) yapı faktörü ve hidrodinamik fonksiyon H T (Q) (Denklem 4) tarafından tanımlanan hidrodinamik etkileşimler tarafından ölçülen protein-protein etkileşimlerinden etkilenir:

D T(Q) = DT0 ∙HT(Q, c) / S(Q, c) (4)

Denklem 4'te, DT0, DLS ölçümlerinden sıfır konsantrasyona ekstrapolasyonlu difüzyon değeridir (Adım 2.2.). H T, HT = 1 -c∙ [η] olarak hesaplanır, burada c protein konsantrasyonudur, [η] [η] = (η - η 0) /η0 ∙ c ile hesaplanan içsel viskozitedir ve η0 ölçülen dinamik viskozitedir (Adım 2.3.-2.4). Yapı faktörü S(Q, c), IgG proteini için SAXS ölçümlerinden ve MBP proteini için SANS ölçümlerinden elde edildi.

Şekil 3, IgG ve MBP proteinleri için NSE ile ölçülen I(Q, t) / I(Q, t = 0) ara saçılma fonksiyonlarının örneklerini göstermektedir. Basit bir difüzyon benzeri gevşeme sürecinden açık bir sapma, kısa Fourier zaman ölçeğinde, <25 ns'de, NSE tarafından protein iç dinamiklerinin erişilebilirliğini ve gözlemlenen dinamik süreçleri tanımlamak için daha karmaşık bir modele duyulan ihtiyacı gösteren açık bir sapma gözlenmiştir.

Figure 3
Şekil 3: IgG ve MBP proteinleri için NSE gevşeme spektrumları. IgG verileri, difüzyondan sapmayı daha kısa Fourier zamanlarında ortaya çıkarmak için sadece tek üstel bir fonksiyonla donatılmış olarak gösterilmektedir. Her iki protein için de sapma gözlendi. Buna karşılık, MBP verileri burada, Biehl45 tarafından geliştirilen model tarafından takılan tam gevşeme aralığında gösterilmektedir. Model, kaba taneciklenmeyi ima eder ve kısa, orta ve uzun Fourier zaman rejimlerinin aynı anda oturmasını sağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu nedenle, saçılma fonksiyonları, 18,25,38,43,44,46 referanslarında tanımlanan Biehl tarafından geliştirilen modeller kullanılarak her iki proteinin atomik modellemesi ile donatılmıştır. Ara saçılma fonksiyonu, hesaplama yükünü ve süresini azaltmak için tüm atom simülasyonunun aksine, birkaç yüz ayrı taneye kaba tanecik ile hesaplandı ve MMTK49 yazılım kütüphanesi (serbestçe erişilebilir) atomik koordinatlara erişmek ve protein alanları ve parçaları üzerinde trans-rotasyonel hareketler uygulamak için kullanıldı. Her iki protein için ara saçılma fonksiyonu hesaplamasının sonuçları, deneysel NSE verileriyle mükemmel bir uyum içindeydi ve uzun Fourier zamanlarında gözlenen daha yavaş dinamiklerin genel translasyonel ve rotasyonel difüzyon süreçlerine atfedilebileceğini, kısa zaman ölçeklerinde gözlenen hızlı dinamiklerin ise protein alanlarının dinamiklerine atfedilebileceğini kanıtladı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NSE spektroskopisi, diğer spektroskopik tekniklerin üretemediği proteinlerin dinamiklerinin benzersiz ve ayrıntılı bir görünümünü sunar. Uzun bir zaman ölçeğindeki ölçümler, burada sunulduğu gibi, hem proteinlerin translasyonel hem de rotasyonel difüzyonunun gözlemlerini sağlar. Segmental dinamikler ve diğer iç salınımlar kendilerini kısa bir zaman ölçeğinde tutarlı saçılma fonksiyonu S(Q, t)'nin güçlü bir bozunumu olarak ortaya çıkarır ve genel difüzyonel gevşeme süreçlerinden iyi ayrılır. NSE tekniğinin ana sınırlamaları, uzun ölçüm süresi ve iyi bir istatistiksel sinyal elde etmek için gereken büyük numune hacimleridir. Bu, mobil türlerin düşük konsantrasyonlarını ve azaltılmış ömürleri sergileyen ilgili makromoleküler sistemlerin ölçülmesinde zorluk yaratabilir.

IgG'nin iç dinamikleri
IgG proteini, esnek bağlayıcılarla bağlanmış üç büyük fragman ile yaklaşılabilen antikorlara özgü Y şeklinde bir yapıya sahiptir. Bu tür bir yapı için harmonik potansiyelde bulunan üç büyük parçacığın matematiksel bir modeli varsayılıyordu. Bağlayıcılar, sabit bir denge pozisyonu veren, ancak Brownian hareketinin bir formu olarak dalgalanmalara izin veren elastik yaylarla yaklaştırıldı. Göreli denge28 etrafındaki her parça için üç serbestlik derecesine izin verildi. Denklem 2'de Fint(Q, t) ile temsil edilen iç dinamikler Ornstein-Uhlenbeck süreci50,51 ile tanımlanmıştır. Model, potansiyel daldırmadaki parçaların ortalama kare yer değiştirmesinin, farklı hareketlerin zaman ölçeğinin, sürtünmenin ve meydana gelen kuvvet sabitlerinin hesaplanmasına izin verir. İç hareketin genliği, her parça için farklı hareket dereceleri göz önünde bulundurularak normal mod analizi ile yaklaştırıldı. Modelin ve ortaya çıkan matematiksel parametrelerin kapsamlı bir açıklaması burada kapsam dışıdır, ancak referans28'de ayrıntılı olarak bulunabilir. IgG'nin bu vaka çalışmasında, birkaç nanosaniyelik zaman ölçeğinde iç dinamiklerin açık bir imzası gözlendi. Bağlayıcının hesaplanan yay sabiti, benzer uzunluktaki entropik bir yay ile gerçekçi bir şekilde karşılaştırılabilir gibi görünmektedir. Gözlemlenen etkili sürtünme, serbest bağlanmamış bir IgG parçasının sürtünmesine yakın görünmektedir. Önceden var olan denge hipotezi, farklı bağlanma bölgeleri ve bağlanma özgüllükleri sergileyen dengede olan IgG'lerin birlikte var olduğu varsayılan "açık" veya "kapalı" konfigürasyonları ile doğrulanmıştır28. Bu bilgi, antikorların mekaniğini ve bu mekanik davranışın biyouyumluluğu ve biyoyararlanımı geliştirmek için kullanılıp kullanılamayacağını anlamak için geçerli olabilir.

MBP'nin iç dinamikleri
MBP yapısı, esnek rastgele bobin uçları ile güçlü germe ve bükme hareketlerine izin veren kompakt bir küresel çekirdeğe sahiptir. MBP dinamikleri, iç sürtünme28,39 eklenmiş ve eklenmemiş esnek polimer modelleri kullanılarak yorumlanmıştır. IgG'de olduğu gibi, MBP'nin iç dinamiklerinin gözlemleri, daha büyük bir hareket genliğinin, protein zinciri içindeki iç sürtünmenin etkileriyle daha uzun gevşeme süresiyle sonuçlandığı Brownian hareket teorisi içinde uzlaştırılabilir. Daha büyük bir hareket genliği ancak daha küçük sürtünme ile artan gevşeme süresi, harmonik bir potansiyelde Brownian hareketinin50,51'i ile aynı Ornstein-Uhlenbeck süreci kullanılarak tanımlanabilir. Büyük genliklere ancak yavaş gevşeme sürelerine sahip iç hareketler, zincir konfigürasyonunun (dihedral potansiyeller) geri yükleme kuvvetlerini azaltarak ve yerel enerji bariyerlerini düzleştirerek MBP'nin doğal durumundan tam olarak denatürasyonu üzerine aktif hale gelir. MBP iç dinamiklerinin yerel ve denatüre durumdaki ayrıntılı açıklamaları28,39 referanslarında daha ayrıntılı olarak bulunabilir. MBP çalışmasında, NSE kullanılarak yapılan araştırma, rastgele bobin polimerleri ve küresel proteinler arasındaki proteinin ara kompaktlığına işaret eden dinamik bir davranış ortaya koymuştur. İç protein dinamiklerinin birkaç nanosaniyelik bir gevşeme oranına sahip önemli katkısı, düşük frekanslı kolektif germe ve bükme hareketleri5 tarafından yönetilmiştir. Doğal MBP dinamiklerinin polimer teorisi dökümünden modellerle tanımlanması, büyük miktarda protein iç sürtünmesi nedeniyle sağlanmıştır. Denatüre MBP'de, protein zinciri içindeki iç sürtünme azalır ve gevşeme spektrumunun polimer zincir karakteri hakimdir. Yapısal topluluk hareketlerinin yüksek esnekliği, erişilebilir protein yüzeyinin arttırılmasına yardımcı olabilir, böylece farklı bağlanma ortaklarıyla etkileşimi kolaylaştırabilir.

Dinamik modeller
Bir teknik olarak NSE, biyolojik makromoleküllerde ve moleküler alt birimlerde düşük frekanslı harmonik hareketleri değerlendirmede deneysel olarak benzersiz olsa da, ara saçılma fonksiyonunun analizi, çeşitli matematiksel modellerden türetilen nötron spektrumları ile bir karşılaştırma gerektirir. Burada sunulan ve Biehl ve ark.28 tarafından konsantre protein çözeltileri için geliştirilen model, ara saçılma fonksiyonunun uygun modüler fonksiyonların bir evrişimi olduğu ve Brownian osilatörlerinin iç dinamikleri temsil ettiği elastik bir ağ yaklaşımı kullanır. Bu, proteinlerin segmental dinamiklerini analiz etmek için mevcut çok az modelden biridir. Seyreltik protein çözeltileri için iyi kurulmuş bir başka model, istatistiksel mekaniği kullanan ve karmaşık uyumlar veya çoklu parametreler gerektirmeyen sağlam bir model olan Bu ve ark.52 tarafından önerilen modeldir. Dinamik dekuplaj yaklaşımına dayanan benzer bir yaklaşım, etkili difüzyonu kendi kendine translasyonel ve içsel hareketlerin toplamı olarak karakterize etmek için seyreltik sistemlere de uygulanabilir53. Referanslarımızın birçoğu bu modeller ve sınırlamaları hakkında kapsamlı raporlar sağlayabilir. Fitter ve ark.1 ve Liu ve ark.54'ü şiddetle tavsiye ediyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazar, rakip finansal çıkarlar ve çıkar çatışması olmadığını beyan eder. Makalenin içeriği, yazarın 2019-2021 yılları arasında HANDS-Neutron Scattering Applications in Structural Biology School'da sunduğu derse dayanmaktadır.

Acknowledgments

Bu araştırma, Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı tarafından işletilen Bilim Kullanıcı Tesisi'nin bir DOE Ofisi olan Spallation Neutron Source'taki (BL-15, BL-6, Biyoloji ve Kimya laboratuvarları) kaynakları kullandı. Bu araştırma aynı zamanda MLZ-FRM2 reaktörü Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) ve Forschungszentrum Jülich GmbH, Almanya'daki JCNS1'deki kaynakları da kullandı. Yazar, modelleme konusundaki yardımları ve hem IgG hem de MBP protein araştırmalarına katkıları için Dr. Ralf Biehl ve Dr. Andreas Stadler'a, NSE veri azaltma desteği için Dr. Piotr A. Żołnierczuk'a, SANS ölçümlerine destek için Dr. Changwoo Do'ya ve SNS biyokimya laboratuvarı desteği için Rhonda Moody ve Dr. Kevin Weiss'a teşekkür ediyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine MBP protein solution Sigma-Aldrich M1891 lyophilized powder reconstituted in  D2O
D2O - heavy water Sigma-Aldrich Product No. 151882 liquid
Dionized water in house - for washing / cleanning cells
DLS instrument Zetasizer Nano ZS, FZ-Jülich - dynamic light scattering instrument
Elastic scattering standards SNS-NSE, ORNL - Al2O3  and Graphite powders
Ethanol Sigma-Aldrich 65350-M 70% ethanol for cleaning cells
IgG protein solution Sigma-Aldrich I4506 lyophilized powder reconstituted in  D2O
KWS-2 instrument JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - small angle neutron instrument
Liquinox dish detergent Alconox - Phosphate-free liquid lab glassware cleaner
Na2HPO4·7H2O Sigma-Aldrich Product No.S9390 disodium phosphate heptahydrate salt
NaCl Sigma-Aldrich Product No.S9888 sodium chloride salt
NaH2PO4·H2O Sigma-Aldrich Product No. S9638 monosodium phosphate monohydrate salt
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific Catalog number: ND-2000 NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
Neutron alignment camera NeutronOptics, Grenoble NOG210222 100 x 100 mm camera with Sony IMX249 CMOS sensor
Parafilm M - wax parafilm Bemis Parafilm M - 5259-04LC PM996 all-purpose laboratory film in cardboard dispenser
Phoenix-J-NSE Spectrometer JCNS outstation at the MLZ,  Garching, Germany - neutron spectrometer
SasView https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument FZ-Jülich - small angle x-ray instrument
Slide-A-Lyzer dialysis membranes Thermo Scientific 88400-88405 Slide-A-Lyzer mini dialysis devices tubes of 3.5 K MWCO
SNS Remote Analysis Cluster Neutron Science Remote Analysis (sns.gov) https://analysis.sns.gov
SNS-NSE spectrometer ORNL, Oak Ridge, TN, USA - neutron spectrometer
Sterile syringe filters VWR N.A. PN:28145-501 0.2 µm pore size filters
Temperature Forcing System (TFS) SP Scientific Part Number 100004055 sample environment equipment
Urea -d4 Sigma-Aldrich Product No. 176087 deuterated Urea salt
Viscometer FZ-Jülich - falling ball viscometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fitter, J., Gutberlet, T., Katsaras, J. Neutron Scattering in Biology: Techniques and Applications. , New York. (2006).
  2. Stadler, A., Monkenbusch, M., Biehl, R., Richter, D., Ollivier, J. Neutron spin-echo and TOF reveals protein dynamics in solution. Journal of the Physical Society of Japan. 82, (2013).
  3. Inoue, R. Large domain fluctuations on 50-ns timescale enable catalytic activity in phosphoglycerate kinase. Biophysical Journal. 99 (7), 2309-2317 (2010).
  4. Callaway, D. J. E., et al. Controllable activation of nanoscale dynamics in a disordered protein alters binding kinetics. Journal of Molecular Biology. 429 (7), 987-998 (2017).
  5. Stingaciu, L. R., Biehl, R., Changwoo, D., Richter, D., Stadler, A. M. Reduced internal friction by osmolyte interaction in intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (1), 292-296 (2020).
  6. Monkenbusch, M., Richter, D. High resolution neutron spectroscopy-a tool for the investigation of dynamics of polymers and soft matter. Comptes Rendus Physique. , (2007).
  7. Richter, D., Monkenbusch, M., Schwahn, D. Neutron Scattering. Polymer Science: A Comprehensive Reference, 10 Volume Set. , (2012).
  8. Wilson, C. C. Single Crystal Neutron Diffraction From Molecular Materials. , World Scientific. Singapore. (2000).
  9. Marshall, W. Theory of thermal neutron scattering. , Oxford University Press. (1971).
  10. Roger Pynn Introduction & Neutron Scattering "Theory". , Available from: https://neutrons.ornl.gov/sites/default/files/intro_to_neutron_scattering.pdf (2004).
  11. Richter, D. Neutron scattering in polymer physics. Physica B: Condensed Matter. 276-278, 22-29 (2000).
  12. Harroun, T. A., Wignall, G. D., Katsaras, J. Neutron scattering for biology. Neutron Scattering in Biology. , (2006).
  13. SNS. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/sna (2020).
  14. HFIR. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/hfir (2020).
  15. CNCS. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/cncs (2020).
  16. Perticaroli, S., et al. Description of hydration water in protein (green fluorescent protein) solution. Journal of the American Chemical Society. 139 (3), 1098-1105 (2017).
  17. Perticaroli, S., Nickels, J. D., Ehlers, G., Sokolov, A. P. Rigidity, secondary structure, and the universality of the boson peak in proteins. Biophysical Journal. 106 (12), 2667-2674 (2014).
  18. Miao, Y., et al. Coupled flexibility change in cytochrome p450cam substrate binding determined by neutron scattering, NMR, and molecular dynamics simulation. Biophysical Journal. 103 (10), 2167-2176 (2012).
  19. Mamontov, E., Zamponi, M., Hammons, S., Keener, W. S., Hagen, M., Herwig, K. W. BASIS: A new backscattering spectrometer at the SNS. Neutron News. 19 (3), 22-24 (2008).
  20. Mamontov, E. Microscopic diffusion processes measured in living planarians. Scientific Reports. 9, 8708 (2018).
  21. Alpert, Y., Cser, L., Faragó, B., Franěk, F., Mezei, F., Ostanevich, Y. M. Segmental flexibility in pig immunoglobulin G studied by neutron spin-echo technique. Biopolymers. 24 (9), 1769-1784 (1985).
  22. Bu, Z., Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D., Callaway, D. J. E. Coupled protein domain motion in Taq polymerase revealed by neutron spin-echo spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (49), 17646-17651 (2005).
  23. Biehl, R., et al. Direct observation of correlated interdomain motion in alcohol dehydrogenase. Physical Review Letters. 101, 138102 (2008).
  24. Farago, B., Li, J., Cornilescu, G., Callaway, D. J. E., Bu, Z. Activation of nanoscale allosteric protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Journal. 99 (10), 3473-3482 (2010).
  25. Bu, Z., Callaway, D. J. E. Dynamic propagation of long-range allosteric signals by nanoscale protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Journal. 100 (3), 223 (2011).
  26. Hong, L., et al. Structure and dynamics of a compact state of a multidomain protein, the mercuric ion reductase. Biophysical Journal. 107 (2), 393-400 (2014).
  27. Longeville, S., Stingaciu, L. -R. Hemoglobin diffusion and the dynamics of oxygen capture by red blood cells. Scientific Reports. 7, 10448 (2017).
  28. Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring. Scientific Reports. 6, 22148 (2016).
  29. Hahn, E. L. Nuclear induction due to free larmor precession. Physical Review. 77, 297 (1950).
  30. Hahn, E. L. Spin echoes. Physical Review. 80, 580 (1950).
  31. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735-1782 (2003).
  32. Sasview. , Available from: https://www.sasview.org (2020).
  33. Zhao, J. K., Gao, C. Y., Liu, D. The extended Q-range small-angle neutron scattering diffractometer at the SNS. Journal of Applied Crystallography. 43, 5 PART 1 1068-1077 (2010).
  34. Ohl, M., et al. The high-resolution neutron spin-echo spectrometer for the SNS with τ ≥ 1 µs. Physica B: Condensed Matter. 350, 147-150 (2004).
  35. SNS-NSE web page. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/nse (2022).
  36. Ohl, M., et al. The spin-echo spectrometer at the Spallation Neutron Source (SNS). Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 696, 85-99 (2012).
  37. Zolnierczuk, P. A., Holderer, O., Pasini, S., Kozielewski, T., Stingaciu, L. R., Monkenbusch, M. Efficient data extraction from neutron time-of-flight spin-echo raw data. Journal of Applied Crystallography. 52 (5), 1022-1034 (2019).
  38. Dr Spine hub. , Available from: https://jugit.fz-juelich.de/nse/drspine (2022).
  39. Stadler, A. M., et al. Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), (2014).
  40. FZJ. , Available from: https://www.fz-juelich.de/portal/EN/AboutUs (2022).
  41. KWS2. , Available from: https://miz-garching.de/kws-2 (2022).
  42. Moorhouse, M., Barry, P. The protein databank. Bioinformatics Biocomputing and Perl. , (2005).
  43. Tria, G., Mertens, H. D. T., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (2), 207-217 (2015).
  44. Holderer, O., Monkenbusch, M., Schätzler, R., Kleines, H., Westerhausen, W., Richter, D. The JCNS neutron spin-echo spectrometer J-NSE at the FRM II. Measurement Science and Technology. 90 (4), 043107 (2008).
  45. Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D. Exploring internal protein dynamics by neutron spin echo spectroscopy. Soft Matter. 7 (4), 1299-1307 (2011).
  46. Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring. Scientific Reports. 6, 22148 (2016).
  47. Stadler, A. M., et al. Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein. Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6987-6994 (2014).
  48. Biehl, R., Richter, D. Slow internal protein dynamics in solution. Journal of Physics: Condensed Matter. 26 (50), 503103 (2014).
  49. Hinsen, K. The molecular modeling toolkit: A new approach to molecular simulations. Journal of Computational Chemistry. 21 (2), 79-85 (2000).
  50. Uhlenbeck, G. E., Ornstein, L. S. On the theory of the Brownian motion. Physical Review. 36 (5), 823 (1930).
  51. Wang, M. C., Uhlenbeck, G. E. On the theory of the Brownian motion II. Reviews of Modern Physics. 17, 323 (1945).
  52. Callaway, D. J. E., Bu, Z. Nanoscale protein domain motion and long-range allostery in signaling proteins-a view from neutron spin echo spectroscopy. Biophysical Reviews. 7 (2), 165-174 (2015).
  53. Liu, Y. Intermediate scattering function for macromolecules in solution probed by neutron spin echo. Physical Review E. 95, 020501 (2017).
  54. Liu, Y. Short-time dynamics of proteins in solutions studied by neutron spin echo. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 42, 147-156 (2019).

Tags

Mühendislik Sayı 182 Nötron saçılması nötron spin-ekosu protein çözümü yavaş dinamikler protein etki alanı hareketleri protein esnekliği
Nötron Spin Yankı Spektroskopisi <em>ile</em> Protein Dinamiğinin İncelenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stingaciu, L. R. Study of Protein… More

Stingaciu, L. R. Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy. J. Vis. Exp. (182), e61862, doi:10.3791/61862 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter