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Biochemistry

झिल्ली प्रोटीन को लक्षित करने वाले कार्यात्मक विश्लेषण और एंटीबॉडी विकास के लिए प्रोटियोलिपोसोम का सेल-मुक्त उत्पादन

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61871
Automatic Translation
1, 2
1Graduate School of Medicine, Ehime University, 2Proteo-Science Center, Ehime University

Summary

यह प्रोटोकॉल गेहूं सेल-मुक्त प्रणाली और लिपोसोम का उपयोग करके बाइलेयर-डायलिसिस विधि द्वारा उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटियोलिपोसोम के उत्पादन के लिए एक कुशल सेल-मुक्त विधि का वर्णन करता है। यह विधि झिल्ली प्रोटीन, दवा लक्ष्य स्क्रीनिंग और एंटीबॉडी विकास के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त साधन प्रदान करती है।

Abstract

झिल्ली प्रोटीन विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं में आवश्यक भूमिका निभाते हैं और महत्वपूर्ण कार्य करते हैं। दवा की खोज में झिल्ली प्रोटीन चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे सभी दवाओं के आधे से अधिक के लक्ष्य हैं। झिल्ली प्रोटीन के जैव रासायनिक, बायोफिज़िकल और संरचनात्मक अध्ययन के साथ-साथ एंटीबॉडी विकास के संचालन के लिए एक बाधा सही रचना और गतिविधि के साथ उच्च गुणवत्ता वाले झिल्ली प्रोटीन की बड़ी मात्रा का उत्पादन करने में कठिनाई रही है। यहां हम गेहूं के रोगाणु कोशिका-मुक्त प्रणाली, लिपोसोम और डायलिसिस कप का उपयोग करके एक "बाइलेयर-डायलिसिस विधि" का वर्णन करते हैं ताकि झिल्ली प्रोटीन को कुशलतापूर्वक संश्लेषित किया जा सके और उच्च सफलता दर के साथ कम समय में शुद्ध प्रोटियोलिपोसोम तैयार किया जा सके। झिल्ली प्रोटीन का उत्पादन कई मिलीग्राम में किया जा सकता है, जैसे जीपीसीआर, आयन चैनल, ट्रांसपोर्टर और टेट्रास्पैनिन। यह सेल-मुक्त विधि उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटियोलिपोसोम तैयार करने के लिए समय, लागत और प्रयास को कम करने में योगदान देती है, और झिल्ली प्रोटीन, दवा लक्ष्य स्क्रीनिंग और एंटीबॉडी विकास के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त साधन प्रदान करती है।

Introduction

मेम्ब्रेन प्रोटीन निदान और चिकित्सीय में सबसे महत्वपूर्ण दवा लक्ष्यों में से एक हैं। दरअसल, छोटे यौगिक दवाओं के लक्ष्य का आधा झिल्ली प्रोटीन है, जैसे जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) और आयन चैनल1। वर्षों से, शोधकर्ता उनकी संरचना और कार्य 2,3 को स्पष्ट करने के लिए झिल्ली प्रोटीन के जैव रासायनिक, बायोफिज़िकल और संरचनात्मक अध्ययन पर काम कर रहे हैं। झिल्ली प्रोटीन के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का विकास भी कार्यात्मक और संरचनात्मक अध्ययनों में तेजी लाने और चिकित्सीय और नैदानिक अनुप्रयोगों को विकसित करने के लिए सक्रिय रूप से किया जाता है। इन सभी अध्ययनों में उच्च गुणवत्ता वाले झिल्ली प्रोटीन की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होतीहै। उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी विकास के लिए प्राकृतिक रचना के साथ शुद्ध झिल्ली प्रोटीन के कई मिलीग्राम की आवश्यकता होती है। एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए अत्यधिक शुद्ध झिल्ली प्रोटीन की बहुत बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। हालांकि, झिल्ली प्रोटीन का बड़े पैमाने पर उत्पादन झिल्लीप्रोटीन अनुसंधान में एक बाधा बना हुआ है। झिल्ली प्रोटीन में एक या अधिक ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिकॉप्टरों के साथ जटिल संरचनाएं होती हैं और सेल होमियोस्टैसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। झिल्ली प्रोटीन के हेटरोलॉगस ओवरएक्प्रेशन से कई बाधाएं होती हैं जैसे कि झिल्ली प्रोटीन का एकत्रीकरण जो उच्च स्थानीय सांद्रता या सेलुलर सिग्नल मार्गों की गड़बड़ी पर जमा होता है। यहां तक कि अगर अभिव्यक्ति सफल होती है, तो नमूना तैयार करने के बाद के चरणों को भी कठिनाई का सामना करना पड़ता है। उदाहरण के लिए, प्रोटिओलिपोसोम की तैयारी के लिए झिल्ली प्रोटीन के घुलनशीलता, शुद्धिकरण और स्थिरीकरण में उच्च-स्तरीय कौशल और पेशेवर अनुभवों की आवश्यकता होती है, औरइसमें बहुत प्रयास और समय लगता है।

दूसरी ओर, हाल के दशकों में जीवित कोशिकाओं के उपयोग के बिना प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए कुछ उन्नत प्रौद्योगिकियां उभरी हैं 14,15,16,17,18। सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण तकनीक एक टेस्ट ट्यूब में अनुवाद प्रतिक्रिया का पुनर्गठन करती है। चूंकि सेलुलर अभिव्यक्ति प्रणाली की कोई सीमा नहीं है, इसलिए सेल-मुक्त प्रणालियों में विभिन्न प्रकार के प्रोटीनों को संश्लेषित करने की क्षमता होती है जो कोशिकाओं में विषाक्तता को व्यक्त करना या दिखाना मुश्किल होता है। शुद्ध सेल अर्क या पुनर्गठित ट्रांसलेशनल मशीनरी को टेम्पलेट एमआरएनए, अमीनो एसिड और ऊर्जा स्रोतों के साथ मिलाया जाता है, और पुनः संयोजक प्रोटीन को थोड़े समय में संश्लेषित किया जाता है। झिल्ली प्रोटीन संश्लेषण के संबंध में, लिपिड या एम्फीफाइल से बने कुछ प्रकार के मचान, जैसे लिपोसोम, बिसेल, नैनोडिस्क, या कॉपोलिमर को सेल-मुक्त प्रतिक्रिया 19,20,21,22,23,24 में जोड़ा जाता है। संश्लेषित झिल्ली प्रोटीन मचानों के साथ बातचीत करते हैं और पानी में स्थिर हो सकते हैं। सेल-मुक्त संश्लेषित झिल्ली प्रोटीन का व्यापक रूप से कार्यात्मक अध्ययन और एंटीबॉडी उत्पादन में उपयोग किया जाता है 25,26,27,28,29,30,31।

इस प्रोटोकॉल में, हम गेहूं सेल-मुक्त प्रणाली और लिपोसोम का उपयोग करके प्रोटिओलिपोसोम उत्पादन की एक कुशल सेल-मुक्त विधि का वर्णन करते हैं। गेहूं कोशिका-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रणाली गेहूं के रोगाणु 15,32,33 से अर्क का उपयोग करके एक शक्तिशाली इन विट्रो अनुवाद प्रणाली है। गेहूं के रोगाणु में बड़ी मात्रा में ट्रांसलेशनल मशीनरी और कुछ अनुवाद अवरोधक होते हैं। गेहूं में ट्रांसलेशनल मशीनरी, यूकेरियोट्स का एक सदस्य, यूकेरियोटिक प्रोटीन का अनुवाद करने के लिए उपयुक्त है, और इसकी अनुवाद दक्षता शायद ही टेम्पलेट एमआरएनए के कोडन उपयोग से प्रभावित होती है। गेहूं कोशिका-मुक्त प्रणाली का उपयोग करते हुए, हमने प्रोटीन किनेसेस34,35, यूबिकिटिन लिगेस 36, प्रतिलेखन कारक37 और उच्च सफलता दर वाले झिल्ली प्रोटीन सहित विभिन्न प्रकार केप्रोटीनों को संश्लेषित किया है। झिल्ली प्रोटीन उत्पादन के लिए, हम पाड़19,38 के रूप में अनुवाद मिश्रण में लिपिड पुटिका लिपोसोम जोड़ते हैं। झिल्ली प्रोटीन के हाइड्रोफोबिक डोमेन लिपिड बाइलेयर के साथ बातचीत करते हैं और अनायास लिपोसोम के साथ एकीकृत होते हैं। घनत्व प्रवणता सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग अंतर्जात गेहूं प्रोटीन से प्रोटिओलिपोसोम को सख्ती से अलग करने के लिए किया जाता है, भले ही अनुवाद प्रतिक्रिया मिश्रण का एक सामान्य सेंट्रीफ्यूजेशन प्रोटिओलिपोसोम20 के सरल शुद्धिकरण के लिए पर्याप्त हो। गेहूं कोशिका-मुक्त प्रणाली का उपयोग करके कई प्रकार के अभिन्न झिल्ली प्रोटीन को संश्लेषित किया गया है और विभिन्न शोधों और विकास के लिए लागू कियागया है 25,38,39,40,41,42,43,44। इसके अलावा, हमने बड़े पैमाने पर उत्पादन45,46 के लिए "बाइलेयर-डायलिसिस विधि" विकसित की। इस विधि में, कप-प्रकार डायलिसिस डिवाइस को सब्सट्रेट फीडिंग बफर में डुबोया जाता है, और कप में अनुवाद प्रतिक्रिया मिश्रण और सब्सट्रेट फीडिंग बफर की दो परतें बनती हैं जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। सब्सट्रेट्स की निरंतर आपूर्ति और उपोत्पाद को हटाने को लंबे समय तक प्रतिक्रिया मिश्रण के शीर्ष और निचले दोनों पर कुशलतापूर्वक आयोजित किया जा सकता है, जिससे उत्कृष्ट अनुवाद प्रभावकारिता (चित्रा 2 ए और चित्रा 2 बी) 45 होती है।

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Protocol

1. पीईयू अभिव्यक्ति प्लास्मिड की तैयारी

नोट: पीईयू अभिव्यक्ति प्लास्मिड में स्टार्ट कोडन, लक्ष्य झिल्ली प्रोटीन का ओपन रीडिंग फ्रेम और टुकड़े में स्टॉप कोडन शामिल होना चाहिए ( चित्रा 1 देखें)। आवश्यकता पड़ने पर उपयुक्त स्थिति में पहचान /शुद्धिकरण टैग अनुक्रम जोड़ें। या तो प्रतिबंध एंजाइम पाचन या निर्बाध क्लोनिंग सबक्लोनिंग के लिए लागू है। यहां हम एक सहज क्लोनिंग विधि का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

  1. डीएनए टुकड़ा डालें तैयार करें।
    1. सीडीएनए टेम्पलेट, प्राइमर 1 और प्राइमर 2 का उपयोग करके पीसीआर द्वारा रुचि के जीन को बढ़ाएं। प्राइमर 1 और प्राइमर 2 में क्रमशः निर्बाध क्लोनिंग के लिए 15 बीपी ओवरलैप होते हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: कोशिकाओं में परिपक्व प्रोटीन (जैसे, सिग्नल अनुक्रम) से संसाधित और हटाए जाने वाले अनुक्रमों को शामिल न करें। संश्लेषित प्रोटीन का प्रसंस्करण गेहूं सेल-मुक्त प्रणाली में नहीं किया जाता है। Kozak अनुक्रम न जोड़ें. पीईयू-ई01-एमसीएस वेक्टर में ई01 अनुवाद बढ़ाने वाला है।
    2. टेम्पलेट प्लास्मिड डीएनए को हटाने के लिए पीसीआर उत्पाद में डीपीएनआई प्रतिबंध एंजाइम की 1/25 मात्रा जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करने और 20-50 एनजी / μL पर एकाग्रता को समायोजित करने के लिए पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करें।
  2. पीईयू-ई01-एमसीएस वेक्टर को रैखिक बनाएं।
    1. पीईयू-ई01-एमसीएस, प्राइमर 3 और प्राइमर 4 का उपयोग करके व्युत्क्रम पीसीआर का संचालन करें।
    2. व्युत्क्रम पीसीआर उत्पाद में डीपीएनआई प्रतिबंध एंजाइम की 1/25 मात्रा जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. निर्माता की सिफारिश के अनुसार पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करने के लिए पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करें। एकाग्रता को 20-50 ng/μL पर समायोजित करें।
  3. डीएनए टुकड़े के 2 μL, रैखिक वेक्टर के 2 μL, और 2x सहज क्लोनिंग एंजाइम मिश्रण के 4 μL मिलाएं।
  4. सहज क्लोनिंग उत्पाद के साथ एस्चेरिचिया कोलाई स्ट्रेन जेएम 109 को बदलें। स्प्रेडर का उपयोग करके, एलबी-एम्पीसिलीन एगर प्लेट पर बैक्टीरियल सस्पेंशन फैलाएं।
    नोट: पीईयू वेक्टर में एक एम्पीसिलीन प्रतिरोध मार्कर है।
  5. क्रमशः पीईयू प्लास्मिड में एमसीएस के 5 ' और 3 ' साइड से प्राइमर 5 और प्राइमर 6 का उपयोग करके निर्मित अभिव्यक्ति प्लास्मिड के अनुक्रम की पुष्टि करें।
  6. अभिव्यक्ति प्लास्मिड को बढ़ाना और शुद्ध करना।
    1. प्लास्मिड-रूपांतरित ई कोलाई स्ट्रेन जेएम 109 को एलबी-एम्पीसिलीन माध्यम के 150 एमएल में 37 डिग्री सेल्सियस और 125 स्ट्रोक प्रति मिनट रात भर हिलाता है।
    2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लास्मिड प्रेप मिडी किट का उपयोग करके प्लास्मिड को निकालें और शुद्ध करें। टीई बफर के 500 μL में प्लास्मिड को भंग करें।
      सावधानी: प्लास्मिड निष्कर्षण के लिए मिनी प्रेप किट का उपयोग न करें। यह प्लास्मिड की पर्याप्त गुणवत्ता और मात्रा प्रदान नहीं करता है।
    3. फिनोल /क्लोरोफॉर्म / आइसोमिल अल्कोहल के 500 μL जोड़ें (25: 24: 1)। 5 मिनट के लिए जोर से मिलाएं, और 17,800 x g और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। ऊपरी प्लास्मिड समाधान को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      सावधानी: फिनोल और क्लोरोफॉर्म से त्वचा की रक्षा के लिए डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें।
      नोट: प्लास्मिड निष्कर्षण किट से आरएनएस के संदूषण को हटाने के लिए, फिनोल-क्लोरोफॉर्म शुद्धिकरण का उपयोग करके प्लास्मिड को शुद्ध करें।
    4. फिनोल को पूरी तरह से हटाने के लिए क्लोरोफॉर्म के 500 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए जोर से मिलाएं, और 17,800 x g और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। ऊपरी प्लास्मिड समाधान को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. इथेनॉल की 2.5 मात्रा और 7.5 एम अमोनियम एसीटेट की 1/8 मात्रा जोड़ें, और 1 घंटे के लिए -30 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 17,800 x g पर। 70% इथेनॉल के 500 μL के साथ गोली धो लें। सतह पर तैरने वाले को सावधानी से निकालें और गोली को सूखने के लिए 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
    7. अल्ट्राप्योर पानी के 100 μL में अभिव्यक्ति प्लास्मिड को पूरी तरह से भंग करें। 260 एनएम पर अवशोषण के साथ प्लास्मिड की एकाग्रता को मापें। एकाग्रता को 1 मिलीग्राम / एमएल में समायोजित करें।

2. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन

सावधानी: प्रतिलेखन और अनुवाद के चरणों में DNase और न्यूक्लियस-मुक्त प्लास्टिक ट्यूब और युक्तियों का उपयोग करें। संदूषण को रोकने के लिए प्लास्टिक के माल को ऑटोक्लेव करने से बचें।

  1. एक नई प्लास्टिक ट्यूब में अल्ट्राप्योर पानी काटें।
    सावधानी: डीईपीसी-उपचारित पानी का उपयोग न करें क्योंकि अवशिष्ट डीईपीसी प्रतिक्रिया को दृढ़ता से रोकता है। प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए ताजा शुद्ध अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करें।
  2. 115.2 μL अल्ट्राप्योर पानी, 40 μL ट्रांसक्रिप्शन बफर LM, NTP मिश्रण के 20 μL, 80 U/μL RNase इनहिबिटर के 2.4 μL, 80 U/μL SP6 पोलीमरेज़ के 2.4 μL और 1 mg/mL pEU अभिव्यक्ति प्लास्मिड के 20 μL को मिलाकर ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। अभिकर्मकों को धीरे-धीरे इनवर्ट करके मिलाएं। एक त्वरित स्पिन प्रदर्शन करें।
  3. 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिलेखन प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
  4. प्रतिक्रिया को धीरे-धीरे मिलाएं और जल्दी से नीचे घुमाएं। अनुवाद के लिए इसे तुरंत उपयोग करें, अन्यथा -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज और स्टोर करें।
  5. वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रतिलेखन उत्पाद की पुष्टि करें।
    1. 1x TAE बफर के 100 एमएल और 1 ग्राम अगारोस मिलाएं। 1% अगारोस टीएई जेल तैयार करने के लिए माइक्रोवेव ओवन में निलंबन गर्म करें।
    2. प्रतिलेखन प्रतिक्रिया का 1 μL लें और 3 μL पानी और 4 μL 2x लोडिंग डाई के साथ मिलाएं।
      नोट: आरएनए के विकृतीकरण की आवश्यकता नहीं है।
    3. मिश्रण के 4 μL और 2 μL डीएनए सीढ़ी मार्कर को Agarose TAE जेल में लोड करें।
    4. 20 मिनट के लिए 100 वोल्ट पर वैद्युतकणसंचलन।
    5. जेल को 30 मिनट के लिए एथिडियम ब्रोमाइड में दाग दें। यूवी ट्रांसिल्युमिनेटर और जेल इमेजर का उपयोग करके एमआरएनए के सीढ़ी बैंड पैटर्न की जांच करें।
      नोट: जब 500 बीपी से कम का एक स्मीयर बैंड देखा जाता है, तो एमआरएनए गिरावट का संदेह होता है।

3. अनुवाद के लिए सामग्री की तैयारी

  1. अनुवाद बफर तैयार करें।
    1. 50 एमएल ट्यूब में क्रमशः एस 1, एस 2, एस 3 और एस 4 के लिए प्रत्येक 40 एक्स स्टॉक समाधान के 27 एमएल ताजा तैयार अल्ट्राप्योर पानी और 0.75 एमएल मिलाएं।
      नोट: 1x अनुवाद बफर की अंतिम आवश्यक मात्रा के अनुसार सामग्री की मात्रा को संशोधित करें।
      सावधानी: उपयोग के बाद अतिरिक्त 1x अनुवाद बफर को संग्रहीत या पुन: फ्रीज न करें।
  2. क्रिएटिन काइनेज स्टॉक समाधान तैयार करें। अल्ट्राप्योर पानी में लियोफिलाइज्ड क्रिएटिन किनेज को 20 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता में घोलें। 0.2 एमएल 8-स्ट्रिप पीसीआर ट्यूबों में समाधान को छोटी मात्रा (प्रत्येक 10 से 50 μL) में वितरित करें। तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों को फ्रीज करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    सावधानी: पिघलने के बाद क्रिएटिन किनेज समाधान को फिर से फ्रीज न करें।
  3. डायलिसिस झिल्ली से ग्लिसरॉल को हटाने के लिए डायलिसिस कप (0.1 एमएल आकार) धोएं।
    नोट: कई अलग-अलग आकार के डायलिसिस कप हैं। छोटे आकार के कप (0.1 एमएल) का उपयोग क्रमशः छोटे पैमाने पर परीक्षण (खंड 5.4) के लिए किया जाता है, और बड़े आकार के कप (2 एमएल) क्रमशः बड़े पैमाने पर उत्पादन (खंड 5.5) के लिए किया जाता है। बड़े आकार के कप के डायलिसिस झिल्ली के धोने का चरण टाला जा सकता है।
    1. एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में 1 एमएल अल्ट्राप्योर पानी डालें। ट्यूब में छोटे आकार का डायलिसिस कप (0.1 एमएल) डालें। कप में 0.5 एमएल अल्ट्राप्योर पानी डालें।
    2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट से अधिक समय के लिए इनक्यूबेट करें।

4. लिपोसोम की तैयारी

नोट: यहां हम लिपोसोम की तैयारी के लिए दो प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एक रेडी-टू-यूज़ लियोफिलाइज्ड लिपोसोम्स (सेक्शन 4.1) का उपयोग करता है, जबकि दूसरा एक पतली लिपिड फिल्म (सेक्शन 4.2) को हाइड्रेट करके लिपोसोम का उत्पादन करता है।

  1. लियोफिलाइज्ड लिपोसोम का उपयोग करके लिपोसोम तैयार करें।
    नोट: प्रोटियोलिपोसोम का उत्पादन करने का एक आसान तरीका व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसोलेक्टिन लिपोसोम का उपयोग करना है। एसोलेक्टिन सोयाबीन से निकाला जाने वाला एक प्रकार का प्राकृतिक लिपिड है।
    1. 10 मिलीग्राम लियोफिलाइज्ड एसोलेक्टिन लिपोसोम्स वाली शीशी खोलें (सामग्री की तालिका देखें) और शीशी के निचले भाग में 200 μL अनुवाद बफर (खंड 3.1) जोड़ें। शीशी को सील करें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. शीशी को 1 मिनट के लिए भंवर-मिक्सर पर डालकर जोर से मिलाएं।
    3. शीशी को 50 एमएल ट्यूब में डालें। 1 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके ट्यूब को नीचे घुमाएं।
    4. पिपेट का उपयोग करके, एसोलेक्टिन लिपोसोम निलंबन (50 मिलीग्राम लिपिड / एमएल) को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। अनुवाद के लिए तुरंत लिपोसोम का उपयोग करें, अन्यथा तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. एक पतली लिपिड फिल्म को हाइड्रेट करके लिपोसोम तैयार करें।
    1. यदि एक लिपिड पाउडर के रूप में बेचा जाता है, तो क्लोरोफॉर्म या उपयुक्त कार्बनिक विलायक में 10-100 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता में घुल ें।
      नोट: शुद्ध और / या संश्लेषित एम्फीफिलिक लिपिड का उपयोग करके एक पतली लिपिड फिल्म तैयार की जा सकती है। एसोलेक्टिन की शुद्धि विधि पहले38 वर्णित है। कार्यात्मक रूप से संशोधित लिपिड, जैसे बायोटिनिलेटेड लिपिड, फ्लोरोसेंट लिपिड और सहायक लिपिड, कार्यात्मक लिपोसोम का उत्पादन करने के लिए बेसल लिपिड में जोड़ा जा सकता है।
    2. 50 मिलीग्राम लिपिड युक्त लिपिड समाधान को वाष्पीकरण फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
    3. एक रोटरी बाष्पीकरणकर्ता का उपयोग करके, विलायक को वाष्पित करें और लिपिड की एक पतली फिल्म बनाने के लिए फ्लास्क तल की दीवार पर समान रूप से लिपिड फैलाएं।
    4. फ्लास्क को वैक्यूम डेसिकेटर में डालें और विलायक को पूरी तरह से हटाने के लिए रात भर नकारात्मक दबाव में छोड़ दें।
    5. वाष्पीकरण फ्लास्क में 1 एमएल अनुवाद बफर जोड़ें। पतली लिपिड फिल्म पर बफर फैलाने के लिए फ्लास्क को घुमाएं। फिल्म को हाइड्रेट करने के लिए 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. फ्लास्क को अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र या अल्ट्रासोनिक क्लीनर के साथ सोनिकेट करें। समाधान को फिल्म को अच्छी तरह से छूने की अनुमति देने के लिए कभी-कभी फ्लास्क के कोण को बदलें। सुनिश्चित करें कि पतली लिपिड फिल्म को नीचे से छील दिया गया है और पूरी तरह से और समरूप रूप से इमल्सीफाई किया गया है।
      नोट: लिपोसोम युक्त बायोटिनाइलेटेड लिपिड का इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ चित्रा 1 में दिखाया गया है।
    7. लिपोसोम निलंबन (50 मिलीग्राम लिपिड / एमएल) को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। यदि इसका उपयोग तुरंत नहीं किया जाना है, तो लिपोसोम को तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. इन विट्रो अनुवाद

  1. कुछ मिनटों के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों को पानी पर तैरकर गेहूं के रोगाणु के अर्क को जल्दी से पिघलाएं। पिघलने के बाद, तुरंत ट्यूबों को मोड़कर धीरे से मिलाएं, नीचे घुमाएं, और उपयोग होने तक बर्फ पर ठंडा करें।
    नोट: उपयोग के बाद तरल नाइट्रोजन में गेहूं के रोगाणु निकालने को फ्रीज करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यह कई फ्रीज / पिघलना चक्रों का सामना करता है।
  2. 20 मिलीग्राम / एमएल क्रिएटिन किनेज स्टॉक समाधान को पिघलाएं। 2 मिलीग्राम / एमएल क्रिएटिन किनेज वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करने के लिए 5 μL स्टॉक समाधान और 45 μL ट्रांसलेशन बफर मिलाएं।
    सावधानी: क्रिएटिन किनेज को फिर से फ्रीज करने की सिफारिश नहीं की जाती है।
  3. आवश्यकता पड़ने पर लिपोसोम या एमआरएनए को पिघलाएं।
  4. एक छोटे पैमाने पर प्रोटीन अनुवाद का संचालन करें।
    1. चरण 3.3.2 में तैयार किए गए ट्यूब और डायलिसिस कप (0.1 एमएल) दोनों से पानी निकालें।
    2. ट्यूब और डायलिसिस कप में क्रमशः 1 एमएल और 300 μL ट्रांसलेशन बफर इंजेक्ट करें।
      चेतावनी: यदि डायलिसिस कप का निचला भाग 1.5 एमएल ट्यूब में अनुवाद बफर की सतह तक नहीं पहुंचता है, तो ट्यूब में अतिरिक्त 50-100 μL बफर इंजेक्ट करें।
    3. अनुवाद बफर के 15.6 μL, 2 mg/mL क्रिएटिन काइनेज के 2.4 μL, 50 mg/mL लिपोसोम्स के 12 μL, गेहूं के रोगाणु निकालने के 15 μL और mRNA के 15 μL को मिलाकर अनुवाद प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। ट्यूबों को मोड़कर धीरे से मिलाएं, और नीचे घूमें।
    4. 200 μL पिपेट का उपयोग करके अनुवाद प्रतिक्रिया मिश्रण का 60 μL.
    5. डायलिसिस कप में अनुवाद बफर के नीचे की सतह में पिपेट टिप डालें। प्रतिक्रिया मिश्रण को धीरे-धीरे और धीरे से बाहर निकालें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए डायलिसिस कप को ढक्कन के साथ कवर करें।
      नोट: प्रतिक्रिया मिश्रण स्वाभाविक रूप से कप के तल पर डूब जाता है और एक बाइलेयर बनाता है। कप को मिलाकर या हिलाकर बाइलेयर को परेशान न करें।
  5. बड़े पैमाने पर अनुवाद का संचालन करें (चित्रा 1)।
    1. 25 एमएल ट्यूब में 22 एमएल अनुवाद बफर डालें। ट्यूब में एक बड़े आकार का डायलिसिस कप (2 एमएल) डालें और कप में 2 एमएल अनुवाद बफर जोड़ें।
    2. ट्रांसलेशन बफर के 130 μL, 2 mg/mL क्रिएटिन काइनेज के 20 μL, 50 mg/mL लिपोसोम के 100 μL, गेहूं के रोगाणु निकालने के 125 μL और mRNA के 125 μL को मिलाकर एक अनुवाद प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। पाइपिंग द्वारा धीरे से मिलाएं।
    3. 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके सभी अनुवाद प्रतिक्रिया मिश्रण (500 μL) को एस्पिरेटेड करें। डायलिसिस कप में अनुवाद प्रतिक्रिया मिश्रण को उसी तरह इंजेक्ट करें जैसे चरण 5.4.5 में वर्णित है। वाष्पीकरण को रोकने के लिए डायलिसिस कप को ढक्कन के साथ कवर करें।
  6. 24 घंटे के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें।
  7. पाइपिंग द्वारा डायलिसिस कप में प्रतिक्रिया को अच्छी तरह से मिलाएं। कच्चे प्रोटिओलिपोसोम निलंबन को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: छोटे पैमाने पर अनुवाद से प्रोटिओलिपोसोम एकत्र करने के लिए एक फ्लैट-बॉटम 1.5 एमएल ट्यूब की सिफारिश की जाती है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, लिपोसोम ट्यूब के निचले कोने पर कॉम्पैक्ट और आसानी से दिखाई देने वाली गोली बनाते हैं।

6. प्रोटियोलिपोसोम का शुद्धिकरण

  1. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 17,800 x g पर कच्चे प्रोटिओलिपोसोम निलंबन युक्त ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. सतह पर तैरने वाले को हटा दें। पिपेटिंग द्वारा पीबीएस (छोटे पैमाने पर: 1 एमएल, बड़े पैमाने: 10 एमएल) में प्रोटिओलिपोसोम गोली को निलंबित करें।
  3. अन्य दो वृत्तों के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन और प्रोटियोलिपोसोम को धोने को दोहराएं।
  4. धोने के बाद, पीबीएस की थोड़ी मात्रा जोड़ें और पिपेटिंग द्वारा प्रोटियोलिपोसोम गोली को अच्छी तरह से फिर से निलंबित करें। माइक्रो पिपेट का उपयोग करके निलंबन की मात्रा को मापें। वॉल्यूम को 60 μL (छोटे पैमाने) या 500 μL (बड़े पैमाने) में समायोजित करने के लिए PBS जोड़ें। निलंबन को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. एसडीएस-पेज के लिए एक नई पीसीआर ट्यूब में प्रोटियोलिपोसोम निलंबन के 10 μL स्थानांतरित करें। जब आवश्यक हो तो उपयोग के लिए शेष नमूनों को छोटे भागों में विभाजित करें। तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. एसडीएस-पेज और सीबीबी धुंधला

  1. प्रोटियोलिपोसोम सस्पेंशन के 10 μL में 70 μL पानी और 3x SDS-PAGE नमूना बफर का 40 μL जोड़ें।
    चेतावनी: एसडीएस-पेज नमूने को उबालें, क्योंकि झिल्ली प्रोटीन एकत्रित होते हैं, और वैद्युतकणसंचलन में एक्रिलामाइड जेल में मुश्किल से प्रवेश करते हैं। इसके अलावा, ऑक्सीकरण को रोकने के लिए एसडीएस-पेज नमूना बफर (जैसे, 3% अंतिम एकाग्रता पर 2-मर्काप्टोएथेनॉल) में पर्याप्त कम करने वाला एजेंट जोड़ें।
  2. वैद्युतकणसंचलन कक्ष में 5% -20% ढाल एसडीएस-पेज जेल सेट करें। लोड 3 μL, 6 μL, 12 μL प्रोटीओलिपोसोम नमूने, प्रोटीन आकार मार्कर के 2 μL, और बीएसए मानक श्रृंखला भी।
  3. 52 mA पर वैद्युतकणसंचलन, 30 मिनट के लिए 400 V।
  4. जेल को 1 घंटे के लिए सीबीबी डाई के साथ दाग दें। गर्म पानी में रंग कम करें और जेल छवि को स्कैन करें।
  5. एनआईएच इमेज जे सॉफ्टवेयर (https://imagej.nih.gov/ij/) का उपयोग करके, प्रत्येक लेन में झिल्ली प्रोटीन की बैंड तीव्रता को निर्धारित करें। बीएसए मानक श्रृंखला के साथ संश्लेषित झिल्ली प्रोटीन की मात्रा का अनुमान लगाएं।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, आंशिक रूप से शुद्ध प्रोटियोलिपोसोम कम समय में प्राप्त किए जा सकते हैं। प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 ए में दिखाए गए हैं। क्लास ए, बी और सी के पच्चीस जीपीसीआर को बाइलेयर-डायलिसिस विधि (छोटे पैमाने) का उपयोग करके सफलतापूर्वक संश्लेषित किया गया और सेंट्रीफ्यूजेशन और बफर वॉश द्वारा आंशिक रूप से शुद्ध किया गया। यद्यपि संश्लेषित प्रोटीन की मात्रा प्रोटीन के प्रकार के अनुसार भिन्न होती है, 50 से 400 μg झिल्ली प्रोटीन आमतौर पर बड़े डायलिसिस कप का उपयोग किए जाने पर प्रति प्रतिक्रिया संश्लेषित किया जा सकता है। गेहूं कोशिका-मुक्त प्रणाली की उच्च मापनीयता के कारण प्रतिक्रियाओं की संख्या में वृद्धि करके झिल्ली प्रोटीन के कई मिलीग्राम आसानी से उत्पादित किए जा सकते हैं। एक छोटे डायलिसिस कप का उपयोग करके एक पूर्व-परीक्षण बाइलेयर-डायलिसिस विधि में लक्ष्य प्रोटीन की उत्पादन प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए पर्याप्त है। प्राप्त उत्पादकता के अनुसार, बड़े डायलिसिस कप का उपयोग करके उत्पादित किए जाने वाले लक्ष्य प्रोटीन की मात्रा का अनुमान लगाया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल झिल्ली प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त है, विशेष रूप से कई ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिकॉप्टरों वाले लोगों के लिए। ज्यादातर मामलों में, तीन या अधिक ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिकॉप्टरों वाले झिल्ली प्रोटीन आसानी से संश्लेषण के बाद प्रोटियोलिपोसोम में शामिल हो जाते हैं (चित्रा 2 बी), जो प्रोटियोलिपोसोम की अच्छी उत्पादकता बनाता है। एकल-ट्रांसमेम्ब्रेन-हेलिक्स प्रोटीन आमतौर पर आसानी से संश्लेषित होते हैं; हालांकि, वे छोटे हाइड्रोफोबिक क्षेत्र के कारण लिपोसोम में शायद ही एकीकृत होते हैं। दो ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिकॉप्टरों वाले प्रोटीन के बारे में, चाहे वे लिपोसोम से जुड़े हों या नहीं, यह उनके ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिकॉप्टरों के उजागर होने के तरीके पर निर्भर करता है।

संश्लेषित प्रोटियोलिपोसोम को सरल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया जाता है, और आंशिक रूप से वाशिंग बफर के साथ शुद्ध किया जाता है, जो झिल्ली प्रोटीन की शुद्धि प्रक्रिया को बहुत कम कर देता है। यद्यपि जैविक झिल्ली और झिल्ली प्रोटीन दोनों को गेहूं के रोगाणु के अर्क से पहले हटा दिया गया है, गेहूं प्रोटीन की छोटी मात्रा कभी-कभी लिपोसोम या झिल्ली प्रोटीन संश्लेषित (चित्रा 2 ए) से बंधकर सह-अवक्षेपित होती है। इस तरह के प्रोटीन दूषित पदार्थों को सरल सेंट्रीफ्यूजेशन और बफर वॉश द्वारा हटाना मुश्किल है। जब एक अत्यधिक शुद्ध झिल्ली प्रोटीन की आवश्यकता होती है, तो आंशिक रूप से शुद्ध प्रोटियोलिपोसोम को सर्फेक्टेंट के साथ घुलनशील करना और कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा उन्हें शुद्ध करना आवश्यक होता है।

Figure 1
चित्रा 1: सेल मुक्त प्रोटियोलिपोसोम उत्पादन की योजना। एसपी 6, एसपी 6 प्रमोटर अनुक्रम; E01, E01 अनुवाद बढ़ाने वाला अनुक्रम; एएमपीआर, एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन; डीटीटी, डिथियोथ्रेइटोल। इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ लिपोसोम युक्त बायोटिनाइलेटेड लिपिड के इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग को दर्शाता है। बार, 0.2 μm. यह इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ छवि टाकेडा एट अल, 2015 45 में चित्रा 1 डी से थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: बाइलेयर-डायलिसिस विधि द्वारा प्रोटिओलिपोसोम उत्पादन के प्रतिनिधि परिणाम। (A) सेल-मुक्त संश्लेषित GPCRs की SDS-PAGE छवि पच्चीस चयनित GPCR को बाइलेयर-डायलिसिस विधि द्वारा संश्लेषित किया गया था। प्रोटियोलिपोसोम को आंशिक रूप से शुद्ध किया गया और एसडीएस-पेज और सीबीबी धुंधला करने पर लागू किया गया। एरोहेड लक्ष्य जीपीसीआर को इंगित करते हैं(बी) विभिन्न अनुवाद विधियों के बीच झिल्ली प्रोटीन प्रस्तुतियों की तुलना। डोपामाइन रिसेप्टर डी 1 (डीआरडी 1) प्रोटीन को क्रमशः गेहूं के रोगाणु निकालने, लिपोसोम और एमआरएनए के समान अनुपात में प्रत्येक विधि द्वारा संश्लेषित किया गया था। डीआरडी 1 प्रोटिओलिपोसोम को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा आंशिक रूप से शुद्ध किया गया था, और एसडीएस-पेज और सीबीबी धुंधला होने के अधीन किया गया था। (ग) डीआरडी1-बायोटिन/लिपोसोम कॉम्प्लेक्स की इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग। डीआरडी 1 को बीआरए बायोटिन लिगेज द्वारा एंजाइमेटिक रूप से बायोटिनिलेटेड किया गया था। बार, 0.2 μm. खाली तीर के निशान लिपोसोम पर डीआरडी 1-बायोटिन का संकेत देते हैं। इस आंकड़े को टाकेडा एट अल, 2015 45 में चित्रा 1 से संशोधित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: कार्यात्मक प्रोटियोलिपोसोम का अनुप्रयोग। (ए) सहायक लिपिड युक्त प्रोटिओलिपोसोम का टीकाकरण। (बी) बायोटिनिलेटेड लिपोसोम-आधारित इंटरैक्शन परख (बीआईएलआईए)। अल्फास्क्रीन द्वारा झिल्ली प्रोटीन और एंटी-मेम्ब्रेन प्रोटीन एंटीबॉडी के बीच बातचीत का पता लगाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल उच्च सफलता दर पर झिल्ली प्रोटीन के उत्पादन की एक विधि प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल सरल, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और स्केल करने में आसान है। इसमें उन प्रयोगों के समय और लागत को कम करने की क्षमता भी है जो बड़ी मात्रा में झिल्ली प्रोटीन का उपभोग करते हैं। बाइलेयर-डायलिसिस विधि बाईलेयर विधि या डायलिसिस विधि (चित्रा 2 बी) 45 की तुलना में उत्पादकता में 4-10 गुना सुधार करती है। एक चरम मामले में, एक आयन चैनल और एक ट्रांसपोर्टर की उपज क्रमशः 30 और 20 गुना बढ़ गई, बाईलेयर विधि की तुलना में बाईलेयर-डायलिसिस विधि के साथ (डेटा नहीं दिखाया गया)। इस प्रोटोकॉल की उच्च उत्पादकता टीकाकरण के लिए एंटीजन उत्पादन में एक लाभ है। प्रोटियोलिपोसोम का उपयोग अक्सर एंटी-मेम्ब्रेन प्रोटीन एंटीबॉडी के विकास के लिए एंटीजन को प्रतिरक्षित करने के रूप में किया जाता है। प्रोटियोलिपोसोम में अत्यधिक केंद्रित और शुद्ध झिल्ली प्रोटीन प्रभावी रूप से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को उत्तेजित करते हैं और एंटीबॉडी41,47 को प्रेरित करते हैं। इस बाइलेयर-डायलिसिस विधि का उपयोग करके, टीकाकरण उद्देश्य के लिए कई मिलीग्राम झिल्ली प्रोटीन ले जाने वाले प्रोटियोलिपोसोम को आसानी से कुछ दिनों में तैयार किया जा सकता है। दरअसल, हमारे समूह ने इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके जीपीसीआर, आयन चैनलों और क्लॉडिन को संश्लेषित किया है और उनके खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी प्राप्त करने के लिए उत्पादों के साथ चूहों को प्रतिरक्षित किया है। प्राप्त कुछ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को कार्यात्मक एंटीबॉडी के रूप में सत्यापित किया गया था, जैसे कि उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी, अनुरूपता-संवेदनशील एंटीबॉडी, फ्लो साइटोमेट्री लागू एंटीबॉडी और निरोधात्मक एंटीबॉडी, जो इंगित करता है कि यह प्रोटोकॉल कार्यात्मक रूप से सही अनुरूपता के साथ झिल्ली प्रोटीन का उत्पादन करने में सक्षम है।

इस प्रोटोकॉल का एक और आकर्षक लाभ प्रोटियोलिपोसोम के उत्पादन की अनुमति देना है जिन्हें संशोधित लिपिड का उपयोग करके विशिष्ट कार्य सौंपे जाते हैं, जैसे कि बायोटिनिलेटेड लिपिड, फ्लोरोसेंट लिपिड, या सहायक लिपिड। विशिष्ट कार्यों के साथ तैयार प्रोटियोलिपोसोम उपयोगी हैं और प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू होते हैं। उदाहरण के लिए, सहायक लिपिड युक्त प्रोटियोलिपोसोम, जैसे लिपिड ए48 या मोनोफॉस्फोरिल लिपिड ए (एमपीएलए)49, एंटीजन को सुविधाजनक प्रतिरक्षित करते हैं, क्योंकि उन्हें इमल्शन के बिना चूहों को प्रतिरक्षित करने के लिए सीधे प्रशासित किया जा सकता है। सहायक लिपिड मेजबान जानवरों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावी ढंग से उत्तेजित करते हैं, लक्ष्य झिल्ली प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी को प्रेरित करते हैं (चित्रा 3 ए)। दरअसल, हमने एमपीएलए युक्त प्रोटियोलिपोसोम31 के साथ चूहों को प्रतिरक्षित करके प्रवाह साइटोमेट्री लागू एंटीबॉडी को सफलतापूर्वक प्रेरित किया है। इसके अलावा, बायोटिनिलेटेड लिपिड से तैयार प्रोटियोलिपोसोम स्क्रीनिंग परख के लिए आदर्श जांच हैं। हमने बायोटिनिलेटेड प्रोटियोलिपोसोम्स और अल्फास्क्रीन (बीआईएलआईए विधि) (चित्रा 3 बी) 45 का उपयोग करके एंटी-मेम्ब्रेन प्रोटीन एंटीबॉडी का चयन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधि विकसित की। सैंडविच एलिसा भी बायोटिनिलेटेड प्रोटियोलिपोसोम और स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित प्लेटों का उपयोग करके आसानी से बनाया जा सकता है।

अंत में, दो महत्वपूर्ण चेतावनियां हैं जिन्हें इस विधि का उपयोग करते समय संबोधित किया जाना चाहिए। सबसे पहले, अनुवाद बफर में डीटीटी की उच्च सांद्रता के कारण डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड का गठन अपर्याप्त हो सकता है, जो संभवतः कुछ प्रकार के झिल्ली प्रोटीन15 की संरचना को प्रभावित करता है। यद्यपि शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान रिडक्टेंट को हटाने के बाद डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड बनने में सक्षम होते हैं, वे संभवतः प्राकृतिक लोगों के बजाय विभिन्न प्रकार में बनते हैं। दूसरा यह है कि झिल्ली प्रोटीन ग्लाइकोसिलेटेड नहीं होते हैं। ग्लाइकोसिलेशन के लिए आवश्यक एंजाइम सेल-मुक्त प्रणाली में सैद्धांतिक रूप से अनुपस्थित हैं क्योंकि प्रक्रिया के दौरान जब गेहूं के रोगाणु निकालने का उत्पादन होता है, तो गोल्गी और ईआर सहित बायोमेम्ब्रेन को हटा दिया गया है। चूंकि डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड और ग्लाइकोसिलेशन की कमी से अलग-अलग अनुरूपण हो सकते हैं, इसलिए प्रयोगात्मक डिजाइन पर सावधानीपूर्वक विचार और मूल्यांकन दिया जाना चाहिए, खासकर जब प्रयोगात्मक उद्देश्यों के अनुसार प्रोटीन की कार्यात्मक अभिव्यक्ति के लिए पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन महत्वपूर्ण हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को ग्रांट नंबर जेपी 20 एम 0101077 के तहत एएमईडी से सपोर्टिंग ड्रग डिस्कवरी एंड लाइफ साइंस रिसर्च (आधार) सपोर्टिंग ड्रग डिस्कवरी एंड लाइफ साइंस रिसर्च (आधार) द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को आंशिक रूप से JSPS KAKENHI अनुदान संख्या 20K05709 द्वारा भी समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
×3 SDS-PAGE sample buffer Containing 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gel ATTO E-D520L
70% ethanol Diluted ethanol by ultrapure water.
Agarose Takara Bio
Ammonium acetate Nakalai tesque 02406-95 As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin Sodium Nakalai tesque 02739-74
Asolectin Liposome, lyophilized CellFree Sciences CFS-PLE-ASL A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interest Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
Chloroform Nakalai tesque 08402-84
Cooled incubator Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinase Roche Diagnostics 04524977190
Dialysis cup (0.1 mL) Thermo Fisher Scientific 69570 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL) Thermo Fisher Scientific 88404 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder marker Thermo Fisher Scientific SM0311 GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnI Thermo Fisher Scientific FD1703 FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamber ATTO
Ethanol (99.5%) Nakalai tesque 14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scanner We use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interest Avanti Polar Lipids
Micro centrifuge TOMY MX-307
NTP mix CellFree Sciences CFS-TSC-NTP Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tube IWAKI 362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubes Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tips Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kit MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vector CellFree Sciences CFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Plasmid prep Midi kit MACHEREY-NAGEL 740410 NucleoBond Xtra Midi
Primer 1 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’
Sequencing primer, forward
Primer 6 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’
Sequencing primer, reverse
Protein size marker Bio-Rad 1610394 Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixture New England BioLabs E2611L Gibson Assembly Master Mix
Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor CellFree Sciences CFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LM CellFree Sciences CFS-TSC-5TB-LM
Translation buffer CellFree Sciences CFS-SUB-SGC SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4).
Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure water We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave.
We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system.
Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizer Branson SONIFIER model 450D-Advanced Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extract CellFree Sciences CFS-WGE-7240 WEPRO7240

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बायोकैमिस्ट्री अंक 163 झिल्ली प्रोटीन प्रोटिओलिपोसोम सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण गेहूं के रोगाणु निकालने एंटीबॉडी विकास जीपीसीआर आयन चैनल ट्रांसपोर्टर
झिल्ली प्रोटीन को लक्षित करने वाले कार्यात्मक विश्लेषण और एंटीबॉडी विकास के लिए प्रोटियोलिपोसोम का सेल-मुक्त उत्पादन
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Zhou, W., Takeda, H. Cell-Free… More

Zhou, W., Takeda, H. Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (163), e61871, doi:10.3791/61871 (2020).

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