Presentiamo un metodo specificamente su misura per l’immagine dell’intero cervello della Drosophila adulta durante il comportamento e in risposta agli stimoli. La testa è posizionata per consentire l’accesso ottico a tutto il cervello, mentre la mosca può muovere le gambe e le antenne, la punta della proboscide e gli occhi possono ricevere stimoli sensoriali.
Presentiamo un metodo sviluppato specificamente per immaginiamo l’intero cervello drosofilo durante il comportamento continuo come camminare. La fissazione e la dissezione della testa sono ottimizzate per ridurre al minimo il loro impatto sul comportamento. Ciò si ottiene per la prima volta utilizzando un supporto che riduce al minimo gli ostacoli al movimento. La parte posteriore della testa della mosca è incollata a questo supporto con un angolo che consente l’accesso ottico a tutto il cervello mantenendo la capacità della mosca di camminare, governare, annusare, assaggiare e vedere. La parte posteriore della testa viene sezionata per rimuovere i tessuti nel percorso ottico e i muscoli responsabili dei manufatti del movimento della testa. Il cervello della mosca può essere successivamente immaginato per registrare l’attività cerebrale, ad esempio usando indicatori di calcio o tensione, durante comportamenti specifici come camminare o toelettatura e in risposta a diversi stimoli. Una volta che la dissezione impegnativa, che richiede una notevole pratica, è stata padroneggiata, questa tecnica consente di registrare ricchi set di dati che riguardano l’intera attività cerebrale con il comportamento e le risposte di stimolo.
L’imaging dell’attività cerebrale utilizzando varie tecniche ha approfondito la comprensione della funzione cerebrale. Nell’uomo, le tecniche di imaging cerebrale hanno limitazioni importanti: mentre la risonanza magnetica funzionale (fMRI) offre una risoluzione spazio-temporale molto al di sotto della risoluzione del singolo neurone, tecniche veloci come l’elettroencefalografia (EEG) consentono solo l’accesso indiretto e parziale alcervello 1. In modelli animali sufficientemente grandi come i roditori, la registrazione di sensori di attività fluorescente (ad esempio GCaMP) utilizzando microscopi montati sulla testa consente di osservare l’attività cerebrale mentre l’animale si muove nel suoambiente 2. Tuttavia, queste tecniche attualmente danno accesso solo a una piccola porzione del cervello. Gli animali fissi alla testa possono essere immagini più complete, ma la copertura è ancora parziale (ad esempio, la superficie della corteccia3). È solo nei piccoli animali, come le larve di zebrafish, C. elegans e Drosophila che l’intero cervello può essere immaginato con risoluzione temporale e spaziale a livello o vicino a singoli neuroni4.
D. melanogaster è particolarmente promettente perché è stato a lungo utilizzato come organismo modello genetico5 e sono stati sviluppati potenti strumenti genetici6. Completata dalla nuova rete anatomica su larga scala derivata dalla microscopia elettronica7, la mosca potrebbe fornire opportunità uniche per studiare dinamiche cerebrali complesse generate su una rete su largascala 8. Sebbene la cuticola non sia trasparente e debba quindi essere rimossa per immaginare il cervello, l’imaging funzionale in vivo è diventato sempre più comune dal primo studio nel 20029 e diversi protocolli sono già stati pubblicati. Tuttavia, questi metodi prevedono la separazione della testa di moscadal corpo 10,la limitazione grave dei movimenti della mosca e/o le risposte agli stimoli11,12,13,14,15,o consentire solo una piccola parte cervello da imaged9,16,25,26,27,17,18,19,20,21,22,23,24. Per completare questi approcci tuttavia potenti, abbiamo recentemente sviluppato una preparazione per l’immagine di tutto il cervello durante il comportamento e le risposte a varistimoli 28.
Qui, costruiamo su questo studio per presentare un metodo specificamente sviluppato per l’immagine di tutto il cervello mentre la mosca esegue un comportamento semi-naturalistico (cioè camminare e toelettatura) e risponde a stimoli sensoriali. Ciò si ottiene utilizzando un supporto di osservazione progettato per dare accesso a tutto il cervello dal lato dorsale-posteriore, lasciando intatte le antenne e la proboscide e permettendo alla mosca di muovere le gambe per camminare (ad esempio, su una palla ammortizzata ad aria). I passi per sezionare la parte posteriore della testa sono stati perfezionati per velocità, riproducibilità e per ridurre al minimo il loro effetto sulla vitalità e sulla mobilità della mosca.
La drosofilia è uno dei rari animali adulti in cui l’intero cervello può essere immaginato durante comportamenti complessi. Qui, presentiamo un metodo per preparare la mosca ed esporre tutto il suo cervello all’immagine dell’intera attività cerebrale in corso. Va notato diversi punti importanti.
Sezionare un piccolo animale come D. melanogaster è impegnativo. Il metodo richiede quindi molta pratica e pazienza per padroneggiarlo. Tuttavia, dopo l’allenamento, la procedura richiede meno di 30 minuti e produce risultati riproducibili.
Il metodo che abbiamo presentato ha ulteriori limitazioni. In primo luogo, inclinare la testa della mosca dalla sua posizione naturale porta ad allungare il collo che potrebbe essere dannoso per il tessuto connettivo, i nervi o il muscolo. In secondo luogo, sebbene la zona subesofagea ventrale (SEZ) sia otticamente accessibile, è al di sotto dell’esofago semitrasparente, che diminuisce l’intensità e la risoluzione in quest’area. Infine, anche se il supporto è fuori portata nella maggior parte delle direzioni, la mosca a volte si rende ancora conto della sua presenza e spinge su di essa per cercare di fuggire.
Nonostante questi limiti, i dati completi ottenuti dall’imaging cerebrale intero durante il comportamento e le risposte agli stimoli renderanno possibile decifrare la funzione cerebrale a livello dell’intera rete quando l’animale interagisce e naviga in ambienti complessi e naturalistici.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Heidi Miller-Mommerskamp per l’aiuto tecnico e Iveth Melissa Guatibonza Arevalo per i commenti utili sul manoscritto. Le prime versioni del protocollo furono sviluppate nel laboratorio di Ralph Greenspan. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG), in particolare attraverso una sovvenzione FOR2705 (TP3) all’IGK, e dalla fondazione Simons (Aimon – 414701) e dal Kavli Institute for Brain and Mind (numero di sovvenzione #2017-954) ricevuto da SA.
#5 forceps | FST by DUMONT | 11252-30 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long |
#55 forceps | FST by DUMONT | 11255-20 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long |
30x oculars | yegren | WF30-9-30-H | WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle |
AHOME/UV flashlight | Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd | B07V2W9543 (ASIN) | 365 nm |
Fotoplast Gel/UV Glue | Dreve Otoplastik GmbH | 44791 | GHS07, GHS08 |
Gloss Finish Transparent Tape | 3M Scotch | ||
KIMTECH Science/Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | 11 x 21 cm |
KL 1500 LCD/Microscope light | Schott | ||
Leica MS5 Microscope | Leica | WF30X/9 | |
Nail Lacqueur | Opi Products Inc., N. Hollywood | 6306585338 | black |
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose | Sigma Aldrich | ||
Scalpel | Werner Dorsch GmbH | 78 621; B07SXCXWFS (ASIN) | soft handle |
Vacuum grease | Dow corning | 0020080 /100 gr | Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g |