En snabb-tvärvetenskaplig strategi för tidig upptäckt av cyanobakteriella blommor och associerade cyanotoxiner beskrivs här. Det gör det möjligt att påtäcka cyanobakterier och relaterade cyanotoxiner i vattenprover och i organiska matriser, såsom tvåskaliga prover, i 24 timmar.
Snabb detektion av cyanobakterier och cyanotoxiner uppnås med hjälp av en snabb detekteringsstrategi (FDS). Endast 24 h behövs för att nysta upp förekomsten av cyanobakterier och relaterade cyanotoxiner i vattenprover och i en organisk matris, såsom musslor. FDS kombinerar fjärr-/proximala avkänningstekniker med analytiska/bioinformatiska analyser. Provtagningsplatser väljs genom tvärvetenskaplig, multi-scale och multi-parametrisk övervakning i ett tredimensionellt fysiskt utrymme, inklusive fjärranalys. Mikroskopisk observation och taxonomisk analys av proverna utförs i laboratoriemiljön, vilket gör det möjligt att identifiera cyanobakteriella arter. Prover extraheras sedan med organiska lösningsmedel och bearbetas med LC-MS/MS. Data som erhållits av MS/MS analyseras med hjälp av ett bioinformatiskt tillvägagångssätt med hjälp av onlineplattformen Global Natural Products Social (GNPS) för att skapa ett nätverk av molekyler. Dessa nätverk analyseras för att upptäcka och identifiera toxiner och jämföra data från fragmenteringsspektra som erhållits genom masspektrometri med GNPS-biblioteket. Detta gör det möjligt att upptäcka kända toxiner och okända analoger som verkar relaterade i samma molekylära nätverk.
Cyanobakteriella blommor har dykt upp som ett miljöproblem över hela världen under de senaste 15 åren1,2. Cyanobakteriella blommor beror på överväxten av mikroorganismer som heter cyanobakterier. De är en iögonfallande grupp fotosyntetiska mikroorganismer som har anpassat sig för att leva i ett stort antal miljöer, inklusive tropiska områden och extremt kallt vatten. De är kända för att producera stora blommor som täcker vattenytor, särskilt som svar på en massiv berikning av näringsämnen, den så kallade övergödningsprocessen3.
Därför är cyanobakterier utmärkta bioindikatorer av vattenföroreningar4,5,6. De kan också producera ett brett utbud av naturliga föreningar med intressanta farmakologiska egenskaper7,8. Miljöproblemet med cyanobakterier är själva blomningen. Blommor kan blockera solljus till undervattensgräs, konsumera syre i vattnet som leder till fiskdöd, producera ytavskum och lukt och störa filtermatningen av organismer9.
Dessutom, och ännu allvarligare, i en specifik kombination av faktorer som temperatur, näringsämnen (fosfor och kväve), solljus (för fotosyntesen) och pH i vattnet utlöser cyanobakteriella blommor toxinproduktionen; därför blir de skadliga för människor och djur. Den mest studerade klassen av cyanotoxiner produceras av släktena Microcystis. Dessa är cykliska peptider kända under det allmänna namnet mikrocystiner (MCs): mikrocystin-LR är den mest studerade som kan producera allvarlig levertoxicitet10. Djur och människor kan utsättas för MC genom intag av förorenat dricksvatten eller livsmedel. Världshälsoorganisationen (WHO) föreslog ett totalt mikrocystin-LR-värde på 0,001 mg/L som riktlinje11. Detta är dock endast relaterat till en variant (dvs. MC-LR) av mer än 100 mikrocystiner som hittills har isolerats.
Kombinerade metoder som tidigare rapporterats, såsom fjärranalys med MALDI-TOFMS-analys 12,13, 14,15, har fokuserat på koncentrationsdetektering av MCs. De senaste metoderna använder lågupplösta sensorer som är effektiva för att upptäcka endast breda blomvidder; De kan också avslöja endast toxiner för vilka standarder finns tillgängliga. Dessutom är de flesta av dessa förfaranden tidskrävande, och tid är en dramatisk faktor för tidig upptäckt av blomman för att förebygga eller minimera säkerhetsproblem. Den tvärvetenskapliga strategi som föreslås här ger snabb upptäckt av cyanobakterier blomma och cyanotoxiner, efter endast 24 h16.
Inom ramen för programmet som kallas MuM3, “Multi-disciplinary, Multi-scale and Multi-parametric Monitoring in the three-dimensional (3D) physical space”17,18, kombinerar en snabb detekteringsstrategi (FDS) fördelarna med flera tekniker: 1) fjärranalys för att upptäcka blomman; 2) Mikroskopisk observation för att upptäcka cyanobakterier. och 3) analytiska/bioinformatiska analyser, nämligen LC-HRMS-baserade molekylära nätverk, för att upptäcka cyanotoxiner. Resultaten erhålls inom 24 timmar.
Det nya tillvägagångssättet är användbart för att övervaka stora kustområden på kort tid, undvika många provtagningar och analyser och minska upptäcktstiden och kostnaderna. Denna strategi är resultatet av studier och tillämpning av olika metoder för övervakning av cyanobakterier och deras toxiner och kombinerar fördelarna med var och en av dem. Analysen av resultaten, som kommer från användning av olika plattformar (satellit, flygplan, drönare) och sensorer (MODIS, termisk infraröd) för fjärranalys, t.ex. av olika metodologiska metoder för identifiering av cyanobakteriella arter (mikroskop, UV-Vis-spektroskopi, 16S-analys) och toxiner (LC-MS-analys, molekylärt nätverk), gjorde det möjligt att välja den lämpligaste metoden både för de specifika och allmänna ändamålen. Den nya metoden experimenterades och validerades i efterföljande övervakningskampanjer vid Kampaniens kuster (Italien), inom ramen för Naturvårdsverkets övervakningsprogram i Kampanien.
Figur 1: FDS-strategi. En översikt över fast detection strategi för cyanobakterier och cyanotoxiner. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Under de senaste åren har vårt team testat och validerat flera olika tillvägagångssätt som gjorde det möjligt att lösa upp förekomsten av cyanobakterier och cyanotoxiner i vattenkroppar och musslor. Den nyutvecklade strategin representerar resultatet av dessa studier. De optimala tekniker och tekniker som passar omfattningen av snabb detektering samlas under hatten av en unik procedur som maximerar effektiviteten hos varje enskilt steg. Målområdet, blomförlängningen och odlingsstadiet är drivkraften för valet av lämpliga metoder och tekniker att använda.
När cyanobakterier och cyanotoxiner snabbdetektering är prioriteten, effektiviseras strategin och minskar det totala antalet till fyra huvudsteg: (1) Fjärr- och proximal avkänning och dataanalys för en första undersökning, lokalisering av platser och definition av blommönster och förlängning; (2) Guidad provtagning. (3) Mikroskopisk observation och taxonomisk analys. (4) Kemisk analys och molekylärt nätverk av LC-MS-data för dereplicering av vattenproverna och snabb påvisande av cyanotoxiner.
När det gäller det första steget, även om tillgången till data som förvärvats av en komplett kedja av plattformar som täcker alla lager av hierarkisk övervakning skulle vara den bästa lösningen för att upprepa en fullständig vision av det analyserade scenariot, kan ofta bara ett informationslager driva områdesundersökningsåtgärden och effektivt fokusera på de heta punkterna för att utföra provtagningsåtgärder på plats. Enligt de rapporterade erfarenheter där data förvärvades med hjälp av satelliter, flygplan, helikoptrar, UAV, är lösningen som helt matchar de behov som krävs enligt strategin för snabbdetektering användningen av de enda satellitprodukterna.
Dessutom har de informationslager som härrör från uppdrag som utförs av plattformar som flyger på lägre höjder än satelliter (t.ex. flygplan, helikoptrar, UAV) restitute information med stor upplösning men dessa är mycket dyra och kräver också mer tid för att slutföra hela förvärvsprocessen som också inkluderar färdplansdefinierande och godkännande.
När de fläckar som ska tas ut har valts ut (steg 2) är analytiska/bioinformatiska analyser (molekylärt nätverk av LC-MS-data) verktyget för snabb dereplicering av vattenproverna och snabb detektion av cyanotoxiner (steg 3 och 4). 16S metagenomisk analys tar minst 2 veckors arbete. Även när cyanobakteriella arter som är generiskt giftiga identifieras påvisas inte deras toxinproduktion. Av samma anledning är mikroskopisk observation inte i sig tillräcklig för att avslöja förekomsten av giftiga cyanobakterier. Naturligtvis har MS-analys och molekylära nätverk vissa begränsningar; De är ganska effektiva om föreningar av intresse (t.ex. toxiner) är väl joniserade under de applicerade förhållandena, om de är i tillräcklig mängd för att upptäckas. För den kända cyanobakteriella detektionen och övervakningen av toxiner representerar MS-baserade molekylära nätverk faktiskt en av de mer robusta och tillförlitliga teknikerna.
Därför visar sig detta tillvägagångssätt vara ganska användbart när det krävs en snabb påvisande av cyanobakterier och relaterade cyanotoxiner. Dessutom är kvantifiering av både cyanobakteriell blomning och toxin över tid och rum också möjlig genom denna strategi för att förhindra hälsosamhällens problem som kan uppstå genom stora cyanobakteriella giftiga blommor.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning finansierades av “Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)” inom ramen för projektet “Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania”, och utfördes i samarbete med Naturvårdsverket i Kampanien. Italien (ARPAC), “Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare” (IZSM/ORSA), Universitetet i Neapel “Federico II” – Institutionen för veterinärmedicin och animalisk produktion, ref. prof. A. Anastasio).
10X Vitamin mix | Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B12 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL | ||
1-BuOH | Sigma-Aldrich | 33065.2.5L-R | |
BG11 stock solution | Na2EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H2O 120 mg/L; CaCl2·2H2O 700 mg/L, MgSO4·7H2O 1.5 g/L, K2HPO4·3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4·6H2O (0.1 mM stock) 5 mL; Na2SeO4 (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL | ||
Centrifuge | Hermle | Z36HK | |
CHCl3 | Honeywell | 32211.2.5L | |
H2O | Sigma-Aldrich | 34877.2.5L | |
Kinetex C18 cloumn | Phenomenex | ||
LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system | Thermo | ||
MeOH | Honeywell | 32213.2.5L | |
Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera | Optech | Biostar B3 | |
Multiband camera | Intergraph DMC | ||
Nitsch's Solution | H3BO3 0.5 g/L MnSO4· H2O 2.28 g/L ZnSO4·7H2O 0.5 g/L CuSO4·5H2O 0.025 g/L COCl2·6H2O 0.135 g/L Na2MoO4·2H2O 0.025 g/L |
||
Refractomer mr 100 ATC | AQL | ||
SWBG11 medium | BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L |