Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Tidig upptäckt av cyanobakteriella blommor och tillhörande cyanotoxiner med hjälp av snabb detekteringsstrategi

doi: 10.3791/61889 Published: February 25, 2021
* These authors contributed equally

Summary

En snabb-tvärvetenskaplig strategi för tidig upptäckt av cyanobakteriella blommor och associerade cyanotoxiner beskrivs här. Det gör det möjligt att påtäcka cyanobakterier och relaterade cyanotoxiner i vattenprover och i organiska matriser, såsom tvåskaliga prover, i 24 timmar.

Abstract

Snabb detektion av cyanobakterier och cyanotoxiner uppnås med hjälp av en snabb detekteringsstrategi (FDS). Endast 24 h behövs för att nysta upp förekomsten av cyanobakterier och relaterade cyanotoxiner i vattenprover och i en organisk matris, såsom musslor. FDS kombinerar fjärr-/proximala avkänningstekniker med analytiska/bioinformatiska analyser. Provtagningsplatser väljs genom tvärvetenskaplig, multi-scale och multi-parametrisk övervakning i ett tredimensionellt fysiskt utrymme, inklusive fjärranalys. Mikroskopisk observation och taxonomisk analys av proverna utförs i laboratoriemiljön, vilket gör det möjligt att identifiera cyanobakteriella arter. Prover extraheras sedan med organiska lösningsmedel och bearbetas med LC-MS/MS. Data som erhållits av MS/MS analyseras med hjälp av ett bioinformatiskt tillvägagångssätt med hjälp av onlineplattformen Global Natural Products Social (GNPS) för att skapa ett nätverk av molekyler. Dessa nätverk analyseras för att upptäcka och identifiera toxiner och jämföra data från fragmenteringsspektra som erhållits genom masspektrometri med GNPS-biblioteket. Detta gör det möjligt att upptäcka kända toxiner och okända analoger som verkar relaterade i samma molekylära nätverk.

Introduction

Cyanobakteriella blommor har dykt upp som ett miljöproblem över hela världen under de senaste 15 åren1,2. Cyanobakteriella blommor beror på överväxten av mikroorganismer som heter cyanobakterier. De är en iögonfallande grupp fotosyntetiska mikroorganismer som har anpassat sig för att leva i ett stort antal miljöer, inklusive tropiska områden och extremt kallt vatten. De är kända för att producera stora blommor som täcker vattenytor, särskilt som svar på en massiv berikning av näringsämnen, den så kallade övergödningsprocessen3.

Därför är cyanobakterier utmärkta bioindikatorer av vattenföroreningar4,5,6. De kan också producera ett brett utbud av naturliga föreningar med intressanta farmakologiska egenskaper7,8. Miljöproblemet med cyanobakterier är själva blomningen. Blommor kan blockera solljus till undervattensgräs, konsumera syre i vattnet som leder till fiskdöd, producera ytavskum och lukt och störa filtermatningen av organismer9.

Dessutom, och ännu allvarligare, i en specifik kombination av faktorer som temperatur, näringsämnen (fosfor och kväve), solljus (för fotosyntesen) och pH i vattnet utlöser cyanobakteriella blommor toxinproduktionen; därför blir de skadliga för människor och djur. Den mest studerade klassen av cyanotoxiner produceras av släktena Microcystis. Dessa är cykliska peptider kända under det allmänna namnet mikrocystiner (MCs): mikrocystin-LR är den mest studerade som kan producera allvarlig levertoxicitet10. Djur och människor kan utsättas för MC genom intag av förorenat dricksvatten eller livsmedel. Världshälsoorganisationen (WHO) föreslog ett totalt mikrocystin-LR-värde på 0,001 mg/L som riktlinje11. Detta är dock endast relaterat till en variant (dvs. MC-LR) av mer än 100 mikrocystiner som hittills har isolerats.

Kombinerade metoder som tidigare rapporterats, såsom fjärranalys med MALDI-TOFMS-analys 12,13, 14,15, har fokuserat på koncentrationsdetektering av MCs. De senaste metoderna använder lågupplösta sensorer som är effektiva för att upptäcka endast breda blomvidder; De kan också avslöja endast toxiner för vilka standarder finns tillgängliga. Dessutom är de flesta av dessa förfaranden tidskrävande, och tid är en dramatisk faktor för tidig upptäckt av blomman för att förebygga eller minimera säkerhetsproblem. Den tvärvetenskapliga strategi som föreslås här ger snabb upptäckt av cyanobakterier blomma och cyanotoxiner, efter endast 24 h16.

Inom ramen för programmet som kallas MuM3, "Multi-disciplinary, Multi-scale and Multi-parametric Monitoring in the three-dimensional (3D) physical space"17,18, kombinerar en snabb detekteringsstrategi (FDS) fördelarna med flera tekniker: 1) fjärranalys för att upptäcka blomman; 2) Mikroskopisk observation för att upptäcka cyanobakterier. och 3) analytiska/bioinformatiska analyser, nämligen LC-HRMS-baserade molekylära nätverk, för att upptäcka cyanotoxiner. Resultaten erhålls inom 24 timmar.

Det nya tillvägagångssättet är användbart för att övervaka stora kustområden på kort tid, undvika många provtagningar och analyser och minska upptäcktstiden och kostnaderna. Denna strategi är resultatet av studier och tillämpning av olika metoder för övervakning av cyanobakterier och deras toxiner och kombinerar fördelarna med var och en av dem. Analysen av resultaten, som kommer från användning av olika plattformar (satellit, flygplan, drönare) och sensorer (MODIS, termisk infraröd) för fjärranalys, t.ex. av olika metodologiska metoder för identifiering av cyanobakteriella arter (mikroskop, UV-Vis-spektroskopi, 16S-analys) och toxiner (LC-MS-analys, molekylärt nätverk), gjorde det möjligt att välja den lämpligaste metoden både för de specifika och allmänna ändamålen. Den nya metoden experimenterades och validerades i efterföljande övervakningskampanjer vid Kampaniens kuster (Italien), inom ramen för Naturvårdsverkets övervakningsprogram i Kampanien.

Figure 1
Figur 1: FDS-strategi. En översikt över fast detection strategi för cyanobakterier och cyanotoxiner. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Protocol

1. Fjärr- och proximal avkänning: datainsamling och analys

OBS: I detta fall används fjärr-/proximala avkänningsdata för en första makroområdesundersökning och för att välja specifika platser i kustområden som ska provtas. I MuM3 Framework17-schemat baseras logik flödet på en hierarkisk övervaknings modell som innehåller flera nivåer med namnet informations lager. Informationen på varje nivå baseras på data som förvärvats med hjälp av en eller flera sensorer som transporteras ombord på plattformar som finns på olika höjder. Varje nivå definierar en rumslig skala beroende på höjden på mätningen19. Det finns potential för flera sensorer på varje nivå. Några exempel är: synlig nära infraröd (VNIR) och termisk infraröd (TIR) avbildning20 på satelliter, flygplan, helikoptrar, UAV21 och vid ytan; fysiska, kemiska och biologiska analyser m.m.22 vid ytan och i snabb respons med hjälp av det mobila labbet. De data som förvärvas av varje sensor bearbetas och kombineras för att beräkna multispektrala index (t.ex. normaliserat differensvegetationsindex (NDVI), Normaliserat differensvattenindex (NDWI), Klorofyllindex etc.), så att rådata omvandlas till mer användbara parametrar och format (t.ex. tematisk karta).

Figure 2
Figur 2:Fjärr-/proximala avkänningsanalyser för provtagning (steg 1-2). Multi-level och multi-sensor inflygning för detektion av cyanobakteriell blomning. Datainsamling sker via satellit (A), luftfartyg (B), och / eller drönare (C). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

  1. Fjärr- och proximal avkänningsdatahämtning
    1. Hämta data från de olika offentliga och privata fjärranalysdatamängderna, som producerats särskilt för innehållsbaserad hämtning och scenklassificering. Typiska datauppsättningskällor som används i det här steget inkluderar: Landsat-produkter som tillhandahålls av U.S. Geological Survey23,Sentinel-2,3-produkter som tillhandahålls av NASA24och Copernicus Open Access Hub25,MODIS-Aqua26.
    2. Identifiera de produkter som är tillgängliga för det specifika området, datumintervallet och överväg gränsen som härleds av molnomslaget. Definiera: A) intresseområdet med hjälp av grafiskt användargränssnitt och polygonval; B) datumintervallet och molntäckningen med hjälp av textfrågafilterfälten.
      OBS: Även om många vetenskapliga rapporter citerar att ett acceptabelt molntäckesvärde är <20%, i denna typ av forskning, är det viktigt att vara uppmärksam på det verkliga molntäcket endast på vattenytan, så ett effektivitetsvärde för denna region är <5%.
    3. Välj produkter som härrör från plattformarna som bäst passar uppdragets specifika behov. Från varje kombination av tekniska specifikationer för satellit- och nyttolast är det möjligt att erhålla flera produktkollektioner. Till exempel bearbetas NASA EOSDIS24-dataprodukter på olika nivåer, från nivå 0 till nivå 4: Nivå 0-produkterna är rådata med full instrumentupplösning medan data på högre nivåer omvandlas till mer användbara parametrar och format. Vanligtvis är nivåerna 0-1 tillgängliga, medan produkterna i nivå 2-4 behöver specifik bearbetning relaterad till specifika forskningsmål, så deras tillgänglighet är begränsad i tid och den region som omfattas.
    4. Ladda ner den valda datauppsättningen med satellitobservationer. I detalj, välja bland listan över resultat från föregående åtgärd, ladda ner en komplett datauppsättningsprodukt (t.ex. en grupp geo-tiff-filer, en för varje band, plus information och andra metadata) eller bara ett specifikt enda band.
      OBS: För den specifika beskrivningen av varje grundläggande åtgärd som ingår i förfarandet i steg 1, se även Huan-Huan Chen et al. 202027.
  2. Dataförbehandling och behandling för analys och omvandling till mer användbara parametrar och format för att möjliggöra en första screening av makroområdet.
    OBS: Följande åtgärder (steg 1.2) är dedikerade till databehandling som slutförs för att omvandla rådata som kommer från lägre nivåer till information och sedan till användbar information (högre nivåer). Detta steg består av bearbetning av rådata från varje sensor (t.ex. produktnivåer 0-1) och omvandling till produkter på högre nivå (t.ex. nivåer 2-4) och därefter i informationslager för att generera mer användbara parametrar och format (t.ex. tematisk karta).
    1. Förprocessråvara med geometrisk och radiometrisk kalibrering. Den här åtgärden kan utföras med hjälp av specifik programvara som på ett automatiskt eller halvautomatiskt sätt (oövervakad eller övervakad) tillhandahåller en uppsättning anslutna verktyg för rasterbearbetning för att utföra en enkel klassificering med respekt för ett korrekt arbetsflöde.
      OBS: I denna forskning används två gratis verktyg med öppen källkod: Q-GIS 3.1428 kombinerat med Semi-Automatic Classification Plugin (SCP). SCP-plugin29 tillåter halvautomatisk klassificering av fjärranalysbilder, vilket ger en komplett verktygsuppsättning för nedladdning av gratisbilder, förbehandling, efterbehandling och rasterberäkning.
    2. Bearbeta kalibrerade data som beräknar multispektrala index. Vanligtvis utförs den här åtgärden med hjälp av ett rasterkalkylatorverktyg. Beräkningen av ett multispektrala index definierar en korrelation mellan olika band/lager som som ett resultat genererar ett nytt lager som kan hanteras på en GIS-plattform. Till exempel, med början från Sentinel och Landsat operational land imager sensor (OLI), är det möjligt att beräkna multispektrala index somNormalized Difference Vegetation Index (NDVI). Vegetationsindex används sedan för att uppskatta klorofyllhalten30,31.
    3. Analysera resultaten från uppskattningen av klorofyllinnehållsindex representerat som i falska färgamatiska kartor och definiera kritiskt område med hög klorofyllkoncentration. I denna studie genereras klorofyll-en karta med hjälp av datauppsättning av MODIS-sensor32, monterad på Terra- och Aqua-satellitplattformar. Provtagningsplatserna lokaliseras där onormala värden registreras.
      OBS: Algblomningsflaggan (som definierar varje specifik plats) hissas i fjärranalysdomänen när Chl-a-koncentrationen överstiger 20 mg/L33.

2. Guidade provtagningar

OBS: Valet av provtagningsplatser drivs av fjärr-/proximal avkänningsskiktsanalys som gör det möjligt att välja platser i stora kustområden. Med tanke på att provtagning kan vara farlig för operatörerna på grund av mikrocystins toxicitet behövs förfaranden för säkerhetsprovtagning. Särskilt behövs det för att skydda operatörer från aerosolinandning och hudkontakt. Utför sedan sampling enligt proceduren som beskrivs nedan.

  1. Använd skyddsglasögon för ögonskydd, FFP2-mask för att förhindra aerosolinandning och skyddshandskar för att förhindra hudkontakt.
  2. Samla 0,5 L vatten i tre exemplar på varje plats.
  3. Mät salthalten för varje prov med hjälp av en refraktometer. Sätt en droppe av provet på refraktometern och läs salthaltsvärdet i termer av delar per tusen (ppt - ▼).
  4. I slutet av provtagningen, tvätta först händerna; ta sedan i sin tur bort handskarna, masken och skyddsglasögonen och se till att inte röra den personliga skyddsutrustningens yttre yta.
  5. Bär provet till labbet vid rumstemperatur.

3. Identifiering av cyanobakterier genom mikroskopiska observationer och taxonomisk identifiering

  1. Centrifugera varje prov (≈0,5 L) vid 11 200 x g i 5 minuter.
  2. Extrahera supernatanter enligt följande: Häll 500 ml butanol i varje prov och använd en tratt, överför blandningen som ska extraheras i separatorytratten. Placera separertratten upprätt i ringklämman så att båda lagren kan separeras. Låt vattenfasen rinna av i en Erlenmeyerkolv. Upprepa det här steget tre gånger. Koncentrera sedan de organiska faserna under vakuum och väg dem.
  3. Samla pellets från steg 3.1 och analysera dem vid 400x och 1000x förstoring med ett optiskt mikroskop utrustat med en 18 MP digitalkamera för mikroskop. Leta efter närvaron av cyanobakterier på grundval av deras morfologiska egenskaper: blågrön färg, cellform och storlek gör det möjligt att känna igen cyanobakterier bland andra mikroorganismer.
  4. Identifiera arten genom taxonomisk analys genom mikroskopisk observation, enligt förfarandet som beskrivs i Komarék et al. 201434.
    OBS: Kompletterande 16S metagenomisk analys kan utföras för att identifiera cyanobakteriell taxa3.
  5. Späd ut en alikvot av pelletsen med 10 ml havsvatten/sötvatten BG11-medier, beroende på dess salthalt, för odling.

4. Identifiering av cyanotoxiner

  1. Extraktion av prover med organiska lösningsmedel
    1. Lägg varje prov av pellet i en kolv och ultraljudsbehandling i 5 minuter med ett isbad. Tillsätt sedan 50 ml färsk MeOH och skaka försiktigt. Filtrera lösningen med ett pappersfilter och samla filtratet i en rund bottenkolv. Upprepa det här steget två gånger. Extrahera sedan pelletsen som tillsätter 50 ml blandning av MeOH / DCM två gånger (1:1, 50 ml) och två gånger med 100% DCM (x2, 50 mL)35. Märk varje rund bottenkolv som "MeOH-extrakt", "MeOH/DCM-extrakt" respektive "DCM-extrakt" och koncentrera under vakuum.
    2. Analysera varje organiskt extrakt (MeOH, MeOH/DCM, DCM) med LC-HRMS/MS.
  2. LC-HRMS/MS-analys
    1. LC-HRMS- och LC-HRMS/MS-provberedning: lös upp varje prov med MeOH ≥ 99,9% för att få en slutlig koncentration på 10 mg/ml.
    2. Analysera varje prov med hjälp av en högupplöst ESI-masspektrometer i kombination med ett HPLC-system (LC-HRMS/MS-system). Arbeta på HPLC med en 5-μm C18-kolumn (100 x 2,10 mm), vid rumstemperatur. Använd en gradient eluering med H2O (kompletterad med 0,1% HCOOH) och MeOHat 200 μL min-1. Gradientprogrammet är: 10% MeOH i 3 min, 10% till 100% MeOH i 30 min, 100% MeOH i 7 min. Använd MeOH som kontroll.
    3. Datainsamling. Samla in data i det databeroende förvärvsläget (DDA): De 10 mest intensiva jonerna i ett massspektrum med full skanning måste genomgå högupplöst tandemmasspektrometrianalys (HRMS/MS). Skaffa HRMS/MS-skanningar efter utvalda joner med CID-fragmentering, en isoleringsbredd på 2,0, normaliserad kollisionsenergi på 35, aktivering Q på 0,250 och en aktiveringstid på 30 ms.
  3. Bioinformatiska analyser och molekylära nätverk
    1. Analysera fragmenteringsmönster för varje intensiv jon med MS-specifik programvara.
    2. Använd MS-Cluster för att gruppera data (överordnad masstolerans på 1,0 Da och MS/MS fragmentjontolerans på 0,5 Da). Konsensusspektra som innehåller mindre än 2 spektra elimineras.
    3. Analysera MS/MS-data från GNPS (Global Natural Products Social36)för molekylärt nätverkande.
    4. Parvis jämföra konsensusspektra och även med de som rapporteras i GNPS-Mass-Ive-biblioteken.
    5. Visualisera det erhållna nätverket37.
      OBS: För molekylärt nätverkande, se Sigrist et al. 202038.

Figure 3
Bild 3: FDS steg i labbet (3-4). Visuell representation av de huvudsakliga aktiviteter som utförs i laboratoriet efter provtagning (steg 3 och 4). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Representative Results

I en första studie3observerades fyra antropogent påverkade platser längs Kampaniens kust i SW Italien med hjälp av satelliten Landsat 8 och flygplan under sommaren 2015. Landsat 8 fungerande landbildarsensor (OLI) och flygplanets multispektrala kamera tillät att skapa NDWI-bilder (Normalized Difference Water Index) för områdena för att avslöja närvaron av cyanobakteriella samhällen. Cyanobakteriell samhällssammansättning fastställdes genom spektrofotometriska analyser för detektion av cyanobakteriellt pigment fykocyanin (PC). Sedan, kompletterande 16S ögongenomisk analys tillåts identifiera cyanobakteriell taxa. Den förenklade multispektrala bild indexering och klassificering genom satellit/flygplattformar i kombination med metagenomiska analyser var effektiva för att upptäcka förekomsten av cyanobakterier som tillhör släkten som är associerade med starka eutrofiiska villkor (såsom Leptolyngbya sp., Pseudooscillatoria sp.), i ett tidigt skede av blomningen.

I en andra studie14testades FDS-metoden under våren/sommaren 2017. Satellitdata användes som den enda fjärranalysnivån. I detalj tillät data som förvärvats av MODIS-sensorn (MODerate Image Spectroradiometer), monterade på satellitplattformarna Terra och Aqua, kvantifiering av klorofyll a (Chl-a) i vattenförekomsterna längs Campanias kuster och valet av tio provtagningsplatser. Prover bearbetades i labbet genom mikroskopisk observation och taxonomisk identifiering, sedan extraheras med organiska lösningsmedel. Organiska extrakt bearbetades genom LC-MS-MS analys. Data som erhållits av MS-MS analyserades med hjälp av ett bioinformatiskt tillvägagångssätt, med hjälp av GNPS-plattformen för att skapa ett nätverk av molekyler. Nätverket analyserades för att upptäcka och identifiera toxiner som jämförde data från fragmenteringsspektrat som erhållits genom masspektrometri med GNPS-biblioteket. Detta gjorde det möjligt att upptäcka kända toxiner och okända analoger som kommer att visas relaterade i samma molekylära nätverk. Specifikt upptäcktes Lyngbyatoxin A, ett lipofila dermatotoxiner, i alla vattenprover och tvåskaliga prover. i Lyngbyatoxin ett molekylärt kluster fanns även noder som inte var relaterade till några kända föreningar av lyngbyatoxiner, vilket tyder på att det finns okända lyngbyatoxinanaloger. Inga mikrocystiner och andra toxiner upptäcktes i proverna. Alla resultat erhölls inom 24 mantimmar.

Figure 4
Figur 4: FDS-representativa resultat. Ett exempel på tillämpning av FDS-strategin vid Kampaniens kust (Italien). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

Under de senaste åren har vårt team testat och validerat flera olika tillvägagångssätt som gjorde det möjligt att lösa upp förekomsten av cyanobakterier och cyanotoxiner i vattenkroppar och musslor. Den nyutvecklade strategin representerar resultatet av dessa studier. De optimala tekniker och tekniker som passar omfattningen av snabb detektering samlas under hatten av en unik procedur som maximerar effektiviteten hos varje enskilt steg. Målområdet, blomförlängningen och odlingsstadiet är drivkraften för valet av lämpliga metoder och tekniker att använda.

När cyanobakterier och cyanotoxiner snabbdetektering är prioriteten, effektiviseras strategin och minskar det totala antalet till fyra huvudsteg: (1) Fjärr- och proximal avkänning och dataanalys för en första undersökning, lokalisering av platser och definition av blommönster och förlängning; (2) Guidad provtagning. (3) Mikroskopisk observation och taxonomisk analys. (4) Kemisk analys och molekylärt nätverk av LC-MS-data för dereplicering av vattenproverna och snabb påvisande av cyanotoxiner.

När det gäller det första steget, även om tillgången till data som förvärvats av en komplett kedja av plattformar som täcker alla lager av hierarkisk övervakning skulle vara den bästa lösningen för att upprepa en fullständig vision av det analyserade scenariot, kan ofta bara ett informationslager driva områdesundersökningsåtgärden och effektivt fokusera på de heta punkterna för att utföra provtagningsåtgärder på plats. Enligt de rapporterade erfarenheter där data förvärvades med hjälp av satelliter, flygplan, helikoptrar, UAV, är lösningen som helt matchar de behov som krävs enligt strategin för snabbdetektering användningen av de enda satellitprodukterna.

Dessutom har de informationslager som härrör från uppdrag som utförs av plattformar som flyger på lägre höjder än satelliter (t.ex. flygplan, helikoptrar, UAV) restitute information med stor upplösning men dessa är mycket dyra och kräver också mer tid för att slutföra hela förvärvsprocessen som också inkluderar färdplansdefinierande och godkännande.

När de fläckar som ska tas ut har valts ut (steg 2) är analytiska/bioinformatiska analyser (molekylärt nätverk av LC-MS-data) verktyget för snabb dereplicering av vattenproverna och snabb detektion av cyanotoxiner (steg 3 och 4). 16S metagenomisk analys tar minst 2 veckors arbete. Även när cyanobakteriella arter som är generiskt giftiga identifieras påvisas inte deras toxinproduktion. Av samma anledning är mikroskopisk observation inte i sig tillräcklig för att avslöja förekomsten av giftiga cyanobakterier. Naturligtvis har MS-analys och molekylära nätverk vissa begränsningar; De är ganska effektiva om föreningar av intresse (t.ex. toxiner) är väl joniserade under de applicerade förhållandena, om de är i tillräcklig mängd för att upptäckas. För den kända cyanobakteriella detektionen och övervakningen av toxiner representerar MS-baserade molekylära nätverk faktiskt en av de mer robusta och tillförlitliga teknikerna.

Därför visar sig detta tillvägagångssätt vara ganska användbart när det krävs en snabb påvisande av cyanobakterier och relaterade cyanotoxiner. Dessutom är kvantifiering av både cyanobakteriell blomning och toxin över tid och rum också möjlig genom denna strategi för att förhindra hälsosamhällens problem som kan uppstå genom stora cyanobakteriella giftiga blommor.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Denna forskning finansierades av "Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)" inom ramen för projektet "Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania", och utfördes i samarbete med Naturvårdsverket i Kampanien. Italien (ARPAC), "Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare" (IZSM/ORSA), Universitetet i Neapel "Federico II" - Institutionen för veterinärmedicin och animalisk produktion, ref. prof. A. Anastasio).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X Vitamin mix Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B12 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL
1-BuOH Sigma-Aldrich 33065.2.5L-R
BG11 stock solution Na2EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H2O 120 mg/L; CaCl2·2H2O 700 mg/L, MgSO4·7H2O 1.5 g/L, K2HPO4·3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4·6H2O (0.1 mM stock) 5 mL; Na2SeO4 (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL
Centrifuge Hermle Z36HK
CHCl3 Honeywell 32211.2.5L
H2O Sigma-Aldrich 34877.2.5L
Kinetex C18 cloumn Phenomenex
LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system Thermo
MeOH Honeywell 32213.2.5L
Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera  Optech Biostar B3
Multiband camera Intergraph DMC
Nitsch's Solution H3BO3 0.5 g/L
MnSO4· H2O 2.28 g/L
ZnSO4·7H2O 0.5 g/L
CuSO4·5H2O 0.025 g/L
COCl2·6H2O 0.135 g/L
Na2MoO4·2H2O 0.025 g/L
Refractomer mr 100 ATC AQL
SWBG11 medium BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tamele, I. J., Silva, M., Vasconcelos, V. The incidence of marine toxins and the associated seafood poisoning episodes in the African countries of the Indian ocean and the Red sea. Toxins. 11, (1), 25-48 (2019).
  2. Lürling, M., Faassen, E. J. Dog poisonings associated with a Microcystis aeruginosa bloom in the Netherlands. Toxins. 5, (3), 556-567 (2013).
  3. O'Neil, J. M., Davis, T. W., Burford, M. A., Gobler, C. J. The rise of harmful cyanobacteria blooms: The potential roles of eutrophication and climate change. Harmful Algae. 14, 313-334 (2012).
  4. Teta, R., et al. Cyanobacteria as indicators of water quality in Campania coasts, Italy: A monitoring strategy combining remote/proximal sensing and in situ data. Environmental Research Letters. 12, (2), (2017).
  5. Teta, R. Bioindicators as a tool in environmental impact assessment: Cyanobacteria as a sentinel of pollution. International Journal of Sustainable Development and Planning. 14, (1), 1-8 (2019).
  6. Teta, R., Della Sala, G., Mangoni, A., Lega, M., Costantino, V. Tracing cyanobacterial blooms to assess the impact of wastewaters discharges on coastal areas and lakes. International Journal of Sustainable Development and Planning. 11, (5), 804-811 (2016).
  7. Teta, R., et al. A joint molecular networking study of a: Smenospongia sponge and a cyanobacterial bloom revealed new antiproliferative chlorinated polyketides. Organic Chemistry Frontiers. 6, (11), 1762-1774 (2019).
  8. Singh, R. K., Tiwari, S. P., Rai, A. K., Mohapatra, T. M. Cyanobacteria: an emerging source for drug discovery. Journal of Antibiotics. 64, (6), 401-412 (2011).
  9. Huisman, J., et al. Cyanobacterial blooms. Nature Reviews Microbiology. 16, (8), 471-483 (2018).
  10. Gupta, N., Pant, S. C., Vijayaraghavan, R., Rao, P. V. L. Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants (LR, RR, YR) in mice. Toxicology. 188, (2-3), 285-296 (2003).
  11. WHO. Cyanobacterial toxins: Microcystin-LR in drinking water. Background document for development of WHO Guidelines for Drinking-Water Quality. WHO. 2, (1998).
  12. Agha, R., Cirés, S., Wörmer, L., Domínguez, J. A., Quesada, A. Multi-scale strategies for the monitoring of freshwater cyanobacteria: Reducing the sources of uncertainty. Water Research. 46, (9), 3043-3053 (2012).
  13. Giménez-Campillo, C. Determination of cyanotoxins and phycotoxins in seawater and algae-based food supplements using ionic liquids and liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry. Toxins. 11, (10), 610 (2019).
  14. Sanseverino, I., António, D. C., Loos, R., Lettieri, T. Cyanotoxins: methods and approaches for their analysis and detection. JRC Technical Reports. (2017).
  15. Teta, R. Combined LC-MS/MS and molecular networking approach reveals new cyanotoxins from the 2014 cyanobacterial bloom in Green Lake, Seattle. Environmental Science and Technology. 49, (24), 14301-14310 (2015).
  16. Esposito, G., et al. A fast detection strategy for cyanobacterial blooms and associated cyanotoxins (FDSCC) reveals the occurrence of lyngbyatoxin A in campania (South Italy). Chemosphere. 225, 342-351 (2019).
  17. Lega, M., Casazza, M., Teta, R., Zappa, C. J. Environmental impact assessment: a multilevel, multi-parametric framework for coastal waters. International Journal of Sustainable Development and Planning. 13, (8), 1041-1049 (2018).
  18. Di Fiore, V. Integrated hierarchical geo-environmental survey strategy applied to the detection and investigation of an illegal landfill: A case study in the Campania Region (Southern Italy). Forensic Science International. 279, 96-105 (2017).
  19. Gargiulo, F., Persechino, G., Lega, M., Errico, A. IDES project: A new effective tool for safety and security in the environment. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). 8286 LNCS (PART 2) (2013).
  20. Ferrara, C., Lega, M., Fusco, G., Bishop, P., Endreny, T. Characterization of terrestrial discharges into coastal waters with thermal imagery from a hierarchical monitoring program. Water. 9, (7), Switzerland. (2017).
  21. Alfeo, A. L., Cimino, M. G. C. A., De Francesco, N., Lega, M., Vaglini, G. Design and simulation of the emergent behavior of small drones swarming for distributed target localization. Journal of Computational Science. 29, 19-33 (2018).
  22. Casazza, M., Lega, M., Liu, G., Ulgiati, S., Endreny, T. A. Aerosol pollution, including eroded soils, intensifies cloud growth, precipitation, and soil erosion: a review. Journal of Cleaner Production. 189, 135-144 (2018).
  23. U.S. Geological Survey. Available from: https://ers.cr.usgs.gov (2020).
  24. NASA Earthdata. Available from: https://urs.earthdata.nasa.gov (2020).
  25. Copernicus Opern Access Hub. Available from: https://scihub.copernicus.eu/apihub (2020).
  26. MODerate Image Spectroradiometer (MODIS) Aqua. Available from: podaac-tools.jpl.nasa.gov (2020).
  27. Chen, H. -H., Tang, R., Zhang, H. -R., Yu, Y., Wang, Y. Investigating the relationship between sea surface chlorophyll and major features of the south china sea with satellite information. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
  28. QGIS. Available from: https://www.qgis.org/it/site/ (2020).
  29. Congedo, L. Semi-automatic classification plugin documentation release 4.8.0.1. Available from: https://manualzz.com/doc/7130012/semi-automatic-classification-plugin-documentation (2016).
  30. Rouse, J. W., Hass, R. H., Schell, J. A., Deering, D. W. Monitoring vegetation systems in the great plains with ERTS. Third Earth Resources Technology Satellite (ERTS) Symposium. 1, 309-317 (1973).
  31. Carmona, F., Rivas, R., Fonnegra, D. C. Vegetation index to estimate chlorophyll content from multispectral remote sensing data. European Journal of Remote Sensing. 48, (1), 319-326 (2015).
  32. Savtchenko, A., et al. MODIS data from terra and aqua satellites. International Geoscience and Remote Sensing Symposium (IGARSS). 5, 3028-3030 (2003).
  33. Binding, C. E., Greenberg, T. A., McCullough, G., Watson, S. B., Page, E. An analysis of satellite-derived chlorophyll and algal bloom indices on Lake Winnipeg. Journal of Great Lakes Research. 44, (3), 436-446 (2018).
  34. Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86, 295-335 (2014).
  35. Esposito, G., et al. Chlorinated thiazole-containing polyketide-peptides from the caribbean sponge smenospongia conulosa: structure elucidation on microgram scale. European Journal of Organic Chemistry. 2016, (16), 2871-2875 (2016).
  36. UCSD Commputational Mass Spectrometer Website. Available from: http://gnps.ucsd.edu/ (2020).
  37. Shannon, P. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13, (11), 2498-2504 (2003).
  38. Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. Mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
Tidig upptäckt av cyanobakteriella blommor och tillhörande cyanotoxiner med hjälp av snabb detekteringsstrategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teta, R., Esposito, G., De Sterlich, C., Lega, M., Costantino, V. Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy. J. Vis. Exp. (168), e61889, doi:10.3791/61889 (2021).More

Teta, R., Esposito, G., De Sterlich, C., Lega, M., Costantino, V. Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy. J. Vis. Exp. (168), e61889, doi:10.3791/61889 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter