Summary
这里描述了一种快速多学科的快速多学科，用于早期检测蓝藻花和相关的氰毒素。它允许在24小时内在水样和有机基质（如双壳菌样本）中检测蓝藻和相关氰毒素。
Abstract
使用快速检测策略 （FDS） 实现了对蓝藻和氰毒素的快速检测。只需 24 小时，就可解开水样和有机基质（如双壳提取物）中蓝藻和相关氰毒素的存在。FDS 将远程/近向传感技术与分析/生物信息学分析相结合。采样点通过包括遥感在内的三维物理空间中的多学科、多尺度和多参数监测进行选择。在实验室环境中对样品进行微观观察和分类分析，从而能够识别蓝藻物种。然后用有机溶剂提取样品，并用LC-MS/MS进行处理。 MS/MS 获得的数据使用在线平台全球天然产品社交（GNPS）进行生物信息处理，以创建分子网络。对这些网络进行分析，以检测和识别毒素，将质谱学获得的碎片光谱数据与 GNPS 库进行比较。这允许检测在同一分子网络中出现的已知毒素和未知模拟物。
Introduction
在过去的15年里，蓝藻的盛开已经成为全世界的环境问题。蓝藻的盛开是由于名为蓝藻的微生物的过度生长。它们是一组引人注目的光合作用微生物，它们已经适应了各种环境，包括热带地区和极端寒冷的海水。它们以在水面上产生大花而闻名，特别是为了应对大量富集的营养物质，即所谓的富营养化过程3。
因此，蓝藻是水污染4、5、6的优秀生物指标。他们还可以产生广泛的天然化合物与有趣的药理学性质7，8。与蓝藻有关的环境问题是花本身。花可以阻挡阳光照射到水下草丛中，在水中消耗氧气导致鱼类死亡，产生表面污秽和气味，并干扰生物体的过滤喂养。
此外，更严重的是，在温度、养分（磷和氮）、阳光（光合作用）和水的pH度等因素的特定组合中，蓝藻的绽放会引发毒素的产生：因此，它们对人类和动物有害。研究最多的氰毒素类是由属微囊肿产生的。这些是环氧肽，以微囊素（MCs）的通用名称命名：微囊素-LR是研究最多的能够产生严重的肝毒性10。动物和人类可能因摄入受污染的饮用水或食物而接触到MC。世界卫生组织（WHO）建议将微细胞素-LR的总值0.001毫克/升作为准则11。然而，这仅与迄今被分离的100多个微囊中的一个变种（即MC-LR）有关。
先前报告的综合方法，如遥感与MALDI-TOFMS分析12、13、14、15，都集中在MC的浓度检测上。最近的方法使用低分辨率传感器，能够有效地检测只有大面积的开花：它们还能够只暴露有标准的毒素。此外，这些程序大多很耗时，而且时间是早期发现花期以防止或尽量减少安全问题的一个显著因素。这里提出的多学科战略提供了蓝藻开花和氰毒素的快速检测，后只有24小时16。
在名为MuM3的程序框架中，"三维（3D）物理空间中的多学科、多尺度和多参数监测"17、18、快速探测策略（FDS）结合了多种技术的优势：1）遥感检测绽放：2） 微观观察检测蓝藻物种：和 3） 分析/生物信息学分析，即基于LC-HRMS的分子网络，以检测氰毒素。结果在 24 小时内获得。
新方法有助于在短时间内监测广大沿海地区，避免大量采样和分析，并降低检测时间和成本。这一战略是研究和应用不同方法监测蓝藻及其毒素的结果，并结合了它们各自的优势。具体来说，对结果的分析， 来自使用不同的平台（卫星、飞机、无人机）和传感器（MODIS、热红外）进行遥感分析，例如用于识别蓝藻物种（显微镜、紫外线-维斯光谱学、16S分析）和毒素（LC-MS分析、分子网络）的不同方法方法，允许为特定和一般目的选择最合适的方法。在坎帕尼亚环境保护局监测方案框架内，在随后的坎帕尼亚海岸（意大利）监测运动中试验并验证了新方法。
图1：FDS策略。蓝藻和氰毒素快速检测策略概述。请单击此处查看此图的较大版本。
Protocol
1. 远程和近距离传感：数据采集和分析
注：在这种情况下，遥感/近地传感数据用于第一次宏观区域调查，并选择要取样的沿海地区的具体点。在 MuM3 框架17 方案中，逻辑流基于一个分层监控模型，该模型包括多个级别命名的信息层。每个级别的信息基于使用位于不同高度的板平台上携带的一个或多个传感器获得的数据。每个级别根据测量19的高度定义空间尺度。每个级别都有多个传感器的潜力。一些例子是：在卫星、飞机、直升机、无人机21 和地面上可见红外（VNIR）和热红外（TIR）成像20： 物理、化学和生物分析等22 在表面和快速响应使用移动实验室。每个传感器获得的数据经过处理和组合，以计算多光谱索引（例如标准化差值植被指数 （NDVI）、规范化差分水指数 （NDWI）、叶绿素索引等），因此原始数据被转换为更有用的参数和格式（例如，主题地图）。
图2：用于取样的遥感/近向感应分析（第1-2步）。多级和多传感器方法，用于检测蓝藻开花。数据采集由卫星（A）、飞机（B）和/或无人机（C）执行。请单击此处查看此图的较大版本。
- 遥感和近邻传感数据检索
- 检索各种公共和私人遥感数据集的数据，这些数据集是专门为基于内容的检索和现场分类而制作的。这一步骤中使用的典型数据集来源包括：美国地质调查局23号提供的Landsat产品、NASA24提供的Sendiel-2，3号产品以及哥白尼开放接入中心25号、MODIS-Aqua26号。
- 确定特定区域、日期范围的可用产品，并考虑云盖产生的限制。定义：A） 使用图形用户界面和多边形选择感兴趣的区域：B） 使用文本查询过滤字段的日期范围和云覆盖范围。
注：即使许多科学报告都指出，在这类研究中，可接受的云层覆盖值为<20%，但重要的是只关注水面上的真实云层覆盖，因此该地区的有效值为<5%。 - 选择最适合特派团特定需求的平台的产品。从卫星和有效载荷技术规格的每个组合，可以获得几个集合的产品。例如，NASA EOSDIS24 数据产品在从 0 级到 4 级的不同级别进行处理：0 级产品是全仪器分辨率的原始数据，而在较高级别，数据被转换为更有用的参数和格式。通常，0-1 级可用，而 2-4 级的产品需要与特定研究目标相关的特定处理，因此其可用性在时间和覆盖区域有限。
- 下载卫星观测所选数据集。详细而言，从上一个操作中选择结果列表，下载完整的数据集产品（例如，一组地理 tiff 文件，每个频段一个，外加信息和其他元数据），或仅下载一个特定的单个波段。
注：对于第1步程序中包括的每一个基本动作的具体说明，请参阅陈焕焕等人2020年27日。
- 数据预处理和处理用于分析和转换为更有用的参数和格式，以便对宏观区域进行首次筛选。
注：以下操作（第 1.2 步）专门用于最终完成的数据处理，将来自较低级别的原始数据转换为信息，然后转化为有用的信息（更高级别）。此步骤包括处理来自每个传感器的原始数据（例如，产品级别 0-1）并转换为更高级的产品（例如，级别 2-4），然后在信息层中生成更有用的参数和格式（例如主题地图）。- 涉及几何和辐射校准的预处理原始数据。此操作可以使用特定软件执行，该软件以自动或半自动的方式（不受监督或监督）提供一组连接工具，用于铲刀处理，以便执行尊重正确工作流程的简单分类。
注：在本研究中，使用两个免费开源工具：Q-GIS 3.1428 与半自动分类插件 （SCP） 相结合。SCP 插件29 允许对遥感图像进行半自动分类，为免费图像的下载、预处理、后处理和鼠击计算提供了完整的工具集。 - 过程校准数据计算多光谱索引。通常，此操作使用鼠击计算器工具执行。多光谱索引的计算定义了不同波段/层之间的相关性，从而生成一个可以在 GIS 平台上管理的新层。例如，从哨兵和 Landsat 操作陆地成像仪传感器 （OLI） 开始，可以计算多光谱索引，如规范化差分植被指数 （NDVI）。然后，植被指数用于估计叶绿素含量30，31。
- 分析假彩色主题图中叶绿素含量指数的估计结果，确定叶绿素浓度高的关键区域。在这项研究中，叶绿素-a地图是使用安装在Terra和Aqua卫星平台上的MODIS传感器32的数据集生成的。在记录异常值时，对取样点进行本地化。
注：当Chl-a浓度超过20毫克/升33时，藻类绽放标志（定义每个特定点）在遥感领域升起。
- 涉及几何和辐射校准的预处理原始数据。此操作可以使用特定软件执行，该软件以自动或半自动的方式（不受监督或监督）提供一组连接工具，用于铲刀处理，以便执行尊重正确工作流程的简单分类。
2. 引导抽样
注：采样点的选择由遥感/近地传感层分析驱动，允许在大型沿海地区选择点。考虑到由于微囊素的毒性，取样对操作员可能很危险，因此需要进行安全取样程序。特别需要保护操作员免受气溶胶吸入和皮肤接触。然后，按照下面详细的程序进行取样。
- 戴上护目镜，保护眼睛，FFP2面膜，以防止气溶胶吸入，和安全手套，以防止皮肤接触。
- 在每个站点收集 0.5 升三脚架水。
- 使用折射计测量每个样品的盐度。将样品滴放在折射仪上，并读取千分之一（ppt - ‰）的盐度值。
- 在取样结束时，先洗手：然后又取下手套、口罩和护目镜，小心不要触摸个人防护设备的外部表面。
- 在室温下将样品带到实验室。
3. 通过微观观察和分类鉴定鉴定蓝藻物种
- 每个样品（≈0.5升）在11，200 x 克 5分钟。
- 提取超纳特如下：在每个样品中倒入500毫升丁醇，并使用漏斗，将混合物转移到分离漏斗中。将分离漏斗直立放置在环夹中，使两层分开。让水相排入埃伦迈尔烧瓶中。重复此步骤三次。然后，在真空中浓缩有机相，并称重它们。
- 从步骤 3.1 收集颗粒，并以 400 倍和 1，000 倍的放大倍数进行分析，配备配备 18 MP 数码相机的光学显微镜用于显微镜。根据蓝绿色、细胞形状和大小等微生物的形态特征，寻找蓝藻的存在。
- 根据科马雷克等人2014年34年描述的程序，通过微观观察分类分析确定该物种。
注：可以进行补充的16S元基因组分析，以确定蓝藻分类3。 - 根据颗粒的盐度，用10mL的海水/淡水BG11介质稀释颗粒，用于种植。
4. 氰毒素鉴定
- 用有机溶剂提取样品
- 将每个颗粒样本放入烧瓶中，使用冰浴将声波酸盐放入 5 分钟。然后，加入50毫升的新鲜MeOH，轻轻摇动。使用纸过滤器过滤溶液，并将过滤液收集到圆形底部烧瓶中。重复此步骤两次。然后，提取加入MeOH/DCM两次（1：1，50 mL）的50mL混合物的颗粒，并两次使用100%DCM（x2，50mL）35。将每个圆形底部烧瓶分别标记为"MEOH 提取物"、"MEOH/DCM 提取物"和"DCM 提取物"，并在真空下浓缩。
- 通过LC-HRMS/MS分析每个有机提取物（MEOH、MEOH/DCM、DCM）。
- LC-HRMS/MS 分析
- LC-HRMS 和 LC-HRMS/MS 样品制备：使用 MeOH 溶解每个样品≥ 99.9%，最终浓度为 10 毫克/mL。
- 使用高分辨率 ESI 质谱仪与 HPLC 系统 （LC-HRMS/MS 系统） 分析每个样本。在室温下使用 5μm C18 列（100 x 2.10 mm）处理 HPLC。使用梯度弹性与H2O（补充0.1%HCOOH）和MeOHat 200μL最小-1。梯度程序是：10%MeOH 3分钟，10%至100%MEOH 30分钟，100%MEOH 7分钟。使用MEOH作为控制。
- 数据采集。在数据依赖采集模式 （DDA） 中收集数据：全扫描质量谱的 10 个最密集的离子必须接受高分辨率串联质谱 （HRMS/MS） 分析。获取 HRMS/MS 扫描选定的 CID 碎片化离子、2.0 的隔离宽度、35 的规范化碰撞能量、0.250 的激活 Q 和 30 毫秒的激活时间。
- 生物信息分析和分子网络
- 使用MS特定软件分析每个强离子的碎片化模式。
- 使用 MS-Cluster 对数据进行聚类（父质量容差为 1.0 Da，MS/MS 片段离子容差为 0.5 Da）。消除包含小于 2 光谱的共识光谱。
- 分析MS/MS数据由GNPS（全球天然产品社会36）分子网络。
- 对比共识光谱，也与GNPS-Mass-Ive库中报告的光谱进行比较。
- 可视化获得的网络37。
注：有关分子网络，请参阅西格里斯特等人202038。
图3：FDS实验室内步骤（3-4）。采样后在实验室进行的主要活动的视觉表现（第 3 步和第 4 步）。请单击此处查看此图的较大版本。
Representative Results
在一项第3项研究中，2015年夏季，在意大利西南部坎帕尼亚海岸，使用卫星Landsat 8和飞机观测到4个受人类影响的地点。Landsat 8 可操作陆地成像传感器 （OLI） 和飞机多光谱摄像机允许为这些区域创建标准化差异水指数 （NDWI） 图像，从而揭示蓝藻群落的存在。蓝藻群落组成是通过光谱光度分析确定的，用于检测蓝藻色素植物青素（PC）。然后，补充的16S元基因组分析允许识别蓝藻分类。通过卫星/航空平台结合计量学分析简化的多光谱图像索引和分类，在开花的早期阶段有效地检测了属于与强富营养病（如 Leptolyngbya sp.、Pseudoosillatoria sp.）相关的属属蓝藻的存在。
在第二项研究14中，FDS方法在2017年春夏期间进行了测试。卫星数据被用作唯一的遥感水平。详细地，MODerate图像光谱仪（MODIS）传感器获得的数据安装在Terra和Aqua卫星平台上，允许对坎帕尼亚沿岸水体中的叶绿素-a（Chl-a）进行量化，并推动了10个采样点的选择。样品在实验室中通过微观观察和分类鉴定进行处理，然后用有机溶剂提取。有机提取物通过LC-MS-MS分析进行处理。MS-MS 获得的数据使用生物信息学方法进行分析，使用 GNPS 平台创建分子网络。对网络进行了分析，以检测和识别毒素，将质谱学获得的碎片光谱数据与GNPS库进行比较。这允许检测已知的毒素和未知的模拟，这些类似物将出现在同一分子网络中。具体来说，在所有水样和双壳体样本中都检测到一种嗜脂性皮霉毒素Lyngbyatoxin A：在林比阿托辛分子簇中，也存在与林比亚毒素家族中任何已知化合物无关的节点，这表明存在未知的林比亚毒素模拟物。样品中未检出微囊素和其他毒素。所有结果都是在24小时内取得的。
图4：FDS代表结果。在坎帕尼亚海岸（意大利）应用FDS战略的一个例子。请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
在过去的几年里，我们的团队测试并验证了几种不同的方法，这些方法可以解开水体和双壳体中蓝藻和蓝藻毒素的存在。新的发展战略代表了这些研究的结果。符合快速检测范围的最佳技术和工艺，聚集在一个独特的程序的帽子下，最大限度地提高每个步骤的有效性。目标面积、开花期和生长阶段是选择适当方法和技术的驱动力。
当蓝藻和氰毒素快速检测是重中之重时，战略被简化为将总数简化为四个主要步骤：（1） 首次调查的远程和近向传感和数据分析、站点的本地化以及开花模式和扩展的定义：（2） 引导抽样：（三）微观观察和分类分析：（4） LC-MS数据的化学分析和分子网络，用于水样去复制和细胞毒素的快速检测。
关于第一步，即使覆盖所有层次监测方法的所有层的完整平台链获得的数据可用性是恢复所分析场景完整愿景的最佳解决方案，通常只有一个信息层可以驱动区域调查行动，并有效地专注于热点进行现场采样操作。根据报告的经验，利用卫星、飞机、直升机、无人机获取数据，完全符合快速探测战略所需需求的解决办法是使用唯一的卫星产品。
此外，来自在低空飞行的平台（如飞机、直升机、无人机）执行的任务的信息层以极高的分辨率重述信息，但这些信息非常昂贵，还需要更多的时间来完成完整的获取过程，其中还包括飞行计划的定义和批准。
一旦选定了要取样点（第 2 步），分析/生物信息学分析（LC-MS 数据的分子网络）是快速去复制水样和快速检测氰毒素（步骤 3 和 4）的工具。16S计量分析至少需要2周的工作。此外，即使发现具有一般毒性的蓝藻物种，其毒素生产也未得到证明。出于同样的原因，微观观察本身不足以揭示有毒蓝藻的存在。当然，MS分析和分子网络有一定的局限性：如果感兴趣的化合物（如毒素）在应用条件下电化良好，如果它们有足够的量被检测出来，它们是相当有效的。为了已知的蓝藻毒素检测和监测，基于MS的分子网络实际上是一种更可靠、更可靠的技术。
因此，当需要快速检测蓝藻和相关氰毒素时，这种方法被证明是非常有用的：此外，通过这一战略，还可以量化蓝藻的开花和在空间和时间上的毒素，以防止健康社区的问题，可能由大蓝藻有毒开花。
Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究由"西库雷扎·萨尼塔里亚·德尔佩斯卡托（CRiSSAP）地区中心"在项目框架中资助，"阿提维蒂·试点迪·迪亚诺巴泰里·内拉·法西亚·科斯蒂埃拉·德拉地区坎帕尼亚"， 并与意大利坎帕尼亚地区环境保护局（ARPAC）合作，"梅佐焦尔诺动物园"/西库雷扎阿里门塔雷区（IZSM/ORSA），那不勒斯大学"费德里科二世"-兽医和动物生产系，阿纳斯塔西奥教授）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Vitamin mix | Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B12 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL | ||
| 1-BuOH | Sigma-Aldrich | 33065.2.5L-R | |
| BG11 stock solution | Na2EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H2O 120 mg/L; CaCl2·2H2O 700 mg/L, MgSO4·7H2O 1.5 g/L, K2HPO4·3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4·6H2O (0.1 mM stock) 5 mL; Na2SeO4 (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL | ||
| Centrifuge | Hermle | Z36HK | |
| CHCl3 | Honeywell | 32211.2.5L | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 34877.2.5L | |
| Kinetex C18 cloumn | Phenomenex | ||
| LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system | Thermo | ||
| MeOH | Honeywell | 32213.2.5L | |
| Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera | Optech | Biostar B3 | |
| Multiband camera | Intergraph DMC | ||
| Nitsch's Solution | H3BO3 0.5 g/L MnSO4· H2O 2.28 g/L ZnSO4·7H2O 0.5 g/L CuSO4·5H2O 0.025 g/L COCl2·6H2O 0.135 g/L Na2MoO4·2H2O 0.025 g/L |
||
| Refractomer mr 100 ATC | AQL | ||
| SWBG11 medium | BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L |
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