En hurtig-tværfagligt strategi for tidlig påvisning af cyanobakterielle blomster og tilhørende cyanotoksiner er beskrevet her. Det giver mulighed for påvisning af cyanobakterier og relaterede cyanotoksiner i vandprøver og i organiske matricer, såsom toskallede prøver, i 24 timer.
Hurtig påvisning af cyanobakterier og cyanotoksiner opnås ved hjælp af en hurtig påvisningsstrategi (FDS). Kun 24 timer er nødvendige for at optrævle tilstedeværelsen af cyanobakterier og relaterede cyanotoksiner i vandprøver og i en organisk matrix, såsom toskallede ekstrakter. FDS kombinerer fjern-/proksimale sensorteknikker med analytiske/bioinformatikanalyser. Prøvetagningssteder vælges ved hjælp af tværfaglig, multi-skala og multi-parametrisk overvågning i et tredimensionelt fysisk rum, herunder telemåling. Mikroskopisk observation og taksonomisk analyse af prøverne udføres i laboratorieindstillingen, hvilket gør det muligt at identificere cyanobakterielle arter. Prøverne udtrækkes derefter med organiske opløsningsmidler og behandles med LC-MS/MS. Data indhentet af MS/MS analyseres ved hjælp af en bioinformatatisk tilgang ved hjælp af onlineplatformen Global Natural Products Social (GNPS) for at skabe et netværk af molekyler. Disse netværk analyseres for at opdage og identificere toksiner og sammenligner data om fragmenteringsspektre opnået ved massespektrometri med GNPS-biblioteket. Dette gør det muligt at detektere kendte toksiner og ukendte analoger, der vises relateret i det samme molekylære netværk.
Cyanobakterielle blomster er dukket op som et miljøproblem over hele verden i de sidste 15 år1,2. Cyanobakterielle blomster skyldes overvæksten af mikroorganismer ved navn cyanobakterier. De er en iøjnefaldende gruppe af fotosyntetiske mikroorganismer, der har tilpasset sig til at leve i en lang række miljøer, herunder tropiske områder og ekstremt koldt vand. De er kendt for at producere store blomster, der dækker vandoverflader, især som reaktion på en massiv berigelse af næringsstoffer, den såkaldte eutrofieringsproces3.
Derfor cyanobakterier er fremragende bioindikatorer for vandforurening4,5,6. De kan også producere en bred vifte af naturlige forbindelser med interessante farmakologiske egenskaber7,8. Miljøproblemet i forbindelse med cyanobakterier er selve blomsterne. Blooms kan blokere sollys til undervandsgræs, forbruge ilt i vandet, der fører til fisk dræber, producere overflade afskum og lugt, og forstyrre filter fodring af organismer9.
Derudover, og endnu mere alvorligt, i en bestemt kombination af faktorer som temperatur, næringsstoffer (fosfor og nitrogen), sollys (til fotosyntesen) og pH i vandet udløser cyanobakterielle blomster toksinproduktion; derfor bliver de skadelige for mennesker og dyr. Den mest undersøgte klasse af cyanotoksiner produceres af slægterne Microcystis. Disse er cykliske peptider kendt under det generelle navn microcystins (MCs): microcystin-LR er den mest undersøgte som værende i stand til at producere svær hepatoxicitet10. Dyr og mennesker kan blive udsat for MCs ved indtagelse af forurenet drikkevand eller mad. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) foreslog en samlet mikrocystin-LR-værdi på 0,001 mg/l som retningslinje11. Dette er dog kun relateret til en variant (dvs. MC-LR) ud af mere end 100 mikrocystins, der er blevet isoleret indtil videre.
Kombinerede metoder tidligere rapporteret, såsom telemåling med MALDI-TOF MS analyse12,13,14,15, har fokuseret på koncentrationen påvisning af MC’er. De nyeste metoder bruger sensorer med lav opløsning, der kun er effektive til at detektere brede bloom-vidder; de er også i stand til kun at afsløre toksiner, for hvilke der findes standarder. Desuden er de fleste af disse procedurer tidskrævende, og tid er en dramatisk faktor for tidlig påvisning af blomsten for at forhindre eller minimere sikkerhedsproblemer. Den tværfaglige strategi, der foreslås her, giver hurtig påvisning af cyanobakterier og cyanotoksiner, efter kun 24 h16.
I rammen af programmet kaldet MuM3, “Multi-disciplinære, Multi-skala og Multi-parametrisk overvågning i de tre-dimensionelle (3D) fysiske rum”17,18, en Fast Detection Strategy (FDS) kombinerer fordelene ved flere teknikker: 1) telemåling at opdage blomsten; 2) mikroskopisk observation til påvisning af cyanobakterier og 3) analyseanalyser af analytiske/bioinformatik, nemlig LC-HRMS-baseret molekylært netværk, til påvisning af cyanotoksiner. Resultaterne opnås inden for 24 timer.
Den nye metode er nyttig til at overvåge store kystområder på kort tid, undgå talrige stikprøver og analyser og reducere detektionstid og omkostninger. Denne strategi er resultatet af undersøgelsen og anvendelsen af forskellige tilgange til overvågning af cyanobakterier og deres toksiner og kombinerer fordelene ved hver af dem. Specifikt gjorde analysen af resultaterne, der kom fra brugen af forskellige platforme (satellit, fly, droner) og sensorer (MODIS, termisk infrarød) til telemålingsanalyse, såsom forskellige metodologiske tilgange til identifikation af cyanobakterielle arter (mikroskop, UV-Vis-spektroskopi, 16S-analyse) og toksiner (LC-MS-analyse, molekylærnetværk), det muligt at vælge den mest hensigtsmæssige metode til både specifikke og generelle formål. Den nye metode blev eksperimenteret og valideret i efterfølgende overvågningskampagner på Campania kyster (Italien), inden for rammerne af Campania miljøbeskyttelse agentur overvågningsprogram.
Figur 1: FDS-strategi. En oversigt over fastdetekteringsstrategi for cyanobakterier og cyanotoksiner. Klik her for at se en større version af dette tal.
I løbet af de sidste år testede og validerede vores team flere forskellige tilgange, der gjorde det muligt at optrævle tilstedeværelsen af cyanobakterier og cyanotoksiner i vandlegemer og muslinger. Den nye strategi er resultatet af disse undersøgelser. De optimale teknikker og teknologier, der passer til omfanget af hurtig detektion, samles under hatten af en unik procedure, der maksimerer effektiviteten af hvert enkelt trin. Målområdet, bloom-udvidelsen og vækstfasen er drivkraften bag valget af egnede metoder og teknologier, der skal bruges.
Når cyanobakterier og cyanotoksiner hurtig påvisning er prioriteten, strømlines strategien, hvilket reducerer det samlede antal til fire hovedtrin: (1) Fjern- og proksimal sensing og dataanalyse til en første undersøgelse, lokalisering af steder og definition af blomstermønster og udvidelse; (2) Styret prøveudtagning; (3) mikroskopisk observation og taksonomisk analyse (4) Kemisk analyse og molekylært netværk af LC-MS-data med henblik på dereplication af vandprøverne og hurtig påvisning af cyanotoksiner.
Med hensyn til det første skridt, selv om tilgængeligheden af data, der er erhvervet af en komplet kæde af platforme, der dækker alle lag af hierarkisk overvågning tilgang ville være den bedste løsning til at genskabe en komplet vision af det analyserede scenario, ofte kun ét informationslag kan drive området undersøgelse handling og effektivt fokusere på hot spots til at udføre in-situ prøvetagning aktioner. Ifølge de rapporterede erfaringer, hvor data blev erhvervet ved hjælp af satellitter, fly, helikoptere, UAV’er, er den løsning, der helt svarer til de behov, der kræves i strategien for hurtig detektion, brugen af de eneste satellitprodukter.
Derudover restituerer de informationslag, der stammer fra missioner, der udføres af platforme, der flyver i lavere højder end satellitter (f.eks. fly, helikoptere, UAV’er), information med stor opløsning, men disse er meget dyre og kræver også mere tid til at fuldføre den fulde erhvervelsesproces, der også omfatter flyveplan definere og godkendelse.
Når de steder, der skal udtages prøver, er blevet udvalgt (trin 2), er analyse af analytisk/bioinformatik (molekylært netværk af LC-MS-data) værktøjet til hurtig desplikation af vandprøverne og hurtig påvisning af cyanotoksiner (trin 3 og 4). 16S metagenomisk analyse tager mindst 2 ugers arbejde. Selv når cyanobakterielle arter, der er generisk giftige, identificeres, påvises deres toksinproduktion ikke. Af samme grund er mikroskopisk observation ikke i sig selv tilstrækkelig til at afsløre tilstedeværelsen af giftige cyanobakterier. Selvfølgelig har MS-analyse og molekylære netværk nogle begrænsninger; de er ret effektive, hvis interesseforbindelser (f.eks. toksiner) er godt ioniseret under de anvendte forhold, hvis de er i tilstrækkelig mængde til at blive opdaget. Med henblik på den kendte cyanobakterielle toksindetektion og overvågning repræsenterer MS-baseret molekylærnetværk faktisk en af de mere robuste og pålidelige teknologier.
Derfor viser denne tilgang sig at være ganske nyttig, når der er behov for en hurtig påvisning af cyanobakterier og relaterede cyanotoksiner; desuden kvantificering af både cyanobakterielle blomstre og toksin over tid og rum er også muligt ved denne strategi for at forhindre sundhedsfællesskaber problemer, der kan opstå ved store cyanobakterielle giftige blomster.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret af “Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)” inden for rammerne af projektet “Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania”. og udføres i samarbejde med Campania-regionen Environmental Protection Agency, Italien (ARPAC), “Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare” (IZSM/ORSA), University of Napoli “Federico II” – Department of Veterinary Medicine and Animal Production, ref. prof. A. Anastasio).
10X Vitamin mix | Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B12 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL | ||
1-BuOH | Sigma-Aldrich | 33065.2.5L-R | |
BG11 stock solution | Na2EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H2O 120 mg/L; CaCl2·2H2O 700 mg/L, MgSO4·7H2O 1.5 g/L, K2HPO4·3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4·6H2O (0.1 mM stock) 5 mL; Na2SeO4 (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL | ||
Centrifuge | Hermle | Z36HK | |
CHCl3 | Honeywell | 32211.2.5L | |
H2O | Sigma-Aldrich | 34877.2.5L | |
Kinetex C18 cloumn | Phenomenex | ||
LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system | Thermo | ||
MeOH | Honeywell | 32213.2.5L | |
Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera | Optech | Biostar B3 | |
Multiband camera | Intergraph DMC | ||
Nitsch's Solution | H3BO3 0.5 g/L MnSO4· H2O 2.28 g/L ZnSO4·7H2O 0.5 g/L CuSO4·5H2O 0.025 g/L COCl2·6H2O 0.135 g/L Na2MoO4·2H2O 0.025 g/L |
||
Refractomer mr 100 ATC | AQL | ||
SWBG11 medium | BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L |