Una estrategia rápido-multidisciplinaria para la detección temprana de floraciones de las cianobacterias y de cianotoxinas asociadas se describe aquí. Permite la detección de cianobacterias y cianotoxinas relacionadas en muestras de agua y en matrices orgánicas, como muestras de bivalvos, en 24 h.
La detección rápida de cianobacterias y cianotoxinas se logra utilizando una estrategia de detección rápida (FDS). Solo se necesitan 24 h para desentrañar la presencia de cianobacterias y cianotoxinas relacionadas en muestras de agua y en una matriz orgánica, como los extractos de bivalvos. Fds combina técnicas de teledetección/proximal con análisis analíticos/bioinformáticos. Los puntos de muestreo se eligen mediante un monitoreo multidisciplinario, multiescala y multiparasital en un espacio físico tridimensional, incluida la teledetección. La observación microscópica y el análisis taxonómico de las muestras se realizan en el entorno de laboratorio, lo que permite la identificación de especies de cianobacterias. A continuación, las muestras se extraen con disolventes orgánicos y se procesan con LC-MS/MS. Los datos obtenidos por MS/MS se analizan utilizando un enfoque bioinformático utilizando la plataforma en línea Global Natural Products Social (GNPS) para crear una red de moléculas. Estas redes se analizan para detectar e identificar toxinas, comparando los datos de los espectros de fragmentación obtenidos por espectrometría de masas con la biblioteca GNPS. Esto permite la detección de toxinas conocidas y análogos desconocidos que aparecen relacionados en la misma red molecular.
Las floraciones de cianobacterias han surgido como un problema ambiental en todo el mundo en los últimos 15 años1,2. Las floraciones de cianobacterias se deben al crecimiento excesivo de microorganismos llamados cianobacterias. Son un conspicuo grupo de microorganismos fotosintéticos que se han adaptado para vivir en una gran variedad de ambientes, incluyendo áreas tropicales y aguas extremadamente frías. Son conocidos por producir grandes floraciones que cubren las superficies del agua, especialmente en respuesta a un enriquecimiento masivo de nutrientes, el llamado proceso de eutrofización3.
Por lo tanto, las cianobacterias son excelentes bioindicadoras de la contaminación del agua4,5,6. También pueden producir una amplia gama de compuestos naturales con interesantes propiedades farmacológicas7,8. El problema ambiental relacionado con las cianobacterias son las propias floraciones. Las floraciones pueden bloquear la luz solar a las gramíneas submarinas, consumir oxígeno en el agua provocando la muerte de los peces, producir escoria superficial y olores, e interferir con la alimentación filtrante de los organismos9.
Además, y aún más grave, en una combinación específica de factores como la temperatura, los nutrientes (fósforo y nitrógeno), la luz solar (para la fotosíntesis) y el pH del agua, las floraciones de cianobacterias desencadenan la producción de toxinas; por lo tanto, se vuelven perjudiciales para los seres humanos y los animales. La clase más estudiada de cianotoxinas es la producida por los géneros Microcystis. Se trata de péptidos cíclicos conocidos bajo el nombre general de microcistinas (MCs): siendo la microcistina-LR la más estudiada como capaz de producir hepatotoxicidad severa10. Los animales y los seres humanos pueden estar expuestos a los MCs por la ingestión de agua potable o alimentos contaminados. La Organización Mundial de la Salud (OMS) sugirió un valor total de microcistina-LR de 0,001 mg/L como pauta11. Sin embargo, esto se relaciona solamente con una variante (es decir, MC-LR) fuera de más de 100 microcystins que se han aislado hasta ahora.
Los métodos combinados previamente reportados, como la teledetección con el análisis MALDI-TOF MS12,13,14,15,se han centrado en la detección de concentración de MCs. Los métodos más recientes utilizan sensores de baja resolución que son efectivos para detectar solo amplias extensiones de floración; también son capaces de revelar sólo las toxinas para las que se dispone de normas. Además, la mayoría de estos procedimientos consumen mucho tiempo, y el tiempo es un factor dramático para la detección temprana de la floración para prevenir o minimizar los problemas de seguridad. La estrategia multidisciplinar aquí propuesta proporciona una rápida detección de floración de cianobacterias y cianotoxinas, después de sólo 24 h16.
En el marco del programa denominado MuM3, “Monitoreo Multidisciplinario, Multiescala y Multi-paramétrico en el espacio físico tridimensional (3D)”17,18,una Estrategia de Detección Rápida (FDS) combina las ventajas de varias técnicas: 1) teledetección para detectar la floración; 2) observación microscópica para detectar especies de cianobacterias; y 3) análisis analíticos/bioinformáticos, a saber, redes moleculares basadas en LC-HRMS, para detectar cianotoxinas. Los resultados se obtienen dentro de las 24 h.
El nuevo enfoque es útil para vigilar amplias zonas costeras en poco tiempo, evitando numerosos muestreos y análisis, y reduciendo el tiempo y los costes de detección. Esta estrategia es el resultado del estudio y aplicación de diferentes enfoques para el seguimiento de las cianobacterias y sus toxinas y combina las ventajas de cada una de ellas. En concreto, el análisis de los resultados, procedentes del uso de diferentes plataformas (satélite, aeronaves, drones) y sensores (MODIS, infrarrojo térmico) para el análisis de teledetección, como de diversos enfoques metodológicos para la identificación de especies de cianobacterias (microscopio, espectroscopia UV-Vis, análisis 16S) y toxinas (análisis LC-MS, redes moleculares), permitió seleccionar el método más adecuado tanto para los fines específicos como generales. La nueva metodología fue experimentada y validada en campañas de monitoreo posteriores en las costas de Campania (Italia), en el marco del programa de monitoreo de la agencia de protección ambiental de Campania.
Figura 1:Estrategia FDS. An overview of Fast Detection Strategy for cyanobacteria and cyanotoxins. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Durante los últimos años, nuestro equipo probó y validó varios enfoques diferentes que permitieron desentrañar la presencia de cianobacterias y cianotoxinas en cuerpos de agua y bivalvos. La nueva estrategia desarrollada representa el resultado de estos estudios. Las técnicas y tecnologías óptimas que se ajustan al alcance de la detección rápida, se reúnen bajo el sombrero de un procedimiento único que maximiza la eficacia de cada paso. El área objetivo, la extensión de la floración y la etapa de crecimiento son la fuerza impulsora para la elección de métodos y tecnologías adecuados para usar.
Cuando la detección rápida de cianobacterias y cianotoxinas es la prioridad, la estrategia se racionaliza reduciendo el número total a cuatro pasos principales: (1) Detección remota y proximal y análisis de datos para un primer estudio, localización de sitios y definición de patrón de floración y extensión; (2) Muestreo guiado; (3) Observación microscópica y análisis taxonómico; (4) Análisis químico y redes moleculares de datos LC-MS para la desreplicación de las muestras de agua y la detección rápida de cianotoxinas.
En cuanto al primer paso, incluso si la disponibilidad de datos adquiridos por una cadena completa de plataformas que cubren todas las capas del enfoque de monitoreo jerárquico sería la mejor solución para restituir una visión completa del escenario analizado, a menudo solo una capa de información puede impulsar la acción de la encuesta de área y centrarse efectivamente en los puntos calientes para realizar acciones de muestreo in situ. De acuerdo con las experiencias reportadas en las que se adquirieron datos utilizando satélites, aeronaves, helicópteros, UAV, la solución que se ajusta totalmente a las necesidades requeridas por la estrategia de detección rápida es el uso de los únicos productos satelitales.
Además, las capas de información que derivan de las misiones realizadas por plataformas que vuelan a altitudes más bajas que los satélites (por ejemplo, aeronaves, helicópteros, UAV) restituyen información con gran resolución, pero estas son muy costosas y también requieren más tiempo para completar el proceso de adquisición completo que también incluye la definición y aprobación del plan de vuelo.
Una vez seleccionados los puntos a ser muestras (paso 2), los análisis analíticos/bioinformáticos (redes moleculares de datos LC-MS) son la herramienta para la desreplicación rápida de las muestras de agua y la detección rápida de cianotoxinas (pasos 3 y 4). El análisis metagenómico 16S toma al menos 2 semanas de trabajo. Además, incluso cuando se identifican especies de cianobacterias que son genéricamente tóxicas, no se demuestra su producción de toxinas. Por la misma razón, la observación microscópica no es suficiente para revelar la presencia de cianobacterias tóxicas. Por supuesto, el análisis de la EM y las redes moleculares tienen algunas limitaciones; son bastante eficaces si los compuestos de interés (por ejemplo, toxinas) están bien ionizados en las condiciones aplicadas, si están en cantidad suficiente para ser detectados. Con el fin de la detección y monitoreo de toxinas de cianobacterias conocidas, las redes moleculares basadas en LA EM representan en realidad una de las tecnologías más robustas y confiables.
Por lo tanto, este enfoque demuestra ser bastante útil cuando se necesita una detección rápida de cianobacterias y cianotoxinas relacionadas; además, la cuantificación tanto de la floración de cianobacterias como de la toxina en el espacio y el tiempo también es posible mediante esta estrategia para prevenir los problemas de las comunidades de salud que podrían surgir por las grandes floraciones tóxicas de cianobacterias.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue financiada por “Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)” en el marco del proyecto “Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania”, y realizada en cooperación con la Agencia de Protección Ambiental de la Región de Campania, Italia (ARPAC), “Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare” (IZSM/ORSA), Universidad de Nápoles “Federico II” – Departamento de Medicina Veterinaria y Producción Animal, ref. prof. A. Anastasio).
10X Vitamin mix | Nicotinic acid 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotin 1 mg/100 mL; Thiamine 200 mg/100 mL; B12 1 mg/100 mL; Folic Acid 1 mg/100 mL; i-inositol 1 mg/100 mL; Ca-pantothenate 100 mg/100 mL | ||
1-BuOH | Sigma-Aldrich | 33065.2.5L-R | |
BG11 stock solution | Na2EDTA 20 mg/L; Ferric ammonium citrate 120 mg/L; Citric acid·1H2O 120 mg/L; CaCl2·2H2O 700 mg/L, MgSO4·7H2O 1.5 g/L, K2HPO4·3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4·6H2O (0.1 mM stock) 5 mL; Na2SeO4 (0.1 mM stock) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL | ||
Centrifuge | Hermle | Z36HK | |
CHCl3 | Honeywell | 32211.2.5L | |
H2O | Sigma-Aldrich | 34877.2.5L | |
Kinetex C18 cloumn | Phenomenex | ||
LTQ Orbitrap XL high-resolution ESI mass spectrometer coupled to a U3000 HPLC system | Thermo | ||
MeOH | Honeywell | 32213.2.5L | |
Microscope equipped with an OMAX 18 MP CMOS camera | Optech | Biostar B3 | |
Multiband camera | Intergraph DMC | ||
Nitsch's Solution | H3BO3 0.5 g/L MnSO4· H2O 2.28 g/L ZnSO4·7H2O 0.5 g/L CuSO4·5H2O 0.025 g/L COCl2·6H2O 0.135 g/L Na2MoO4·2H2O 0.025 g/L |
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Refractomer mr 100 ATC | AQL | ||
SWBG11 medium | BG11 stock solution 50 mL/L; Instant Ocean 33 g/L; Water 950 mL/L 10X; Vitamin mix 100 µL/L |