Summary
وقد تورطت مناطق المخيخ المختلفة للعب دور في النواتج السلوكية المتميزة، ومع ذلك لا تزال الآليات الجزيئية الكامنة غير معروفة. يصف هذا العمل طريقة لتشريح قشرة المخيخ بشكل مستنسخ وسريع في نصفي الكرة الأرضية والمناطق الأمامية والخلفية من الحشرات ، والنوى المخيخية العميقة من أجل التحقيق في الاختلافات الجزيئية عن طريق عزل الحمض النووي الريبي واختبار الاختلافات في التعبير الجيني.
Abstract
المخيخ يلعب دورا هاما في العديد من الوظائف الرئيسية بما في ذلك السيطرة على الحركة, توازن, الإدراك, مكافأة, وتؤثر. تشير دراسات التصوير إلى أن مناطق المخيخ المتميزة تساهم في هذه الوظائف المختلفة. الدراسات الجزيئية دراسة الاختلافات المخيخ الإقليمية متخلفة كما يتم في الغالب على مقتطفات المخيخ كله وبالتالي إخفاء أي تمييز عبر مناطق المخيخ محددة. هنا نصف تقنية لتشريح أربع مناطق مخيخية مختلفة بشكل مستنسخ وسريع: نواة المخيخ العميقة (DCN) ، قشرة المخيخ الأمامية والخلفية ، والقشرة المخيخية في نصفي الكرة الأرضية. تشريح هذه المناطق المتميزة يسمح باستكشاف الآليات الجزيئية التي قد تكمن وراء مساهماتها الفريدة في التوازن والحركة والتأثير والإدراك. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لاستكشاف الاختلافات في قابلية المرضية من هذه المناطق المحددة عبر نماذج مختلفة مرض الماوس.
Introduction
المخيخ يحتوي على أكثر من نصف الخلايا العصبية في الدماغ، وقد تاريخيا يشار إليها باسم مركز التحكم في المحركات والتوازن في الدماغ1. في الآونة الأخيرة ، أثبتت الدراسات أن المخيخ يلعب دورا رئيسيا في وظائف أخرى مختلفة بما في ذلك الإدراك ، ومعالجة المكافأة ، وتؤثر على2و3و4و5.
المخيخ لديه تشريح موصوف جيدا: تتكون منطقة القشرة من حبيبات وبوركينجي وطبقات جزيئية. تشكل خلايا الحبيبات طبقة الخلية الحبيبية وترسل مدخلات عبر ألياف متوازية إلى تشعبات خلايا بوركينجي للطبقة الجزيئية التي تتلقى أيضا مدخلات من ألياف التسلق التي نشأت في الزيتون السفلي. ترسل خلايا بوركينجي إسقاطات مثبطة إلى الخلايا في نواة المخيخ العميقة (DCN) ، والتي تعمل كخرج رئيسي من المخيخ. يتم تعديل إخراج هذه الدائرة المخيخية من خلال نشاط الخلايا الداخلية المثبطة في قشرة المخيخ ، بما في ذلك Golgi و stellate و خلايا السلة4. يتم توزيع هذه الوحدة الوظيفية المخيخ في جميع أنحاء lobules من قشرة المخيخ. على الرغم من هذه الدوائر موحدة نسبيا عبر المخيخ, الأدلة من الأدب التصوير العصبي البشري ودراسات المريض يشير إلى عدم التجانس الوظيفي للميخيخ6,7.
يمكن تقسيم قشرة المخيخ إلى منطقتين رئيسيتين: الحشرات المحددة في منتصف الخط، ونصفي الكرة الأرضية الجانبيين. يمكن تقسيم الحشرات إلى مصابيح الأمامي والخلفي. وقد تورطت هذه المناطق المتميزة من المخيخ في المساهمة في سلوكيات مختلفة. أنماط النشاط التي تثيرها المهام أو الخالية من المهام تورط فيها أن المناطق الأمامية من الحشرات تساهم بشكل أكبر في الوظيفة الحركية في حين تساهم الحشرات الخلفية بشكل أكبر في الإدراك6 ،7. ويرتبط أيضا مع vermis تؤثر والعواطف، في حين أن نصفي المخيخ تسهم في التنفيذية والبصرية المكانية واللغة، وغيرها من الوظائف الذاكرية8. بالإضافة إلى ذلك، قدمت الدراسات التشريحية أدلة على أن مناطق المخيخ المتميزة وظيفيا ترتبط بالمناطق القشرية المختلفة9. كشف رسم خرائط أعراض الآفة أن المرضى الذين يعانون من السكتات الدماغية التي تؤثر على الفص الأمامي (تمتد إلى lobule VI) كان أداؤهم ضعيفا في المهام الحركية الدقيقة ، في حين أظهر المرضى الذين يعانون من تلف في مناطق الفص الخلفي ونصفي الكرة الأرضية عجزا معرفيا في غياب متلازمة المخيخ الحركي10. وأخيرا ، تشير أمراض المخيخ الإقليمية في المرض إلى أن مناطق المخيخ المتميزة وظيفيا معرضة أيضا بشكل مختلف للمرض11و12.
في حين أن أقل بكثير استكشافها، والأدلة الأولية يدل على توقيعات التعبير الجيني متميزة عبر المناطق القشرية المخيخية. Purkinje تعبير الخلية من زيبرين الثاني يظهر نمط المنطقة محددة في vermis بحيث يكون هناك المزيد من الخلايا الإيجابية زيبريني الثاني في lobules الخلفي وأقل في lobulesالأمامية 13. ويرتبط هذا أيضا مع وظيفة الفسيولوجية متميزة إقليميا كما Zebrin II خلايا بوركينجي السلبية عرض وتيرة أعلى من إطلاق منشط من خلايا بوركينجي التي هي زيبرين الثانيإيجابية 14.
بالإضافة إلى قشرة المخيخ ، يتضمن المخيخ نواة المخيخ العميقة (DCN) التي تعمل كخرج أساسي للميخيخ. تتكون النوى من الوسيط (MN) ، المتشابكة (IN) ، والنوى الجانبية (LN). وقد أظهرت دراسات التصوير الوظيفي والمريض أن DCN تشارك أيضا في السلوكيات المختلفة15، ولكن دراسات قليلة جدا دراسة تغيير التعبير الجيني في DCN.
جعلت التقدم في التقنيات الجزيئية من الممكن تقييم التعبير الجيني الإقليمي في الدماغ وكشفت عن عدم التجانس عبر وداخل مناطق الدماغ المختلفة في كل من الحالات الفسيولوجيةوالمرضية 16. مثل هذه الدراسات تورط أن المخيخ يختلف عن مناطق الدماغ الأخرى. على سبيل المثال، يتم عكس نسبة الخلايا العصبية إلى الخلايا الدبقية في المخيخ مقارنة مع مناطق الدماغ الأخرى1. حتى في الظروف الفسيولوجية العادية ، يتم تنظيم التعبير عن الجينات proinflammatory في المخيخ مقارنة بالمناطق الدماغية الأخرى17. كما كانت التقنيات الجزيئية مفيدة للغاية في تحديد المسارات التي تساهم في مسببات أمراض المخيخ. على سبيل المثال، حدد تسلسل الحمض النووي الريبي لمستخلصات المخيخ بأكملها الجينات التي تم تغييرها في نموذج فأرة معدل وراثيا محدد لخلية بوركينجي من نوع ترنح سبينوكيربيلار 1 (SCA1) بالمقارنة مع ضوابط النوع البرية الخاصة بهم. وقد كشفت هذه الأدلة المسارات الجزيئية الرئيسية الكامنة وراء الإمراض في خلايا المخيخ بوركينجي وساعد على تحديد الأهداف العلاجية المحتملة18. ومع ذلك، تشير الدراسات الحديثة إلى أن هناك اختلافات في التعرض للأمراض عبر مناطق المخيخ11و12و19. وهذا يمكن أن يشير إلى أن هناك تغييرات رئيسية تحدث في مناطق المخيخ متميزة، والتي قد تكون ملثمين أو غير مكتشفة مع مقتطفات المخيخ كله. وبالتالي، هناك حاجة لتطوير التقنيات التي تسمح للباحثين بفحص الملامح الجزيئية في مناطق المخيخ المختلفة.
وتصف التقنية المقترحة هنا طريقة قابلة للاستنساخ لتشريح أربع مناطق متميزة من المخيخ الماوس من أجل عزل الحمض النووي الريبي من تلك المناطق واستكشاف الاختلافات الإقليمية في التعبير الجيني. التخطيطي للميخيخ الماوس في الشكل 1A يسلط الضوء على vermis باللون الأزرق، ونصف الكرة الأرضية باللون الأصفر. على وجه التحديد، هذه التقنية تجعل من الممكن عزل أربع مناطق: نواة المخيخ العميق (DCN) (مربعات حمراء منقط في الشكل 1A)،القشرة المخيخية من الحشرات الأمامية (CCaV) (الأزرق الداكن في الشكل 1A)، القشرة المخيخية للفيرميس الخلفي (CCpV) (الأزرق الفاتح في الشكل 1A)،والقشرة المخيخية لنصفي الكرة الأرضية (CCH) (الأصفر في الشكل 1A). ومن خلال تقييم التعبير الجيني لهذه المناطق بشكل منفصل، سيكون من الممكن التحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء وظائف منفصلة لهذه المناطق المختلفة، فضلا عن الاختلافات المحتملة في ضعفها في المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الإعداد
- جمع المعدات اللازمة بما في ذلك مقص قطع الرأس، ملقط حادة، مقص تشريح، مقص الأوعية الدموية، microspatula، مصفوفة الدماغ الماوس القوس، شفرات الحلاقة، نصائح الأنابيب 200 ميكرولتر، طبق بيتري الزجاج، والانزلاق الزجاجي، ودلو الثلج. وضع جميع المعدات على لوحة ماصة.
- ضع طبق بتري، لوحة زجاجية، ومصفوفة الدماغ على الجليد.
- باستخدام شفرة حلاقة بزاوية عمودية، قم بتقليم حوالي 5 مم من طرف طرف أنبوبي واحد سعة 200 ميكرولتر. وهذا يجعل حجم الفتحة في نهاية الطرف حوالي 1 ملم. وينبغي أن يكون هذا كافيا لكمة خارج DCN. ولكن يمكن أيضا تعديل هذا حسب الحاجة اعتمادا على تشريح. لديك العديد من النصائح جاهزة لسهولة الاستبدال والتكيف.
- تسمية 1.5 مل أنابيب الميكروفون مع تحديد هوية الحيوان ومنطقة المخيخ (أربعة أنابيب لكل حيوان).
- ملء حاوية cryosafe مع النيتروجين السائل لوميض تجميد الأنسجة بعد الاستخراج.
2. استخراج الدماغ وتشريح
وقد أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للجان رعاية الحيوان في جامعة مينيسوتا.
- القتل الرحيم الماوس باستخدام التعرض 5٪ CO2. بمجرد توقف التنفس، قم بإجراء خلع عنق الرحم. قطع رأس الفأر بمقص قطع الرأس والتخلص من الذبيحة في الوعاء المناسب.
- إجراء شق مع شفرة حلاقة على طول خط القوس الوتوسطي من الرأس بدءا من الأنف والاستمرار على طول الطريق مرة أخرى. فصل الجلد، فراق إلى جانبي خط الوسط. استخدام شفرة الحلاقة لقطع العضلات على كل جانب، وقطع الماضي قنوات الأذن.
- باستخدام مقص تشريح، تقليم أي مناطق الحبل الشوكي، حتى حيث جذع الدماغ يلتقي المخيخ، والحرص على عدم الإضرار المخيخ.
- أدخل إحدى شفرات مقص الأوعية الدموية في المسافة بين جذع الدماغ والعمود الفقري وقطع نحو قناة الأذن، ورفع على مقص لقطع العظام نظيفة ولكن الحد من الأضرار التي لحقت الأنسجة.
- الاستمرار في قطع على طول حافة الجمجمة حتى نحو المصابيح الشمية، والاستمرار في رفع في حين قطع للحد من الأضرار التي لحقت أنسجة الدماغ.
- باستخدام ملقط حاد، قشر بلطف قبالة الجزء الخلفي من الجمجمة الكشف عن المنطقة الخلفية من الدماغ والمخيخ.
- باستخدام ملقط حاد على طول حافة الجمجمة التي تم قطعها للتو، قشر بقية الجمجمة صعودا وأكثر من الدماغ. هذه الخطوة يجب أن تزيل غالبية غطاء الجمجمة، وتكشف عن الدماغ.
- تقليم بقية الجمجمة مع مقص الأوعية الدموية والملقط حادة، وتطهير معظم الجمجمة من أعلى الدماغ.
- باستخدام ميكروسباتولا، رفع الدماغ قليلا ومغرفة تحت والانزلاق لإزالة المصابيح الشمية من الجمجمة المتبقية وقطع ألياف المسالك البصرية. الدماغ يجب أن يأتي مجانا بسهولة في هذه المرحلة.
- ضع الدماغ في طبق بيتري الجالس على الجليد وأزل أي جمجمة متبقية أو حطام آخر.
- باستخدام ميكروسباتولا، ضع الدماغ بلطف في مصفوفة الدماغ مع الجانب الظهري لأعلى. يستغرق وقتا طويلا للتأكد من أنه يتم تعيين مستوى في المصفوفة، وخاصة أن خط الوسط يقع مركز في المصفوفة. تم تصميم هذه المصفوفة لأنسجة الدماغ الماوس الكبار، والأنسجة من الحيوانات الأصغر سنا أو المريضة قد بقية أقل في المصفوفة ولكن ينبغي أن يكون لا يزال من الممكن تحقيق نتائج قابلة للاستنساخ عبر العينات.
- ضع شفرة حلاقة واحدة على طول خط الوسط القوسي ، مع التأكد من أن النصل يدفع على طول الطريق إلى أسفل المصفوفة(الشكل 1B).
- ضع شفرة حلاقة أخرى 1 مم إلى جانب النصل الأول(الشكل 1B). ضع نصلين آخرين 1 مم بعيدا عن بعضهما البعض. وينبغي أن تكون النتيجة النهائية ثلاثة شفرات وضعت على جانب واحد من الدماغ، وكلها 1mm بعيدا. افعل نفس الشيء مع الجانب الآخر. في المجموع، سيتم وضع 7 ريش 1mm بعيدا (الشكل 1C).
- بعناية، والاستيلاء على طرفي الأمامية والخلفية من شفرات الحلاقة ورفع مباشرة حتى من المصفوفة. يمكن التخلص من الأنسجة على السطح الخارجي لشفرات الحلاقة.
- ببطء، فصل شفرة حلاقة واحدة في وقت واحد من الآخرين، مع الحرص على عدم تلف أقسام الأنسجة.
- الشريحة بعناية قسم الأنسجة الخروج من شفرة الحلاقة وعلى الشريحة الزجاجية مع ميكروسباتولا. في المجموع سيكون هناك ستة أقسام الدماغ القوس(الشكل 1D).
- سيكون للأقسام الجانبية 4 DCN مرئية (مربع أرجواني الشكل 1D). لعزل DCN، عقد قلصت 200 ميكرولتر ماصة تلميح عموديا على DCN ودفع إلى أسفل من خلال الأنسجة بحزم، هزاز في جميع الاتجاهات لتشريح كامل DCN من الأنسجة المحيطة بها. ارفعه مباشرة إلى الأعلى لإزالة DCN بشكل نظيف ، وتأكد بصريا من وجود الأنسجة في الطرف.
- ضع إصبعا واحدا في الجزء العلوي من الطرف وادفع لأسفل ، مما تسبب في انتفاخ الأنسجة. ضع الطرف في أنبوب الميكروفوغ المسمى بشكل صحيح وتأكد من وضع لكمة الأنسجة في الجزء السفلي من الأنبوب. كرر 2.17 للأقسام الثلاثة المتبقية ، ووضع اللكمات DCN في نفس الأنبوب. وضع أنبوب في النيتروجين السائل لتجميد فلاش. تمثيل حجم كل لكمة في الشكل 1E.
- الأقسام التي استخرجت DCN مؤهلة لنصف الكرة المخيخ. أبعد بقية أنسجة الدماغ حول المخيخ في هذه الأقسام. استخدام ملقط حاد والتقاط بلطف هذه المقاطع قشرة المخيخ نصف الكرة الأرضية ومكان في أنبوب الميكروفونكل منها. تجميد فلاش.
- لآخر قسمين فيرمال (مربع أزرق فاتح، Figure1D)،دفع بعيدا أنسجة الدماغ المحيطة ترك المخيخ فقط. باستخدام شفرة حلاقة، وجعل قطع فصل المصابيح الأمامية من lobules الخلفي. يجب أن يكون قطع فقط بعد تشكيل lobule 6 وينبغي أن لا تشمل lobule 10(الشكل 1F).
- باستخدام ملقط حاد، ضع بعناية أقسام قشرة المخيخ الأمامية وأقسام قشرة المخيخ الخلفية في أنابيب الميكروفون الخاصة بهم وتجميد الفلاش عن طريق ترك الأنابيب في النيتروجين السائل لمدة 5 دقائق. من هنا المضي قدما لاستخراج الحمض النووي الريبي، أو قد تخزين الأنابيب في -80 درجة مئوية.
3. استخراج الحمض النووي الريبي
ملاحظة: يتم تعديل هذا البروتوكول من بروتوكول كولد سبرينغ هاربور لاستخراج الحمض النووي الريبي مع TRIzol20. TRIzol solubilizes المواد البيولوجية، مما يجعل من الممكن لاستخراج الحمض النووي الريبي.
- ضع أنابيب الميكروفون في الثلج للحفاظ على الأنسجة من ذوبان بسرعة كبيرة جدا، وتطبيق 150 ميكرولتر من TRIzol الباردة في أنبوب microfuge. تجانس مع الحشرات المعقمة. مرة واحدة يتم تجانس الأنسجة، pipet الحل صعودا وهبوطا لضمان عدم وجود الأنسجة المتبقية سليمة. مزيد من تفريق أي قطع الأنسجة الصغيرة عن طريق سحب ما يصل الى حقنة الأنسولين عدة مرات.
- إضافة أخرى 350 ميكرولتر من TRIzol وماصة صعودا وهبوطا لخلط جيدا. اسمحوا الجلوس في درجة الحرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 150 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى الأنبوب ويهز بقوة ثم ترك بقية لمدة 2-3 دقائق. يفصل الكلوروفورم محلول الأنسجة المتجانسة إلى مراحل (الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين).
- جهاز طرد مركزي عند 12,000 x g، عند 15 درجة مئوية، لمدة 10 دقائق. تأكد من أن جميع الأنابيب في نفس الاتجاه.
- قم بإزالة الأنابيب بعناية وحدد درجة حرارة جهاز الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية. إزالة فقط مرحلة مائي واضح في أنبوب جديد (وهذا هو الجيش الملكي النيبالي)، والحرص على عدم تعطيل interphase مبهمة (الحمض النووي). وستكون المرحلة الأدنى حمراء وتحتوي على البروتين. يمكن حفظ المحلول المتبقي في الأنابيب أو التخلص منه.
- إضافة الكحول isopropyl 100٪ بنسبة 1:2 (إذا أزيلت 200 ul من المرحلة المائية، إضافة 100 ميكرولتر من الكحول isopropyl). تخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. اترك الراحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. الكحول isopropyl يعجل الجيش الملكي النيبالي للخروج من الحل.
- جهاز طرد مركزي عند 12,000 x g، عند 4°C، لمدة 10 دقائق. تأكد من وضع جميع الأنابيب في نفس الاتجاه لتسهيل تصور بيليه. وسوف تكون بيليه الناتجة عن الحمض النووي الريبي المستخرج.
- إزالة بعناية الأنابيب، وإزالة supernatant مع pipet الحرص على عدم تعطيل بيليه. بيليه هو هلام إلى حد ما مثل وسيكون من الصعب أن نرى، ولكن ينبغي أن تكون قادرة على تقدير حيث يستند إلى اتجاه الأنابيب في جهاز الطرد المركزي.
- بعد إزالة كل من supernatant، إضافة 500 ميكرولتر من الإيثانول 75٪، دوامة لفترة وجيزة، والطرد المركزي في 7500 x ز، في 4 درجة مئوية، لمدة 5 دقائق. الايثانول يغسل كذلك بيليه.
- إزالة supernatant بعناية، دون تعطيل بيليه. اترك القبعات مفتوحة لتجفيف العينة. هذا عادة ما يستغرق 5-10 دقائق ولكن يمكن أن تختلف تبعا لكمية الإيثانول تركت على بيليه. لا أكثر من الجافة.
- مرة واحدة جافة، resuspend بيليه في المياه الحرة DNase. إضافة 20 ميكرولتر لعينات DCN، و 30 ميكرولتر لجميع الآخرين.
- وبمجرد إعادة الإنفاق، يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية أو الشروع في إجراء المزيد من الاختبارات.
4. في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (RTqPCR)
- قبل هذه الخطوة سيكون من الضروري أن DNase علاج الحمض النووي الريبي لإزالة أي الحمض النووي الجينوم، وتوليد cDNA باستخدام iScript من BioRad. تأكد من تطبيع تركيز الحمض النووي الريبي قبل إجراء cDNA. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم تحسين التمهيديات لqPCR. اتبع الطرق الموضحة هنا لإكمال هذه الخطوة21. وصف موجز لqPCR أدناه.
- يتم شراء جميع التمهيديات من IDT. التسلسلات الأمامية والعكسية كلاهما في نفس أنبوب العينة، ويتم تخزينهما بتركيز 20x.
Rps18 (جين التحكم):
إلى الأمام – 5'-CCTGAGAGCCAGCACAT-3'
عكس – 5'-أكاكاكاتغاغكاتاكتكتيك-3'
بارفالبومين (بروتين ملزم للكالسيوم، خلايا مثبطة):
إلى الأمام – '5-ATGAGGTGAAGAGGTTCC-3'
عكس – '5-AGCGTCTTTGTTTCTCTGCAG-3'
Kcng4 (وحدة فرعية قناة البوتاسيوم):
إلى الأمام – 5'-CTGTCTTCTCTGGTCAGTGA-3'
عكس – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
ألدولاس C (زيبرين الثاني، أعرب عن التفاضلية عبر قشرة المخيخ):
إلى الأمام – 5'-AGAGAACAAGغاكتغ-3'
عكس – 5'-TCAGTAGGCATGGGGC-3' - وكانت شروط qPCR كما يلي. فترة ما قبل الحضانة، 5 دقائق، عند 95 درجة مئوية. فترة التضخيم، 50 دورة: 10 دقائق عند 95 درجة مئوية، 10 دقائق عند 62 درجة مئوية، و 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. فترة منحنى الذوبان، 5 ثوان عند 95 درجة مئوية، دقيقة واحدة عند 65 درجة مئوية، وتعيين معدل المنحدر إلى 0.07 درجة مئوية/ ثانية حتى درجة الحرارة المستهدفة من 97 درجة مئوية. ثم فترة التبريد لمدة 10 دقائق إلى 40 درجة مئوية. تم إجراء جميع ردود فعل qPCR في ثلاثية القنوات وتم تحليل التعبير الجيني باستخدام 2- ΔΔCt مع Rps18 كتحكم في التحميل لتطبيع التعبير الجيني. تم استخدام مستخلص المخيخ السائب كمرجع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لهذه التجارب، تم استخدام أربعة فئران برية أنثى عمرها أحد عشر أسبوعا C57/Black6. تم استخدام فأر واحد لإجراء تشريح المخيخ الكامل الذي يشار إليه باسم "المخيخ السائب" وسمح بمقارنة مستويات الحمض النووي الريبي في المناطق المشرحة بتشريح كامل. واستخدمت الفئران الثلاثة الأخرى لإجراء تشريح المخيخ الموصوف في هذا البروتوكول. استخدام ثلاثة فئران يجعل من الممكن التأكد من أن الاتجاهات المكتشفة في مستويات الحمض النووي الريبي قابلة للاستنساخ عبر الفئران.
الشكل 1A يمثل المخيخ الماوس - vermis في الأزرق ونصف الكرة الأرضية باللون الأصفر. التخطيطات القوسية للفيرميس (المناطق الأمامية باللون الأزرق الداكن والمناطق الخلفية باللون الأزرق الفاتح) ونصف الكرة الأرضية (باللون الأصفر). يتم تمييز DCN في مربعات منقط أحمر. وسوف يبدأ تشريح ناجحة مع وضع شفرة حلاقة الأولي أسفل خط الوسط من الدماغ (الشكل 1B); هذا يوجه التنسيب الناجح للشفرات الستة التالية (الشكل 1C). وهذا يترك ستة أقسام القوس(الشكل 1D)،أربعة أقسام الجانبي / نصف الكرة الأرضية (المبينة في الأرجواني) واثنين من أقسام خط الوسط / الحشرات (المبينة باللون الأزرق الفاتح). تحتوي المقاطع الجانبية 4 DCN; يصور الشكل 1E تشريح لكمة DCN الناجحة. من المرجح أن تحتوي الأقسام الحيوية المتوسطة على نصف أكثر DCN وسيطة موجودة في القسم السميك 1 مم ، ومع ذلك لن تكون موجودة على طول الطريق من خلال وليس من الممكن تشريحها بشكل مستنسخ. يتم فصل أقسام حيوية خط الوسط إلى المصابيح الأمامية والخلفية المصورة في الشكل 1F. تشريح ناجحة بإعداد بقية التجارب للنجاح.
تظهر نتائج سلسلة تفاعل البوليميراز النوعي في الوقت الحقيقي (RTqPCR) جدوى تقييم مستويات التعبير الجيني لكل منطقة على حدة وكذلك العمل على التحقق من صحة التشريح. استخدمنا التمهيديات الكشف عن الجينات التي تظهر التعبير التدرج من القشرة الأمامية إلى القشرة المخيخية الخلفية والإثراء في DCN ومقارنة تعبيرها إلى lysates المخيخ السائبة.
قمنا بتقييم مستويات التعبير لثلاث جينات: ألدولاز C، بارفالبومين، و Kcng4. الدولاسي C، المعروف أيضا باسم زيبرين الثاني، هو إنزيم يتم التعبير عنه في نمط ربط ثابت من خلال المخيخ. يتم التعبير عنه بشكل أعلى في الحشرات الخلفية من الحشرات الأمامية. وهناك أيضا عصابات في نصفي الكرة الأرضية13،14. Parvalbumin وهو بروتين الكالسيوم ملزمة التي يتم التعبير عنها في الخلايا المثبطة. استنادا إلى أطلس الدماغ ألين، parvalbumin يبدو أعرب بشكل موحد نسبيا في جميع أنحاء قشرة المخيخ وفي DCN (http://mouse.brain-map.org/gene/show/19056). Kcng4، وحدة فرعية قناة بوابة الجهد البوتاسيوم، ويبدو أن المخصب في DCN وفي الأمامي مقارنة مع الفصوص الخلفية (https://mouse.brain-map.org/gene/show/42576). أظهر تحليل التعبير الكمي أنه ، كما هو متوقع ، يتم التعبير عن aldolase C بشكل أكبر في vermis المخيخ الخلفي (CCpV) ولكنه أقل في DCN والمنطقة الأمامية من الفيرميس (CCaV) بالمقارنة مع تشريح المخيخ السائب(الشكل 2A). Parvalbumin موجود بالمثل في DCN، vermis الأمامية، فيرميس الخلفي، والكورتيز المخيخ نصف الكرة الأرضية كما هو الحال في مقتطفات المخيخ السائبة(الشكل 2B). يتم إثراء Kcng4 بشكل كبير في DCN والفيرميس الأمامي (CCaV) ولا يتم تخصيبه بشكل كبير في الحشرات الخلفية (CCpV) أو نصفي الكرة الأرضية (CCH) بالمقارنة مع استخراج السائبة(الشكل 2C). وتتبع هذه النتيجة ما كان متوقعا استنادا إلى النمط الذي شوهد في أطلس دماغ آلن. وهكذا، فإن تحليل التعبير الجيني يؤكد صحة بروتوكول التشريح ويؤكد أنه يمكن الحصول على الحمض النووي الريبي عالي الجودة واختباره.
للمقارنة مباشرة بين التعبير عن الألدولاز C عبر قشرة المخيخ ، تمت مقارنة مستويات التعبير بالمكان الذي يفترض أن يكون فيه أدنى ، وهو الحشرات الأمامية (CCaV) (الشكل 3). كان مستوى التعبير من aldolase C أعلى بكثير في الحشرات الخلفية (CCpV) ، وتتجه إلى أعلى في نصفي المخيخ (CCH) ، وإن لم يكن ذلك بشكل كبير. هذا الاتجاه في نصفي المخيخ من المرجح أن يكون بسبب وجود عصابات من الدولا C في نصفي الكرة الأرضية، وتشريح يلتقط aldolase العصابات السلبية والإيجابية.
الشكل 1: صور تمثيلية لتشريح المخيخ
أ. التخطيطي للميخيخ الماوس مع vermis في الأزرق ونصف الكرة الأرضية باللون الأصفر. تخطيطات المخيخ القوسي لكل من الحشرات ونصف الكرة الأرضية. فيرميس باللون الأزرق، مع الأزرق الداكن بمناسبة vermis الأمامية، والأزرق الفاتح بمناسبة vermis الخلفي. نصف الكرة الأرضية باللون الأصفر. يتم وضع علامة DCN في كل مع مربعات منقط أحمر. باء - ال 20 في المائ الدماغ الكامل في مصفوفة دماغ الماوس القوسي، مع شفرة حلاقة أسفل خط الوسط. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن وضع ثلاثة شفرات حلاقة 1 ملم على جانبي خط الوسط. د- الناتجة ستة أقسام الدماغ القوس. أربعة تحتوي على أقسام المخيخ الجانبي / نصف الكرة الأرضية (أعلى أربع صور المبينة في الأرجواني). اثنين تحتوي على أقسام المخيخ الوسيط / vermal (أسفل صورتين، المبينة باللون الأزرق الفاتح). هاء - ال هاء ممثل الجانبي / نصف الكرة المخيخ القسم مع لكمة DCN تشريح إلى يمين القسم (القسم المبينة باللون الوردي في الشكل 1D). واو - ال و- ال و. قسم المخيخ في الشكل 1D مع turquois منقط مربع حوله، تشريحها إلى الفص الحشرات الأمامي والخلفي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التعبير الجيني النسبي في مناطق محددة معزولة من المخيخ.
التعبير النسبي من ألدولاز C (2A), parvalbumin (2B), و Kcng4 (2C) تطبيع إلى Rps 18 (البروتين المرتبطة الحمض النووي الريبي ريبوسومي أعرب في جميع الخلايا), واستخدام استخراج المخيخ السائبة كمرجع. كما هو متوقع، كان التعبير C aldolase أعلى في vermis الخلفية وأقل في DCN والفيرميس الأمامي (2A). كما هو متوقع، استنادا إلى أطلس الدماغ ألين، يتم التعبير عن التعبير parvalbumin بشكل موحد عبر كل منطقة مستخرجة، في حين يتم إثراء التعبير Kcng4 بشكل كبير في DCN و CCaV. في اتجاه واحد ANOVA، مع اختبار توكي في مرحلة ما بعد مخصصة. *p<.0.005, ** p<.0.0001 بالنسبة لاستخراج المخيخ السائبة. تمثل المدرجات التكرارية متوسط القيم ل N = 3 مع قيم لكل فأرة فردية تظهر كنقاط. تمثل أشرطة الخطأ خطأ قياسي في الوسط. DCN (النواة المخيخية العميقة) ، CCaV (القشرة المخيخية للحشرات الأمامية) ، CCpV (القشرة المخيخية للفيرميس الخلفي) ، وCCH (قشرة المخيخ في نصفي الكرة الأرضية). N = 3 الفئران لمناطق تشريح المخيخ. N = 1 استخراج السائبة. التجربة التي أجريت في ثلاثة نسخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: RTqPCR التعبير الجيني النسبي من الدولاز C عبر قشرة المخيخ
التعبير النسبي عن الألدولاز C في مناطق محددة من قشرة المخيخ - الحشرات الأمامية (CCaV) والفيرميس الخلفي (CCpV) ونصفي الكرة الأرضية (CCH). تم تطبيع مستوى التعبير الجيني من aldolase C إلى Rps18 ومقارنته بمستوى التعبير في الحشرات الأمامية. كما هو متوقع تم إثراء التعبير Aldolase C في vermis الخلفي. في اتجاه واحد ANOVA، مع اختبار توكي في مرحلة ما بعد مخصصة. *p<.0.005 بالنسبة إلى CCaV. تمثل أشرطة الخطأ خطأ قياسي في الوسط. CCaV (القشرة المخيخية للحشرات الأمامية) ، CCpV (قشرة المخيخ من الحشرات الخلفية) ، وCCH (قشرة المخيخ في نصفي الكرة الأرضية). N = 3 الفئران، والتجربة التي أجريت في ثلاثية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا تجعل من الممكن تقييم التعبير الجيني الأساسي والآليات الجزيئية داخل أربع مناطق مخيخ متميزة - النوى المخيخية العميقة (DCN) ، والقشرة المخيخية الأمامية للفيرميس (CCaV) ، والقشرة المخيخية الخلفية للفيرميس (CCpV) ، والقشرة المخيخية لنصفي الكرة الأرضية (CCH). إن القدرة على تقييم هذه المناطق بشكل منفصل سوف توسع معرفتنا بتباين مناطق المخيخ المحددة وربما تلقي الضوء على مساهمتها في السلوكيات المختلفة.
عن طريق تقسيم أنسجة الدماغ الكاملة القوس فمن الممكن تصور بسهولة وتحديد هذه المناطق الأربع من المخيخ، مما يسمح لتشريح سريع. على حد علم المؤلف هذا هو الوصف الأول للتشريح الإقليمي المخيخ الكامل للتحليل الجزيئي. في ورقة نشرت مؤخرا، استخدم الباحثون تشريح السائبة من lobules الأمامية للمخيخ والفصيص العقيدي للمخيخ للتحليل الجزيئي22. ومع ذلك ، مع الطريقة الموصوفة لن تكون قادرة على تشريح DCN أيضا. محاولات لعزل اللكمات DCN باستخدام هزاز لقطع شرائح سميكة 300um عادة ما تواجه ثلاث مشاكل حرجة. أولا، بسبب الاختلافات الطفيفة في تركيب سيربيلا والزاوية التي يتم قطع الأنسجة، فإنه ليس من السهل عزل نفس المناطق بشكل مستنسخ عبر الحيوانات. ثانيا، يستغرق التركيب والقطع وقتا، مما يزيد من فرص تدهور الحمض النووي الريبي ويخفض جودة عينة الحمض النووي الريبي لتطبيقات المصب. وأخيرا، اللكمات من شرائح سميكة 300um تنتج غلة منخفضة من الحمض النووي الريبي.
وتشير البيانات المعروضة هنا إلى أنه من الممكن استخدام هذه التقنية لتقييم التعبير الجيني النسبي عبر مناطق المخيخ. Aldolase C هو أعلى تنظيما للغاية في CCpV. Kcng4 هو أعلى تنظيما للغاية في DCN و CCaV، ويتم التعبير عن parvalbumin بالتساوي نسبيا في جميع المناطق في المخيخ. في حين أن هذه هي الجينات الثلاثة فقط، وهذه النتائج تثبت أن هذا الأسلوب تشريح يمكن استخدامها لتحديد التوقيعات الجزيئية الكامنة وراء هذه المناطق المتميزة.
هناك بعض الأشياء الحاسمة التي يجب الانتباه إليها في جميع أنحاء هذا البروتوكول. وضع الدماغ في المصفوفة هو خطوة هامة. في بعض الحالات، قد لا يكون الدماغ قد تم تعيين مستوى تماما في المصفوفة أو بالضبط على خط الوسط. هذا من شأنه أن يصبح واضحا عند النظر في كل من أقسام القوس. على سبيل المثال، إذا قطع بالضبط في خط الوسط، فإن معظم المقاطع المخيخية الوسطى تبدو متطابقة تقريبا وليس لها DCN مرئية. نظرا لأن هذه المعالم يمكن التعرف عليها بالعين ، فمن الممكن استكشاف عدد المقاطع المؤهلة كأقسام فيرمال أو نصف الكرة الأرضية ، ويمكن دمجها معا في نفس أنبوب الميكروفون. خطوة أخرى حاسمة هي استخراج DCN. في بعض الحالات، والاكتئاب إصبع إلى أعلى تلميح ماصة 200 ميكرولتر ليست كافية للضغط لاستخراج لكمة الأنسجة. إذا كان هذا هو الحال، سيكون من الضروري أن يغرف من لكمة مع ملقط الأنف إبرة ووضع لكمة في الأنبوب الصحيح. الخطوة الحاسمة التالية من هذا البروتوكول هو استخراج الحمض النووي الريبي. في حين تم تحسين وحدات التخزين المذكورة لاستخراج الحمض النووي الريبي الأقصى ، قد يكون من الضروري أيضا ضبط كميات الحل في بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي لتناسب الاحتياجات الفردية للمختبر. لأن هناك القليل من الأنسجة للعمل مع, هناك فرصة أكبر للتلوث الفينول في المنتج الحمض النووي الريبي النهائي. ويمكن إدارة ذلك عن طريق ضبط كمية TRIzol المستخدمة لتجانس الأنسجة وضمان أن الأنسجة المتجانسة مختلطة تماما.
القيود المفروضة على هذا البروتوكول هي أنه في حين يتم تقسيم DCN إلى ثلاثة نوى منفصلة (الجانبية، متشابكة، ووسط) فمن الصعب تصور ولكمة بشكل مستنسخ كل من هذه المقاطع من 1 ملم، ناهيك عن وجود ما يكفي من الأنسجة التي لاستخراج الحمض النووي الريبي. جنبا إلى جنب مع هذا القيد، نصف DCN الأكثر وسيطة يظهر في vermis; ومع ذلك ، مع هذا التشريح من الصعب تصور وتشريح بشكل مستنسخ. كما هو البروتوكول حاليا، يتم تشريح النصف الآخر من DCN الوسيطة وDCN المتبقية. وهناك أيضا عشرة فصات خضراء فردية وثمانية فصات في نصفي الكرة الأرضية، ولكن تشريح كل منها على حدة وبطريقة قابلة للاستنساخ سيكون صعبا ويؤدي إلى انخفاض شديد في غلة تركيز الحمض النووي الريبي. في حين أن هذه الطريقة تجعل من الممكن الخوض بشكل أكثر تحديدا في مناطق المخيخ ، إلا أنها لا تزال تجمع بين المناطق التشريحية المتميزة في مجموعات يمكن أن تخفي تغييرات فريدة على مستوى الفصيلات الفردية أو وحدات الفصيصات الفرعية.
في الختام، هذه الطريقة تجعل من الممكن استكشاف الاختلافات الجزيئية الإقليمية في وقت واحد أربع مناطق محددة من المخيخ. من خلال تقييم المخيخ بهذه الطريقة الخاصة بالمنطقة ، من الممكن فصل الآليات الجزيئية الأساسية والتعبير الجيني الذي يميز تلك المناطق. وهذا من شأنه أن يعزز فهمنا للدور الذي تلعبه مناطق المخيخ المتميزة في السلوكيات المختلفة ويسمح للعمل المستقبلي بالتركيز على وجه التحديد في منطقة واحدة من المخيخ واستكشاف دورها في المرض أو العلاج المستهدف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لأوستن فيرو وجواو غيليرمي روزا في مختبر سفيتانوفيتش لمساعدتهم في استكشاف الأخطاء وإصلاحها تشريح وفي استخراج الجيش الملكي النيبالي وRTqPCR. يتم تمويل هذا البحث من قبل M. Cvetanovic, R01 NS197387; | HHS المعاهد الوطنية للصحة (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , Online Preprint (2020).
