Summary
Forskellige cerebellar regioner har været impliceret til at spille en rolle i forskellige adfærdsmæssige output, men de underliggende molekylære mekanismer forbliver ukendt. Dette arbejde beskriver en metode til reproducerbart og hurtigt dissekere cerebellar cortex af halvkugler, forreste og bageste regioner i vermis, og den dybe cerebellar kerner med henblik på at sonde for molekylære forskelle ved at isolere RNA og test for forskelle i genekspression.
Abstract
Cerebellum spiller en vigtig rolle i flere nøglefunktioner, herunder kontrol af bevægelse, balance, kognition, belønning og indflydelse. Imaging undersøgelser viser, at forskellige cerebellar regioner bidrager til disse forskellige funktioner. Molekylære undersøgelser, der undersøger regionale cerebellarforskelle, halter, da de for det meste udføres på hele cerebellarekstrakter og derved maskerer enhver sondring på tværs af specifikke cerebellar-regioner. Her beskriver vi en teknik til reproducerbart og hurtigt dissekere fire forskellige cerebellar regioner: den dybe cerebellar kerner (DCN), forreste og bageste vermal cerebellar cortex, og cerebellar cortex af halvkugler. Dissekering af disse forskellige regioner giver mulighed for udforskning af molekylære mekanismer, der kan ligger til grund for deres unikke bidrag til balance, bevægelse, indflydelse og kognition. Denne teknik kan også bruges til at undersøge forskelle i patologisk modtagelighed af disse specifikke regioner på tværs af forskellige musesygdomsmodeller.
Introduction
Den lillehjernen indeholder over halvdelen af neuroner i hjernen og har historisk været omtalt som en motorisk kontrol og balance center i hjernen1. For nylig har undersøgelser vist, at lillehjernen spiller en central rolle i forskellige andre funktioner, herunder kognition, belønningsbehandling og påvirker2,3,4,5.
Lillehjernen har velbeskrevet anatomi: cortex-regionen består af granulat, Purkinje og molekylære lag. Granulatceller danner granulatcellelaget og sender input via parallelle fibre til Purkinje-celledecititterne i det molekylære lag, som også modtager input fra klatrefibre, der stammer fra den ringere oliven. Purkinje celler sende hæmmende fremskrivninger til celler i den dybe cerebellar kerner (DCN), der tjener som den vigtigste produktion fra lillehjernen. Produktionen af dette lillehjernskredsløb moduleres yderligere af aktiviteten af de hæmmende interneuroner i cerebellar cortex, herunder Golgi, stellate og kurvceller4. Denne lillehjernen funktionelle enhed er fordelt over alle lobules af cerebellar cortex. På trods af dette relativt ensartede kredsløb på tværs af lillehjernen indikerer beviser fra menneskelig neuroimaging litteratur og patientundersøgelser funktionel heterogenitet af lillehjernen6,7.
Den lillehjernen cortex kan opdeles i to hovedregioner: den midterlinje-definerede vermis, og den laterale halvkugler. Vermis kan yderligere opdeles i forreste og bageste lobules. Disse forskellige regioner i lillehjernen har været impliceret i at bidrage til forskellige adfærd. Opgave-fremkaldte eller opgave-fri aktivitetsmønstre impliceret, at forreste regioner i vermis bidrage mere til motorisk funktion, mens posterior vermis bidrager mere til kognition6,7. Vermis er også forbundet med påvirkning og følelser, mens cerebellar halvkugler bidrager til udøvende, visuel-rumlige, sprog og andre mnemoniske funktioner8. Desuden gav anatomiske undersøgelser bevis for, at funktionelt adskilte cerebellar regioner er forbundet med forskellige kortikale regioner9. Lesion-symptom kortlægning viste, at patienter med slagtilfælde påvirker forreste lobules (strækker sig ind i lobule VI) havde dårligere resultater på finmotoriske opgaver, mens patienter med skader på bageste lap regioner og halvkugler udstillet kognitive underskud i mangel af cerebellar motor syndrom10. Endelig, regionale cerebellar patologi i sygdom viser, at funktionelt forskellige cerebellar regioner er også forskelligt modtagelige for sygdom11,12.
Mens langt mindre udforsket, foreløbige beviser viser forskellige genekspression underskrifter på tværs af cerebellar kortikale regioner. Purkinje celle udtryk zebrin II viser region specifikke mønstre i vermis sådan, at der er flere Zebrin II positive celler i posterior lobules og færre i forreste lobules13. Dette korrelerer også med regionalt forskellige fysiologiske funktion som Zebrin II negative Purkinje celler viser højere hyppighed af tonic fyring end Purkinje celler, der er Zebrin II positive14.
Ud over cerebellar cortex omfatter lillehjernen de dybe cerebellarkerner (DCN), der tjener som den primære udgang for lillehjernen. Kernerne består af mediale (MN), interposed (IN), og lateral kerner (LN). Funktionel billeddannelse og patientundersøgelser har vist, at DCN også deltager i forskellige adfærdsformer15, men meget få undersøgelser undersøger genekspressionsændring i DCN.
Fremskridt inden for molekylære teknikker har gjort det muligt at vurdere regionale genekspression i hjernen og har afdækket heterogenitet på tværs af og inden for forskellige hjerneområder i både fysiologiske og sygdomstilstande16. Sådanne undersøgelser implicerer, at lillehjernen er forskellig fra andre hjerneregioner. For eksempel er forholdet mellem neuroner og gliaceller omvendt i lillehjernen sammenlignet med andre hjerneområder1. Selv under normale fysiologiske forhold er ekspressionen af proinflammatoriske gener upreguleret i lillehjernen sammenlignet med de andre hjerneområder17. Molekylære teknikker har også været meget nyttige til at identificere de veje, der bidrager til patogenese af cerebellarsygdomme. For eksempel identificerede RNA-sekventering af hele cerebellarekstrakterne gener, der var ændret i en Purkinje-cellespecifik transgen musemodel af spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) sammenlignet med deres vilde typekontroller. Sådanne beviser har afsløret vigtige molekylære veje, der ligger til grund for patogenese i cerebellar Purkinje-celler og har bidraget til at identificere potentielle terapeutiske mål18. Nylige undersøgelser tyder dog på, at der er forskelle i sårbarheden over for sygdomme i de lillehjernen regioner11,12,19. Dette kan indikere, at der sker vigtige ændringer i forskellige cerebellarområder, som kan maskeres eller ikke registreres med hele cerebellarekstrakter. Der er således behov for at udvikle teknikker, der gør det muligt for forskere at undersøge molekylære profiler i forskellige cerebellarregioner.
Den teknik, der foreslås her, beskriver en reproducerbar metode til at dissekere fire forskellige regioner i musebellum for at isolere RNA fra disse regioner og udforske regionale forskelle i genekspression. Den skematiske af musen lillehjernen i Figur 1A fremhæver vermis i blåt, og halvkugler i gult. Nærmere bestemt denne teknik gør det muligt at isolere fire regioner: dyb cerebellarkerner (DCN) (rød-prikket kasser i figur 1A), den lillehjernen cortex af forreste vermis (CCaV) (mørk blå i figur 1A), den lillehjernen cortex af den bageste vermis (CCpV) (lyseblå i figur 1A), og cerebellar cortex af halvkugler (CCH) (gul i figur 1A). Ved at vurdere genekspressionen af disse regioner separat vil det være muligt at undersøge molekylære mekanismer, der ligger til grund for diskrete funktioner i disse forskellige regioner, samt potentielle forskelle i deres sårbarhed i sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opsætning
- Saml nødvendigt udstyr, herunder halshugning saks, stump tang, dissektion saks, vaskulær saks, mikrospatula, sagittal mus hjerne matrix, barberblade, 200 μL pipet tips, glas petriskål, glas dias, og is spand. Læg alt udstyr på en absorberende pude.
- Placer petriskål, glasplade og hjernematrix på is.
- Ved hjælp af et barberblad i vinkelret vinkel skal du trimme ca. 5 mm af spidsen af en 200 μL pipetspids. Dette gør størrelsen af åbningen i slutningen af spidsen ca. 1 mm bred. Dette bør være tilstrækkeligt til at slå ud DCN. Men dette kan også justeres efter behov afhængigt af dissektionen. Har mange tips klar til nem udskiftning og justering.
- Etiket 1,5 mL mikrofugerør med identifikation af dyr og cerebellarregion (fire rør pr. dyr).
- Fyld kryosmøtbeholderen med flydende nitrogen for at blinke frysevæv efter ekstraktion.
2. Hjerneudtrækning og dissektion
Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Animal Care Udvalg fra University of Minnesota.
- Aflive musen ved hjælp af 5% CO2 eksponering. Når vejrtrækningen er ophørt, udføre livmoderhalskræft dislokation. Halshugge musen med halshugning saks og kassér slagtekroppen i den relevante beholder.
- Lav et snit med et barberblad langs hovedets mediale sagittallinje, der starter ved næsen og fortsætter helt tilbage. Adskil huden, afsked til hver side af midterlinjen. Brug barberbladet til at skære væk musklen på hver side, skære ned forbi øregangene.
- Brug dissekere saks, trim enhver rygmarv regioner, op til hvor hjernestammen opfylder lillehjernen, omhyggelig med ikke at beskadige lillehjernen.
- Indsæt en af de vaskulære sakseblade i rummet mellem hjernestammen og rygsøjlen og skær mod øregangen, løft op på saksen for at skære knoglen rent, men begræns skader på vævet.
- Fortsæt med at skære langs kanten af kraniet op mod olfaktoriske pærer, fortsætter med at løfte op, mens skære for at begrænse skader på hjernevævet.
- Brug stumpe pincet, forsigtigt skræl bagsiden af kraniet afdække posterior region af hjernen og lillehjernen.
- Brug stumpe pincet langs kanten af kraniet, der var lige skåret, skræl resten af kraniet op og over hjernen. Dette trin skal fjerne størstedelen af kraniehætten og afsløre hjernen.
- Trim resten af kraniet med vaskulær saks og stumpe pincet, der rydder det meste af kraniet fra toppen af hjernen.
- Brug mikrospatulaen til at løfte hjernen lidt og scoop under og glide op for at fjerne de olfaktoriske pærer fra det resterende kranium og afbryde optiske tarmkanalfibre. Hjernen bør komme fri nemt på dette punkt.
- Placer hjernen i petriskålen sidder på is og fjerne eventuelle resterende kraniet eller andet affald.
- Brug mikropatula, forsigtigt placere hjernen i hjernen matrix med dorsal side op. Tag dig tid til at sikre, at det er indstillet niveau i matrixen, især at midterlinjen falder midt i matrixen. Denne matrix er designet til voksne mus hjernevæv, væv fra yngre eller syge dyr kan hvile lavere i matrixen, men det bør stadig være muligt at opnå reproducerbare resultater på tværs af prøver.
- Placer et barberblad langs sagittal midterlinjen, og sørg for, at bladet skubber hele vejen til bunden af matrixen(Figur 1B).
- Placer et andet barberblad 1 mm på siden af det første blad (Figur 1B). Placer yderligere to knive 1 mm fra hinanden. Slutresultatet skal være tre knive placeret på den ene side af hjernen, alle 1mm fra hinanden. Gør det samme på den anden side. I alt vil 7 knive blive placeret 1 mm fra hinanden (Figur 1C).
- Tag forsigtigt fat i for- og bagenden af barberbladene, og løft lige op af matrixen. Vævet på ydersiden af barberbladene kan kasseres.
- Langsomt adskilles et barberblad ad gangen fra de andre, idet du skal passe på ikke at beskadige vævssektionerne.
- Skub forsigtigt vævssektionen af barberbladet og ned på glasrutsjebanen med mikrospatulaen. I alt vil der være seks sagittal hjerne sektioner(Figur 1D).
- De 4 mest laterale sektioner vil have DCN synlige (Purple box, Figur 1D). For at isolere DCN skal du holde den trimmede 200 μL pipetspids vinkelret over DCN og skubbe fast gennem vævet og rokke i alle retninger for fuldt ud at dissekere DCN fra det omgivende væv. Løft lige op igen for at fjerne DCN'en rent, og bekræft visuelt tilstedeværelsen af vævet i spidsen.
- Placer en finger på toppen af spidsen og tryk ned, hvilket får vævet til at bule ud. Placer spidsen i korrekt mærket mikrofuge rør og sikre, at væv punch er placeret i bunden af røret. Gentag 2,17 for de resterende tre sektioner, placere DCN slag i samme rør. Placer røret i flydende nitrogen for at lyne fryse. Repræsentation af størrelsen af hvert slag i figur 1E.
- Sektioner, der havde DCN udvundet kvalificere sig som lillehjernen halvkugle. Skub resten af hjernevævet væk omkring lillehjernen i disse sektioner. Brug stumpe pincet og forsigtigt afhente disse halvkugle cerebellar cortex sektioner og sted i respektive mikrofuge rør. Flash fryse.
- For de sidste to vermal sektioner (lyseblå boks, Figur1D), skubbe væk omkringliggende hjernevæv forlader kun lillehjernen. Brug et barberblad til at skære mellem de forreste lobules fra de bageste lobules. Cut skal være lige efter dannelsen af lobule 6 og bør ikke omfatte lobule 10(Figur 1F).
- Ved hjælp af stumpe pincet, omhyggeligt placere forreste cerebellar cortex sektioner og bageste cerebellar cortex sektioner i deres respektive mikrofuge rør og flash fryse ved at forlade rørene i flydende nitrogen i 5 minutter. Herfra bevæger man sig frem til RNA-ekstraktionen eller kan opbevare rørene ved -80 °C.
3. RNA-ekstraktion
BEMÆRK: Denne protokol er ændret fra Cold Spring Harbor-protokollen for RNA-ekstraktion med TRIzol20. TRIzol opløser biologisk materiale, hvilket gør det muligt at udtrække RNA.
- Mikrofugerørene anbringes i is for at forhindre vævet i at tø for hurtigt op, og påfør 150 μL kold TRIzol i mikrofugerøret. Homogeniseres med en steriliseret pestle. Når vævet er homogeniseret, pipetter opløsningen op og ned for at sikre, at der ikke er noget resterende væv intakt. Yderligere bryde op eventuelle små væv stykker ved at trække det op i en insulin sprøjte et par gange.
- Tilsæt yderligere 350 μL TRIzol og rør op og ned for at blande grundigt. Lad sidde på værelset temp i 5 minutter.
- Der tilsættes 150 μL kloroform til røret, og der rystes kraftigt, og der hviles derefter i 2-3 minutter. Kloroformen adskiller den homogeniserede vævsopløsning i faser (RNA, DNA og protein).
- Centrifuge ved 12.000 x g ved 15°C i 10 minutter. Sørg for, at alle rør har samme retning.
- Fjern forsigtigt rørene og sæt centrifugeens temperatur til 4 °C. Fjern kun den klare vandige fase i et nyt rør (dette er RNA), pas på ikke at forstyrre den uigennemsigtige interfase (DNA). Den laveste fase vil være rød og indeholder protein. Resterende opløsning i rørene kan gemmes eller kasseres.
- Der tilsættes 100% isopropylalkohol i et forhold på 1:2 (hvis det fjernes 200 ul vandig fase, tilsættes 100 μL isopropylalkohol). Bland grundigt ved pipettering op og ned. Lad hvile ved stuetemperatur i 10 minutter. Isopropylalkoholen udfælder RNA'et ud af opløsningen.
- Centrifuge ved 12.000 x g ved 4 °C i 10 minutter. Sørg for at placere alle rørene i samme retning for at gøre det lettere at visualisere pellet. Den resulterende pellet vil være det udvundne RNA.
- Fjern forsigtigt rørene, fjern supernatanten med en pipet, og pas på ikke at forstyrre pelleten. Pellet er noget gel-lignende og vil være svært at se, men bør være i stand til at vurdere, hvor det er baseret på orienteringen af rørene i centrifuge.
- Efter at have fjernet alle supernatanten tilsættes 500 μL 75% ethanol, vortex kort og centrifuge ved 7500 x g ved 4 °C i 5 minutter. Ethanolen vasker pelleten yderligere.
- Fjern supernatanten forsigtigt uden at forstyrre pelleten. Lad hætterne være åbne for at tørre prøven. Dette tager normalt 5-10 minutter, men kan variere afhængigt af hvor meget ethanol der var tilbage på pellet. Må ikke overtørres.
- Når det er tørt, opbruges pellet i DNase frit vand. Der tilsættes 20 μL til prøver for DCN og 30 μL for alle andre.
- Når prøverne er blevet genbrugt, kan de opbevares ved -80 °C eller fortsættes til yderligere test.
4. Real Time kvantitative Polymerase kædereaktion (RTqPCR)
- Før dette trin vil det være nødvendigt at DNase behandle RNA for at fjerne ethvert genomisk DNA og generere cDNA ved hjælp af iScript fra BioRad. Sørg for at normalisere koncentrationen af RNA, før du foretager cDNA. Derudover er det vigtigt at optimere primere til qPCR. Følg de metoder, der er beskrevet her, for at fuldføre dette trin21. Kort beskrivelse af qPCR nedenfor.
- Primere er alle købt fra IDT. For- og omvendt sekvenser er begge i samme prøveglas og opbevares ved 20x koncentration.
Rps18 (kontrolgen):
Fremad – 5'-CCTGAAGTTCCAGCACAT-3'
Omvendt – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
Parvalbumin (Calciumbindingsprotein, hæmmende celler):
Fremad – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
Omvendt – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3'
Kcng4 (underenhed til kaliumkanal):
Fremad – 5'-CTGTCTTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
Omvendt – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
Aldolase C (Zebrin II, forskelligt udtrykt på tværs af cerebellar cortex):
Fremad – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3'
Omvendt – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3' - qPCR-betingelserne var som følger. For inkubationsperiode, 5 minutter, ved 95°C. Forstærkningsperiode, 50 cyklusser: 10 minutter ved 95°C, 10 minutter ved 62°C og 10 minutter ved 72°C. Smeltekurveperiode, 5 sekunder ved 95°C, et minut ved 65°C, og sæt rampehastigheden til 0,07°C/sekund indtil måltemperaturen på 97°C. Derefter afkølingsperiode i 10 minutter til 40 °C. Alle qPCR-reaktioner blev udført i tre eksemplarer, og genekspression blev analyseret ved hjælp af 2- ΔΔCt med Rps18 som en belastningskontrol for at normalisere genekspression. Massemæringscertifikatekstrakt blev brugt som reference.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til disse eksperimenter blev der anvendt fire elleve uger gamle vilde kvindelige C57/Black6-mus. En mus blev brugt til at foretage en fuld cerebellar dissektion, der kaldes 'bulk cerebellum' og gav mulighed for sammenligning af RNA-niveauer i dissekerede regioner til en fuld dissektion. De tre andre mus blev brugt til at udføre den cerebellar dissektion, der er beskrevet i denne protokol. Ved hjælp af tre mus gør det muligt at sikre, at de tendenser, der opdages i niveauerne af RNA, kan reproduceres på tværs af mus.
Figur 1A repræsenterer musebellum - vermis i blåt og halvkugler i gult. Sagittal skemaer af vermis (forreste regioner i mørkeblå, bageste regioner i lyseblå) og halvkugle (i gult). DCN er fremhævet i røde prydede bokse. En vellykket dissektion vil starte med den første placering af barberbladet ned midt på hjernen (Figur 1B); Dette styrer den vellykkede placering af følgende seks blade (Figur 1C). Dette efterlader seks sagittale sektioner (Figur 1D), fire laterale /halvkugle sektioner (skitseret i lilla) og to midterlinjen / vermal sektioner (skitseret i lyseblå). De 4 sideafsnit indeholder DCN. Figur 1E skildrer en vellykket DCN punch dissektion. Den midline vermal sektioner vil højst sandsynligt have halvdelen af de mest mediale DCN til stede i 1 mm tyk sektion, men det vil ikke være til stede hele vejen igennem og er ikke muligt at reproducereibly dissekere ud. De midterlinjede vermale sektioner er opdelt i forreste og bageste lobules afbildet i figur 1F. En vellykket dissektion opstiller resten af eksperimenterne for succes.
Resultater af kvalitativ polymerasekædereaktion (RTqPCR) i realtid viser, at det er muligt at vurdere genudtryksniveauerne i hver enkelt region samt at validere dissektioner. Vi brugte primere til at opdage gener, der viser gradientudtryk fra forreste til bageste cerebellar cortex og berigelse i DCN og sammenlignede deres udtryk med bulk cerebellar lysater.
Vi vurderede ekspressionsniveauerne for tre gener: aldolase C, parvalbumin og Kcng4. Aldolase C, også kendt som zebrin II, er et enzym, der udtrykkes i et konsistent båndmønster gennem lillehjernen. Det udtrykkes mere i den bageste vermis end den forreste vermis. Der er også bands på halvkuglerne13,14. Parvalbumin, som er et calciumbindingsprotein, der udtrykkes i hæmmende celler. Baseret på Allen Brain Atlas, parvalbumin synes relativt ensartet udtrykt i hele cerebellar cortex og i DCN (http://mouse.brain-map.org/gene/show/19056). Kcng4, en kalium spænding gated kanal underenhed, synes at være beriget i DCN og i den forreste i forhold til den bageste lobes (https://mouse.brain-map.org/gene/show/42576). Kvantitativ udtryksanalyse viste, at aldolase C som forventet er mere stærkt udtrykt i den bageste cerebellar vermis (CCpV), men lavere i DCN og den forreste region i vermis (CCaV) sammenlignet med bulk cerebellar dissektion (Figur 2A). Parvalbumin er ligeledes til stede i DCN, forreste vermis, posterior vermis, og halvkugle cerebellar cortices som i bulk cerebellar ekstrakter (Figur 2B). Kcng4 er signifikant beriget i DCN og den forreste vermis (CCaV), og det er ikke signifikant beriget i den bageste vermis (CCpV) eller halvkugler (CCH) sammenlignet med bulk udvinding (Figur 2C). Dette resultat følger, hvad der var forventet baseret på det mønster, der ses i Allen Brain Atlas. Således validerer genekspressionsanalyse dissektionsprotokollen og bekræfter, at RNA af god kvalitet kan opnås og testes.
For direkte at sammenligne udtrykket af aldolase C på tværs af cerebellar cortex, udtrykket niveauer blev sammenlignet med, hvor det formodes at være lavest, den forreste vermis (CCaV) (Figur 3). Udtrykket niveau af aldolase C var betydeligt højere i den bageste vermis (CCpV), og trending højere i cerebellar halvkugler (CCH), men ikke helt væsentligt så. Denne tendens i lillehjernen halvkugler er sandsynligt, fordi der er bands af aldolase C på halvkugler, og dissektion fanger aldolase negative og positive bånd.
Figur 1: Repræsentative billeder af cerebellardissektion
A. Det er ikke så lidt. Skematisk af mus lillehjernen med vermis i blå og halvkugler i gult. Sagittal cerebellar skemaer over både vermis og halvkugle. Vermis er i blåt, med mørkeblå markerer den forreste vermis, og lyseblå mærkning posterior vermis. Halvkugle i gult. DCN er markeret i hver med rød-prikket bokse. B. Fuld hjerne i sagittal mus hjerne matrix, med barberblad ned midt på grænsen. C. Placering af tre barberblade med 1 mm fra hinanden på hver side af midterlinjen. D. Det er mig. De resulterende seks sagittal hjerne sektioner. Fire indeholder lateral / halvkugle cerebellar sektioner (de fire øverste billeder skitseret i lilla). To indeholder mediale/vermale cerebellar-sektioner (nederste to billeder, skitseret med lyseblå). E. Repræsentativ sideværts/halvkugle cerebellar sektion med DCN punch dissekeret til højre for afsnittet (afsnit skitseret i pink i figur 1D). F. Cerebellar sektion i figur 1D med firkantede prikket turkis omkring det, dissekeret i forreste og bageste vermal lobules. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Relativt genekspression i isolerede specifikke områder af lillehjernen.
Relativt udtryk for aldolase C (2A), parvalbumin (2B) og Kcng4 (2C) normaliseret til Rps 18 (protein forbundet med ribosomalt RNA udtrykt i alle celler) og ved hjælp af bulk cerebellarekstrakt som reference. Som forventet var aldolase C-udtrykket højere i den bageste vermis og lavere i DCN og forreste vermis (2A). Som forventet, baseret på Allen Brain Atlas, udtrykkes parvalbumin udtryk ensartet på tværs af hver udvundet region, mens Kcng4 udtryk er betydeligt beriget i DCN og CCaV. Envejs ANOVA, med en Tukey's post hoc-test. *p<.0.005, ** p<.0.0001 i forhold til masseviskbellarekstraktet. Histogrammer repræsenterer gennemsnitsværdier for N=3 med værdier for hver enkelt mus vist som prikker. Fejllinjer repræsenterer standardfejl af middelværdien. DCN (Deep cerebellar nuclei), CCaV (den lillehjernen cortex af forreste vermis), CCpV (den lillehjernen cortex af posterior vermis), og CCH (den lillehjernen cortex af halvkugler). N=3 mus til cerebellar dissektionsområder. N=1 masseekstrakt. Eksperiment udført i tre eksemplarer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: RTqPCR Relativ genekspression af aldolase C på tværs af cerebellar cortex
Relativt udtryk for aldolase C i bestemte regioner i cerebellar cortex - forreste vermis (CCaV), posterior vermis (CCpV) og halvkugler (CCH). Genekspressionsniveauet for aldolase C blev normaliseret til Rps18 og sammenlignet med ekspressionsniveauet i den forreste vermis. Som forventet blev aldolase C-udtrykket beriget i den bageste vermis. Envejs ANOVA, med en Tukey's post hoc-test. *p<.0.005 i forhold til CCaV. Fejllinjer repræsenterer standardfejl af middelværdien. CCaV (den lillehjernen cortex af forreste vermis), CCpV (den lillehjernen cortex af posterior vermis), og CCH (den lillehjernen cortex af halvkugler). N=3 mus, forsøg udført i tre eksemplarer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne metode gør det muligt at vurdere det underliggende genekspression og molekylære mekanismer inden for fire forskellige cerebellarområder – den dybe cerebellarkerner (DCN), vermis '(CCaV) forreste cerebellarbark , vermis 's bageste cerebellar cortex (CCpV) og halvkuglernes lillehjernen cortex (CCH). Evnen til at vurdere disse regioner separat vil udvide vores viden om heterogeniteten i specifikke cerebellar-regioner og muligvis kaste lys over deres bidrag til forskellige adfærd.
Ved at sektionsopdele det fulde hjernevæv sagittally er det muligt nemt at visualisere og identificere disse fire regioner i lillehjernen, hvilket giver mulighed for en hurtig dissektion. Så vidt forfatteren ved, er dette den første beskrivelse af fuld cerebellar regional dissektion til molekylær analyse. I et papir, der for nylig blev offentliggjort, brugte forskere bulk dissektion af cerebellums forreste lobules og cerebellumets nodulærlaule til molekylær analyse22. Men med den beskrevne metode ville de ikke være i stand til også at dissekere DCN. Forsøg på at isolere DCN slag ved hjælp af en vibratome til at skære 300um tykke skiver normalt løbe ind i tre kritiske problemer. For det første er det på grund af små forskelle i monteringen af cerebella og den vinkel, hvor vævet skæres, ikke let at reproducere de samme regioner på tværs af dyr. For det andet tager montering og udskæring tid, hvilket øger chancerne for RNA-nedbrydning og faldende kvalitet af RNA-prøve til downstream-applikationer. Endelig giver slag fra 300um tykke skiver lavt udbytte af RNA.
Data vist her tyder på, at det er muligt at bruge denne teknik til at vurdere relative genekspression på tværs af cerebellar regioner. Aldolase C er stærkt opreguleret i CCPV. Kcng4 er stærkt upreguleret i DCN og CCaV, og parvalbumin udtrykkes relativt ligeligt på tværs af alle regioner i lillehjernen. Selv om disse kun er tre gener, viser disse resultater, at denne dissektionsmetode kan bruges til at identificere de underliggende molekylære signaturer i disse forskellige regioner.
Der er et par kritiske ting at være opmærksom på i hele denne protokol. Placering af hjernen i matrixen er et vigtigt skridt. I nogle tilfælde kan hjernen ikke have været indstillet perfekt niveau i matrixen eller præcis på midterlinjen. Dette ville blive klart, når man ser på hver af de sagittal sektioner. For eksempel, hvis de skæres nøjagtigt ved midterlinjen, vil de mest mediale cerebellar sektioner se næsten identiske ud og har ingen DCN synlig. Da disse vartegn kan identificeres med øjet, er det muligt at foretage fejlfinding af, hvor mange sektioner der kvalificerer sig som vermale eller halvkuglesektioner, og de kan kombineres i det samme mikrofugerør. Et andet kritisk skridt er udvindingen af DCN. I nogle tilfælde er det ikke nok tryk at trykke en finger til toppen af 200 μl pipetspidsen for at udtrække vævsstansen. Hvis dette er tilfældet, vil det være nødvendigt at scoop ud punch med en nål næse pincet og placere punch i det rigtige rør. Det næste kritiske trin i denne protokol er RNA-udtrækningen. Mens de anførte mængder er optimeret til maksimal RNA-ekstraktion, kan det også være nødvendigt at justere mængden af opløsning i RNA-ekstraktionsprotokollen, så den passer til laboratoriets individuelle behov. Fordi der er lidt væv at arbejde med, er der større chance for phenolforurening i det endelige RNA-produkt. Dette kan styres ved at justere mængden af TRIzol, der bruges til at homogenisere vævet og sikre, at det homogeniserede væv blandes grundigt.
Begrænsningerne i denne protokol er, at mens DCN er opdelt i tre separate kerner (lateral, interposed, og mediale) er det vanskeligt at visualisere og reproducerbart punch hver af disse ud af 1 mm sektioner, endsige have nok væv til at udtrække RNA. Sammen med denne begrænsning vises halvdelen af de mest mediale DCN i vermis; Men med denne dissektion er det vanskeligt at visualisere og reproducere dissekere ud. Som protokollen er i øjeblikket, er den anden halvdel af den mediale DCN og de resterende DCN dissekeret ud. Der er også ti individuelle vermale lobules og otte lobules på halvkuglerne, men at dissekere hver af disse individuelt og reproducerbart ville være vanskeligt og føre til meget lave RNA-koncentrationsudbytter. Selv om denne metode gør det muligt at dykke mere specifikt ned i områder af lillehjernen, kombinerer den stadig forskellige anatomiske regioner i grupper, der kan maskere unikke ændringer på niveau med individuelle lobules eller sub-lobule enheder.
Afslutningsvis vil jeg sige, at denne metode gør det muligt samtidig at udforske regionale molekylære forskelle fire specifikke regioner i lillehjernen. Ved at vurdere lillehjernen på denne regionsspecifikke måde er det muligt at drille underliggende molekylære mekanismer og genekspression, der karakteriserer disse regioner. Dette vil fremme vores forståelse af den rolle, som de forskellige cerebellar regioner spiller i forskellige adfærd og give mulighed for fremtidigt arbejde til at fokusere specifikt på en cerebellar region og udforske sin rolle i sygdom eller målbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Austin Ferro og Juao-Guilherme Rosa i Cvetanovic lab for deres hjælp til fejlfinding dissektioner og i RNA udvinding og RTqPCR. Denne forskning er finansieret af M. Cvetanovic, R01 NS197387; HHS | Nationale institutter for sundhed (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , Online Preprint (2020).
