Summary
Verschillende cerebellaire regio's zijn betrokken om een rol te spelen in verschillende gedragsoutputs, maar de onderliggende moleculaire mechanismen blijven onbekend. Dit werk beschrijft een methode om de cerebellaire cortex van de hemisferen, voorste en achterste gebieden van de vermis en de diepe cerebellaire kernen reproduceerbaar en snel te ontleden om moleculaire verschillen te onderzoeken door RNA te isoleren en te testen op verschillen in genexpressie.
Abstract
Cerebellum speelt een belangrijke rol in verschillende belangrijke functies, waaronder controle van beweging, evenwicht, cognitie, beloning en invloed. Beeldvormende studies geven aan dat verschillende cerebellaire regio's bijdragen aan deze verschillende functies. Moleculaire studies die regionale cerebellaire verschillen onderzoeken, blijven achter, omdat ze meestal worden gedaan op hele cerebellaire extracten, waardoor elk onderscheid tussen specifieke cerebellaire regio's wordt gemaskeerd. Hier beschrijven we een techniek om vier verschillende cerebellaire gebieden reproduceerbaar en snel te ontleden: de diepe cerebellaire kernen (DCN), de voorste en achterste verale cerebellaire cortex en de cerebellaire cortex van de hemisferen. Het ontleden van deze verschillende regio's maakt het mogelijk om moleculaire mechanismen te verkennen die ten grondslag kunnen liggen aan hun unieke bijdragen aan evenwicht, beweging, invloed en cognitie. Deze techniek kan ook worden gebruikt om verschillen in pathologische gevoeligheid van deze specifieke regio's tussen verschillende muisziektemodellen te onderzoeken.
Introduction
Het cerebellum bevat meer dan de helft van de neuronen in de hersenen en is historisch aangeduid als een motorische controle en evenwicht centrum in de hersenen1. Meer recentelijk hebben studies aangetoond dat het cerebellum een sleutelrol speelt in verschillende andere functies, waaronder cognitie, beloningsverwerking en2,3,4,5beïnvloedt .
Het cerebellum heeft een goed beschreven anatomie: het cortexgebied bestaat uit korrels, Purkinje en moleculaire lagen. Korrelcellen vormen de korrelcellaag en sturen via parallelle vezels input naar de Purkinje-celdendrieten van de moleculaire laag die ook input ontvangen van klimvezels die afkomstig zijn van de inferieure olijf. Purkinje-cellen sturen remmende projecties naar cellen in de diepe cerebellaire kernen (DCN), die dient als de belangrijkste output van het cerebellum. De output van dit cerebellaire circuit wordt verder gemoduleerd door de activiteit van de remmende interneurons in de cerebellaire cortex, waaronder Golgi, stellaat en mandcellen4. Deze cerebellaire functionele eenheid is verdeeld over alle lobules van de cerebellaire cortex. Ondanks deze relatief uniforme circuits over het cerebellum wijst bewijs uit menselijke neuroimaging literatuur en patiëntenstudies op functionele heterogeniteit van het cerebellum6,7.
De cerebellaire cortex kan worden onderverdeeld in twee hoofdgebieden: de middellijngedefinieerde vermis en de laterale hemisferen. De vermis kan verder worden onderverdeeld in voorste en achterste lobules. Deze verschillende gebieden van het cerebellum zijn betrokken bij het bijdragen aan verschillende gedragingen. Taak-opgeroepen of taakvrije activiteitspatronen impliceerden dat voorste gebieden van de vermis meer bijdragen aan de motorische functie, terwijl posterieure vermis meer bijdraagt aan cognitie6,7. De vermis is ook verbonden met affect en emoties, terwijl cerebellaire hemisferen bijdragen aan uitvoerende, visueel-ruimtelijke, taal en andere mnemonische functies8. Bovendien leverden anatomische studies bewijs dat functioneel verschillende cerebellaire regio's verbonden zijn met verschillende corticale regio's9. Laesiesymptomen in kaart gebracht bleek dat patiënten met beroertes die de voorste lobules aantasten (die zich uitstrekken tot lobule VI) slechtere prestaties hadden bij fijne motorische taken, terwijl patiënten met schade aan achterste kwabregio's en hemisferen cognitieve tekorten vertoonden bij afwezigheid van cerebellair motorisch syndroom10. Ten slotte geeft regionale cerebellaire pathologie bij ziekten aan dat functioneel verschillende cerebellaire regio's ook verschillend vatbaar zijn voor ziekte11,12.
Hoewel veel minder onderzocht, toont voorlopig bewijs verschillende genexpressiesignaturen aan in cerebellaire corticale regio's. Purkinje celexpressie van Zebrin II toont regiospecifieke patronen in de vermis zodanig dat er meer Zebrin II positieve cellen in de achterste lobules en minder in de voorste lobules13. Dit correleert ook met regionaal onderscheidende fysiologische functie als Zebrin II negatieve Purkinje cellen vertonen een hogere frequentie van tonic vuren dan Purkinje cellen die Zebrin II positief14.
Naast de cerebellaire cortex omvat het cerebellum de diepe cerebellaire kernen (DCN) die dienen als de primaire output voor het cerebellum. De kernen bestaan uit de mediale (MN), interposed (IN) en laterale kernen (LN). Functionele beeldvorming en patiëntstudies hebben aangetoond dat de DCN ook deelneemt aan verschillende gedragingen15, maar zeer weinig studies onderzoeken genexpressieverandering in DCN.
Vooruitgang in moleculaire technieken heeft het mogelijk gemaakt om regionale genexpressie in de hersenen te beoordelen en heeft heterogeniteit in en binnen verschillende hersengebieden in zowel fysiologische als ziektetoestanden blootgelegd16. Dergelijke studies impliceren dat het cerebellum verschilt van andere hersengebieden. De verhouding van neuronen tot gliacellen wordt bijvoorbeeld omgekeerd in het cerebellum in vergelijking met andere hersengebieden1. Zelfs in normale fysiologische omstandigheden wordt de expressie van pro-inflammatoire genen geüreguleerd in het cerebellum in vergelijking met de andere hersengebieden17. Moleculaire technieken zijn ook zeer nuttig geweest bij het identificeren van de paden die bijdragen aan de pathogenese van cerebellaire ziekten. Bijvoorbeeld, RNA sequencing van de hele cerebellaire extracten geïdentificeerd genen veranderd in een Purkinje cel specifieke transgene muis model van spinocerebellaire ataxie type 1 (SCA1) in vergelijking met hun wild type controles. Dergelijk bewijs heeft belangrijke moleculaire routes onthuld die ten grondslag liggen aan pathogenese in cerebellaire Purkinje-cellen en heeft geholpen bij het identificeren van potentiële therapeutische doelen18. Recente studies suggereren echter dat er verschillen zijn in de kwetsbaarheid voor ziekten in de cerebellaire regio 's11,12,19. Dit kan erop wijzen dat er belangrijke veranderingen optreden in verschillende cerebellaire regio's, die kunnen worden gemaskeerd of onopgemerkt met hele cerebellaire extracten. Er is dus behoefte aan technieken waarmee onderzoekers moleculaire profielen in verschillende cerebellaire gebieden kunnen onderzoeken.
De hier voorgestelde techniek beschrijft een reproduceerbare methode om vier verschillende gebieden van het muis cerebellum te ontleden om RNA van die gebieden te isoleren en regionale verschillen in genexpressie te onderzoeken. Het schema van het muis cerebellum in figuur 1A markeert de vermis in blauw en hemisferen in geel. In het bijzonder maakt deze techniek het mogelijk om vier regio's te isoleren: diepe cerebellaire kernen (DCN) (roodgestippelde vakken in figuur 1A),de cerebellaire cortex van voorste vermis (CCaV) (donkerblauw in figuur 1A),de cerebellaire cortex van de posterieure vermis (CCpV) (lichtblauw in figuur 1A)en de cerebellaire cortex van de hemisferen (CCH) (geel in figuur 1A). Door de genexpressie van deze regio's afzonderlijk te beoordelen, zal het mogelijk zijn om moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan discrete functies van deze verschillende regio's, evenals potentiële verschillen in hun kwetsbaarheid voor ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Instellen
- Verzamel de benodigde apparatuur, waaronder onthoofdingschaar, stompe tang, dissectieschaar, vasculaire schaar, microspatula, sagittale muishersenmatrix, scheermesjes, 200 μL pipetpunten, glazen petrischaal, glazen glijbaan en ijsemmer. Leg alle apparatuur op een absorberend kussen.
- Plaats petrischaal, glazen plaat en hersenmatrix op ijs.
- Knip met een scheermesje loodrecht onder een loodrechte hoek ongeveer 5 mm van de punt van een pipetpunt van 200 μL af. Hierdoor is de opening aan het einde van de punt ongeveer 1 mm breed. Dit moet voldoende zijn om het DCN uit te stoten. Maar dit kan ook naar behoefte worden aangepast afhankelijk van de dissectie. Heb veel tips klaar voor eenvoudige vervanging en aanpassing.
- Etiket 1,5 ml microfugebuizen met dieridentificatie en cerebellaire regio (vier buizen per dier).
- Vul cryosafe container met vloeibare stikstof om vriesweefsel na extractie te flitsen.
2. Hersenextractie en dissectie
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Care Committees van de Universiteit van Minnesota.
- Euthanaseer de muis met 5% CO2 blootstelling. Zodra de ademhaling is gestopt, voert u cervicale dislocatie uit. Onthoofd de muis met de onthoofdingschaar en gooi het karkas weg in de daarvoor bestemde recipiënt.
- Maak een incisie met een scheermesje langs de mediale sagittale lijn van het hoofd, beginnend bij de neus en helemaal terug. Scheid de huid en scheid aan weerszijden van de middellijn. Gebruik het scheermesje om de spier aan elke kant weg te snijden en langs de gehoorgangen te snijden.
- Met behulp van een ontledende schaar, trim eventuele ruggenmerggebieden, tot waar de hersenstam het cerebellum ontmoet, voorzichtig om het cerebellum niet te beschadigen.
- Steek een van de vasculaire schaarbladen in de ruimte tussen de hersenstam en de wervelkolom en snijd naar de gehoorgang, til de schaar op om het bot schoon te snijden, maar beperk schade aan het weefsel.
- Blijf langs de rand van de schedel snijden in de richting van de olfactorische bollen en blijf optillen tijdens het snijden om schade aan het hersenweefsel te beperken.
- Verwijder met behulp van de stompe tang voorzichtig de achterkant van de schedel en ontdek het achterste gebied van de hersenen en het cerebellum.
- Met behulp van de stompe tang langs de rand van de schedel die net is doorgesneden, pelt u de rest van de schedel op en over de hersenen. Deze stap moet het grootste deel van de schedelkap verwijderen en de hersenen onthullen.
- Knip de rest van de schedel af met de vasculaire schaar en stompe tang, waarbij het grootste deel van de schedel van de bovenkant van de hersenen wordt verwijderd.
- Til met behulp van de microspatula de hersenen iets op en schep eronder en schuif omhoog om de olfactorische bollen uit de resterende schedel te verwijderen en de optische tractusvezels los te koppelen. Hersenen moeten op dit moment gemakkelijk vrij komen.
- Plaats de hersenen in de petrischaal zittend op ijs en verwijder eventuele resterende schedel of ander puin.
- Plaats de hersenen met behulp van de microspatula voorzichtig in de hersenmatrix met de rugzijde naar boven. Neem de tijd om ervoor te zorgen dat het niveau in de matrix is ingesteld, vooral dat de middellijn in het midden in de matrix valt. Deze matrix is ontworpen voor volwassen muizenhersenweefsel, weefsel van jongere of zieke dieren kan lager in de matrix rusten, maar het moet nog steeds mogelijk zijn om reproduceerbare resultaten over monsters te bereiken.
- Plaats een scheermesje langs de sagittale middellijn en zorg ervoor dat het mes helemaal naar de bodem van de matrix duwt (afbeelding 1B).
- Plaats nog een scheermesje van 1 mm aan de zijkant van het eerste mes (afbeelding 1B). Plaats nog twee messen van 1 mm van elkaar. Het eindresultaat moet drie bladen zijn die aan één kant van de hersenen zijn geplaatst, allemaal 1 mm uit elkaar. Doe hetzelfde met de andere kant. In totaal worden 7 messen 1 mm uit elkaar geplaatst(figuur 1C).
- Pak voorzichtig de voor- en achterkant van de scheermesjes en til ze recht uit de matrix. Het weefsel aan de buitenkant van de scheermesjes kan worden weggegooid.
- Scheid langzaam het ene scheermesje tegelijk van het andere, waarbij u voorzichtig bent om de weefselsecties niet te beschadigen.
- Schuif het weefselgedeelte voorzichtig van het scheermesje en op de glazen glijbaan met de microspatula. In totaal zullen er zes sagittale hersensecties zijn (Figuur 1D).
- De 4 meest laterale secties hebben DCN zichtbaar (paarse doos, figuur 1D). Om het DCN te isoleren, houdt u de bijgesneden pipetpunt van 200 μL loodrecht over het DCN en duwt u het weefsel stevig naar beneden en schommelt u in alle richtingen om het DCN volledig te ontleden van het omringende weefsel. Til recht omhoog om het DCN netjes te verwijderen en bevestig visueel de aanwezigheid van het weefsel in de punt.
- Plaats een vinger aan de bovenkant van de punt en duw naar beneden, waardoor het weefsel uitpuilt. Plaats de punt in de correct gelabelde microfugebuis en zorg ervoor dat de weefselpons in de bodem van de buis wordt geplaatst. Herhaal 2.17 voor de overige drie secties en plaats de DCN-ponsen in dezelfde buis. Plaats de buis in vloeibare stikstof om te knipperen. Weergave van de grootte van elke pons in figuur 1E.
- Secties met DCN-extract kwalificeren als cerebellaire hemisfeer. Duw de rest van het hersenweefsel rond het cerebellum weg in deze secties. Gebruik een stompe tang en pak voorzichtig deze cerebellaire cortexsecties van de hemisfeer op en plaats ze in de respectievelijke microfugebuis. Flash bevriezen.
- Voor de laatste twee vermal secties (lichtblauwe doos, Figure1D), duw je het omringende hersenweefsel weg en laat alleen het cerebellum achter. Maak met behulp van een scheermesje een snede die de voorste lobules scheidt van de achterste lobules. De snede moet net na de vorming van lobule 6 zijn en mag geen lobule 10 (figuur 1F) bevatten.
- Plaats met behulp van stompe tangen voorzichtig de voorste cerebellaire cortexsecties en achterste cerebellaire cortexsecties in hun respectieve microfugebuizen en flitsvries door de buizen gedurende 5 minuten in vloeibare stikstof te laten. Ga vanaf hier verder met RNA-extractie, of bewaar de buizen bij -80 °C.
3. RNA-extractie
OPMERKING: Dit protocol is gewijzigd van het Cold Spring Harbor Protocol voor RNA Extractie met TRIzol20. TRIzol solubiliseert biologisch materiaal, waardoor het mogelijk is om RNA te extraheren.
- Plaats de microfugebuizen in ijs om te voorkomen dat het weefsel te snel ontdooit, breng 150 μL koude TRIzol aan in de microfugebuis. Homogeniseer met een gesteriliseerde stamper. Zodra weefsel is gehomogeniseerd, pijpt u de oplossing op en neer om ervoor te zorgen dat er geen restweefsel intact blijft. Breek verder kleine weefselstukken door het een paar keer in een insulinespuit te trekken.
- Voeg nog eens 350 μL TRIzol toe en pipet op en neer om grondig te mengen. Laat 5 minuten op kamertemperatuur zitten.
- Voeg 150 μL chloroform toe aan de buis en schud krachtig en laat vervolgens 2-3 minuten rusten. De chloroform scheidt de gehomogeniseerde weefseloplossing in fasen (RNA, DNA en eiwit).
- Centrifugeer bij 12.000 x g, bij 15°C, gedurende 10 minuten. Zorg ervoor dat alle buizen in dezelfde stand staan.
- Verwijder de buizen voorzichtig en stel de temperatuur van de centrifuge in op 4°C. Verwijder alleen de heldere waterfase in een nieuwe buis (dit is het RNA), zorg ervoor dat u de ondoorzichtige interfase (het DNA) niet verstoort. De laagste fase is rood en bevat eiwitten. Resterende oplossing in de buizen kan worden opgeslagen of weggegooid.
- Voeg 100% isopropylalcohol toe in een verhouding van 1:2 (indien verwijderd 200 ul waterige fase, voeg 100 μL isopropylalcohol toe). Meng grondig door op en neer te pipetten. Laat 10 minuten rusten op kamertemperatuur. De isopropylalcohol precipitateert het RNA uit de oplossing.
- Centrifugeer bij 12.000 x g, bij 4°C, gedurende 10 minuten. Zorg ervoor dat u alle buizen in dezelfde richting plaatst om het gemakkelijker te maken om de pellet te visualiseren. De resulterende pellet zal het geëxtraheerde RNA zijn.
- Verwijder voorzichtig de buizen, verwijder het supernatant met een pipet dat voorzichtig is om de pellet niet te verstoren. De pellet is enigszins gelachtig en zal moeilijk te zien zijn, maar moet kunnen inschatten waar het is gebaseerd op de oriëntatie van de buizen in de centrifuge.
- Voeg na het verwijderen van al het supernatant 500 μL 75% ethanol, vortex kort toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 7500 x g, bij 4°C. De ethanol wast de pellet verder.
- Verwijder het supernatant voorzichtig, zonder de pellet te verstoren. Laat de doppen open om het monster te drogen. Dit duurt meestal 5-10 minuten, maar kan variëren afhankelijk van hoeveel ethanol er nog op de pellet zat. Niet te droog.
- Eenmaal droog, resuspend de pellet in DNase vrij water. Voeg 20 μL toe aan monsters voor DCN en 30 μL voor alle andere.
- Na resuspendatie kunnen monsters bij -80 °C worden opgeslagen of verder worden getest.
4. Real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie (RTqPCR)
- Voor deze stap moet DNase het RNA behandelen om genomisch DNA te verwijderen en cDNA genereren met behulp van iScript uit BioRad. Zorg ervoor dat u de concentratie RNA normaliseert voordat u het cDNA maakt. Daarnaast is het belangrijk om primers te optimaliseren voor qPCR. Volg de hier beschreven methoden om deze stap21te voltooien . Korte beschrijving van de qPCR hieronder.
- Primers worden allemaal gekocht bij IDT. Voorwaartse en omgekeerde sequenties bevinden zich beide in dezelfde monsterbuis en worden opgeslagen bij een concentratie van 20x.
Rps18 (controlegen):
Voorwaarts – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
Achteruit – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
Parvalbumine (Calciumbindend eiwit, remmende cellen):
Voorwaarts – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
Achteruit – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3'
Kcng4 (kaliumkanaalsubeenheid):
Voorwaarts – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
Achteruit – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
Aldolase C (Zebrin II, differentieel uitgedrukt over de cerebellaire cortex):
Voorwaarts – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3'
Achteruit – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3' - qPCR-voorwaarden waren als volgt. Pre-incubatieperiode, 5 minuten, bij 95°C. Versterkingsperiode, 50 cycli: 10 minuten bij 95°C, 10 minuten bij 62°C en 10 minuten bij 72°C. Smeltcurve, 5 seconden bij 95°C, één minuut bij 65°C, en stel de hellingssnelheid in op 0,07°C/seconde tot een streeftemperatuur van 97°C. Vervolgens 10 minuten afkoelen tot 40°C. Alle qPCR-reacties werden uitgevoerd in drievoud en genexpressie werd geanalyseerd met behulp van 2- ΔΔCt met Rps18 als een beladingscontrole om genexpressie te normaliseren. Bulk cerebellaire extract werd gebruikt als referentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor deze experimenten werden vier elf weken oude vrouwelijke wilde type C57/Black6 muizen gebruikt. Eén muis werd gebruikt om een volledige cerebellaire dissectie uit te voeren die "bulk cerebellum" wordt genoemd en die het mogelijk maakte om RNA-niveaus in ontleedde gebieden te vergelijken met een volledige dissectie. De andere drie muizen werden gebruikt om de cerebellaire dissectie uit te voeren die in dit protocol wordt beschreven. Het gebruik van drie muizen maakt het mogelijk om ervoor te zorgen dat de trends die worden gedetecteerd in de niveaus van RNA reproduceerbaar zijn voor alle muizen.
Figuur 1A vertegenwoordigt het muis cerebellum - vermis in blauw en hemisferen in geel. Sagittale schema's van de vermis (voorste gebieden in donkerblauw, achterste gebieden in lichtblauw) en hemisfeer (in geel). De DCN worden gemarkeerd in rode stippeldozen. Een succesvolle dissectie begint met de eerste plaatsing van scheermesjes in de middellijn van de hersenen(figuur 1B); dit begeleidt de succesvolle plaatsing van de volgende zes messen (figuur 1C). Hierdoor blijven zes sagittale secties(figuur 1D),vier laterale/hemisfeersecties (in paars) en twee middenlijn/vermalen secties (lichtblauw) over. De 4 zijsecties bevatten het DCN; Figuur 1E toont een succesvolle DCN punch dissectie. De midline vermal secties zullen hoogstwaarschijnlijk de helft van de meest mediale DCN aanwezig hebben in de 1 mm dikke sectie, maar het zal niet helemaal aanwezig zijn en is niet mogelijk om reproduceerbaar te ontleden. De vermalen middenlijnsecties zijn gescheiden in voorste en achterste lobules afgebeeld in figuur 1F. Een succesvolle dissectie zet de rest van de experimenten op voor succes.
Real Time kwalitatieve Polymerase Chain Reaction (RTqPCR) resultaten tonen de haalbaarheid aan van het beoordelen van de genexpressieniveaus van elke individuele regio en dienen om dissecties te valideren. We gebruikten primers die genen detecteren die gradiëntexpressie vertonen van voorste naar achterste cerebellaire cortex en verrijking in het DCN en vergeleken hun expressie met de bulk cerebellaire lysaten.
We beoordeelden de expressieniveaus van drie genen: aldolase C, parvalbumine en Kcng4. Aldolase C, ook bekend als zebrin II, is een enzym dat wordt uitgedrukt in een consistent banderolleerpatroon door het cerebellum. Het wordt meer uitgedrukt in de achterste vermis dan de voorste vermis. Er zijn ook banden in de hemisferen13,14. Parvalbumine, een calciumbindend eiwit dat wordt uitgedrukt in remmende cellen. Gebaseerd op de Allen Brain Atlas, parvalbumine lijkt relatief uniform uitgedrukt in de cerebellaire cortex en in de DCN (http://mouse.brain-map.org/gene/show/19056). Kcng4, een kaliumspanning gated channel subunit, lijkt te zijn verrijkt in het DCN en in de voorste in vergelijking met de achterste kwabben (https://mouse.brain-map.org/gene/show/42576). Kwantitatieve expressieanalyse toonde aan dat, zoals verwacht, aldolase C meer wordt uitgedrukt in de posterieure cerebellaire vermis (CCpV), maar lager in het DCN en het voorste gebied van de vermis (CCaV) in vergelijking met de bulk cerebellaire dissectie (Figuur 2A). Parvalbumine is even aanwezig in de DCN, anterieure vermis, posterieure vermis en cerebellaire cortices van de hemisfeer als in de bulk cerebellaire extracten (Figuur 2B). Kcng4 is aanzienlijk verrijkt in het DCN en de voorste vermis (CCaV) en is niet significant verrijkt in de achterste vermis (CCpV) of hemisferen (CCH) in vergelijking met de bulkextractie (Figuur 2C). Dit resultaat volgt wat werd verwacht op basis van het patroon in de Allen Brain Atlas. Genexpressieanalyse valideert dus het dissectieprotocol en bevestigt dat RNA van goede kwaliteit kan worden verkregen en getest.
Om de expressie van aldolase C over de cerebellaire cortex direct te vergelijken, werden de expressieniveaus vergeleken met waar het het laagst zou moeten zijn, de voorste vermis (CCaV) (Figuur 3). Het expressieniveau van aldolase C was significant hoger in de achterste vermis (CCpV) en hoger in de cerebellaire hemisferen (CCH), hoewel niet helemaal significant. Deze trend in de cerebellaire hemisferen is waarschijnlijk omdat er banden van aldolase C in de hemisferen zijn en de dissectie aldolase negatieve en positieve banden vangt.
Figuur 1: Representatieve beelden van cerebellaire dissectie
A. Schematisch van muis cerebellum met vermis in blauw en hemisferen in geel. Sagittale cerebellaire schema's van zowel vermis als hemisfeer. Vermis is in blauw, met donkerblauwe markering van de voorste vermis en lichtblauwe markering posterieure vermis. Halfrond in geel. De DCN zijn gemarkeerd in elk met rood gestippelde vakken. B. Volledige hersenen in sagittale muishersenmatrix, met scheermesje onderaan middellijn. C. Plaatsing van drie scheermesjes met een uit elkaar 1 mm uit elkaar aan weerszijden van de middellijn. D. De resulterende zes sagittale hersensecties. Vier bevatten laterale/halfrond cerebellaire secties (de bovenste vier afbeeldingen in paars). Twee bevatten mediale/vermal cerebellaire secties (onderste twee afbeeldingen, omlijnd in lichtblauw). E. Representatieve laterale/halfrond cerebellaire sectie met DCN-pons rechts van de sectie ontleed (sectie in roze omlijnd in figuur 1D). F. Cerebellaire sectie in figuur 1D met vierkante gestippelde turquois eromheen, ontleed in voorste en achterste vermalen lobules. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Relatieve genexpressie in geïsoleerde specifieke gebieden van het cerebellum.
Relatieve expressie van aldolase C (2A), parvalbumine (2B) en Kcng4 (2C) genormaliseerd tot Rps 18 (eiwit geassocieerd met ribosomale RNA uitgedrukt in alle cellen), en met behulp van bulk cerebellair extract als referentie. Zoals verwacht was de aldolase C-expressie hoger in de achterste vermis en lager in de DCN en anterieure vermis (2A). Zoals verwacht, gebaseerd op Allen Brain Atlas, wordt parvalbumine expressie uniform uitgedrukt in elk geëxtraheerd gebied, terwijl Kcng4 expressie aanzienlijk wordt verrijkt in de DCN en CCaV. Eenrichtings ANOVA, met een Tukey's post hoc test. *p<.0.005, ** p<.0.0001 ten opzichte van het bulk cerebellaire extract. Histogrammen vertegenwoordigen gemiddelde waarden voor N=3 met waarden voor elke afzonderlijke muis weergegeven als stippen. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. DCN (Deep cerebellar nuclei), CCaV (de cerebellaire cortex van anterieure vermis), CCpV (de cerebellaire cortex van de posterieure vermis) en CCH (de cerebellaire cortex van de hemisferen). N=3 muizen voor cerebellaire dissectiegebieden. N=1 bulkextract. Experiment gedaan in drievoud. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: RTqPCR Relatieve genexpressie van aldolase C over cerebellaire cortex
Relatieve expressie van aldolase C in specifieke gebieden van de cerebellaire cortex - voorste vermis (CCaV), posterieure vermis (CCpV) en hemisferen (CCH). Genexpressieniveau van aldolase C werd genormaliseerd tot Rps18 en vergeleken met het expressieniveau in de voorste vermis. Zoals verwacht werd de aldolase C-expressie verrijkt in de posterieure vermis. Eenrichtings ANOVA, met een Tukey's post hoc test. *p<.0.005 t.o.v. CCaV. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. CCaV (de cerebellaire cortex van anterieure vermis), CCpV (de cerebellaire cortex van de posterieure vermis) en CCH (de cerebellaire cortex van de hemisferen). N=3 muizen, experiment gedaan in drievoud. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode maakt het mogelijk om de onderliggende genexpressie en moleculaire mechanismen binnen vier verschillende cerebellaire gebieden te beoordelen - de diepe cerebellaire kernen (DCN), de voorste cerebellaire cortex van de vermis (CCaV), de achterste cerebellaire cortex van de vermis (CCpV) en de cerebellaire cortex van de hemisferen (CCH). Het vermogen om deze regio's afzonderlijk te beoordelen zal onze kennis van de heterogeniteit van specifieke cerebellaire regio's uitbreiden en mogelijk licht werpen op hun bijdrage aan verschillende gedragingen.
Door het volledige hersenweefsel verzakt is het mogelijk om deze vier gebieden van het cerebellum gemakkelijk te visualiseren en te identificeren, waardoor een snelle dissectie mogelijk is. Voor zover de auteur weet is dit de eerste beschrijving van volledige cerebellaire regionale dissectie voor moleculaire analyse. In een onlangs gepubliceerd artikel gebruikten onderzoekers bulkdissectie van de voorste lobules van het cerebellum en de nodulaire lobule van het cerebellum voor moleculaire analyse22. Met de beschreven methode zouden ze echter niet in staat zijn om ook het DCN te ontleden. Pogingen om DCN-stoten te isoleren met behulp van een vibratoom om 300um dikke plakjes te snijden, lopen meestal tegen drie kritieke problemen aan. Ten eerste, vanwege kleine verschillen in montage van de cerebella en de hoek waarin het weefsel wordt gesneden, is het niet gemakkelijk om dezelfde gebieden tussen dieren reproduceerbaar te isoleren. Ten tweede kost het monteren en snijden tijd, waardoor de kans op RNA-afbraak toeneemt en de kwaliteit van het RNA-monster voor downstreamtoepassingen afneemt. Ten slotte produceren stoten van 300um dikke plakjes een lage opbrengst RNA.
Gegevens die hier worden getoond, suggereren dat het mogelijk is om deze techniek te gebruiken om de relatieve genexpressie in cerebellaire regio's te beoordelen. Aldolase C is sterk geüreguleerd in de CCpV. Kcng4 is sterk geüreguleerd in het DCN en CCaV, en parvalbumine wordt relatief gelijk uitgedrukt in alle regio's in het cerebellum. Hoewel dit slechts drie genen zijn, tonen deze resultaten aan dat deze dissectiemethode kan worden gebruikt om de onderliggende moleculaire handtekeningen van deze verschillende regio's te identificeren.
Er zijn een paar kritieke dingen om op te letten in dit protocol. Het positioneren van de hersenen in de matrix is een belangrijke stap. In sommige gevallen zijn de hersenen mogelijk niet perfect waterpas gezet in de matrix of precies op de middellijn. Dit zou duidelijk worden als we naar elk van de sagittale secties kijken. Als u bijvoorbeeld precies op de middellijn snijdt, zien de meest mediale cerebellaire secties er bijna identiek uit en is er geen DCN zichtbaar. Omdat deze oriëntatiepunten met het oog kunnen worden geïdentificeerd, is het mogelijk om op te lossen hoeveel secties kwalificeren als vermalen of halfrondsecties, en ze kunnen worden gecombineerd in dezelfde microfugebuis. Een andere cruciale stap is de extractie van het DCN. In sommige gevallen is het indrukken van een vinger naar de bovenkant van de pipetpunt van 200 μl niet genoeg druk om de weefselpons te extraheren. Als dit het geval is, is het noodzakelijk om de pons met een naaldneus tang uit te scheppen en de pons in de juiste buis te plaatsen. De volgende kritieke stap van dit protocol is de RNA-extractie. Hoewel de vermelde volumes zijn geoptimaliseerd voor maximale RNA-extractie, kan het ook nodig zijn om de hoeveelheden oplossing in het RNA-extractieprotocol aan te passen aan de individuele behoeften van het lab. Omdat er weinig weefsel is om mee te werken, is er een grotere kans op fenolbesmetting in het uiteindelijke RNA-product. Dit kan worden beheerd door de hoeveelheid TRIzol aan te passen die wordt gebruikt om het weefsel te homogeniseren en ervoor te zorgen dat het gehomogeniseerde weefsel grondig wordt gemengd.
Beperkingen van dit protocol zijn dat hoewel de DCN zijn verdeeld in drie afzonderlijke kernen (zijdelings, interposed en mediaal), het moeilijk is om elk van deze uit 1 mm secties te visualiseren en reproduceerbaar te ponsen, laat staan genoeg weefsel te hebben waaruit RNA kan worden geëxtraheerd. Samen met deze beperking verschijnt de helft van de meest mediale DCN in de vermis; met deze dissectie is het echter moeilijk te visualiseren en reproduceerbaar te ontleden. Zoals het protocol momenteel is, wordt de andere helft van het mediale DCN en het resterende DCN ontleed. Er zijn ook tien individuele vermal lobules en acht lobules in de hemisferen, maar om elk van deze afzonderlijk en reproduceerbaar te ontleden zou moeilijk zijn en leiden tot zeer lage RNA-concentratieopbrengsten. Hoewel deze methode het mogelijk maakt om zich specifieker te verdiepen in gebieden van het cerebellum, combineert het nog steeds verschillende anatomische regio's in groepen die unieke veranderingen op het niveau van individuele lobules of sub-lobule-eenheden kunnen maskeren.
Concluderend, deze methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd regionale moleculaire verschillen vier specifieke gebieden van het cerebellum te verkennen. Door het cerebellum op deze regiospecifieke manier te beoordelen, is het mogelijk om onderliggende moleculaire mechanismen en genexpressie die deze regio's kenmerken, uit elkaar te plagen. Dit zal ons begrip van de rol die de verschillende cerebellaire regio's spelen in verschillende gedragingen bevorderen en het toekomstige werk mogelijk maken om zich specifiek op één cerebellaire regio te concentreren en de rol ervan in ziekte of doelbehandeling te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
We zijn Austin Ferro en Juao-Guilherme Rosa in het Cvetanovic-lab dankbaar voor hun hulp bij het oplossen van dissecties en bij RNA-extractie en RTqPCR. Dit onderzoek wordt gefinancierd door M. Cvetanovic, R01 NS197387; HHS | Nationale Instituten voor Gezondheid (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , Online Preprint (2020).
