Summary
Verschiedene Kleinhirnregionen spielen eine Rolle bei unterschiedlichen Verhaltensergebnissen, aber die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bleiben unbekannt. Diese Arbeit beschreibt eine Methode, um die Kleinhirnrinde der Hemisphären, der vorderen und hinteren Regionen der Vermis und der tiefen Kleinhirnkerne reproduzierbar und schnell zu sezieren, um durch Isolierung von RNA und Tests auf Unterschiede in der Genexpression auf molekulare Unterschiede zu untersuchen.
Abstract
Kleinhirn spielt eine wichtige Rolle in mehreren Schlüsselfunktionen, einschließlich der Kontrolle von Bewegung, Gleichgewicht, Kognition, Belohnung und Affekt. Bildgebende Untersuchungen deuten darauf hin, dass unterschiedliche Kleinhirnregionen zu diesen verschiedenen Funktionen beitragen. Molekulare Studien, die regionale Kleinhirnunterschiede untersuchen, hinken hinterher, da sie meist an ganzen Kleinhirnextrakten durchgeführt werden, wodurch alle Unterscheidungen zwischen bestimmten Kleinhirnregionen maskiert werden. Hier beschreiben wir eine Technik, um vier verschiedene Kleinhirnregionen reproduzierbar und schnell zu sezieren: die tiefen Kleinhirnkerne (DCN), die vordere und hintere vermale Kleinhirnrinde und die Kleinhirnrinde der Hemisphären. Die Sezierung dieser unterschiedlichen Regionen ermöglicht die Erforschung molekularer Mechanismen, die ihren einzigartigen Beiträgen zu Gleichgewicht, Bewegung, Affekt und Kognition zugrunde liegen können. Diese Technik kann auch verwendet werden, um Unterschiede in der pathologischen Anfälligkeit dieser spezifischen Regionen in verschiedenen Mauskrankheitsmodellen zu untersuchen.
Introduction
Das Kleinhirn enthält mehr als die Hälfte der Neuronen im Gehirn und wurde historisch als motorisches Kontroll- und Gleichgewichtszentrum im Gehirn bezeichnet1. In jüngerer Zeit haben Studien gezeigt, dass das Kleinhirn eine Schlüsselrolle bei verschiedenen anderen Funktionen spielt, einschließlich Kognition, Belohnungsverarbeitung undAffekt 2,3,4,5.
Das Kleinhirn hat eine gut beschriebene Anatomie: Die Kortexregion besteht aus Granula, Purkinje und molekularen Schichten. Körnerzellen bilden die Granulatzellschicht und senden den Input über parallele Fasern an die Purkinje-Zelldendriten der Molekülschicht, die auch Input von Kletterfasern erhalten, die aus der unteren Olive stammen. Purkinje-Zellen senden hemmende Projektionen an Zellen in den tiefen Kleinhirnkernen (DCN), die als Hauptausgang des Kleinhirns dienen. Die Ausgabe dieses Kleinhirnkreislaufs wird durch die Aktivität der inhibitorischen Interneuronen in der Kleinhirnrinde, einschließlich Golgi-, Stern- und Korbzellen, weiter moduliert4. Diese kleinhirnförmige Funktionseinheit ist über alle Läppchen der Kleinhirnrinde verteilt. Trotz dieser relativ einheitlichen Schaltkreise über das Kleinhirn deuten Beweise aus der Human-Neuroimaging-Literatur und Patientenstudien auf eine funktionelle Heterogenität des Kleinhirnshin 6,7.
Die Kleinhirnrinde kann in zwei Hauptregionen unterteilt werden: die mittelliniendefinierte Vermis und die laterale Hemisphäre. Die Vermis kann weiter in vordere und hintere Läppchen unterteilt werden. Diese unterschiedlichen Regionen des Kleinhirns wurden in die Lage verwickelt, zu unterschiedlichen Verhaltensweisen beizutragen. Aufgaben-evozierte oder aufgabenfreie Aktivitätsmuster implizieren, dass vordere Regionen der Vermis mehr zur motorischen Funktion beitragen, während hintere Vermis mehr zur Kognition beitragen6,7. Die Vermis ist auch mit Affekt und Emotionen verbunden, während Kleinhirnhemisphären zu exekutiven, visuell-räumlichen, sprachlichen und anderen mnemonischen Funktionen beitragen8. Darüber hinaus lieferten anatomische Studien Hinweise darauf, dass funktionell unterschiedliche Kleinhirnregionen mit verschiedenen kortikalen Regionen verbunden sind9. Die Kartierung der Läsionssymptome ergab, dass Patienten mit Schlaganfällen, die die vorderen Läppchen betrafen (bis in das Läppchen VI hinein), eine schlechtere Leistung bei feinmotorischen Aufgaben zeigten, während Patienten mit Schäden an den hinteren Lappenregionen und Hemisphären kognitive Defizite in Abwesenheit des kleinhirnmotorischen Syndromsaufwiesen 10. Schließlich zeigt die regionale Kleinhirnpathologie bei Krankheiten, dass funktionell unterschiedliche Kleinhirnregionen auch unterschiedlich anfällig für Krankheiten sind11,12.
Obwohl viel weniger erforscht, zeigen vorläufige Beweise unterschiedliche Genexpressionssignaturen über zerebelläre kortikale Regionen hinweg. Die Purkinje-Zellexpression von Zebrin II zeigt eine regionsspezifische Musterung in der Vermis, so dass es mehr Zebrin II-positive Zellen in den hinteren Läppchen und weniger in den vorderen Läppchen gibt13. Dies korreliert auch mit einer regional unterschiedlichen physiologischen Funktion, da Zebrin II-negative Purkinje-Zellen eine höhere Frequenz des tonischen Feuerns aufweisen als Purkinje-Zellen, die Zebrin II-positiv sind14.
Neben der Kleinhirnrinde umfasst das Kleinhirn die tiefen Kleinhirnkerne (DCN), die als Primärausgang für das Kleinhirn dienen. Die Kerne bestehen aus den medialen (MN), interposierten (IN) und lateralen Kernen (LN). Funktionelle Bildgebung und Patientenstudien haben gezeigt, dass das DCN auch an verschiedenen Verhaltensweisen beteiligt ist15, aber nur sehr wenige Studien untersuchen die Veränderung der Genexpression in DCN.
Fortschritte in molekularen Techniken haben es ermöglicht, die regionale Genexpression im Gehirn zu beurteilen und haben Heterogenität zwischen und innerhalb verschiedener Gehirnregionen sowohl in physiologischen als auch in Krankheitszuständen aufgedeckt16. Solche Studien implizieren, dass sich das Kleinhirn von anderen Gehirnregionen unterscheidet. Zum Beispiel ist das Verhältnis von Neuronen zu Gliazellen im Kleinhirn im Vergleich zu anderen Hirnregionen invertiert1. Selbst unter normalen physiologischen Bedingungen ist die Expression von proinflammatorischen Genen im Kleinhirn im Vergleich zu den anderen Hirnregionen hochreguliert17. Molekulare Techniken waren auch sehr nützlich bei der Identifizierung der Wege, die zur Pathogenese von Kleinhirnerkrankungen beitragen. Zum Beispiel identifizierte die RNA-Sequenzierung der gesamten Kleinhirnextrakte Gene, die in einem Purkinje-zellspezifischen transgenen Mausmodell der spinozerebellären Ataxie Typ 1 (SCA1) im Vergleich zu ihren Wildtypkontrollen verändert wurden. Solche Beweise haben wichtige molekulare Wege aufgedeckt, die der Pathogenese in kleinhirnen Purkinje-Zellen zugrunde liegen, und haben dazu beigetragen, potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren18. Neuere Studien deuten jedoch darauf hin, dass es Unterschiede in der Anfälligkeit für Krankheiten in den Kleinhirnregionen gibt11,12,19. Dies könnte darauf hindeuten, dass es in verschiedenen Kleinhirnregionen zu wichtigen Veränderungen kommt, die mit ganzen Kleinhirnextrakten maskiert oder unentdeckt sein können. Daher müssen Techniken entwickelt werden, die es Forschern ermöglichen, molekulare Profile in verschiedenen Kleinhirnregionen zu untersuchen.
Die hier vorgeschlagene Technik beschreibt eine reproduzierbare Methode, um vier verschiedene Regionen des Kleinhirns der Maus zu sezieren, um RNA aus diesen Regionen zu isolieren und regionale Unterschiede in der Genexpression zu untersuchen. Das Schema des Kleinhirns der Maus in Abbildung 1A hebt die Vermis in Blau und die Hemisphären in Gelb hervor. Insbesondere ermöglicht diese Technik die Isolierung von vier Regionen: tiefe Kleinhirnkerne (DCN) (rot gepunktete Kästchen in Abbildung 1A),die Kleinhirnrinde der vorderen Vermis (CCaV) (dunkelblau in Abbildung 1A),die Kleinhirnrinde der hinteren Vermis (CCpV) (hellblau in Abbildung 1A)und die Kleinhirnrinde der Hemisphären (CCH) (gelb in Abbildung 1A). Durch die getrennte Beurteilung der Genexpression dieser Regionen wird es möglich sein, molekulare Mechanismen zu untersuchen, die den diskreten Funktionen dieser verschiedenen Regionen zugrunde liegen, sowie mögliche Unterschiede in ihrer Anfälligkeit für Krankheiten.
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Protocol
1. Einrichtung
- Sammeln Sie die notwendige Ausrüstung, einschließlich Enthauptungsschere, stumpfe Pinzette, Sezierschere, Gefäßschere, Mikrospatula, sagittale Maushirnmatrix, Rasierklingen, 200 μL Pipettenspitzen, Glassteinschale, Glasobjektträger und Eiskübel. Legen Sie die gesamte Ausrüstung auf einem saugfähigen Pad aus.
- Petrischale, Glasplatte und Gehirnmatrix auf Eis legen.
- Schneiden Sie mit einer Rasierklinge in einem senkrechten Winkel etwa 5 mm von der Spitze einer 200 μL-Pipettspitze ab. Dadurch ist die Größe der Öffnung am Ende der Spitze etwa 1 mm breit. Dies sollte ausreichen, um das DCN auszustanzen. Diese kann aber auch je nach Dissektion bedarfsgemäss angepasst werden. Halten Sie viele Tipps für den einfachen Austausch und die Anpassung bereit.
- Etikett 1,5 ml Mikrofugenröhrchen mit Tieridentifikation und Kleinhirnregion (vier Röhrchen pro Tier).
- Füllen Sie den kryosicheren Behälter mit flüssigem Stickstoff, um das Gewebe nach der Extraktion zu flashen.
2. Gehirnextraktion und Dissektion
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Animal Care Committees der University of Minnesota durchgeführt.
- Euthanasiern Sie die Maus mit 5% CO2-Exposition. Sobald die Atmung aufgehört hat, führen Sie eine zervikale Luxation durch. Enthaupten Sie die Maus mit der Enthauptungsschere und entsorgen Sie den Kadaver im entsprechenden Behälter.
- Machen Sie einen Schnitt mit einer Rasierklinge entlang der medialen sagittalen Linie des Kopfes, beginnend an der Nase und den ganzen Weg zurück. Trennen Sie die Haut und trennen Sie sich zu beiden Seiten der Mittellinie. Verwenden Sie die Rasierklinge, um den Muskel auf jeder Seite wegzuschneiden und an den Gehörgängen vorbei zu schneiden.
- Schneiden Sie mit einer Schere alle Rückenmarksregionen bis zu dem Punkt, an dem der Hirnstamm auf das Kleinhirn trifft, und achten Sie darauf, das Kleinhirn nicht zu beschädigen.
- Führen Sie eine der vaskulären Scherenklingen in den Raum zwischen Hirnstamm und Wirbelsäule ein und schneiden Sie in Richtung Gehörgang, heben Sie die Schere an, um den Knochen sauber zu schneiden, aber die Schädigung des Gewebes zu begrenzen.
- Schneiden Sie weiter entlang des Schädelrandes in Richtung der Riechkolben und heben Sie sich beim Schneiden weiter an, um die Schädigung des Gehirngewebes zu begrenzen.
- Mit der stumpfen Pinzette die Rückseite des Schädels vorsichtig abziehen und die hintere Region des Gehirns und des Kleinhirns freizulegen.
- Mit der stumpfen Pinzette am Rand des Schädels, der gerade geschnitten wurde, schälen Sie den Rest des Schädels nach oben und über das Gehirn. Dieser Schritt sollte den Großteil der Schädelkappe entfernen und das Gehirn enthüllen.
- Schneiden Sie den Rest des Schädels mit der Gefäßschere und der stumpfen Pinzette ab und entfernen Sie den größten Teil des Schädels von der Oberseite des Gehirns.
- Heben Sie mit der Mikrospatula das Gehirn leicht an und schaufeln Sie darunter und gleiten Sie nach oben, um die Riechkolben vom verbleibenden Schädel zu entfernen und die Fasern des Sehtrakts zu trennen. Das Gehirn sollte an dieser Stelle leicht frei kommen.
- Legen Sie das Gehirn in die Petrischale, die auf Eis sitzt, und entfernen Sie alle verbleibenden Schädel oder andere Trümmer.
- Legen Sie das Gehirn mit der Mikrospatula vorsichtig mit der rückenden Seite nach oben in die Gehirnmatrix. Nehmen Sie sich Zeit, um sicherzustellen, dass es in der Matrix auf Höhe eingestellt ist, insbesondere dass die Mittellinie in der Matrix in der Mitte liegt. Diese Matrix ist für adultes Mausgehirngewebe konzipiert, Gewebe von jüngeren oder erkrankten Tieren kann tiefer in der Matrix ruhen, aber es sollte immer noch möglich sein, reproduzierbare Ergebnisse über Proben hinweg zu erzielen.
- Legen Sie eine Rasierklinge entlang der sagittalen Mittellinie, und stellen Sie sicher, dass die Klinge bis zum Boden der Matrix gedrückt wird (Abbildung 1B).
- Legen Sie eine weitere Rasierklinge 1 mm an die Seite der ersten Klinge (Abbildung 1B). Platzieren Sie zwei weitere Klingen 1 mm voneinander entfernt. Das Endergebnis sollten drei Klingen sein, die auf einer Seite des Gehirns platziert sind, die alle 1 mm voneinander entfernt sind. Tun Sie dasselbe mit der anderen Seite. Insgesamt werden 7 Klingen 1 mm voneinander entfernt platziert (Abbildung 1C).
- Greifen Sie vorsichtig die vorderen und hinteren Enden der Rasierklingen und heben Sie sie gerade aus der Matrix heraus. Das Gewebe an der Außenseite der Rasierklingen kann entsorgt werden.
- Trennen Sie langsam eine Rasierklinge nach der anderen von den anderen und achten Sie darauf, die Gewebeabschnitte nicht zu beschädigen.
- Schieben Sie den Gewebeteil vorsichtig von der Rasierklinge auf den Glasträger mit der Mikrospatula. Insgesamt wird es sechs sagittale Hirnschnitte geben (Abbildung 1D).
- Bei den 4 seitlichsten Abschnitten ist DCN sichtbar (Violettes Feld, Abbildung 1D). Um das DCN zu isolieren, halten Sie die getrimmte 200 μL-Pipettspitze senkrecht über das DCN und drücken Sie fest durch das Gewebe, wobei Sie in alle Richtungen schaukeln, um das DCN vollständig aus dem umgebenden Gewebe zu sezieren. Heben Sie gerade wieder nach oben, um das DCN sauber zu entfernen, und bestätigen Sie visuell das Vorhandensein des Gewebes in der Spitze.
- Legen Sie einen Finger an die Oberseite der Spitze und drücken Sie nach unten, wodurch sich das Gewebe auswölbt. Legen Sie die Spitze in das korrekt markierte Mikrofugenröhrchen und stellen Sie sicher, dass der Gewebestempel in den Boden des Röhrchens gelegt wird. Wiederholen Sie 2.17 für die verbleibenden drei Abschnitte und legen Sie die DCN-Stempel in dasselbe Rohr. Legen Sie das Rohr in flüssigen Stickstoff, um es zu gefrieren. Darstellung der Größe jedes Stempels in Abbildung 1E.
- Abschnitte, bei denen DCN extrahiert wurde, gelten als Kleinhirnhemisphäre. Schieben Sie den Rest des Gehirngewebes um das Kleinhirn in diesen Abschnitten weg. Verwenden Sie eine stumpfe Zette und nehmen Sie diese Hemisphären-Kleinhirnrindenabschnitte vorsichtig auf und legen Sie sie in die entsprechende Mikrofugenröhre. Blitzfrost.
- Für die letzten beiden vermalen Abschnitte (hellblauer Kasten, Abbildung 1D)schieben Sie das umgebende Hirngewebe weg und lassen nur das Kleinhirn zurück. Machen Sie mit einer Rasierklinge einen Schnitt, der die vorderen Läppchen von den hinteren Läppchen trennt. Der Schnitt sollte kurz nach der Bildung von Läppchen 6 erfolgen und sollte Läppchen 10 nicht enthalten(Abbildung 1F).
- Legen Sie mit einer stumpfen Handzette die vorderen Kleinhirnkordenabschnitte und die hinteren Kleinhirnrindenabschnitte vorsichtig in ihre jeweiligen Mikrofugenröhrchen und gefrieren Sie blitzgefrieren, indem Sie die Röhrchen 5 Minuten lang in flüssigem Stickstoff belassen. Von hier aus gehen Sie zur RNA-Extraktion über oder können die Röhrchen bei -80 ° C speichern.
3. RNA-Extraktion
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde vom Cold Spring Harbor Protocol für die RNA-Extraktion mit TRIzol20 modifiziert. TRIzol löst biologisches Material und ermöglicht die Extraktion von RNA.
- Legen Sie die Mikrofugenröhrchen in Eis, um zu verhindern, dass das Gewebe zu schnell auftaut, tragen Sie 150 μL kaltes TRIzol in das Mikrofugenröhrchen auf. Mit einem sterilisierten Stößel homogenisieren. Sobald das Gewebe homogenisiert ist, pipetieren Sie die Lösung nach oben und unten, um sicherzustellen, dass kein verbleibendes Gewebe intakt ist. Brechen Sie kleine Gewebestücke weiter auf, indem Sie sie einige Male in eine Insulinspritze ziehen.
- Fügen Sie weitere 350 μL TRIzol hinzu und pipetieren Sie sie auf und ab, um sie gründlich zu mischen. Lassen Sie die Raumtemperatur für 5 Minuten sitzen.
- 150 μL Chloroform in die Tube geben und kräftig schütteln und dann 2-3 Minuten ruhen lassen. Das Chloroform trennt die homogenisierte Gewebelösung in Phasen (RNA, DNA und Protein).
- Zentrifuge bei 12.000 x g, bei 15°C, für 10 Minuten. Stellen Sie sicher, dass sich alle Rohre in der gleichen Ausrichtung befinden.
- Entfernen Sie vorsichtig die Röhrchen und stellen Sie die Temperatur der Zentrifuge auf 4°C ein. Entfernen Sie nur die klare bässrige Phase in eine neue Röhre (dies ist die RNA), achten Sie darauf, die undurchsichtige Interphase (die DNA) nicht zu stören. Die niedrigste Phase ist rot und enthält Protein. Restlösung in den Röhrchen kann gespeichert oder entsorgt werden.
- Fügen Sie 100% Isopropylalkohol im Verhältnis 1:2 hinzu (wenn 200 μL der bässrigen Phase entfernt werden, fügen Sie 100 μL Isopropylalkohol hinzu). Gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren. 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen. Der Isopropylalkohol fällt die RNA aus der Lösung aus.
- Zentrifuge bei 12.000 x g, bei 4°C, für 10 Minuten. Stellen Sie sicher, dass Sie alle Rohre in der gleichen Ausrichtung platzieren, um die Visualisierung des Pellets zu erleichtern. Das resultierende Pellet ist die extrahierte RNA.
- Entfernen Sie vorsichtig die Rohre, entfernen Sie den Überstand mit einer Pipett, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören. Das Pellet ist etwas gelartig und wird schwer zu sehen sein, sollte aber in der Lage sein, abzuschätzen, wo es sich auf der Orientierung der Röhrchen in der Zentrifuge befindet.
- Nachdem Sie den gesamten Überstand entfernt haben, fügen Sie 500 μL 75% Ethanol, Wirbel kurz und Zentrifuge bei 7500 x g, bei 4 ° C, für 5 Minuten hinzu. Das Ethanol wäscht das Pellet weiter.
- Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. Lassen Sie die Kappen offen, um die Probe zu trocknen. Dies dauert normalerweise 5-10 Minuten, kann aber variieren, je nachdem, wie viel Ethanol auf dem Pellet übrig geblieben ist. Nicht zu trocken machen.
- Nach dem Trocknen das Pellet in DNase-freiem Wasser wieder auffüllen. Fügen Sie 20 μL zu Proben für DCN und 30 μL für alle anderen hinzu.
- Nach der Wiederaufbeendigung können die Proben bei -80 °C gelagert oder mit weiteren Tests fortgefahren werden.
4. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit (RTqPCR)
- Vor diesem Schritt wird es notwendig sein, die RNA zu behandeln, um genomische DNA zu entfernen und cDNA mit iScript von BioRad zu generieren. Stellen Sie sicher, dass Sie die Konzentration der RNA normalisieren, bevor Sie die cDNA erstellen. Darüber hinaus ist es wichtig, Primer für qPCR zu optimieren. Befolgen Sie die hier beschriebenen Methoden, um diesen Schritt21abzuschließen. Kurze Beschreibung der qPCR unten.
- Primer werden alle von IDT gekauft. Vorwärts- und Rückwärtssequenzen befinden sich beide im selben Probenröhrchen und werden in 20-facher Konzentration gelagert.
Rps18 (Kontrollgen):
Vorwärts – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
Rückwärts – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
Parvalbumin (Calciumbindendes Protein, hemmende Zellen):
Vorwärts – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
Rückwärts – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3'
Kcng4 (Untereinheit Kaliumkanal):
Vorwärts – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
Rückwärts – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
Aldolase C (Zebrin II, differentiell über die Kleinhirnrinde exprimiert):
Vorwärts – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3'
Rückwärts – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3' - Die qPCR-Bedingungen waren wie folgt. Vorinkubationszeit, 5 Minuten, bei 95°C. Verstärkungszeit, 50 Zyklen: 10 Minuten bei 95 °C, 10 Minuten bei 62 °C und 10 Minuten bei 72 °C. Schmelzkurvendauer, 5 Sekunden bei 95 °C, eine Minute bei 65 °C und Einstellgeschwindigkeit auf 0,07 °C/Sekunde bis zur Zieltemperatur von 97 °C. Dann Kühlzeit für 10 Minuten auf 40°C. Alle qPCR-Reaktionen wurden dreifach durchgeführt und die Genexpression wurde mit 2- ΔΔCt mit Rps18 als Belastungskontrolle analysiert, um die Genexpression zu normalisieren. Bulk-Kleinhirnextrakt wurde als Referenz verwendet.
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Representative Results
Für diese Experimente wurden vier elf Wochen alte weibliche Wildtyp-C57/Black6-Mäuse verwendet. Eine Maus wurde verwendet, um eine vollständige Kleinhirndissektion durchzuführen, die als "Bulk-Kleinhirn" bezeichnet wird und den Vergleich der RNA-Spiegel in sezierten Regionen mit einer vollständigen Dissektion ermöglichte. Die anderen drei Mäuse wurden verwendet, um die in diesem Protokoll beschriebene Kleinhirndissektion durchzuführen. Durch den Einsatz von drei Mäusen kann sichergestellt werden, dass die in den RNA-Spiegeln festgestellten Trends über Mäuse hinweg reproduzierbar sind.
Abbildung 1A stellt das Kleinhirn der Maus dar - Vermis in Blau und Hemisphären in Gelb. Sagittale Schemata der Vermis (vordere Regionen in dunkelblau, hintere Regionen in hellblau) und Hemisphäre (in gelb). Die DCN sind in rot gepunkteten Feldern hervorgehoben. Eine erfolgreiche Dissektion beginnt mit der anfänglichen Platzierung der Rasierklinge in der Mittellinie des Gehirns (Abbildung 1B); Dies leitet die erfolgreiche Platzierung der folgenden sechs Klingen (Abbildung 1C). Übrig bleiben sechs sagittale Abschnitte (Abbildung 1D), vier Seiten- / Hemisphärenabschnitte (violett umrandet) und zwei Mittellinien- / Frühlingsabschnitte (hellblau umrandet). Die 4 seitlichen Abschnitte enthalten das DCN; Abbildung 1E zeigt eine erfolgreiche DCN-Stanzdissektion. Die mittleren vermalen Abschnitte werden höchstwahrscheinlich die Hälfte des medialen DCN im 1 mm dicken Abschnitt aufweisen, aber es wird nicht den ganzen Weg vorhanden sein und es ist nicht möglich, reproduzierbar zu sezieren. Die mittleren Vermalabschnitte sind in vordere und hintere Läppchen unterteilt, die in Abbildung 1Fdargestellt sind. Eine erfolgreiche Dissektion bereitet den Rest der Experimente auf Erfolg vor.
Die Ergebnisse der qualitativen Polymerase-Kettenreaktion (RTqPCR) in Echtzeit zeigen die Machbarkeit der Bewertung der Genexpressionsniveaus jeder einzelnen Region und dienen der Validierung von Dissektionen. Wir verwendeten Primer, die Gene detektieren, die eine Gradientenexpression von der vorderen zur hinteren Kleinhirnrinde und anreicherung im DCN zeigen, und verglichen ihre Expression mit den Massen-Kleinhirnlysaten.
Wir haben die Expressionsniveaus von drei Genen untersucht: Aldolase C, Parvalbumin und Kcng4. Aldolase C, auch bekannt als Zebrin II, ist ein Enzym, das in einem konsistenten Banding-Muster durch das Kleinhirn exprimiert wird. Es wird in der hinteren Vermis stärker exprimiert als in der vorderen Vermis. Es gibt auch Bänder in den Hemisphären13,14. Parvalbumin, ein Kalziumbindungsprotein, das in hemmenden Zellen exprimiert wird. Basierend auf dem Allen Brain Atlas scheint Parvalbumin relativ gleichmäßig in der gesamten Kleinhirnrinde und im DCN (http://mouse.brain-map.org/gene/show/19056) exprimiert zu sein. Kcng4, eine kaliumspannungsgesteuerte Kanaluntereinheit, scheint im DCN und im vorderen Bereich im Vergleich zu den hinteren Lappen (https://mouse.brain-map.org/gene/show/42576) angereichert zu sein. Die quantitative Expressionsanalyse zeigte, dass Aldolase C erwartungsgemäß in der hinteren kleinhirnen Vermis (CCpV) stärker exprimiert ist, aber niedriger im DCN und im vorderen Bereich der Vermis (CCaV) im Vergleich zur Massenzerschleimparierung (Abbildung 2A). Parvalbumin ist in ähnlicher Weise in den DCN-, vorderen Vermis-, hinteren Vermis- und Hemisphären-Kleinhirnkortiken vorhanden wie in den Massen-Kleinhirnextrakten (Abbildung 2B). Kcng4 ist signifikant im DCN und im vorderen Vermis (CCaV) angereichert und im Vergleich zur Massenextraktion nicht signifikant in der hinteren Vermis (CCpV) oder Hemisphäre (CCH) angereichert (Abbildung 2C). Dieses Ergebnis folgt dem, was aufgrund des Musters im Allen Brain Atlas erwartet wurde. So validiert die Genexpressionsanalyse das Dissektionsprotokoll und bestätigt, dass RNA von guter Qualität erhalten und getestet werden kann.
Um die Expression von Aldolase C über die Kleinhirnrinde direkt zu vergleichen, wurden die Expressionsniveaus mit dem gradalsten verglichen, dem vorderen Vermis (CCaV)(Abbildung 3). Das Expressionsniveau der Aldolase C war in der hinteren Vermis (CCpV) signifikant höher und in den Kleinhirnhemisphären (CCH) tendenziell höher, wenn auch nicht ganz signifikant. Dieser Trend in den Kleinhirnhemisphären ist wahrscheinlich, weil es Bänder von Aldolase C in den Hemisphären gibt, und die Dissektion erfasst Aldolase negative und positive Bänder.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder der Zerebellenissektion
A. (A). Schematische Darstellung des Kleinhirns der Maus mit Vermis in Blau und Hemisphären in Gelb. Sagittale Kleinhirnschemata von Vermis und Hemisphäre. Vermis ist blau, wobei dunkelblau die vordere Vermis und hellblau die hintere Vermis markiert. Hemisphäre in gelb. Die DCN sind jeweils mit rot gepunkteten Feldern gekennzeichnet. B. Volles Gehirn in sagittaler Maus-Gehirnmatrix, mit Rasierklinge in der Mittellinie. C. (EN) Platzierung von drei Rasierklingen im Abstand von 1 mm auf beiden Seiten der Mittellinie. D. Die resultierenden sechs sagittalen Hirnschnitte. Vier enthalten laterale/Hemisphären-Kleinhirnabschnitte (die oberen vier Bilder sind violett umrandet). Zwei enthalten mediale/vermale Kleinhirnschnitte (untere beiden Bilder, hellblau umrandet). E. (D. ) Repräsentativer lateraler/Hemisphären-Kleinhirnabschnitt mit DCN-Stempel rechts neben dem Abschnitt (Abschnitt in Rosa in Abbildung 1D). F. (F. Kleinhirnschnitt in Abbildung 1D mit quadratisch gepunkteten Türkisen drum herum, seziert in vordere und hintere Läppchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Relative Genexpression in isolierten spezifischen Regionen des Kleinhirns.
Relative Expression von Aldolase C(2A),Parvalbumin (2B) und Kcng4 (2C) normalisiert auf Rps 18 (Protein assoziiert mit ribosomaler RNA, die in allen Zellen exprimiert wird) und unter Verwendung von Kleinhirnextrakt als Referenz. Wie erwartet, war die Aldolase-C-Expression in der hinteren Vermis höher und in der DCN und der vorderen Vermis niedriger (2A). Wie erwartet, basierend auf Allen Brain Atlas, wird die Parvalbumin-Expression gleichmäßig in jeder extrahierten Region exprimiert, während die Kcng4-Expression im DCN und CCaV signifikant angereichert ist. Einweg-ANOVA mit einem Tukey-Post-hoc-Test. *p<.0.005, ** p<.0.0001 bezogen auf den Massen-Kleinhirnextrakt. Histogramme stellen Durchschnittswerte für N=3 dar, wobei Werte für jede einzelne Maus als Punkte angezeigt werden. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. DCN (Deep cerebellar nuclei), CCaV (die Kleinhirnrinde der vorderen Vermis), CCpV (die Kleinhirnrinde der hinteren Vermis) und CCH (die Kleinhirnrinde der Hemisphären). N=3 Mäuse für zerebelläre Dissektionsregionen. N=1 Massenextrakt. Experiment in dreifacher Ausführung durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: RTqPCR Relative Genexpression der Aldolase C über die Kleinhirnrinde
Relative Expression der Aldolase C in bestimmten Regionen der Kleinhirnrinde - vordere Vermis (CCaV), hintere Vermis (CCpV) und Hemisphären (CCH). Das Genexpressionsniveau der Aldolase C wurde auf Rps18 normalisiert und mit dem Expressionsniveau im vorderen Vermis verglichen. Wie erwartet wurde die Aldolase-C-Expression in der hinteren Vermis angereichert. Einweg-ANOVA mit einem Tukey-Post-hoc-Test. *p<,0,005 relativ zu CCaV. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. CCaV (die Kleinhirnrinde der vorderen Vermis), CCpV (die Kleinhirnrinde der hinteren Vermis) und CCH (die Kleinhirnrinde der Hemisphären). N=3 Mäuse, Experiment in dreifacher Ausfertigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die hier beschriebene Methode ermöglicht es, die zugrunde liegende Genexpression und molekularen Mechanismen innerhalb von vier verschiedenen Kleinhirnregionen zu beurteilen – den tiefen Kleinhirnkernen (DCN), der vorderen Kleinhirnrinde der Vermis (CCaV), der hinteren Kleinhirnrinde der Vermis (CCpV) und der Kleinhirnrinde der Hemisphären (CCH). Die Fähigkeit, diese Regionen separat zu bewerten, wird unser Wissen über die Heterogenität bestimmter Kleinhirnregionen erweitern und möglicherweise ihren Beitrag zu verschiedenen Verhaltensweisen beleuchten.
Durch das sagittale Aufteilen des gesamten Hirngewebes ist es möglich, diese vier Regionen des Kleinhirns leicht zu visualisieren und zu identifizieren, was eine schnelle Dissektion ermöglicht. Nach bestem Wissen des Autors ist dies die erste Beschreibung der vollständigen zerebellären regionalen Dissektion für die molekulare Analyse. In einem kürzlich veröffentlichten Artikel verwendeten Forscher die Massendissektion der vorderen Läppchen des Kleinhirns und des Knotenläppchens des Kleinhirns für die molekulare Analyse22. Mit der beschriebenen Methode wären sie jedoch nicht in der Lage, auch das DCN zu sezieren. Versuche, DCN-Stempel mit einem Vibratom zu isolieren, um 300um dicke Scheiben zu schneiden, stoßen in der Regel auf drei kritische Probleme. Erstens ist es aufgrund geringfügiger Unterschiede in der Montage der Cerebella und des Winkels, in dem das Gewebe geschnitten wird, nicht einfach, die gleichen Regionen über Tiere hinweg reproduzierbar zu isolieren. Zweitens braucht das Montieren und Schneiden Zeit, was die Wahrscheinlichkeit eines RNA-Abbaus erhöht und die Qualität der RNA-Probe für nachgelagerte Anwendungen verringert. Schließlich erzeugen Stempel aus 300um dicken Scheiben eine geringe AUSBEUTE an RNA.
Die hier gezeigten Daten deuten darauf hin, dass es möglich ist, diese Technik zu verwenden, um die relative Genexpression über Kleinhirnregionen hinweg zu beurteilen. Aldolase C ist im CCpV stark hochreguliert. Kcng4 ist im DCN und CCaV stark hochreguliert, und Parvalbumin wird relativ gleichmäßig über alle Regionen im Kleinhirn exprimiert. Obwohl dies nur drei Gene sind, zeigen diese Ergebnisse, dass diese Dissektionsmethode verwendet werden kann, um die zugrunde liegenden molekularen Signaturen dieser verschiedenen Regionen zu identifizieren.
Es gibt ein paar kritische Dinge, auf die sie in diesem Protokoll achten müssen. Die Positionierung des Gehirns in der Matrix ist ein wichtiger Schritt. In einigen Fällen wurde das Gehirn möglicherweise nicht perfekt in der Matrix oder genau auf der Mittellinie eingestellt. Dies würde deutlich werden, wenn man sich jeden der sagittalen Abschnitte ansieht. Wenn sie beispielsweise genau in der Mittellinie geschnitten werden, sehen die medialen Kleinhirnabschnitte fast identisch aus und haben kein DCN sichtbar. Da diese Landmarken mit dem Auge identifizierbar sind, ist es möglich, zu beheben, wie viele Abschnitte als Frühlings- oder Hemisphärenabschnitte gelten, und sie können in derselben Mikrofugenröhre kombiniert werden. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Extraktion des DCN. In einigen Fällen reicht das Drücken eines Fingers an die Oberseite der 200 μl-Pipettspitze nicht aus, um den Gewebestempel zu extrahieren. Wenn dies der Fall ist, ist es notwendig, den Stempel mit einer Nadelnasenzette auszuschöpfen und den Stempel in das richtige Rohr zu legen. Der nächste kritische Schritt dieses Protokolls ist die RNA-Extraktion. Während die aufgeführten Volumina für die maximale RNA-Extraktion optimiert wurden, kann es auch notwendig sein, die Lösungsmengen im RNA-Extraktionsprotokoll an die individuellen Bedürfnisse des Labors anzupassen. Da es wenig Gewebe gibt, mit dem gearbeitet werden kann, besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit einer Phenolkontamination im endgültigen RNA-Produkt. Dies kann bewältigt werden, indem die Menge an TRIzol, die zur Homogenisierung des Gewebes verwendet wird, angepasst und sichergestellt wird, dass das homogenisierte Gewebe gründlich gemischt wird.
Einschränkungen dieses Protokolls sind, dass, während die DCN in drei separate Kerne (lateral, interposed und medial) unterteilt sind, es schwierig ist, jeden dieser Abschnitte aus 1 mm zu visualisieren und reproduzierbar zu stanzen, geschweige denn genug Gewebe zu haben, aus dem RNA extrahiert werden kann. Zusammen mit dieser Einschränkung erscheint die Hälfte des medialsten DCN in der Vermis; Mit dieser Dissektion ist es jedoch schwierig, sie zu visualisieren und reproduzierbar zu sezieren. Wie das Protokoll derzeit ist, werden die andere Hälfte des medialen DCN und das verbleibende DCN herausseziert. Es gibt auch zehn einzelne Vermalläppchen und acht Läppchen in den Hemisphären, aber jede von ihnen einzeln und reproduzierbar zu sezieren, wäre schwierig und würde zu sehr niedrigen RNA-Konzentrationsausbeuten führen. Während diese Methode es ermöglicht, spezifischer in Regionen des Kleinhirns einzutauchen, kombiniert sie immer noch verschiedene anatomische Regionen zu Gruppen, die einzigartige Veränderungen auf der Ebene einzelner Läppchen oder Subläppcheneinheiten maskieren könnten.
Zusammenfassend ermöglicht diese Methode die gleichzeitige Erforschung regionaler molekularer Unterschiede in vier spezifischen Regionen des Kleinhirns. Durch die Beurteilung des Kleinhirns auf diese regionsspezifische Weise ist es möglich, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen und die Genexpression, die diese Regionen charakterisieren, auseinander zu reißen. Dies wird unser Verständnis der Rolle, die die verschiedenen Kleinhirnregionen bei verschiedenen Verhaltensweisen spielen, fördern und es zukünftigen Arbeiten ermöglichen, sich speziell auf eine Kleinhirnregion zu konzentrieren und ihre Rolle bei der Krankheit oder Zielbehandlung zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Wir danken Austin Ferro und Juao-Guilherme Rosa im Cvetanovic-Labor für ihre Hilfe bei der Fehlerbehebung bei Dissektionen und bei der RNA-Extraktion und RTqPCR. Diese Forschung wird gefördert von M. Cvetanovic, R01 NS197387; HHS | Nationale Institute für Gesundheit (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
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