Summary
אזורים מוחיים שונים כבר מעורבים לשחק תפקיד תפוקות התנהגותיות ברורות, עדיין המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין לא ידוע. עבודה זו מתארת שיטה להתרבות במהירות ולנתח קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור, האזורים הקדמיים והאחוריים של ורמיס, ואת גרעיני המוח הקטן העמוקים על מנת לחקור הבדלים מולקולריים על ידי בידוד RNA ובדיקת הבדלים בביטוי הגנים.
Abstract
Cerebellum ממלא תפקיד חשוב במספר פונקציות מפתח כולל שליטה בתנועה, איזון, קוגניציה, תגמול, השפעה. מחקרי הדמיה מצביעים על כך שאזורים מוחיים נפרדים תורמים לפונקציות שונות אלה. מחקרים מולקולריים הבוחנים הבדלים במוח הקטן האזורי מפגרים כפי שהם נעשים בעיקר על תמציות מוחין שלמות ובכך להסוות כל הבחנות על פני אזורים מוחיים ספציפיים. כאן אנו מתארים טכניקה לשחזור ובמהירות של ארבעה אזורי מוח הקטן שונים: גרעיני המוח הקטן העמוקים (DCN), קליפת המוח המוח הקדמית והאחורית, קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור. ניתוח אזורים נפרדים אלה מאפשר לחקור מנגנונים מולקולריים שעשויים לעמוד בבסיס תרומתם הייחודית לאיזון, תנועה, השפעה וקוגניציה. טכניקה זו עשויה לשמש גם כדי לחקור הבדלים ברגישות הפתולוגית של אזורים ספציפיים אלה על פני מודלים שונים של מחלות עכבר.
Introduction
המוח הקטן מכיל יותר ממחצית הנוירונים במוח, מבחינה היסטורית המכונה מרכז שליטה ואיזון מוטורי במוח1. לאחרונה, מחקרים הראו כי המוח הקטן ממלא תפקיד מפתח בפונקציות שונות אחרות, כולל קוגניציה, עיבוד תגמול, ולהשפיעעל 2,3,4,5.
המוח הקטן יש אנטומיה המתוארת היטב: אזור קליפת המוח מורכב גרגר, Purkinje, ושכבות מולקולריות. תאי גרגר יוצרים את שכבת תא הגרגר ושולחים קלט באמצעות סיבים מקבילים לדנדריטים של תאי Purkinje של השכבה המולקולרית אשר מקבלים גם קלט מסיבי טיפוס שמקורם בזית נחות. תאי Purkinje לשלוח תחזיות מעכבות לתאים גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN), אשר משמש את הפלט העיקרי מן המוח הקטן. הפלט של מעגל המוח הקטן הזה מווסת עוד יותר על ידי הפעילות של interneurons מעכב בקליפת המוח הקטן, כולל Golgi, stellate, ותאי סל4. יחידה תפקודית מוחית זו מופצת בכל האונים של קליפת המוח הקטן. למרות מעגלים אחידים יחסית זה על פני המוח הקטן, עדויות מספרות דימות מוחי אנושי ומחקרים סבלניים מצביעים על הטרוגניות תפקודית של המוח הקטן6,7.
קליפת המוח הקטן יכולה להיות מחולקת לשני אזורים עיקריים: ורמיס המוגדר על קו האמצע, וחצי הכדור לרוחב. ניתן לחלק את הוורמוי עוד יותר לאופות הקדמיות והאחוריות. אזורים נפרדים אלה של המוח הקטן היו מעורבים בתרומה להתנהגויות שונות. דפוסי פעילות מעוררי משימות או נטולי משימות סיבכו את העובדה שאזורים הקדמיים של הוורמיס תורמים יותר לתפקוד המוטורי בעוד שהרמיס האחורי תורם יותר לקוגניציה6,7. ורמיס מקושר גם עם השפעה ורגשות, בעוד חצי הכדור המוחי לתרום מנהל, חזותי-מרחבי, שפה, ופונקציות mnemonic אחרים8. בנוסף, מחקרים אנטומיים סיפקו ראיות לכך שאזורי המוח הקטן הייחודיים מבחינה תפקודית מחוברים לאזורים קליפתיים שונים9. מיפוי תסמיני נגע גילה כי חולים עם שבץ המשפיעים על lobules הקדמי (מתרחב לתוך lobule VI) היו ביצועים ירודים יותר על משימות מוטוריות עדינות, בעוד חולים עם נזק לאזורי האונה האחורית וחצי הכדורים הראו ליקויים קוגניטיביים בהיעדר תסמונת מוטורית מוחית10. לבסוף, פתולוגיה מוחית אזורית במחלה מצביעה על כך שאזורי המוח הקטן הייחודיים מבחינה תפקודית רגישים גם הם באופן שונה למחלה11,12.
בעוד הרבה פחות נחקר, ראיות ראשוניות מדגים חתימות ביטוי גנים ברורים על פני אזורים קליפת המוח הקטן. ביטוי התא Purkinje של Zebrin II מראה דפוס ספציפי לאזור vermis, כך שיש יותר תאים חיוביים Zebrin II ב lobules האחוריים ופחות ב lobules הקדמי13. זה גם מתואם עם תפקוד פיזיולוגי ייחודי אזורי כמו תאי Purkinje שלילי זברין II להציג תדירות גבוהה יותר של ירי טוניק מאשר תאי Purkinje כי הם זברין II חיובי14.
בנוסף קליפת המוח הקטן, המוח הקטן כולל גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN) המשמשים את הפלט העיקרי עבור המוח הקטן. הגרעינים מורכבים מהמידל (MN), משולבים (IN) וגרעיני לרוחב (LN). הדמיה פונקציונלית ומחקרי מטופלים הראו כי DCN גם להשתתף בהתנהגויות שונות15, אבל מעט מאוד מחקרים לבחון שינוי ביטוי גנים ב- DCN.
ההתקדמות בטכניקות מולקולריות אפשרה להעריך ביטוי גנים אזורי במוח וחשפו הטרוגניות על פני ובתוך אזורי מוח שונים הן במצבים פיזיולוגיים והן במצבי מחלה16. מחקרים כאלה מסבכים כי המוח הקטן שונה מאזורי מוח אחרים. לדוגמה, היחס בין נוירונים לתאי גליה הפוך במוח הקטן בהשוואה לאזורי מוח אחרים1. אפילו בתנאים פיזיולוגיים רגילים, הביטוי של גנים פרו-דליקים הוא upregulated במוח הקטן לעומת אזורי המוחהאחרים 17. טכניקות מולקולריות היו גם מאוד שימושי בזיהוי המסלולים התורמים פתוגנזה של מחלות מוחיות. לדוגמה, רצף RNA של כל תמציות המוח הקטן זיהה גנים שהשתנו במודל עכבר מהונדס ספציפי לתא Purkinje של spinocerebellar אטקסיה סוג 1 (SCA1) בהשוואה לבקרות סוג הבר שלהם. ראיות כאלה חשפו מסלולים מולקולריים מרכזיים שבבסיס פתוגנזה בתאי פורקיניה במוח הקטן ועזרו לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות18. עם זאת, מחקרים אחרונים מראים כי ישנם הבדלים בפגיעות למחלות ברחבי אזורי המוח הקטן11,12,19. זה יכול להצביע על כך שיש שינויים מרכזיים המתרחשים באזורים מוחיים נפרדים, אשר עשוי להיות רעול פנים או מבלי שיבחינו עם תמציות מוחין שלם. לכן, יש צורך לפתח טכניקות המאפשרות לחוקרים לבחון פרופילים מולקולריים באזורים מוחיים שונים.
הטכניקה המוצעת כאן מתארת שיטה ניתנת לשחזור לנתח ארבעה אזורים נפרדים של המוח הקטן של העכבר על מנת לבודד RNA מאזורים אלה ולחקור הבדלים אזוריים בביטוי גנים. השרטוט של המוח הקטן של העכבר באיור 1A מדגיש את הוורמיס בכחול, ואת ההמיספרות בצהוב. באופן ספציפי, טכניקה זו מאפשרת לבודד ארבעה אזורים: גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN) (תיבות מנוקדות באדום באיור 1A),קליפת המוח הקטן של ורמיס הקדמי (CCaV) (כחול כהה באיור 1A), קליפת המוח המוח של ורמיס האחורי (CCpV) (כחול בהיר באיור 1A),וקליפת המוח הקטן של האונה הקדמית (CCH) (צהוב באיור 1A). על ידי הערכת ביטוי גנים של אזורים אלה בנפרד, ניתן יהיה לחקור מנגנונים מולקולריים שבביסת פונקציות נפרדות של אזורים שונים אלה, כמו גם הבדלים פוטנציאליים בפגיעותם במחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התקנה
- לאסוף את הציוד הדרוש כולל מספריים עריפת ראש, מלקחיים קהים, מספריים ביתוש, מספריים וסקולריים, microspatula, מטריצת המוח של עכבר קשת, סכיני גילוח, 200 קצות צינור μL, צלחת פטרי זכוכית, שקופית זכוכית, ודלי קרח. הניחו את כל הציוד על כרית סופגת.
- מניחים צלחת פטרי, צלחת זכוכית ומטריצת מוח על קרח.
- בעזרת סכין גילוח בזווית אנכית, לקצץ כ 5 מ"מ את הקצה של קצה צינור 200 μL אחד. זה עושה את גודל הפתח בסוף הקצה על 1 מ"מ רוחב. זה צריך להיות מספיק כדי להכות את DCN. אבל זה יכול גם להיות מותאם לפי הצורך בהתאם לנתח. יש טיפים רבים מוכנים להחלפה קלה והתאמה.
- תווית 1.5 mL צינורות מיקרופוגה עם זיהוי בעלי חיים ואזור המוח הקטן (ארבעה צינורות לכל חיה).
- מלא מיכל קריוsafe עם חנקן נוזלי פלאש להקפיא רקמה לאחר החילוץ.
2. מיצוי מוח ותח
כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות הוועדות לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת מינסוטה.
- המתת חסד את העכבר באמצעות חשיפה 5% CO2. לאחר הנשימה נפסק, לבצע נקע צוואר הרחם. לערוף את ראש העכבר עם מספרי עריפת ראש ולהשליך את הפגר בכלי הקיבול המתאים.
- לעשות חתך עם סכין גילוח לאורך קו הקשת המשיאלי של הראש מתחיל באף וממשיך כל הדרך חזרה. להפריד את העור, פרידה לכל צד של קו האמצע. השתמש בסכין הגילוח כדי לחתוך את השריר בכל צד, חיתוך מעבר לתעלות האוזן.
- באמצעות מספריים לנתח, לקצץ את כל אזורי חוט השדרה, עד שבו גזע המוח פוגש את המוח הקטן, זהיר לא לפגוע במוח הקטן.
- הכנס את אחד להבי המספריים של כלי הדם לחלל שבין גזע המוח לעמוד החוליות וחתכו לכיוון תעלת האוזן, הרימו את המספריים כדי לחתוך את העצם בצורה נקייה אך הגבילו את הנזק לרקמה.
- המשך לחתוך לאורך קצה הגולגולת כלפי מעלה לכיוון נורות הריח, ממשיך להרים תוך כדי חיתוך כדי להגביל את הנזק לרקמת המוח.
- באמצעות מלקחיים קהים, בעדינות לקלף את החלק האחורי של הגולגולת לחשוף את האזור האחורי של המוח ואת המוח הקטן.
- באמצעות המלקחיים הקהים לאורך קצה הגולגולת שנחתכו זה עתה, לקלף את שאר הגולגולת למעלה ומעל המוח. שלב זה צריך להסיר את רוב כובע הגולגולת, חושף את המוח.
- לקצץ את שאר הגולגולת עם מספריים וסקולריים ומלקחיים קהים, ניקוי רוב הגולגולת מהחלק העליון של המוח.
- בעזרת המיקרו-המרית, הרימו מעט את המוח והכופפו מתחת והחליקו למעלה כדי להסיר את נורות הריח מהגולגולת הנותרת ולנתק את הסיבים האופטיים. המוח צריך לצאת לחופשי בקלות בשלב זה.
- מניחים את המוח לתוך צלחת הפטרי היושב על קרח ולהסיר כל גולגולת שנותרה או פסולת אחרת.
- באמצעות המיקרו-המרית, הניחו בעדינות את המוח במטריצה של המוח עם צד גב למעלה. קח זמן כדי לוודא שהוא מוגדר ברמה במטריצה, במיוחד כי קו האמצע נופל במרכז המטריצה. מטריצה זו מיועדת לרקמת מוח עכבר בוגרת, רקמה מבעלי חיים צעירים או חולים עשויים לנוח נמוך יותר במטריצה, אך עדיין ניתן להשיג תוצאות ניתנות לשחזור על פני דגימות.
- הניחו סכין גילוח אחד לאורך קו האמצע של הקשת, וודאו שהלהב דוחף עד לתחתית המטריצה(איור 1B).
- מניחים סכין גילוח נוסף 1 מ"מ בצד הלהב הראשון(איור 1B). מניחים עוד שני להבים במרחק של 1 מ"מ זה מזה. התוצאה הסופית צריכה להיות שלושה להבים הממוקמים בצד אחד של המוח, כולם במרחק של 1 מ"מ זה מזה. תעשה את אותו הדבר לצד השני. בסך הכל, 7 להבים יוצבו 1 מ"מ זה מזה(איור 1C).
- בזהירות, לתפוס את הקצוות הקדמיים והאחזוריים של סכיני הגילוח ולהרים ישר מתוך המטריצה. ניתן להשליך את הרקמה בצד החיצוני של סכיני הגילוח.
- לאט, להפריד סכין גילוח אחד בכל פעם מהאחרים, נזהר לא לפגוע בקטעי הרקמה.
- להחליק בזהירות את קטע הרקמה את סכין הגילוח על שקופית הזכוכית עם microspatula. בסך הכל יהיו שישה מקטעי מוח קשתיים(איור 1D).
- ב-4 המקטעים הרחבים ביותר יהיה DCN גלוי (תיבה סגולה, איור 1D). כדי לבודד את DCN, להחזיק את קצה צינור 200 μL קצוץ בניצב מעל DCN ולדחוף למטה דרך הרקמה בחוזקה, מתנדנד בכל הכיוונים כדי לנתח באופן מלא את DCN מן הרקמה שמסביב. הרם ישר למעלה כדי להסיר את ה- DCN בצורה נקייה, ואשר חזותית את נוכחות הרקמה בקצה.
- מניחים אצבע אחת בחלק העליון של הקצה ולדחוף למטה, גורם לרקמה להתבלט החוצה. מניחים את הקצה לתוך צינור microfuge שכותרתו נכונה ולוודא כי ניקוב רקמה ממוקם בתחתית הצינור. חזור על 2.17 עבור שלושת החלקים הנותרים, הצבת אגרופי DCN באותו צינור. מניחים את הצינור לתוך חנקן נוזלי להקפאת הבזק. ייצוג הגודל של כל אגרוף באיור 1E.
- חלקים שחולצו DCN זכאים לחצי הכדור במוח הקטן. תרחיק את שאר רקמת המוח סביב המוח הקטן בחלקים האלה. השתמש במלקחיים קהים והרים בעדינות את מקטעי קליפת המוח הקטן בחצי הכדור והכניס לצינור המיקרו-פוגה המתאים. קיפאון פלאש.
- בשני החלקים האחרונים של המלל (תיבה כחולה בהירה, איור1D),הרחיקה את רקמת המוח המקיפה רק את המוח הקטן. בעזרת סכין גילוח, לעשות חתך המפריד בין lobules הקדמיים מן lobules האחורי. החתך צריך להיות רק לאחר היווצרות של lobule 6 ולא צריך לכלול lobule 10(איור 1F).
- באמצעות מלקחיים קהים, בזהירות למקם את החלקים קליפת המוח הקטן הקדמי ואת החלקים קליפת המוח הקטן האחורי לתוך צינורות microfuge שלהם בהתאמה להקפיא פלאש על ידי השארת הצינורות בחנקן נוזלי במשך 5 דקות. מכאן להמשיך להפקת RNA, או יכול לאחסן את הצינורות ב -80 °C (50 °F).
3. חילוץ RNA
הערה: פרוטוקול זה שונה מפרוטוקול קולד ספרינג הארבור לחילוץ RNA עם TRIzol20. TRIzol solubilizes חומר ביולוגי, מה שמאפשר לחלץ RNA.
- מניחים את צינורות המיקרו-פוגה בקרח כדי למנוע מהרקמה להפשיר מהר מדי, יש למרוח 150 מיקרו-אל של TRIzol קר בצינור המיקרו-שפך. הומוגניזציה עם עלה מעוקר. ברגע שהרקמה הומוגנית, הזרימו את התמיסה למעלה ולמטה כדי להבטיח שלא נותרה רקמה שלמה. עוד לשבור את כל חתיכות רקמה קטנה על ידי משיכת אותו לתוך מזרק אינסולין כמה פעמים.
- מוסיפים עוד 350 μL של TRIzol וצינור למעלה ולמטה לערבב ביסודיות. בואו לשבת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- הוסף 150 μL של כלורופורם לצינור לנער במרץ ולאחר מכן לתת מנוחה במשך 2-3 דקות. הכלורופורם מפריד את תמיסת הרקמה ההומוגנית לשלבים (רנ"א, DNA וחלבון).
- צנטריפוגה ב 12,000 x גרם, ב 15°C, במשך 10 דקות. ודא כי כל הצינורות הם באותו כיוון.
- בזהירות להסיר את הצינורות ולהגדיר את הטמפרטורה של הצנטריפוגה ל 4 מעלות צלזיוס. הסר רק את השלב מימי ברור לתוך צינור חדש (זה RNA), זהיר לא לשבש את interphase אטום (ה- DNA). השלב הנמוך ביותר יהיה אדום ומכיל חלבון. הפתרון הנותר בצינורות ניתן לשמור או להשליך.
- הוסף 100% אלכוהול איזופרופיל ביחס 1:2 (אם הוסר 200 ul של שלב מימי, להוסיף 100 μL של אלכוהול איזופרופיל). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה. בואו לנוח בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. אלכוהול איזופרופיל מזרז את הרנ"א מחוץ לפתרון.
- צנטריפוגה ב 12,000 x גרם, ב 4°C, במשך 10 דקות. הקפד למקם את כל הצינורות באותו כיוון כדי להקל על לדמיין את הכדור. הכדור המתקבל יהיה RNA שחולץ.
- בזהירות להסיר את הצינורות, להסיר את supernatant עם צינור להיות זהיר לא לשבש את הכדור. הכדור הוא קצת כמו ג'ל ויהיה קשה לראות, אבל צריך להיות מסוגל להעריך איפה הוא מבוסס על הכיוון של הצינורות בצנטריפוגה.
- לאחר הסרת כל supernatant, להוסיף 500 μL של 75% אתנול, מערבולת לזמן קצר, וצנטריפוגה ב 7500 x גרם, ב 4°C, במשך 5 דקות. האתנול שוטף עוד יותר את הכדור.
- הסר את supernatant בזהירות, מבלי לשבש את הכדור. השאר כובעים פתוחים כדי לייבש את המדגם. זה בדרך כלל לוקח 5-10 דקות אבל יכול להשתנות בהתאם כמה אתנול נשאר על הכדור. אין להתייבש יתר על המידה.
- לאחר יבש, respend הכדור במים חינם DNase. הוסף 20 μL לדגימות עבור DCN, ו 30 μL עבור כל האחרים.
- לאחר resuspended, דגימות ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F) או להמשיך לבדיקות נוספות.
4. תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RTqPCR)
- לפני שלב זה יהיה צורך DNase לטפל בRNA כדי להסיר כל DNA גנומי, וליצור cDNA ניצול iScript מ BioRad. הקפד לנרמל את הריכוז של RNA לפני ביצוע cDNA. בנוסף, חשוב למטב פריימרים עבור qPCR. בצע את השיטות המתוארות כאן כדי להשלים שלב21זה . תיאור קצר של qPCR להלן.
- פריימרים נרכשים כולם מ-IDT. רצפים קדימה ואחורה נמצאים שניהם באותו צינור מדגם, ומאוחסנים בריכוז של פי 20.
Rps18 (גן בקרה):
קדימה – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
הפוך – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCTCC-3'
פרבלבומין (חלבון סידן מחייב, תאים מעכבים):
קדימה – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
Reverse – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3'
Kcng4 (תת-unit ערוץ אשלגן):
Forward – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
הפוך – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAGCAG-3'
אלדולאז C (זברין II, המתבטא באופן דיפרנציאלי על פני קליפת המוח הקטן):
קדימה – 5'-אגאגאקאאאגאטאטאטג-3'
הפוך – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGTTGGC-3' - תנאי qPCR היו כדלקמן. תקופת טרום דגירה, 5 דקות, ב 95 מעלות צלזיוס. תקופת הגברה, 50 מחזורים: 10 דקות ב 95°C, 10 דקות ב 62°C, ו 10 דקות ב 72°C. תקופת עקומת ההיתוך, 5 שניות ב-95°C, דקה אחת ב-65°C, וקצב הרמפה ל-0.07°C/שניה עד טמפרטורת היעד של 97°C. לאחר מכן תקופת קירור במשך 10 דקות עד 40 מעלות צלזיוס. כל תגובות qPCR בוצעו במשולש וביטוי גנים נותח באמצעות 2- ΔΔCt עם Rps18 כפקד טעינה כדי לנרמל ביטוי גנים. תמצית מוחית בתפזורת שימשה כהפניה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסויים אלה נעשה שימוש בארבעה עכברי בר מסוג נקבה בני 11 שבועות מסוג C57/Black6. עכבר אחד שימש לעריכת ניתוח מוחי מלא המכונה "המוח הקטן בתפזורת" ומאפשר השוואה של רמות RNA באזורים ניתחו לביתור מלא. שלושת העכברים האחרים שימשו לעריכת ניתוח המוח הקטן המתואר בפרוטוקול זה. שימוש בשלושה עכברים מאפשר להבטיח שהמגמות שזוהו ברמות הרנ"א ניתנות לשחזור על פני עכברים.
איור 1A מייצג את המוח הקטן של העכבר - ורמיס בכחול ובחצי הכדור בצהוב. שרטוטים קשתיים של vermis (אזורים הקדמיים בכחול כהה, אזורים אחוריים בכחול בהיר) וחצי הכדור (בצהוב). ה- DCN מסומן בתיבות מנוקדות אדומות. ניתוח מוצלח יתחיל עם מיקום סכין הגילוח הראשוני בקו האמצע של המוח (איור 1B); פעולה זו מנחה את המיקום המוצלח של ששת הלהבים הבאים (איור 1C). זה משאיר שישה מקטעי קשת(איור 1D),ארבעה מקטעים לרוחב/חצי הכדור (המסווגים בסגול) ושני מקטעי קו האמצע/ורמאל (המסווגים בכחול בהיר). 4 המקטעים לרוחב מכילים את ה- DCN; איור 1E מתאר ניתוח אגרוף DCN מוצלח. החלקים המללים האמצעיים ככל הנראה יהיו מחצית DCN המהונדס ביותר נוכח בקטע 1 מ"מ עבה, אולם זה לא יהיה נוכח לאורך כל הדרך ולא ניתן לנתח באופן רב. החלקים הוורמליים של קו האמצע מופרדים לנבולינים הקדמיים והאחוריים המתוארים באיור 1F. ניתוח מוצלח מגדיר את שאר הניסויים להצלחה.
תוצאות תגובת שרשרת פולימראז איכותית בזמן אמת (RTqPCR) ממחישות את ההיתכנות של הערכת רמות ביטוי הגנים של כל אזור בנפרד, כמו גם לשמש לאימות ניתוחים. השתמשנו בפריימרים לזיהוי גנים המראים ביטוי הדרגתי מקליפת המוח המוח הקטן האחורית והעשרה ב- DCN והשווינו את הביטוי שלהם לריסטים המוח הקטן בתפזורת.
הערכנו את רמות הביטוי של שלושה גנים: אלדולאז C, פרבלבומין ו- Kcng4. אלדולאז C, הידוע גם בשם זברין II, הוא אנזים המתבטא בתבנית פסים עקבית דרך המוח הקטן. זה בא לידי ביטוי גבוה יותר ב vermis האחורי מאשר vermis הקדמי. יש גם להקות בחצי הכדור13,14. Parvalbumin שהוא חלבון מחייב סידן המתבטא בתאים מעכבים. בהתבסס על אטלס המוח אלן, parvalbumin נראה מתבטא באופן אחיד יחסית ברחבי קליפת המוח הקטן ב- DCN (http://mouse.brain-map.org/gene/show/19056). Kcng4, תת-כתר מגודר במתח אשלגן, נראה מועשר ב- DCN ובעורף הקדמי בהשוואה לאונות האחוריות (https://mouse.brain-map.org/gene/show/42576). ניתוח הביטוי הכמותי הראה כי, כצפוי, אלדולאז C מתבטאת יותר במוח הקטן האחורי ורמיס (CCpV) אך נמוכה יותר ב- DCN ובאזור הקדמי של ורמיס (CCaV) בהשוואה לניתוח המוח הקטן בתפזורת (איור 2A). Parvalbumin נוכח באופן דומה DCN, ורמיס הקדמי, ורמיס אחורי, קליפות המוח הקטן בחצי הכדור כמו בתמציות המוח הקטן בתפזורת(איור 2B). Kcng4 מועשר באופן משמעותי ב- DCN ובוורמיס הקדמי (CCaV) ואינו מועשר באופן משמעותי בוורמיס האחורי (CCPV) או בחצי הכדור (CCH) בהשוואה לחילוץ בתפזורת(איור 2C). תוצאה זו עוקבת אחר מה שהיה צפוי בהתבסס על הדפוס שנראה באטלס המוח אלן. לכן, ניתוח ביטוי גנים מאמת את פרוטוקול הניתוח ומאשר כי ניתן להשיג ולבדוק RNA באיכות טובה.
כדי להשוות ישירות את הביטוי של אלדולאז C על פני קליפת המוח הקטן, רמות הביטוי הושוו למקום שבו הוא אמור להיות הנמוך ביותר, vermis הקדמי (CCaV) (איור 3). רמת הביטוי של אלדולאז C הייתה גבוהה משמעותית בוורמיס האחורי (CCPV), ומגמה גבוהה יותר בחצי הכדור המוחי (CCH), אם כי לא ממש באופן משמעותי. מגמה זו בחצי הכדור המוחי היא ככל הנראה משום שיש להקות של אלדולאז C בחצי הכדור, והניתוח לוכד להקות שליליות וחיוביות של אלדולאז.
איור 1: תמונות מייצגות של ניתוח מוחי
א. סכמטי של המוח הקטן של העכבר עם ורמיס בכחול וחצי כדור בצהוב. שרטוטי מזל קשת של ורמיס וחצי הכדור. ורמיס בכחול, עם כחול כהה המסמן את ורמיס הקדמי, וסימון כחול בהיר ורמיס אחורי. חצי הכדור בצהוב. ה- DCN מסומנים בכל אחד מהם בתיבות מנוקדות באדום. ב. מוח מלא במטריצת מוח של עכבר קשתי, עם סכין גילוח במרכז. ג. מיקום של שלושה סכיני גילוח במרחק של 1 מ"מ זה מזה משני צדי קו האמצע. ד. ששת חלקי המוח הקשת שהתקבלו. ארבעה מכילים מקטעי מוח הקטן לרוחב/חצי הכדור (ארבע התמונות המובילות המסודרות בסגול). שניים מכילים מקטעי המוח הקטן המהוכל/ורמלי (שתי התמונות התחתונות, המסווגות בכחול בהיר). אי. קטע מוח הקטן לרוחב/חצי הכדור עם פונץ' DCN נותח מימין לסעיף (סעיף המסודר בוורוד באיור 1D). פ. קטע מוחי באיור 1D עם טורקיה מנוקדת מרובעת סביבו, ניתח לתוך lobules vermal הקדמי והאחורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ביטוי גנים יחסי באזורים ספציפיים מבודדים במוח הקטן.
ביטוי יחסי של אלדולאז C (2A), פרבלבומין (2B) ו Kcng4 (2C) מנורמל ל- Rps 18 (חלבון הקשור לרנ"א ריבוזומלי המבוטא בכל התאים), ושימוש בתמצית מוחית בתפזורת כהפניה. כצפוי, ביטוי אלדולאז C היה גבוה יותר ב vermis האחורי ונמוך יותר ב DCN ו vermis הקדמי (2A). כצפוי, בהתבסס על אלן אטלס המוח, ביטוי parvalbumin מתבטא באופן אחיד על פני כל אזור שחולץ, בעוד ביטוי Kcng4 מועשר באופן משמעותי DCN ו- CCaV. ANOVA בכיוון אחד, עם מבחן פוסט הוק של טוקי. *p<.0.005, ** p<.0.0001 ביחס לתמצית המוח הקטן בתפזורת. היסטוגרמה מייצגת ערכים ממוצעים עבור N=3 עם ערכים עבור כל עכבר בודד המוצג כנקודות. קווי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית של הממוצע. DCN (גרעיני המוח הקטן העמוק), CCaV (קליפת המוח הקטן של ורמיס הקדמי), CCPV (קליפת המוח הקטן של ורמיס האחורית) ו- CCH (קליפת המוח הקטן של חצי הכדור). N = 3 עכברים לאזורי ניתוח מוחי. N = 1 תמצית בתפזורת. הניסוי נעשה במשולש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ביטוי גנים יחסי של אלדולאז C על פני קליפת המוח הקטן
ביטוי יחסי של אלדולאז C באזורים ספציפיים של קליפת המוח הקטן - ורמיס הקדמי (CCaV), ורמיס אחורי (CCPV) וחצי הכדור (CCH). רמת ביטוי הגנים של אלדולאז C מנורמלה ל- Rps18 והושוותה לרמת הביטוי בוורמיס הזרוע. כצפוי ביטוי אלדולאז C הועשר בוורמיס האחורי. ANOVA בכיוון אחד, עם מבחן פוסט הוק של טוקי. *p<.0.005 ביחס ל- CCaV. קווי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית של הממוצע. CCaV (קליפת המוח הקטן של ורמיס הקדמי), CCPV (קליפת המוח הקטן של ורמיס האחורי), ו- CCH (קליפת המוח הקטן של ההמיספרות). N = 3 עכברים, ניסוי נעשה משולש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן מאפשרת להעריך את ביטוי הגנים הבסיסיים ואת המנגנונים המולקולריים בארבעה אזורי מוח הקטן נפרדים – גרעיני המוח הקטן העמוקים (DCN), קליפת המוח הקדמית של ורמיס (CCaV), קליפת המוח המוח האחורית של הוורמיס (CCPV), ואת קליפת המוח הקטן של חצי הכדור (CCH). היכולת להעריך אזורים אלה בנפרד תרחיב את הידע שלנו על ההטרוגניות של אזורים מוחיים ספציפיים ואולי לשפוך אור על תרומתם להתנהגויות שונות.
על ידי חתך של רקמת המוח המלאה באופן קשתי ניתן לדמיין ולזהות בקלות את ארבעת האזורים האלה של המוח הקטן, המאפשר ניתוח מהיר. למיטב ידיעת המחבר זהו התיאור הראשון של ניתוח אזורי מלא במוח הקטן לניתוח מולקולרי. במאמר שפורסם לאחרונה, החוקרים השתמשו בניתוח בתפזורת של העייפות החלק התחתון של המוח הקטן ואת האונה של המוח הקטן לניתוחמולקולרי 22. עם זאת, בשיטה המתוארת הם לא יוכלו גם לנתח את DCN. ניסיונות לבודד אגרופים DCN באמצעות ויברטום לחתוך פרוסות בעובי 300um בדרך כלל נתקלים בשלוש בעיות קריטיות. ראשית, בשל הבדלים קלים בהרכבה של המוח ואת הזווית שבה הרקמה נחתכת, זה לא קל לבודד באופן רב את אותם אזורים על פני בעלי חיים. שנית, הרכבה וחתיכה לוקחים זמן, מה שמגדיל את הסיכויים לפגיעה ברנ"א והפחתת האיכות של דגימת RNA עבור יישומים במורד הזרם. לבסוף, אגרופים מפרוסות בעובי 300um מייצרות תפוקה נמוכה של RNA.
הנתונים המוצגים כאן מצביעים על כך שניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להעריך ביטוי גנים יחסי על פני אזורים מוחיים. אלדולאזה C הוא מאוד upregulated ב CCpV. Kcng4 הוא upregulated מאוד DCN ו CCaV, ו parvalbumin מתבטא באופן שווה יחסית בכל האזורים במוח הקטן. בעוד אלה הם רק שלושה גנים, תוצאות אלה מראות כי שיטת ניתוח זו יכולה לשמש כדי לזהות את החתימות המולקולריות הבסיסיות של אזורים נפרדים אלה.
יש כמה דברים קריטיים לשים לב לכל אורך הפרוטוקול הזה. מיקום המוח במטריצה הוא צעד חשוב. במקרים מסוימים, המוח לא יכול להיות מוגדר ברמה מושלמת במטריצה או בדיוק על קו האמצע. זה יתבהר כאשר מסתכלים על כל אחד מקטעי הקשת. לדוגמה, אם לחתוך בדיוק בקו האמצע, החלקים המוח הקטן המהונדס ביותר ייראה כמעט זהה ואין להם DCN גלוי. מכיוון שציוני דרך אלה ניתנים לזיהוי באמצעות עין, ניתן לפתור כמה חלקים נחשבים לחלקים ורמליים או לחצי הכדור, וניתן לשלב אותם יחד באותו צינור מיקרו-פוגה. צעד קריטי נוסף הוא החילוץ של DCN. במקרים מסוימים, מדכא אצבע לחלק העליון של קצה צינור 200 μl הוא לא מספיק לחץ כדי לחלץ את אגרוף הרקמה. אם זה המקרה, יהיה צורך לגרוף את האגרוף עם מלקחיים באף מחט ולהניח את האגרוף בצינור הנכון. השלב הקריטי הבא של פרוטוקול זה הוא חילוץ RNA. בעוד אמצעי האחסון המפורטים עברו אופטימיזציה לחילוץ RNA מקסימלי, ייתכן שיהיה צורך גם להתאים את כמויות הפתרון בפרוטוקול החילוץ של הרנ"א כך שיתאימו לצרכים האישיים של המעבדה. כי יש רקמה קטנה לעבוד עם, יש סיכוי גבוה יותר של זיהום פנול במוצר ה- RNA הסופי. זה יכול להיות מנוהל על ידי התאמת כמות TRIzol המשמש הומוגניזציה הרקמה ולהבטיח כי הרקמה הומוגנית מעורבב ביסודיות.
המגבלות של פרוטוקול זה הן כי בעוד DCN מחולקים לשלושה גרעינים נפרדים (לרוחב, interposed, וממצעי) קשה לדמיין ולפרוע כל אחד מאלה מתוך מקטעים 1 מ"מ, שלא לדבר על יש מספיק רקמה שממנה ניתן לחלץ RNA. יחד עם מגבלה זו, מחצית DCN המהודל ביותר מופיע vermis; עם זאת, עם ניתוח זה קשה לדמיין ולנתח באופן רב. כפי שהפרוטוקול הוא כרגע, החצי השני של DCN המהודל ואת DCN הנותרים הם נותחו. יש גם עשרה אופות מלל בודדות ושמונה lobules בחצי הכדור, אבל לנתח כל אחד מאלה בנפרד ובאופן רבייה יהיה קשה ולהוביל תשואות ריכוז RNA נמוכות מאוד. בעוד שיטה זו מאפשרת להתעמק באופן ספציפי יותר באזורים של המוח הקטן, היא עדיין משלבת אזורים אנטומיים נפרדים לקבוצות אשר יכול להיות מיסוך שינויים ייחודיים על רמת lobules בודדים או יחידות sub-lobule.
לסיכום, שיטה זו מאפשרת לחקור בו זמנית הבדלים מולקולריים אזוריים ארבעה אזורים ספציפיים של המוח הקטן. על ידי הערכת המוח הקטן באופן ספציפי לאזור זה, ניתן להקניט בנפרד מנגנונים מולקולריים הבסיסיים וביטוי גנים המאפיינים אזורים אלה. זה יקדם את הבנתנו את התפקיד כי אזורי המוח הקטן המובהקים לשחק בהתנהגויות שונות ולאפשר עבודה עתידית להתמקד במיוחד באזור המוח הקטן אחד ולחקור את תפקידה במחלה או טיפול היעד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לאוסטין פרו וג'ואאו-גילהרמה רוזה במעבדת Cvetanovic על עזרתם בפתרון בעיות ניתוחים ובחילוץ RNA ו- RTqPCR. מחקר זה ממומן על ידי מ'סבטנוביץ', R01 NS197387; | HHS מכוני בריאות לאומיים (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , Online Preprint (2020).
