Summary
Diverse regioni cerebellari sono state implicate per svolgere un ruolo in distinti output comportamentali, ma i meccanismi molecolari sottostanti rimangono sconosciuti. Questo lavoro descrive un metodo per sezionare in modo riproducibile e rapido la corteccia cerebellare degli emisferi, delle regioni anteriori e posteriori del verme e dei nuclei cerebellari profondi al fine di sondare le differenze molecolari isolando l'RNA e testando le differenze nell'espressione genica.
Abstract
Il cervelletto svolge un ruolo importante in diverse funzioni chiave tra cui il controllo del movimento, l'equilibrio, la cognizione, la ricompensa e l'affetto. Studi di imaging indicano che regioni cerebellari distinte contribuiscono a queste diverse funzioni. Gli studi molecolari che esaminano le differenze cerebellari regionali sono in ritardo in quanto sono per lo più eseguiti su estratti cerebellari interi, mascherando così qualsiasi distinzione tra specifiche regioni cerebellari. Qui descriviamo una tecnica per sezionare in modo riproducibile e rapido quattro diverse regioni cerebellari: i nuclei cerebellari profondi (DCN), la corteccia cerebellare vermale anteriore e posteriore e la corteccia cerebellare degli emisferi. Sezionare queste regioni distinte consente l'esplorazione di meccanismi molecolari che possono essere alla base dei loro contributi unici all'equilibrio, al movimento, all'affetto e alla cognizione. Questa tecnica può anche essere utilizzata per esplorare le differenze nella suscettibilità patologica di queste regioni specifiche in vari modelli di malattia murina.
Introduction
Il cervelletto contiene oltre la metà dei neuroni nel cervello ed è stato storicamente indicato come un centro di controllo motorio e di equilibrio nel cervello1. Più recentemente, gli studi hanno dimostrato che il cervelletto svolge un ruolo chiave in varie altre funzioni tra cui la cognizione, l'elaborazione della ricompensa e l'influenza2,3,4,5.
Il cervelletto ha un'anatomia ben descritta: la regione della corteccia è composta da granuli, Purkinje e strati molecolari. Le cellule del granulo formano lo strato cellulare del granulo e inviano input tramite fibre parallele ai dendriti della cellula di Purkinje dello strato molecolare che ricevono anche input da fibre rampicanti che hanno avuto origine nell'oliva inferiore. Le cellule di Purkinje inviano proiezioni inibitorie alle cellule nei nuclei cerebellari profondi (DCN), che funge da output principale dal cervelletto. L'uscita di questo circuito cerebellare è ulteriormente modulata dall'attività degli interneuroni inibitori nella corteccia cerebellare, comprese le cellule di Golgi, stellate e cesto4. Questa unità funzionale cerebellare è distribuita in tutti i lobuli della corteccia cerebellare. Nonostante questo circuito relativamente uniforme attraverso il cervelletto, le prove della letteratura di neuroimaging umano e degli studi sui pazienti indicano l'eterogeneità funzionale del cervelletto6,7.
La corteccia cerebellare può essere divisa in due regioni principali: il verme definito dalla linea mediana e gli emisferi laterali. Il verme può essere ulteriormente diviso in lobuli anteriori e posteriori. Queste regioni distinte del cervelletto sono state implicate nel contribuire a comportamenti diversi. I modelli di attività evocati o privi di compiti implicavano che le regioni anteriori del verme contribuiscono maggiormente alla funzione motoria mentre il verme posteriore contribuisce maggiormente alla cognizione6,7. Il verme è anche legato agli affetti e alle emozioni, mentre gli emisferi cerebellari contribuiscono alle funzioni esecutive, visivo-spaziali, linguistiche e altre funzioni mnemoniche8. Inoltre, studi anatomici hanno fornito prove che regioni cerebellari funzionalmente distinte sono collegate a diverse regioni corticali9. La mappatura delle lesioni-sintomi ha rivelato che i pazienti con ictus che colpiscono i lobuli anteriori (che si estendono nel lobulo VI) hanno avuto prestazioni più scarse nei compiti motori fini, mentre i pazienti con danni alle regioni del lobo posteriore e agli emisferi hanno mostrato deficit cognitivi in assenza di sindrome motoria cerebellare10. Infine, la patologia cerebellare regionale nella malattia indica che le regioni cerebellari funzionalmente distinte sono anche diversamente suscettibili alla malattia11,12.
Sebbene molto meno esplorate, le prove preliminari dimostrano firme di espressione genica distinte tra le regioni corticali cerebellari. L'espressione cellulare di Purkinje di Zebrin II mostra un pattern specifico della regione nel verme tale che ci sono più cellule positive di Zebrina II nei lobuli posteriori e meno nei lobuli anteriori13. Ciò è anche correlato con la funzione fisiologica distinta a livello regionale in quanto le cellule di Purkinje negative di Zebrin II mostrano una maggiore frequenza di attivazione tonica rispetto alle cellule di Purkinje che sono Zebrin IIpositive 14.
Oltre alla corteccia cerebellare, il cervelletto comprende i nuclei cerebellari profondi (DCN) che fungono da output primario per il cervelletto. I nuclei sono costituiti dai nuclei mediali (MN), interposti (IN) e laterali (LN). L'imaging funzionale e gli studi sui pazienti hanno dimostrato che il DCN partecipa anche a vari comportamenti15, ma pochissimi studi esaminano il cambiamento dell'espressione genica nel DCN.
I progressi nelle tecniche molecolari hanno permesso di valutare l'espressione genica regionale nel cervello e hanno scoperto l'eterogeneità tra e all'interno di diverse regioni del cervello sia negli stati fisiologici che in quelli patologici16. Tali studi implicano che il cervelletto è diverso dalle altre regioni del cervello. Ad esempio, il rapporto tra neuroni e cellule gliali è invertito nel cervelletto rispetto ad altre regioni del cervello1. Anche in condizioni fisiologiche normali, l'espressione dei geni proinfiammatori è sovraregolata nel cervelletto rispetto alle altre regioni cerebrali17. Le tecniche molecolari sono state anche molto utili nell'identificare le vie che contribuiscono alla patogenesi delle malattie cerebellari. Ad esempio, il sequenziamento dell'RNA di interi estratti cerebellari ha identificato geni alterati in un modello murino transgenico specifico della cellula di Purkinje di atassia spinocerebellare di tipo 1 (SCA1) rispetto ai loro controlli di tipo selvaggio. Tali evidenze hanno rivelato percorsi molecolari chiave alla base della patogenesi nelle cellule cerebellari di Purkinje e hanno contribuito a identificare potenziali bersagli terapeutici18. Tuttavia, studi recenti suggeriscono che ci sono differenze nella vulnerabilità alle malattie tra le regioni cerebellari11,12,19. Ciò potrebbe indicare che ci sono cambiamenti chiave che si verificano in regioni cerebellari distinte, che possono essere mascherate o non rilevate con interi estratti cerebellari. Pertanto, è necessario sviluppare tecniche che consentano ai ricercatori di esaminare i profili molecolari in diverse regioni cerebellari.
La tecnica qui proposta descrive un metodo riproducibile per sezionare quattro regioni distinte del cervelletto di topo al fine di isolare l'RNA da quelle regioni ed esplorare le differenze regionali nell'espressione genica. Lo schema del cervelletto del topo nella Figura 1A evidenzia il verme in blu e gli emisferi in giallo. Nello specifico, questa tecnica permette di isolare quattro regioni: i nuclei cerebellari profondi (DCN) (scatole tratteggiate di rosso in Figura 1A),la corteccia cerebellare del verme anteriore (CCaV) (blu scuro in Figura 1A),la corteccia cerebellare del verme posteriore (CCpV) (azzurro in Figura 1A),e la corteccia cerebellare degli emisferi (CCH) (gialla in Figura 1A). Valutando separatamente l'espressione genica di queste regioni, sarà possibile studiare i meccanismi molecolari alla base delle funzioni discrete di queste diverse regioni, nonché le potenziali differenze nella loro vulnerabilità alla malattia.
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Protocol
1. Configurazione
- Raccogli l'attrezzatura necessaria tra cui forbici di decapitazione, pinza smussata, forbici di dissezione, forbici vascolari, microspatula, matrice cerebrale di topo sagittale, lame di rasoio, punte di pipet da 200 μL, piastra di Petri di vetro, vetrino di vetro e secchiello del ghiaccio. Disadere tutte le attrezzature su un pad assorbente.
- Metti la capsula di Petri, la lastra di vetro e la matrice cerebrale sul ghiaccio.
- Utilizzando una lama di rasoio con un angolo perpendicolare, tagliare circa 5 mm dalla punta di una punta di pipetta da 200 μL. Ciò rende la dimensione dell'apertura all'estremità della punta larga circa 1 mm. Questo dovrebbe essere sufficiente per eliminare il DCN. Ma questo può anche essere regolato secondo necessità a seconda della dissezione. Avere molti suggerimenti pronti per una facile sostituzione e regolazione.
- Etichetta 1,5 mL di tubi per microfughe con identificazione animale e regione cerebellare (quattro tubi per animale).
- Riempire il contenitore criosafe con azoto liquido per congelare il tessuto dopo l'estrazione.
2. Estrazione e dissezione del cervello
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida dei comitati per la cura degli animali dell'Università del Minnesota.
- Eutanasia del mouse utilizzando il 5% di esposizione a CO2. Una volta che la respirazione è cessata, eseguire la lussazione cervicale. Decapitare il topo con le forbici di decapitazione e scartare la carcassa nell'apposito recipiente.
- Fai un'incisione con una lama di rasoio lungo la linea sagittale mediale della testa partendo dal naso e continuando fino in fondo. Separare la pelle, separandosi su entrambi i lati della linea mediana. Usa la lama del rasoio per tagliare via il muscolo su ciascun lato, tagliando oltre i canali uditivi.
- Usando le forbici sezionanti, tagliare tutte le regioni del midollo spinale, fino a dove il tronco cerebrale incontra il cervelletto, facendo attenzione a non danneggiare il cervelletto.
- Inserire una delle lame vascolari a forbice nello spazio tra il tronco cerebrale e la colonna vertebrale e tagliare verso il condotto uditivo, sollevando le forbici per tagliare in modo pulito l'osso ma limitare i danni al tessuto.
- Continuare a tagliare lungo il bordo del cranio verso i bulbi olfattivi, continuando a sollevarsi mentre si taglia per limitare i danni al tessuto cerebrale.
- Usando la pinza smussata, staccare delicatamente la parte posteriore del cranio scoprendo la regione posteriore del cervello e del cervelletto.
- Usando la pinza smussata lungo il bordo del cranio che è stato appena tagliato, sbuccia il resto del cranio su e sopra il cervello. Questo passaggio dovrebbe rimuovere la maggior parte della calotta cranica, rivelando il cervello.
- Taglia il resto del cranio con le forbici vascolari e la pinza smussata, liberando la maggior parte del cranio dalla parte superiore del cervello.
- Usando la microspatula, sollevare leggermente il cervello e raccogliere sotto e scivolare verso l'alto per rimuovere i bulbi olfattivi dal cranio rimanente e scollegare le fibre del tratto ottico. Il cervello dovrebbe liberarsi facilmente a questo punto.
- Metti il cervello nella capsula di Petri seduto sul ghiaccio e rimuovi qualsiasi cranio rimanente o altri detriti.
- Usando la microspatula, posizionare delicatamente il cervello nella matrice cerebrale con il lato dorsale in alto. Prenditi del tempo per assicurarti che sia impostato il livello nella matrice, in particolare che la linea mediana cada al centro della matrice. Questa matrice è progettata per il tessuto cerebrale di topo adulto, il tessuto di animali più giovani o malati può riposare più in basso nella matrice, ma dovrebbe essere ancora possibile ottenere risultati riproducibili su tutti i campioni.
- Posizionare una lama di rasoio lungo la linea mediana sagittale, assicurandosi che la lama spinga fino in fondo alla matrice (Figura 1B).
- Posizionare un'altra lama di rasoio di 1 mm sul lato della prima lama (Figura 1B). Posizionare altre due lame a 1 mm di distanza l'una dall'altra. Il risultato finale dovrebbe essere costituito da tre lame posizionate su un lato del cervello, tutte distanti 1 mm l'una dall'altra. Fai lo stesso con l'altra parte. In totale, 7 lame saranno posizionate a 1 mm di distanza (Figura 1C).
- Con attenzione, afferrare le estremità anteriore e posteriore delle lame di rasoio e sollevare direttamente dalla matrice. Il tessuto all'esterno delle lame di rasoio può essere scartato.
- Lentamente, separare una lama di rasoio alla volta dalle altre, facendo attenzione a non danneggiare le sezioni di tessuto.
- Far scorrere con attenzione la sezione di tessuto fuori dalla lama del rasoio e sul vetrino di vetro con la microspatula. In totale ci saranno sei sezioni cerebrali sagittali (Figura 1D).
- Le 4 sezioni più laterali avranno DCN visibile (scatola viola, Figura 1D). Per isolare il DCN, tenere la punta del pipetto da 200 μL tagliata perpendicolarmente sopra il DCN e spingere verso il basso attraverso il tessuto saldamente, oscillando in tutte le direzioni per sezionare completamente il DCN dal tessuto circostante. Sollevare direttamente per rimuovere in modo pulito il DCN e confermare visivamente la presenza del tessuto nella punta.
- Posiziona un dito nella parte superiore della punta e spingi verso il basso, causando il rigonfiamento del tessuto. Posizionare la punta in un tubo di microfuga correttamente etichettato e assicurarsi che il punzone di tessuto sia posizionato sul fondo del tubo. Ripetere 2.17 per le restanti tre sezioni, posizionando i punzoni DCN nello stesso tubo. Posizionare il tubo in azoto liquido per congelare il flash. Rappresentazione della dimensione di ciascun punzone nella Figura 1E.
- Le sezioni che hanno estratto DCN si qualificano come emisfero cerebellare. Spingere via il resto del tessuto cerebrale intorno al cervelletto in queste sezioni. Utilizzare una pinna smussata e raccogliere delicatamente queste sezioni della corteccia cerebellare dell'emisfero e posizionarle nel rispettivo tubo del microfugo. Blocco flash.
- Per le ultime due sezioni vermali (scatola azzurra, Figura 1D),allontanare il tessuto cerebrale circostante lasciando solo il cervelletto. Usando una lama di rasoio, fai un taglio separando i lobuli anteriori dai lobuli posteriori. Il taglio dovrebbe essere subito dopo la formazione del lobulo 6 e non dovrebbe includere il lobulo 10 (Figura 1F).
- Utilizzando una pinna smussata, posizionare con attenzione le sezioni della corteccia cerebellare anteriore e le sezioni della corteccia cerebellare posteriore nei rispettivi tubi del microfugo e congelare il flash lasciando i tubi in azoto liquido per 5 minuti. Da qui passare all'estrazione dell'RNA, o si possono conservare i tubi a -80 °C.
3. Estrazione dell'RNA
NOTA: Questo protocollo è stato modificato dal protocollo Cold Spring Harbor per l'estrazione dell'RNA con TRIzol20. TRIzol solubilizza il materiale biologico, rendendo possibile l'estrazione dell'RNA.
- Posizionare i tubi del microfugo nel ghiaccio per evitare che il tessuto si scongeli troppo rapidamente, applicare 150 μL di TRIzol freddo nel tubo del microfugo. Omogeneizzare con un pestello sterilizzato. Una volta che il tessuto è omogeneizzato, pipettare la soluzione su e giù per assicurarsi che non vi sia tessuto rimanente intatto. Rompere ulteriormente eventuali piccoli pezzi di tessuto tirandolo su in una siringa da insulina un paio di volte.
- Aggiungere altri 350 μL di TRIzol e pipettare su e giù per mescolare accuratamente. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Aggiungere 150 μL di cloroformio al tubo e agitare vigorosamente e quindi lasciare riposare per 2-3 minuti. Il cloroformio separa la soluzione tissutale omogeneizzata in fasi (RNA, DNA e proteine).
- Centrifugare a 12.000 x g, a 15°C, per 10 minuti. Assicurarsi che tutti i tubi siano allo stesso orientamento.
- Rimuovere con cura i tubi e impostare la temperatura della centrifuga a 4°C. Rimuovere solo la fase acquosa chiara in un nuovo tubo (questo è l'RNA), facendo attenzione a non interrompere l'interfase opaca (il DNA). La fase più bassa sarà rossa e contiene proteine. La soluzione rimanente nei tubi può essere salvata o scartata.
- Aggiungere alcol isopropilico al 100% con un rapporto 1:2 (se rimosso 200 ul di fase acquosa, aggiungere 100 μL di alcol isopropilico). Mescolare accuratamente pipettando su e giù. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 10 minuti. L'alcol isopropilico fa precipitare l'RNA fuori dalla soluzione.
- Centrifugare a 12.000 x g, a 4°C, per 10 minuti. Assicurati di posizionare tutti i tubi con lo stesso orientamento per facilitare la visualizzazione del pellet. Il pellet risultante sarà l'RNA estratto.
- Rimuovere con attenzione i tubi, rimuovere il surnatante con un pipetto facendo attenzione a non disturbare il pellet. Il pellet è un po 'gelatinoso e sarà difficile da vedere, ma dovrebbe essere in grado di stimare dove si basa sull'orientamento dei tubi nella centrifuga.
- Dopo aver rimosso tutto il surnatante, aggiungere 500 μL di etanolo al 75%, vortice brevemente e centrifugare a 7500 x g, a 4°C, per 5 minuti. L'etanolo lava ulteriormente il pellet.
- Rimuovere il surnatante con attenzione, senza interrompere il pellet. Lasciare i tappi aperti per asciugare il campione. Questo di solito richiede 5-10 minuti, ma può variare a seconda di quanto etanolo è rimasto sul pellet. Non asciugare troppo.
- Una volta asciutto, risusciughare il pellet in acqua priva di DNase. Aggiungere 20 μL ai campioni per DCN e 30 μL per tutti gli altri.
- Una volta ripresa, i campioni possono essere conservati a -80 °C o procedere a ulteriori test.
4. Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RTqPCR)
- Prima di questo passaggio sarà necessario trattare DNase l'RNA per rimuovere qualsiasi DNA genomico e generare cDNA utilizzando iScript da BioRad. Assicurati di normalizzare la concentrazione di RNA prima di produrre il cDNA. Inoltre, è importante ottimizzare i primer per qPCR. Seguire i metodi descritti qui per completare questo passaggio21. Breve descrizione del qPCR di seguito.
- I primer sono tutti acquistati da IDT. Le sequenze avanti e indietro sono entrambe nella stessa provetta del campione e conservate a una concentrazione di 20 volte superiore.
Rps18 (gene di controllo):
Avanti – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
Inverso – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
Parvalbumina (Proteina legante il calcio, cellule inibitorie):
Avanti – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
Inverso – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3'
Kcng4 (Subunità del canale del potassio):
Avanti – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
Inverso – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
Aldolasi C (Zebrina II, espressa in modo differenziale attraverso la corteccia cerebellare):
Avanti – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3'
Inverso – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3' - Le condizioni qPCR erano le seguenti. Periodo di pre-incubazione, 5 minuti, a 95°C. Periodo di amplificazione, 50 cicli: 10 minuti a 95°C, 10 minuti a 62°C e 10 minuti a 72°C. Periodo della curva di fusione, 5 secondi a 95 °C, un minuto a 65 °C e impostare la velocità di rampa su 0,07 °C/secondo fino alla temperatura target di 97 °C. Quindi periodo di raffreddamento per 10 minuti a 40 ° C. Tutte le reazioni qPCR sono state eseguite in triplice copia e l'espressione genica è stata analizzata utilizzando 2- ΔΔCt con Rps18 come controllo del carico per normalizzare l'espressione genica. L'estratto cerebellare sfuso è stato usato come riferimento.
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Representative Results
Per questi esperimenti sono stati utilizzati quattro topi femmina di tipo C57/Black6 di undici settimane. Un topo è stato utilizzato per condurre una dissezione cerebellare completa che viene definita "cervelletto di massa" e ha permesso il confronto dei livelli di RNA nelle regioni sezionate con una dissezione completa. Gli altri tre topi sono stati utilizzati per condurre la dissezione cerebellare descritta in questo protocollo. L'utilizzo di tre topi consente di garantire che le tendenze rilevate nei livelli di RNA siano riproducibili tra i topi.
La figura 1A rappresenta il cervelletto del topo - vermis in blu e gli emisferi in giallo. Schemi sagittali del verme (regioni anteriori in blu scuro, regioni posteriori in azzurro) ed emisfero (in giallo). I DCN sono evidenziati in caselle tratteggiate rosse. Una dissezione di successo inizierà con il posizionamento iniziale della lama del rasoio lungo la linea mediana del cervello (Figura 1B); questo guida il corretto posizionamento delle seguenti sei lame (Figura 1C). Questo lascia sei sezioni sagittali (Figura 1D), quattro sezioni laterali / emisferiche (delineate in viola) e due sezioni di linea mediana / vermal (delineate in azzurro). Le 4 sezioni laterali contengono il DCN; La Figura 1E illustra una dissezione di punzonatura DCN riuscita. Le sezioni vermale della linea mediana avranno molto probabilmente la metà del DCN più mediale presente nella sezione spessa 1 mm, tuttavia non sarà presente fino in fondo e non è possibile sezionare in modo riproducibile. Le sezioni vermali della linea mediana sono separate in lobuli anteriori e posteriori raffigurati nella Figura 1F. Una dissezione riuscita prepara il resto degli esperimenti per il successo.
I risultati qualitativi della reazione a catena della polimerasi (RTqPCR) in tempo reale dimostrano la fattibilità della valutazione dei livelli di espressione genica di ogni singola regione e servono a convalidare le dissezioni. Abbiamo usato primer che rilevano geni che mostrano l'espressione del gradiente dalla corteccia cerebellare anteriore a quella posteriore e l'arricchimento nel DCN e abbiamo confrontato la loro espressione con i lasati cerebellari di massa.
Abbiamo valutato i livelli di espressione di tre geni: aldolasi C, parvalbumina e Kcng4. L'aldolasi C, nota anche come zebina II, è un enzima che viene espresso in un modello di banding coerente attraverso il cervelletto. È espresso più altamente nel verme posteriore rispetto al verme anteriore. Ci sono anche bande negli emisferi13,14. Parvalbumina che è una proteina legante il calcio che è espressa in cellule inibitorie. Sulla base dell'Atlante cerebrale di Allen, la parvalbumina sembra espressa in modo relativamente uniforme in tutta la corteccia cerebellare e nel DCN (http://mouse.brain-map.org/gene/show/19056). Kcng4, una subunità del canale motrice di tensione del potassio, sembra essere arricchita nel DCN e nell'anteriore rispetto ai lobi posteriori (https://mouse.brain-map.org/gene/show/42576). L'analisi quantitativa dell'espressione ha mostrato che, come previsto, l'aldolasi C è più altamente espressa nel verme cerebellare posteriore (CCpV) ma più bassa nel DCN e nella regione anteriore del verme (CCaV) rispetto alla dissezione cerebellare di massa (Figura 2A). La parvalbumina è presente in modo simile nel DCN, nel verme anteriore, nel verme posteriore e nelle cortecce cerebellari dell'emisfero come negli estratti cerebellari di massa (Figura 2B). Kcng4 è significativamente arricchito nel DCN e nel verme anteriore (CCaV) e non è significativamente arricchito nel verme posteriore (CCpV) o negli emisferi (CCH) rispetto all'estrazione di massa (Figura 2C). Questo risultato segue ciò che ci si aspettava in base al modello visto nell'Atlante del cervello di Allen. Pertanto, l'analisi dell'espressione genica convalida il protocollo di dissezione e conferma che è possibile ottenere e testare un RNA di buona qualità.
Per confrontare direttamente l'espressione di aldolasi C attraverso la corteccia cerebellare, i livelli di espressione sono stati confrontati con dove si suppone che sia più basso, il verme anteriore (CCaV) (Figura 3). Il livello di espressione dell'aldolasi C era significativamente più alto nel verme posteriore (CCpV) e tendeva più in alto negli emisferi cerebellari (CCH), anche se non in modo significativo. Questa tendenza negli emisferi cerebellari è probabile perché ci sono bande di aldolasi C negli emisferi e la dissezione cattura bande negative e positive di aldolasi.
Figura 1: Immagini rappresentative della dissezione cerebellare
A. Schema del cervelletto di topo con vermis in blu ed emisferi in giallo. Schemi cerebellari sagittali sia del verme che dell'emisfero. Il verme è in blu, con il blu scuro che segna il verme anteriore e il verme posteriore azzurro. Emisfero in giallo. I DCN sono contrassegnati in ciascuno con caselle tratteggiate in rosso. B. Cervello pieno nella matrice cerebrale del topo sagittale, con lama di rasoio lungo la linea mediana. C. Posizionamento di tre lame di rasoio a 1 mm di distanza su entrambi i lati della linea mediana. D. Le sei sezioni cerebrali sagittali risultanti. Quattro contengono sezioni cerebellari laterali / emisferiche (le prime quattro immagini delineate in viola). Due contengono sezioni cerebellari mediali/vermali (in basso due immagini, delineate in azzurro). E. Sezione cerebellare laterale/emisferale rappresentativa con punzone DCN sezionato a destra della sezione (sezione delineata in rosa nella Figura 1D). F. Sezione cerebellare nella Figura 1D con turchesi punteggiati quadrati intorno ad essa, sezionati in lobuli vermali anteriori e posteriori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Espressione genica relativa in regioni specifiche isolate del cervelletto.
Espressione relativa di aldolasi C (2A), parvalbumina (2B) e Kcng4 (2C) normalizzata a Rps 18 (proteina associata a RNA ribosomiale espressa in tutte le cellule) e utilizzando l'estratto cerebellare sfuso come riferimento. Come previsto, l'espressione di aldolasi C era più alta nel verme posteriore e più bassa nel DCN e nel verme anteriore (2A). Come previsto, sulla base dell'Atlante cerebrale di Allen, l'espressione della parvalbumina è espressa uniformemente in ogni regione estratta, mentre l'espressione di Kcng4 è significativamente arricchita nel DCN e nel CCaV. ANOVA unizionale, con un test post hoc di Tukey. *p<.0.005, ** p<.0.0001 relativo all'estratto cerebellare sfuso. Gli istogrammi rappresentano valori medi per N = 3 con valori per ogni singolo mouse mostrati come punti. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. DCN (nuclei cerebellari profondi), CCaV (la corteccia cerebellare del verme anteriore), CCpV (la corteccia cerebellare del verme posteriore) e CCH (la corteccia cerebellare degli emisferi). N=3 topi per regioni di dissezione cerebellare. N=1 estratto sfuso. Esperimento fatto in triplice copia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: RTqPCR Espressione genica relativa dell'aldolasi C attraverso la corteccia cerebellare
Espressione relativa dell'aldolasi C in regioni specifiche della corteccia cerebellare - vermi anteriori (CCaV), vermi posteriori (CCpV) ed emisferi (CCH). Il livello di espressione genica dell'aldolasi C è stato normalizzato a Rps18 e confrontato con il livello di espressione nel verme anteriore. Come previsto l'espressione di aldolasi C è stata arricchita nel verme posteriore. ANOVA unizionale, con un test post hoc di Tukey. *p<.0.005 relativa a CCaV. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. CCaV (la corteccia cerebellare del verme anteriore), CCpV (la corteccia cerebellare del verme posteriore) e CCH (la corteccia cerebellare degli emisferi). N = 3 topi, esperimento fatto in triplice copia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo qui descritto consente di valutare l'espressione genica sottostante e i meccanismi molecolari all'interno di quattro distinte regioni cerebellari: i nuclei cerebellari profondi (DCN), la corteccia cerebellare anteriore del verme (CCaV), la corteccia cerebellare posteriore del verme (CCpV) e la corteccia cerebellare degli emisferi (CCH). La capacità di valutare queste regioni separatamente amplierà la nostra conoscenza dell'eterogeneità di specifiche regioni cerebellari e possibilmente farà luce sul loro contributo a vari comportamenti.
Sezionando l'intero tessuto cerebrale sagittalmente è possibile visualizzare e identificare facilmente queste quattro regioni del cervelletto, consentendo una rapida dissezione. Per quanto a conoscenza dell'autore, questa è la prima descrizione della dissezione regionale cerebellare completa per l'analisi molecolare. In un articolo recentemente pubblicato, i ricercatori hanno utilizzato la dissezione di massa dei lobuli anteriori del cervelletto e del lobulo nodulare del cervelletto per l'analisi molecolare22. Tuttavia, con il metodo descritto non sarebbero in grado di sezionare anche il DCN. I tentativi di isolare i punzoni DCN usando un vibratoma per tagliare fette spesse 300um di solito si imbattono in tre problemi critici. In primo luogo, a causa di lievi differenze nel montaggio della cerebella e dell'angolo con cui viene tagliato il tessuto, non è facile isolare in modo riproducibile le stesse regioni tra gli animali. In secondo luogo, il montaggio e l'affettamento richiedono tempo, aumentando le possibilità di degradazione dell'RNA e diminuendo la qualità del campione di RNA per le applicazioni a valle. Infine, i punzoni da fette spesse 300um producono una bassa resa di RNA.
I dati mostrati qui suggeriscono che è possibile utilizzare questa tecnica per valutare l'espressione genica relativa tra le regioni cerebellari. L'aldolasi C è altamente sovraregolata nel CCpV. Kcng4 è altamente sovraregolata nel DCN e nel CCaV, e la parvalbumina è espressa in modo relativamente uguale in tutte le regioni del cervelletto. Mentre questi sono solo tre geni, questi risultati dimostrano che questo metodo di dissezione può essere utilizzato per identificare le firme molecolari sottostanti di queste regioni distinte.
Ci sono alcune cose critiche a cui prestare attenzione in tutto questo protocollo. Posizionare il cervello nella matrice è un passo importante. In alcuni casi, il cervello potrebbe non essere stato impostato perfettamente a livello nella matrice o esattamente sulla linea mediana. Questo diventerebbe chiaro quando si guarda a ciascuna delle sezioni sagittali. Ad esempio, se tagliate esattamente sulla linea mediana, le sezioni cerebellari più mediali appariranno quasi identiche e non avranno DCN visibile. Poiché questi punti di riferimento sono identificabili a occhio, è possibile risolvere il problema di quante sezioni si qualificano come sezioni vermal o emisferiche e possono essere combinate insieme nello stesso tubo di microfuga. Un altro passo critico è l'estrazione del DCN. In alcuni casi, premere un dito sulla parte superiore della punta del pipetto da 200 μl non è una pressione sufficiente per estrarre il pugno del tessuto. Se questo è il caso, sarà necessario estrarre il pugno con una pinze per il naso ad ago e posizionare il pugno nel tubo corretto. Il prossimo passo critico di questo protocollo è l'estrazione dell'RNA. Mentre i volumi elencati sono stati ottimizzati per l'estrazione massima dell'RNA, potrebbe anche essere necessario regolare le quantità di soluzione nel protocollo di estrazione dell'RNA per soddisfare le esigenze individuali del laboratorio. Poiché c'è poco tessuto con cui lavorare, c'è una maggiore probabilità di contaminazione fenolica nel prodotto finale dell'RNA. Questo può essere gestito regolando la quantità di TRIzol utilizzato per omogeneizzare il tessuto e assicurando che il tessuto omogeneizzato sia accuratamente miscelato.
I limiti di questo protocollo sono che mentre i DCN sono divisi in tre nuclei separati (laterale, interposto e mediale) è difficile visualizzare e perforare in modo riproducibile ciascuno di questi da sezioni di 1 mm, per non parlare di avere abbastanza tessuto da cui estrarre l'RNA. Insieme a questa limitazione, metà del DCN più mediale appare nel vermis; tuttavia, con questa dissezione è difficile visualizzare e sezionare in modo riproducibile. Come il protocollo è attualmente, l'altra metà del DCN mediale e il DCN rimanente sono sezionati. Ci sono anche dieci singoli lobuli vermali e otto lobuli negli emisferi, ma sezionare ciascuno di questi individualmente e in modo riproducibile sarebbe difficile e porterebbe a rese di concentrazione di RNA molto basse. Mentre questo metodo consente di approfondire più specificamente le regioni del cervelletto, combina ancora regioni anatomiche distinte in gruppi che potrebbero mascherare cambiamenti unici a livello di singoli lobuli o unità sub-lobule.
In conclusione, questo metodo consente di esplorare contemporaneamente le differenze molecolari regionali di quattro regioni specifiche del cervelletto. Valutando il cervelletto in questo modo specifico per regione, è possibile separare i meccanismi molecolari sottostanti e l'espressione genica che caratterizzano quelle regioni. Ciò favorirà la nostra comprensione del ruolo che le distinte regioni cerebellari svolgono in diversi comportamenti e consentirà al lavoro futuro di concentrarsi specificamente su una regione cerebellare ed esplorare il suo ruolo nella malattia o nel trattamento target.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati ad Austin Ferro e Juao-Guilherme Rosa nel laboratorio Cvetanovic per il loro aiuto nella risoluzione dei problemi delle dissezioni e nell'estrazione dell'RNA e RTqPCR. Questa ricerca è finanziata da M. Cvetanovic, R01 NS197387; | HHS National Institutes of Health (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
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