Summary
Различные мозжечковые области были замешаны в том, чтобы играть роль в различных поведенческих выходах, но основные молекулярные механизмы остаются неизвестными. В этой работе описывается метод воспроизводимого и быстрого рассечения коры мозжечка полушарий, передней и задней областей вермиса и глубоких ядер мозжечка с целью исследования молекулярных различий путем выделения РНК и тестирования различий в экспрессии генов.
Abstract
Мозжечок играет важную роль в нескольких ключевых функциях, включая контроль движения, равновесия, познания, вознаграждения и аффекта. Исследования изображений показывают, что различные мозжечковые области способствуют этим различным функциям. Молекулярные исследования, изучающие региональные различия мозжечка, отстают, поскольку они в основном проводятся на целых экстрактах мозжечка, тем самым маскируя любые различия в конкретных мозжечковых областях. Здесь мы описываем технику воспроизводимого и быстрого рассечения четырех различных мозжечковых областей: глубоких ядер мозжечка (DCN), передней и задней вермальной мозжечковой коры и мозжечковой коры полушарий. Анализ этих различных областей позволяет исследовать молекулярные механизмы, которые могут лежать в основе их уникального вклада в баланс, движение, аффект и познание. Этот метод также может быть использован для изучения различий в патологической восприимчивости этих конкретных областей в различных моделях заболеваний мышей.
Introduction
Мозжечок содержит более половины нейронов в мозге и исторически упоминается как центр управления и равновесия в мозге1. Совсем недавно исследования показали, что мозжечок играет ключевую роль в различных других функциях, включая познание, обработку вознаграждения и влияние2,3,4,5.
Мозжечок имеет хорошо описанную анатомию: область коры состоит из гранул, Пуркинье и молекулярных слоев. Грануляные клетки образуют грануляный клеточный слой и посылают вход через параллельные волокна в клеточные дендриты Пуркинье молекулярного слоя, которые также получают входные данные от вьющихся волокон, возникших в нижней оливе. Клетки Пуркинье посылают ингибирующие проекции клеткам в глубоких мозжечковых ядрах (DCN), которые служат основным выходом из мозжечка. Выход этого мозжечкового контура дополнительно модулируется активностью ингибирующих интернейронов в коре мозжечка, включая гольджи, звездчатые и корзинчатые клетки4. Этот мозжечковой функциональный блок распределен по всем долочкам коры мозжечка. Несмотря на эту относительно однородную схему по всему мозжечку, данные из литературы по нейровизуализации человека и исследований пациентов указывают на функциональную гетерогенность мозжечка6,7.
Кору мозжечка можно разделить на две основные области: среднюю, определенную вермисом, и боковые полушария. Вермис можно далее разделить на переднюю и заднюю дольки. Эти различные области мозжечка были причастны к содействию различному поведению. Паттерны активности, вызванные задачами или без задач, связаны с тем, что передние области вермиса вносят больший вклад в двигательную функцию, в то время как задние вермисы вносят больший вклад в познание6,7. Вермис также связан с аффектами и эмоциями, в то время как полушария мозжечка способствуют исполнительным, визуально-пространственным, языковым и другим мнемоническим функциям8. Кроме того, анатомические исследования предоставили доказательства того, что функционально различные мозжечковые области связаны с различными областями коры9. Картирование симптомов поражения показало, что пациенты с инсультами, затрагивающими передние дольки (распространяющиеся в дольку VI), имели более низкую производительность при выполнении мелкомоторных задач, в то время как пациенты с повреждением областей задней доли и полушарий демонстрировали когнитивный дефицит при отсутствии мозжечкового моторного синдрома10. Наконец, регионарная мозжечковая патология при заболевании указывает на то, что функционально различные мозжечковые области также по-разному восприимчивы к заболеванию11,12.
Хотя предварительные данные гораздо менее изучены, они демонстрируют различные сигнатуры экспрессии генов в мозжечковых корковых областях. Экспрессия клеток Пуркинье Зебрина II показывает специфическую для области структуру в вермисе, так что в задних дочках больше положительных клеток Зебрина II и меньше в передних долеках13. Это также коррелирует с регионально отличной физиологической функцией, поскольку отрицательные клетки Зебрина II Пуркинье демонстрируют более высокую частоту тонического возбуждения, чем клетки Пуркинье, которые являются положительными Зебрином II14.
В дополнение к коре мозжечка, мозжечок включает глубокие мозжечковые ядра (DCN), которые служат основным выходом для мозжечка. Ядра состоят из медиал (MN), интерпозиции (IN) и боковых ядер (LN). Функциональная визуализация и исследования пациентов продемонстрировали, что DCN также участвует в различных поведенческих действиях15,но очень немногие исследования изучают изменение экспрессии генов в DCN.
Достижения в области молекулярных методов позволили оценить региональную экспрессию генов в мозге и выявили гетерогенность между и внутри различных областей мозга как в физиологическом, так и в заболевании состояний16. Такие исследования показывают, что мозжечок отличается от других областей мозга. Например, отношение нейронов к глиальным клеткам инвертируется в мозжечке по сравнению с другими областями мозга1. Даже в нормальных физиологических условиях экспрессия провоспалительных генов повышается в мозжечке по сравнению с другими областями мозга17. Молекулярные методы также были очень полезны для выявления путей, которые способствуют патогенезу мозжечковых заболеваний. Например, секвенирование РНК всех экстрактов мозжечка идентифицировало гены, измененные в специфической для клетки Пуркинье трансгенной мышиной модели спиноцеребеллярной атаксии типа 1 (SCA1) по сравнению с их контролем дикого типа. Такие данные выявили ключевые молекулярные пути, лежащие в основе патогенеза в мозжечковых клетках Пуркинье, и помогли идентифицировать потенциальные терапевтические мишени18. Однако последние исследования показывают, что существуют различия в уязвимости к заболеваниям в мозжечковых областях11,12,19. Это может указывать на то, что существуют ключевые изменения, происходящие в различных мозжечковых областях, которые могут быть замаскированы или незамечены целыми экстрактами мозжечка. Таким образом, существует необходимость в разработке методов, которые позволят исследователям изучать молекулярные профили в различных мозжечковых областях.
Предлагаемый здесь метод описывает воспроизводимый метод рассечения четырех различных областей мозжечка мыши, чтобы изолировать РНК из этих областей и исследовать региональные различия в экспрессии генов. Схема мозжечка мыши на рисунке 1А выделяет вермис синим цветом, а полушария желтым. В частности, этот метод позволяет выделить четыре области: глубокие ядра мозжечка (DCN) (красные пунктирные коробки на рисунке 1A),мозжечковая кора передней вермисы (CCaV) (темно-синий на рисунке 1A),мозжечковая кора задней вермисы (CCpV) (светло-синяя на рисунке 1A)и мозжечковая кора полушарий (CCH) (желтый на рисунке 1A). Оценивая экспрессию генов этих областей отдельно, можно будет исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе дискретных функций этих различных областей, а также потенциальные различия в их уязвимости при заболевании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Настройка
- Соберите необходимое оборудование, включая обезглавленные ножницы, тупые щипцы, ножницы для рассечения, сосудистые ножницы, микропатул, сагиттальную матрицу мозга мыши, лезвия бритвы, наконечники пипетки 200 мкл, стеклянную чашку Петри, стеклянную горку и ведро со льдом. Разложите все оборудование на абсорбирующей прокладке.
- Поместите чашку Петри, стеклянную пластину и мозговую матрицу на лед.
- Используя лезвие бритвы под перпендикулярным углом, отрежьте около 5 мм от кончика одного наконечника пипетки 200 мкл. Это делает размер отверстия на конце наконечника шириной около 1 мм. Этого должно быть достаточно, чтобы выбить DCN. Но это также может быть скорректировано по мере необходимости в зависимости от рассечения. Есть много советов, готовых к легкой замене и регулировке.
- Маркировка микрофьюжных трубок 1,5 мл с идентификацией животных и мозжечковой областью (четыре трубки на животное).
- Наполните контейнер криосафе жидким азотом, чтобы мгновенно заморозить ткань после экстракции.
2. Извлечение и рассечение мозга
Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами комитетов по уходу за животными Университета Миннесоты.
- Усыпить мышь, используя 5% воздействия CO2. Как только дыхание прекратится, выполните вывих шейки матки. Обезглавить мышь обезглавливанием ножницами и выбросить тушу в соответствующий сосуд.
- Сделайте разрез лезвием бритвы вдоль медиальной сагиттальной линии головы, начиная с носа и продолжаясь до конца. Отделите кожу, разделив по обе стороны от средней линии. Используйте лезвие бритвы, чтобы отрезать мышцу с каждой стороны, срезая мимо ушных каналов.
- Используя рассекающие ножницы, обрежьте любые области спинного мозга, вплоть до того места, где ствол мозга встречается с мозжечком, осторожно, чтобы не повредить мозжечок.
- Вставьте одну из лопаток сосудистых ножниц в пространство между стволом мозга и позвоночным столбом и разрезайте к ушным каналу, поднимая ножницы, чтобы чисто разрезать кость, но ограничить повреждение ткани.
- Продолжайте резать вдоль края черепа вверх к обонятельным луковикам, продолжая поднимать вверх, разрезая, чтобы ограничить повреждение мозговой ткани.
- Используя тупые щипцы, аккуратно отклейте заднюю часть черепа, обнажив заднюю область мозга и мозжечок.
- Используя тупые щипцы вдоль края черепа, который был только что разрезан, очистите остальную часть черепа вверх и над мозгом. Этот шаг должен удалить большую часть черепной шапки, раскрывая мозг.
- Обрежьте остальную часть черепа сосудистыми ножницами и тупыми щипцами, очисщая большую часть черепа от верхней части мозга.
- Используя микропатулку, слегка приподнимите мозг и зачерпните под и скользите вверх, чтобы удалить обонятельные луковицы из оставшегося черепа и отсоединить волокна зрительного тракта. Мозг должен легко освободиться в этот момент.
- Поместите мозг в чашку Петри, сидящую на льду, и удалите оставшийся череп или другой мусор.
- Используя микропатулку, аккуратно поместите мозг в мозговой матрикс дорсальной стороной вверх. Потратьте время, чтобы убедиться, что в матрице установлен уровень, особенно в том, что средняя линия попадает в центр матрицы. Эта матрица предназначена для ткани мозга взрослой мыши, ткань молодых или больных животных может лежать ниже в матрице, но все же должна быть возможность достичь воспроизводимых результатов по образцам.
- Поместите одно лезвие бритвы вдоль сагиттальной средней линии, убедившись, что лезвие проталкивается до самого дна матрицы(рисунок 1B).
- Поместите другое лезвие бритвы на 1 мм сбоку от первого лезвия(рисунок 1B). Поместите еще две лопасти на 1 мм друг от друга. Конечным результатом должны быть три лезвия, размещенные на одной стороне мозга, все на 1 мм друг от друга. Проделайте то же самое с другой стороной. В общей сложности 7 лезвий будут размещены на 1 мм друг от друга(рисунок 1C).
- Осторожно возьмите передний и задний концы лезвий бритвы и поднимите прямо из матрицы. Ткань на внешней стороне лезвий бритвы может быть отброшена.
- Медленно отделяйте одно лезвие бритвы за раз от других, стараясь не повредить участки тканей.
- Осторожно соскользните с участка ткани с лезвия бритвы на стеклянную горку с помощью микропатку. Всего будет шесть сагиттальных отделов мозга(рисунок 1D).
- 4 наиболее боковых участка будут иметь видимый DCN (фиолетовая коробка, рисунок 1D). Чтобы изолировать DCN, держите обрезанный наконечник пипетки 200 мкл перпендикулярно над DCN и плотно протолкивайте ткань, раскачиваясь во всех направлениях, чтобы полностью рассечь DCN от окружающих тканей. Поднимите прямо назад вверх, чтобы чисто удалить DCN, и визуально подтвердить наличие ткани в наконечнике.
- Поместите один палец в верхнюю часть кончика и надавите вниз, заставляя ткань выпячиваться. Поместите наконечник в правильно маркированную микрофьюжную трубку и убедитесь, что тканевый перфоратор помещен в нижнюю часть трубки. Повторите 2.17 для остальных трех секций, поместив перфораторы DCN в одну трубу. Поместите трубку в жидкий азот, чтобы мгновенно заморозить. Представление размера каждого перфоратора на рисунке 1Е.
- Участки, в которых был извлечен DCN, квалифицируются как полушарие мозжечка. Оттолкните остальную часть мозговой ткани вокруг мозжечка в этих отделах. Используйте тупые щипцы и осторожно подберите эти участки полушария мозжечковой коры и поместите в соответствующую микрофьюжную трубку. Вспышка зависания.
- Для последних двух вермальных отделов (светло-синяя коробка, рисунок 1D),отталкивайте окружающие ткани мозга, оставляя только мозжечок. Используя лезвие бритвы, сделайте разрез, отделяющий передние дольки от задних долек. Срез должен быть сразу после образования дольки 6 и не должен включать дольку 10(рисунок 1F).
- Используя тупые щипцы, осторожно поместите передние отделы коры мозжечка и задние отделы коры мозжечка в соответствующие микрофьюжетные трубки и мгновенно заморозьте, оставив трубки в жидком азоте на 5 минут. Отсюда переходить к экстракции РНК или может хранить трубки при -80 °C.
3. Экстракция РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол модифицирован из протокола Колд-Спринг-Харбор для экстракции РНК с помощью TRIzol20. TRIzol солюбилизирует биологический материал, что позволяет извлекать РНК.
- Поместите микрофьюжные трубки в лед, чтобы ткань не оттаивания слишком быстро оттаивания, нанесите 150 мкл холодного TRIzol в микрофьюжную трубку. Гомогенизировать стерилизовано пестиком. Как только ткань гомогенизируется, пипетку раствора вверх и вниз, чтобы убедиться, что ткань не осталась неповрежденной. Далее разбейте любые мелкие кусочки ткани, втянув их в инсулиновый шприц несколько раз.
- Добавьте еще 350 мкл TRIzol и пипетку вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать. Оставьте на 5 минут.
- Добавьте в пробирку 150 мкл хлороформа и энергично встряхните, а затем дайте отдохнуть в течение 2-3 минут. Хлороформ разделяет гомогенизированный тканевый раствор на фазы (РНК, ДНК и белок).
- Центрифуга при 12 000 х г, при 15°C, в течение 10 минут. Убедитесь, что все трубки находятся в одинаковой ориентации.
- Осторожно снимите трубки и установите температуру центрифуги на 4°C. Удаляйте в новую трубку только прозрачную водные фазы (это РНК), стараясь не нарушить непрозрачную интерфазу (ДНК). Самая низкая фаза будет красной и содержит белок. Оставшийся раствор в пробирках можно сохранить или выбросить.
- Добавить 100% изопропиловый спирт в соотношении 1:2 (если удалить 200 ul водной фазы, добавить 100 мкл изопропилового спирта). Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Дать отдохнуть при комнатной температуре в течение 10 минут. Изопропиловый спирт высвечивает РНК из раствора.
- Центрифуга при 12 000 х г, при 4°C, в течение 10 минут. Обязательно поместите все трубки в одну и ту же ориентацию, чтобы было легче визуализировать гранулу. Полученная гранула будет представлять извлеченную РНК.
- Осторожно удалите трубки, удалите супернатант пипеткой, стараясь не нарушить гранулу. Гранула несколько гелеобразна и ее будет трудно увидеть, но она должна быть в состоянии оценить, где она основана на ориентации трубок в центрифуге.
- После удаления всего супернатанта добавьте 500 мкл 75% этанола, кратковременно вихрь и центрифугу при 7500 х г, при 4°C, в течение 5 минут. Этанол дополнительно промывает гранулу.
- Удалите супернатант осторожно, не нарушая гранулу. Оставьте крышки открытыми, чтобы высушить образец. Обычно это занимает 5-10 минут, но может варьироваться в зависимости от того, сколько этанола осталось на грануле. Не пересушивайте.
- После высыхания повторно суспендировать гранулы в воде, свободной от ДНКазы. Добавьте 20 мкл к образцам для DCN и 30 мкл для всех остальных.
- После повторного суспендировании образцы могут храниться при -80 °C или приступать к дальнейшим испытаниям.
4. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (RTqPCR)
- Перед этим шагом необходимо будет обработать ДНКазу РНК для удаления любой геномной ДНК и сгенерировать кДНК с использованием iScript из BioRad. Обязательно нормализуйте концентрацию РНК перед внесения кДНК. Кроме того, важно оптимизировать грунтовки для qPCR. Следуйте описанным здесь методам для выполнения этого шага21. Краткое описание qPCR ниже.
- Все грунтовки приобретаются у IDT. Прямой и обратный последовательности находятся в одной и той же пробирке и хранятся в 20-кратной концентрации.
Rps18 (контрольный ген):
Форвард – 5'-CCTGAAGTTCCAGCACAT-3'
Реверс – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
Парвальбумин (кальций-связывающий белок, ингибирующие клетки):
Форвард – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
Реверс – '5-AGCGTCTTTTTTTCTTTAGCAG-3'
Kcng4 (субъединь калиевого канала):
Вперед – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
Реверс – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
Альдолаза С (Зебрин II, дифференциально экспрессируемый через кору мозжечка):
Форвард – 5'-АГАГГАКАААГГГАТААТГЦ-3'
Реверс – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3' - Условия qPCR были следующими. Прединктубационный период, 5 минут, при 95°C. Период усиления, 50 циклов: 10 минут при 95°C, 10 минут при 62°C и 10 минут при 72°C. Период кривой плавления, 5 секунд при 95°C, одна минута при 65°C и установка скорости рампы на уровне 0,07°C/с до целевой температуры 97°C. Затем период охлаждения в течение 10 минут до 40°C. Все реакции qPCR проводили в трех размерах, а экспрессию генов анализировали с использованием 2- ΔΔCt с Rps18 в качестве контроля нагрузки для нормализации экспрессии генов. Объемный экстракт мозжечка использовался в качестве эталона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для этих экспериментов использовались четыре одиннадцатинедельные самки диких мышей типа C57/Black6. Одна мышь использовалась для проведения полного рассечения мозжечка, которое называется «объемным мозжечком» и позволяло сравнивать уровни РНК в рассеченных областях с полным рассечением. Остальные три мыши использовались для проведения рассечения мозжечка, описанного в этом протоколе. Использование трех мышей позволяет гарантировать, что тенденции, обнаруженные в уровнях РНК, воспроизводимы у мышей.
На рисунке 1А представлен мозжечок мыши - вермис синего цвета и полушария желтого цвета. Сагиттальные схемы вермиса (передние области темно-синие, задние области светло-голубого цвета) и полушария (желтый). DCN выделены красными пунктирными полями. Успешное рассечение начнется с первоначального размещения лезвия бритвы вниз по средней линии мозга(рисунок 1B); это направляет успешное размещение следующих шести лезвий(рисунок 1C). Это оставляет шесть сагиттальных секций(рисунок 1D),четыре боковых / полусферических участка (очерченных фиолетовым цветом) и две средние / вермальные секции (очерченные светло-синим цветом). 4 боковые секции содержат DCN; На рисунке 1E показано успешное вскрытие перфоратора DCN. Вермальные участки средней линии, скорее всего, будут иметь половину наиболее медиаального DCN, присутствующего в секции толщиной 1 мм, однако он не будет присутствовать на всем протяжении и его невозможно воспроизвести рассечение. Вермальные участки средней линии разделены на переднюю и заднюю дольки, изображенные на рисунке 1F. Успешное вскрытие настраивает остальные эксперименты на успех.
Результаты качественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (RTqPCR) демонстрируют возможность оценки уровней экспрессии генов каждого отдельного региона, а также служат для проверки рассечений. Мы использовали праймеры, обнаруживающие гены, которые показывают градиентную экспрессию от передней до задней коры мозжечка и обогащение в DCN, и сравнили их экспрессию с объемными мозжечковыми лизатами.
Мы оценили уровни экспрессии трех генов: альдолазы C, парвальбумина и Kcng4. Альдолаза C, также известная как зебрин II, является ферментом, который экспрессируется в последовательной полосчатой картине через мозжечок. Он выражен более высоко в задней вермисе, чем в передней вермисе. Есть также полосы в полушариях13,14. Парвальбумин, который является кальций-связывающим белком, который экспрессируется в ингибирующих клетках. Основываясь на атласе мозга Аллена, парвальбумин, по-видимому, относительно равномерно экспрессируется во всей коре мозжечка и в DCN (http://mouse.brain-map.org/gene/show/19056). Kcng4, субъединь канала калиевого напряжения, по-видимому, обогащается в DCN и в передней по сравнению с задними долями (https://mouse.brain-map.org/gene/show/42576). Количественный анализ экспрессии показал, что, как и ожидалось, альдолаза С более выражена в задней мозжечковой вермисе (CCpV), но ниже в DCN и передней области вермиса (CCaV) по сравнению с объемной мозжечковой рассечением(Рисунок 2A). Парвальбумин также присутствует в DCN, передней вермисе, задней вермисе и полушарии мозжечковой коры, как и в объемных мозжечковых экстрактах(рисунок 2B). Kcng4 значительно обогащается в DCN и передней вермисе (CCaV) и не обогащается значительно в задней вермисе (CCpV) или полушариях (CCH) по сравнению с объемной экстракцией(рисунок 2C). Этот результат следует тому, что ожидалось, основываясь на закономерности, наблюдаемой в Атласе мозга Аллена. Таким образом, анализ экспрессии генов подтверждает протокол рассечения и подтверждает, что РНК хорошего качества может быть получена и проверена.
Чтобы напрямую сравнить экспрессию альдолазы С через кору мозжечка, уровни экспрессии сравнивали с тем, где она должна быть самой низкой, передней вермисой (CCaV)(рисунок 3). Уровень экспрессии альдолазы С был значительно выше в задней вермисе (CCpV) и был выше в полушариях мозжечка (CCH), хотя и не совсем значительно. Эта тенденция в полушариях мозжечка, вероятно, связана с тем, что в полушариях есть полосы альдолазы С, и рассечение захватывает отрицательные и положительные полосы альдолазы.
Рисунок 1:Репрезентативные изображения рассечения мозжечка
А. Схема мозжечка мыши с вермисом синего цвета и полушариями желтого цвета. Сагиттальные мозжечкольные схемы как вермиса, так и полушария. Вермис синего цвета, с темно-синим обозначением передней вермисы и светло-голубой маркировкой задней вермисы. Полусфера желтого цвета. DCN помечены в каждом из них красными точками. В. Полный мозг в сагиттальной матрице мозга мыши, с лезвием бритвы вниз по средней линии. С. Размещение трех лезвий бритвы на 1 мм друг от друга по обе стороны от средней линии. Д. В результате получается шесть сагиттальных отделов мозга. Четыре из них содержат боковые / полусферические мозжечковые секции (верхние четыре изображения очерчены фиолетовым цветом). Два содержат медиаальные/вермальные мозжечковые сечения (два нижних изображения, очерченные светло-голубым цветом). Э. Репрезентативная боковая/полусферальная мозжечковая секция с ударом DCN, рассеченная справа от секции (секция выделена розовым цветом на рисунке 1D). Ф. Мозжечковое сечение на рисунке 1D с квадратной пунктирной бирюзой вокруг него, рассеченной на переднюю и заднюю вермальные дольки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Относительная экспрессия генов в изолированных специфических областях мозжечка.
Относительная экспрессия альдолазы С(2А),парвальбумина(2В)и Kcng4(2С)нормализовалась до Rps 18 (белок, связанный с рибосомальной РНК, экспрессируемой во всех клетках), и с использованием объемного мозжечкового экстракта в качестве эталона. Как и ожидалось, экспрессия альдолазы С была выше в задней вермисе и ниже в DCN и передней вермисе(2A). Как и ожидалось, основываясь на Allen Brain Atlas, экспрессия парвальбумина равномерно экспрессируется в каждой экстрагированной области, в то время как экспрессия Kcng4 значительно обогащается в DCN и CCaV. Односторонняя ANOVA, с пост-специальным тестом Tukey. *p<.0.005, ** p<.0.0001 относительно объемного мозжечкового экстракта. Гистограммы представляют средние значения для N=3 со значениями для каждой отдельной мыши, показанными в виде точек. Полосы погрешности представляют стандартную погрешность среднего значения. DCN (глубокие ядра мозжечка), CCaV (мозжечковая кора передней вермисы), CCpV (мозжечковая кора задней вермисы) и CCH (мозжечковая кора полушарий). N=3 мыши для областей рассечения мозжечка. N=1 объемный экстракт. Эксперимент проводится в трех. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:RTqPCR Относительная экспрессия гена альдолазы C через кору мозжечка
Относительная экспрессия альдолазы С в специфических областях коры мозжечка – передней вермисе (CCaV), задней вермисе (CCpV) и полушариях (CCH). Уровень экспрессии генов альдолазы С нормализовали до Rps18 и сравнили с уровнем экспрессии в передней вермисе. Как и ожидалось, экспрессия альдолазы С обогащалась в задней вермисе. Односторонняя ANOVA, с пост-специальным тестом Tukey. *p<,0,005 относительно CCaV. Полосы погрешности представляют стандартную погрешность среднего значения. CCaV (мозжечковая кора передней вермисы), CCpV (мозжечковая кора задней вермиса) и CCH (мозжечковая кора полушарий). N=3 мыши, эксперимент проводился в трех. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный здесь, позволяет оценить экспрессию основных генов и молекулярные механизмы в четырех различных мозжечковых областях - глубоких ядрах мозжечка (DCN), передней мозжечковой коре вермиса (CCaV), задней мозжечковой коре вермиса (CCpV) и коре мозжечка полушарий (CCH). Возможность оценивать эти области по отдельности расширит наши знания о неоднородности конкретных мозжечковых областей и, возможно, прольет свет на их вклад в различное поведение.
Путем сечения всей мозговой ткани сагиттально можно легко визуализировать и идентифицировать эти четыре области мозжечка, что позволяет быстро рассечение. Насколько известно автору, это первое описание полного регионарного рассечения мозжечка для молекулярного анализа. В недавно опубликованной статье исследователи использовали объемное рассечение передних долек мозжечка и узловой дольки мозжечка мозжечка для молекулярного анализа22. Однако с описанным методом они не смогут также препарировать DCN. Попытки изолировать перфораторы DCN с использованием вибратома для резки срезов толщиной 300 мм обычно находят на три критические проблемы. Во-первых, из-за небольших различий в креплении мозжечкового мозга и угла, под которым разрезается ткань, нелегко воспроизвести одни и те же области у животных. Во-вторых, монтаж и нарезка требуют времени, увеличивая шансы деградации РНК и снижая качество образца РНК для последующих применений. Наконец, удары из срезов толщиной 300 мм производят низкий выход РНК.
Данные, показанные здесь, свидетельствуют о том, что можно использовать этот метод для оценки относительной экспрессии генов в мозжечковых областях. Альдолаза C сильно повышается в CCpV. Kcng4 сильно повышается в DCN и CCaV, а парвальбумин экспрессируется относительно одинаково во всех областях мозжечка. Хотя это только три гена, эти результаты демонстрируют, что этот метод рассечения может быть использован для идентификации основных молекулярных сигнатур этих отдельных областей.
Есть несколько важных вещей, на которые следует обратить внимание на протяжении всего этого протокола. Позиционирование мозга в матрице является важным шагом. В некоторых случаях мозг, возможно, не был установлен идеально ровно в матрице или точно на средней линии. Это станет ясно при взгляде на каждую из сагиттальных секций. Например, если разрезать точно по средней линии, то наиболее медиаальные мозжечковые срезы будут выглядеть практически идентично и не будут иметь DCN видимых. Поскольку эти ориентиры идентифицируются на глаз, можно определить, сколько секций квалифицируются как вермальные или полусферические секции, и они могут быть объединены вместе в одной микрофуге.т.ч. Другим важным шагом является извлечение DCN. В некоторых случаях нажатие пальца на верхнюю часть кончика пипетки 200 мкл не является достаточным давлением для извлечения тканевого перфоратора. Если это так, то необходимо будет зачерпнуть перфоратор иглой носовых щипцов и поместить перфоратор в правильную трубку. Следующим критическим шагом этого протокола является извлечение РНК. Хотя перечисленные объемы были оптимизированы для максимальной экстракции РНК, также может потребоваться корректировка количества раствора в протоколе экстракции РНК в соответствии с индивидуальными потребностями лаборатории. Поскольку ткани мало для работы, существует более высокая вероятность фенольных загрязнений в конечном продукте РНК. Этим можно управлять, регулируя количество TRIzol, используемого для гомогенизации ткани, и гарантируя, что гомогенизированная ткань тщательно смешивается.
Ограничения этого протокола заключаются в том, что, хотя DCN разделены на три отдельных ядра (латеральное, промежуточное и медиальное), трудно визуализировать и воспроизводимо пробить каждый из них из 1 мм участков, не говоря уже о том, чтобы иметь достаточно ткани для извлечения РНК. Наряду с этим ограничением, половина наиболее медиаального DCN появляется в вермисе; однако при таком рассечении трудно визуализировать и воспроизводимо рассекать. Поскольку протокол в настоящее время, другая половина медиаль-DCN и оставшаяся DCN препарируются. Существует также десять отдельных вермальных долек и восемь долек в полушариях, но рассекать каждую из них по отдельности и воспроизводимым образом было бы трудно и привести к очень низкой концентрации РНК. Хотя этот метод позволяет более конкретно углубляться в области мозжечка, он по-прежнему объединяет различные анатомические области в группы, которые могут маскировать уникальные изменения на уровне отдельных долек или субдольковых единиц.
В заключение, этот метод дает возможность одновременно исследовать региональные молекулярные различия четырех конкретных областей мозжечка. Оценивая мозжечок таким специфическим для региона способом, можно отделить основные молекулярные механизмы и экспрессию генов, которые характеризуют эти области. Это будет способствовать нашему пониманию роли, которую различные мозжечковые области играют в различном поведении, и позволит в будущем сосредоточиться конкретно на одной мозжечковой области и изучить ее роль в заболевании или целевом лечении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны Остину Ферро и Жуао-Гильерме Розе в лаборатории Цветановича за их помощь в устранении неполадок вскрытий и в экстракции РНК и RTqPCR. Данное исследование финансируется М. Цветановичем, R01 NS197387; | HHS Национальные институты здравоохранения (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , Online Preprint (2020).
