Summary
Olika cerebellar regioner har varit inblandade att spela en roll i distinkta beteendemässiga utgångar, men de underliggande molekylära mekanismerna är fortfarande okända. Detta arbete beskriver en metod för att reproducerbart och snabbt dissekera cerebellar cortex av halvklotet, främre och bakre regioner i vermis, och de djupa cerebellar atomkärnorna för att undersöka för molekylära skillnader genom att isolera RNA och testa för skillnader i genuttryck.
Abstract
Cerebellum spelar en viktig roll i flera nyckelfunktioner inklusive kontroll av rörelse, balans, kognition, belöning och påverkan. Imaging studier visar att distinkta cerebellar regioner bidrar till dessa olika funktioner. Molekylära studier som undersöker regionala cerebellar skillnader släpar efter eftersom de oftast görs på hela cerebellar extrakt och därmed maskerar eventuella skillnader över specifika cerebellar regioner. Här beskriver vi en teknik för att reproducerbart och snabbt dissekera fyra olika cerebellar regioner: den djupa cerebellar atomkärnor (DCN), främre och bakre vermal cerebellar cortex och cerebellar cortex på halvklotet. Dissekering av dessa distinkta regioner möjliggör utforskning av molekylära mekanismer som kan lindra deras unika bidrag till balans, rörelse, påverkan och kognition. Denna teknik kan också användas för att utforska skillnader i patologisk känslighet för dessa specifika regioner över olika mus sjukdom modeller.
Introduction
Lillhjärnan innehåller över hälften av nervcellerna i hjärnan och har historiskt kallats ett motorkontroll- och balanscenter i hjärnan1. På senare tid har studier visat att lillhjärnan spelar en nyckelroll i olika andra funktioner inklusive kognition, belöningsbehandling ochpåverkar 2,3,4,5.
Lillhjärnan har väl beskriven anatomi: cortexregionen består av granulat, Purkinje och molekylära lager. Granulatceller bildar granulatcellskiktet och skickar indata via parallella fibrer till Purkinje-celldendriterna i det molekylära skiktet som också får input från klätterfibrer som härstammar från den sämre oliven. Purkinje-celler skickar hämmande projektioner till celler i de djupa cerebellarkärnorna (DCN), som fungerar som huvudutgången från lillhjärnan. Utgången av denna cerebellar krets moduleras ytterligare av aktiviteten hos de hämmande interneurons i cerebellar cortex, inklusive Golgi, stellate och korg celler4. Denna cerebellar funktionella enhet är fördelad över alla lobules i cerebellar cortex. Trots denna relativt enhetliga kretsar över lillhjärnan, bevis från mänskliga neuroimaging litteratur och patientstudier tyder funktionell heterogenitet i lillhjärnan6,7.
Cerebellar cortex kan delas in i två huvudregioner: midline-definierade vermis och laterala halvklot. Vermis kan delas in ytterligare i främre och bakre lobules. Dessa distinkta regioner i lillhjärnan har varit inblandade i att bidra till olika beteenden. Uppgift-framkallade eller uppgift-fri aktivitet mönster inblandade att främre regioner i vermis bidrar mer till motorisk funktion medan bakre vermis bidrar mer till kognition6,7. Vermis är också kopplad till påverkan och känslor, medan cerebellar halvklot bidrar till verkställande, visuella-rumsliga, språk och andra mnemonic funktioner8. Dessutom gav anatomiska studier bevis för att funktionellt distinkta cerebellar regioner är kopplade till olika när regioner9. Lesion-symptom mappning visade att patienter med stroke som påverkar de främre lobules (utvidgas till lobule VI) hade sämre prestanda på fina motoriska uppgifter, medan patienter med skador på bakre lob regioner och halvklot uppvisade kognitiva underskott i avsaknad av cerebellar motor syndrom10. Slutligen indikerar regional cerebellar patologi i sjukdom att funktionellt distinkta cerebellar regioner är också olika mottagliga för sjukdom11,12.
Medan mycket mindre utforskas, preliminära bevis visar distinkt gen uttryck signaturer över cerebellar när regioner. Purkinje cell uttryck för Zebrin II visar regionens specifika mönstring i vermis så att det finns fler Zebrin II positiva celler i de bakre lobules och färre i de främrelobules 13. Detta korrelerar också med regionalt distinkt fysiologisk funktion som Zebrin II negativa Purkinje celler visar högre frekvens av tonisk bränning än Purkinje celler som är Zebrin II positiva14.
Förutom cerebellar cortex innehåller lillhjärnan de djupa cerebellarkärnorna (DCN) som fungerar som den primära utgången för lillhjärnan. Kärnorna består av de mediala (MN), interponerade (IN) och laterala atomkärnor (LN). Funktionella avbildningar och patientstudier har visat att DCN också deltar i olika beteenden15, men mycket få studier undersöker genuttrycksförändring i DCN.
Framsteg inom molekylära tekniker har gjort det möjligt att bedöma regionala genuttryck i hjärnan och har upptäckt heterogenitet i olika hjärnregioner i både fysiologiska och sjukdomsstater16. Sådana studier innebär att lillhjärnan skiljer sig från andra hjärnregioner. Till exempel är förhållandet mellan nervceller och gliaceller inverterat i lillhjärnan jämfört med andra hjärnregioner1. Även under normala fysiologiska förhållanden är uttrycket av proinflammatoriska gener uppreglerat i lillhjärnan jämfört med de andrahjärnregionerna 17. Molekylära tekniker har också varit mycket användbara för att identifiera de vägar som bidrar till patogenesen vid cerebellarsjukdomar. Till exempel identifierade RNA sekvensering av hela cerebellar extrakt gener som förändrats i en Purkinje cell specifika transgena mus modell av spinocerebellar ataxi typ 1 (SCA1) jämfört med deras vilda typ kontroller. Sådana bevis har avslöjat viktiga molekylära vägar underliggande patogenes i cerebellar Purkinje celler och har hjälpt till att identifiera potentiella terapeutiska mål18. Nya studier tyder dock på att det finns skillnader i sårbarheten för sjukdomar i cerebellarregionerna11,12,19. Detta kan tyda på att det finns viktiga förändringar som inträffar i distinkta cerebellar regioner, som kan maskeras eller oupptäckt med hela cerebellar extrakt. Det finns därför ett behov av att utveckla tekniker som gör det möjligt för forskare att undersöka molekylära profiler i olika cerebellarregioner.
Tekniken som föreslås här beskriver en reproducerbar metod för att dissekera fyra distinkta regioner i musens lillhjärna för att isolera RNA från dessa regioner och utforska regionala skillnader i genuttryck. Schemat för musens lillhjärna i figur 1A belyser vermis i blått och halvklot i gult. Närmare bestämt Denna teknik gör det möjligt att isolera fyra regioner: djupa cerebellarkärnor (DCN) (rödprydda lådor i figur 1A),cerebellarbarken hos främre vermis (CCaV) (mörkblå i figur 1A),cerebellarbarken i den bakre vermis (CCpV) (ljusblå i figur 1A)och cerebellarbarken på halvkloten (CCH) (gul i figur 1A). Genom att bedöma genuttryck i dessa regioner separat kommer det att vara möjligt att undersöka molekylära mekanismer som ligger till grund för diskreta funktioner i dessa olika regioner samt potentiella skillnader i deras sårbarhet vid sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inställningar
- Samla nödvändig utrustning inklusive halshuggningssax, trubbiga tångar, dissekeringssax, vaskulär sax, mikrospatula, sagittalmushjärnmatris, rakblad, 200 μL rörspetsar, glas petriskål, glasrutschbana och ishink. Lägg ut all utrustning på en absorberande platta.
- Lägg petriskål, glasplatta och hjärnmatris på is.
- Använd ett rakblad i vinkelrät vinkel och trimma ca 5 mm från spetsen på en rörspets på 200 μL. Detta gör öppningens storlek i slutet av spetsen ca 1 mm bred. Detta borde vara tillräckligt för att stansa ut DCN. Men detta kan också justeras efter behov beroende på dissekeringen. Har många tips redo för enkel ersättning och justering.
- Etikett 1,5 ml mikrofugerör med djuridentifiering och cerebellarregion (fyra rör per djur).
- Fyll kryosafebehållaren med flytande kväve för att blinka frysvävnad efter extraktion.
2. Hjärnutvinning och dissekering
Alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna från Djurvårdskommittéerna vid University of Minnesota.
- Avliva musen med 5% CO2-exponering. När andningen har upphört, utför livmoderhalsförskjutning. Halshugg musen med halshuggningssaxen och kassera slaktkroppen i lämplig behållare.
- Gör ett snitt med ett rakblad längs huvudets mediala sagittallinje som börjar vid näsan och fortsätter hela vägen tillbaka. Separera huden, avskilja till vardera sidan av mittlinjen. Använd rakbladet för att skära bort muskeln på varje sida och skär ner förbi öronkanalerna.
- Använd dissekerande sax, trimma eventuella ryggmärgsregioner, upp till där hjärnstammen möter lillhjärnan, var noga med att inte skada lillhjärnan.
- Sätt in ett av de vaskulära saxbladen i utrymmet mellan hjärnstammen och ryggraden och skär mot öronkanalen, lyft upp på saxen för att rent skära benet men begränsa skadorna på vävnaden.
- Fortsätt att skära längs kanten av skallen upp mot luktlökarna, fortsätt att lyfta upp medan du skär för att begränsa skadorna på hjärnvävnaden.
- Använd trubbiga tångar, skala försiktigt av baksidan av skallen och avslöja hjärnans bakre region och lillhjärnan.
- Använd de trubbiga tångarna längs kanten av skallen som just skars, skala resten av skallen upp och över hjärnan. Detta steg bör ta bort majoriteten av skalllocket, avslöjar hjärnan.
- Trimma resten av skallen med kärlsaxen och trubbiga tångar och rensa det mesta av skallen från toppen av hjärnan.
- Använd mikrospatula, lyft hjärnan något och skopa under och skjut upp för att ta bort luktlökarna från den återstående skallen och koppla bort optiska vävnader. Hjärnan borde komma fri lätt vid denna tidpunkt.
- Placera hjärnan i petriskålen som sitter på is och ta bort eventuell återstående skalle eller annat skräp.
- Använd mikrospatula, placera försiktigt hjärnan i hjärnmatrisen med dorsal sida upp. Ta dig tid att se till att den är inställd nivå i matrisen, särskilt att mittlinjen faller i mitten i matrisen. Denna matris är utformad för vuxna mushjärnvävnad, vävnad från yngre eller sjuka djur kan vila lägre i matrisen men det bör fortfarande vara möjligt att uppnå reproducerbara resultat över prover.
- Placera ett rakblad längs den sagitala mittlinjen och se till att bladet trycker hela vägen till botten av matrisen (Bild 1B).
- Placera ett annat rakblad 1 mm på sidan av det första bladet (Bild 1B). Placera ytterligare två blad 1 mm från varandra. Slutresultatet ska vara tre blad placerade på ena sidan av hjärnan, alla 1 mm från varandra. Gör samma sak med den andra sidan. Totalt kommer 7 blad att placeras 1 mm från varandra (figur 1C).
- Ta försiktigt tag i rakbladens fram- och bakändar och lyft rakt upp ur matrisen. Vävnaden på utsidan av rakbladen kan kasseras.
- Separera långsamt ett rakblad i taget från de andra, var försiktig så att vävnadssektionerna inte skadas.
- Skjut försiktigt bort vävnadsdelen från rakbladet och på glasglaset med mikrospatulan. Totalt kommer det att finnas sex sagittal hjärnsektioner (Figur 1D).
- De 4 mest laterala sektionerna kommer att ha DCN synligt (Lila låda, Figur 1D). För att isolera DCN, håll den trimmade 200 μL rörspetsen vinkelrätt över DCN och tryck ner genom vävnaden ordentligt, gunga i alla riktningar för att helt dissekera DCN från omgivande vävnad. Lyft rakt upp igen för att rent avlägsna DCN och bekräfta visuellt närvaron av vävnaden i spetsen.
- Placera ett finger högst upp på spetsen och tryck ner, vilket gör att vävnaden buktar ut. Placera spetsen i korrekt märkt mikrofugerör och se till att vävnadsslag placeras i botten av röret. Upprepa 2.17 för de återstående tre sektionerna och placera DCN-stansarna i samma rör. Placera röret i flytande kväve för att blinka frys. Representation av storleken på varje stämpling i figur 1E.
- Avsnitt som hade DCN extraheras kvalificerar sig som cerebellar halvklotet. Tryck bort resten av hjärnvävnaden runt lillhjärnan i dessa sektioner. Använd trubbiga tång och plocka försiktigt upp dessa halvklotets cerebellar cortex sektioner och placera i respektive mikrofugerör. Blixten fryser.
- För de två sista vermala sektionerna (ljusblå låda, Figur1D),tryck bort omgivande hjärnvävnad och lämna endast lillhjärnan. Använd ett rakblad och gör ett snitt som skiljer de främre lobuleerna från de bakre lobulesna. Skär ska vara strax efter bildandet av lobule 6 och bör inte innehålla lobule 10 (Figur 1F).
- Använd trubbiga tångar, placera försiktigt de främre cerebellar cortexsektionerna och bakre cerebellar cortexsektionerna i sina respektive mikrofugerör och blixtfrysning genom att lämna rören i flytande kväve i 5 minuter. Härifrån gå vidare till RNA-extraktion, eller kan lagra rören vid -80 °C.
3. RNA-extraktion
OBS: Detta protokoll ändras från Cold Spring Harbor Protocol för RNA Extraction med TRIzol20. TRIzol lösligar biologiskt material, vilket gör det möjligt att extrahera RNA.
- Placera mikrofugerören i is för att hålla vävnaden från att tina för snabbt, applicera 150 μL kall TRIzol i mikrofugeröret. Homogenisera med en steriliserad mortel. När vävnaden är homogeniserad, rör lösningen upp och ner för att säkerställa att det inte finns någon återstående vävnad intakt. Bryt ytterligare upp eventuella små vävnadsbitar genom att dra upp det i en insulinspruta några gånger.
- Tillsätt ytterligare 350 μL TRIzol och rör upp och ner för att blanda noggrant. Låt sitta vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Tillsätt 150 μL kloroform i röret och skaka kraftigt och låt sedan vila i 2-3 minuter. Kloroformen separerar den homogeniserade vävnadslösningen i faser (RNA, DNA och protein).
- Centrifugera vid 12 000 x g, vid 15°C, i 10 minuter. Se till att alla rör är i samma riktning.
- Ta försiktigt bort rören och ställ in centrifugens temperatur på 4°C. Ta endast bort den klara vattenfasen i ett nytt rör (detta är RNA), var försiktig så att du inte stör den ogenomskinliga interfasen (DNA). Den lägsta fasen blir röd och innehåller protein. Återstående lösning i rören kan sparas eller kasseras.
- Tillsätt 100% isopropylalkohol vid ett 1:2-förhållande (om det tas bort 200 ul vattenfas, tillsätt 100 μL isopropylalkohol). Blanda noggrant genom att leda upp och ner. Låt vila i rumstemperatur i 10 minuter. Isopropylalkoholen fäller ut RNA ur lösningen.
- Centrifugera vid 12 000 x g, vid 4°C, i 10 minuter. Var noga med att placera alla rör i samma riktning för att göra det lättare att visualisera pelleten. Den resulterande pelleten kommer att vara det extraherade RNA.
- Ta försiktigt bort rören, ta bort supernaten med en rörledning som är försiktig så att den inte stör pelleten. Pelleten är något gelliknande och blir svår att se, men bör kunna uppskatta var den är baserad på rörens orientering i centrifugen.
- Efter att ha tagit bort allt supernatant, tillsätt 500 μL 75% etanol, virvel kort och centrifugera vid 7500 x g, vid 4 °C, i 5 minuter. Etanolen tvättar pelleten ytterligare.
- Ta försiktigt bort supernaten utan att störa pelleten. Låt locken vara öppna för att torka provet. Detta tar vanligtvis 5-10 minuter men kan variera beroende på hur mycket etanol som fanns kvar på pelleten. Torka inte för mycket.
- När den är torr, återanvänd pelleten i DNase fritt vatten. Tillsätt 20 μL till prover för DCN och 30 μL för alla andra.
- När proverna har återsuspenderats kan de förvaras vid -80 °C eller fortsätta till ytterligare tester.
4. Kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (RTqPCR)
- Innan detta steg kommer det att vara nödvändigt att DNase behandla RNA för att ta bort genomiskt DNA och generera cDNA med hjälp av iScript från BioRad. Var noga med att normalisera koncentrationen av RNA innan du gör cDNA. Dessutom är det viktigt att optimera primers för qPCR. Följ de metoder som beskrivs här för att slutföra det här steget21. Kort beskrivning av qPCR nedan.
- Primers är alla köpta från IDT. Framåt- och bakåtsekvenser finns båda i samma provrör och lagras vid 20x koncentration.
Rps18 (kontrollgen):
Framåt – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
Omvänd – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
Parvalbumin (kalciumbindande protein, hämmande celler):
Forward – "5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3"
Omvänd – "5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3"
Kcng4 (kaliumkanalunderenhet):
Framåt – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
Omvänd – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
Aldolase C (Zebrin II, differentiellt uttryckt över cerebellar cortex):
Framåt – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3'
Omvänd – 5'-TCAGTAGGGGGGGGGGGGC-3' - qPCR-villkoren var följande. Förinkubationstid, 5 minuter, vid 95°C. Förstärkningsperiod, 50 cykler: 10 minuter vid 95°C, 10 minuter vid 62°C och 10 minuter vid 72°C. Smältkurva, 5 sekunder vid 95°C, en minut vid 65°C, och ställ in ramphastigheten på .07°C/sekund tills måltempen på 97°C. Sedan kylningsperiod i 10 minuter till 40 °C. Alla qPCR reaktioner utfördes i tre exemplar och gen uttryck analyserades med 2- ΔΔCt med Rps18 som en lastning kontroll för att normalisera gen uttryck. Bulk cerebellar extrakt användes som referens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För dessa experiment användes fyra elva veckor gamla kvinnliga vilda typ C57/Black6 möss. En mus användes för att genomföra en fullständig cerebellar dissekering som kallas "bulk lillhjärna" och tillåtet för jämförelse av RNA nivåer i dissekerade regioner till en fullständig dissekering. De andra tre mössen användes för att genomföra cerebellar dissekering beskrivs i detta protokoll. Att använda tre möss gör det möjligt att se till att de trender som upptäcks i nivåerna av RNA är reproducerbara över möss.
Figur 1A representerar musens lillhjärna - vermis i blått och halvklot i gult. Sagittal schemat av vermis (främre regioner i mörkblå, bakre regioner i ljusblått) och halvklotet (i gult). DCN markeras i röda prickade rutor. En lyckad dissekering börjar med den första rakbladsplaceringen ner i hjärnans mittlinje (Figur 1B); Detta styr den lyckade placeringen av följande sex blad (figur 1C). Detta lämnar sex sagittalsektioner (Figur 1D), fyra laterala / halvklotet avsnitt (skisserade i lila) och två mellanlinje / vermala sektioner (skisserade i ljusblått). De 4 sidosektionerna innehåller DCN; Figur 1E visar en lyckad DCN-stans dissekering. De mittlinjen vermala sektionerna kommer sannolikt att ha hälften av det mest mediala DCN närvarande i den 1 mm tjocka sektionen, men det kommer inte att vara närvarande hela vägen igenom och är inte möjligt att reproducera dissekera ut. De mellanliggande vermala sektionerna är uppdelade i främre och bakre lobules avbildade i figur 1F. En lyckad dissekering ställer in resten av experimenten för framgång.
Resultaten av den kvalitativa polymeraskedjereaktionen (RTqPCR) i realtid visar att det är möjligt att bedöma genuttrycksnivåerna i varje enskild region samt att validera dissekeringar. Vi använde primers upptäcka gener som visar gradient uttryck från främre till bakre cerebellar cortex och berikning i DCN och jämförde deras uttryck med bulk cerebellar lysates.
Vi bedömde uttryck nivåer av tre gener: aldolase C, parvalbumin och Kcng4. Aldolase C, även känd som zebrin II, är ett enzym som uttrycks i ett konsekvent banding mönster genom lillhjärnan. Det uttrycks högre i den bakre vermis än den främre vermis. Det finns också band på halvklotet13,14. Parvalbumin som är ett kalciumbindande protein som uttrycks i hämmande celler. Baserat på Allen Brain Atlas verkar parvalbumin relativt enhetligt uttryckt i hela cerebellar cortex och i DCN (http://mouse.brain-map.org/gene/show/19056). Kcng4, en kaliumspänning gated kanal underavdelning, verkar berikas i DCN och i främre jämfört med de bakre loberna (https://mouse.brain-map.org/gene/show/42576). Kvantitativ uttrycksanalys visade att aldolase C som förväntat uttrycks högre i den bakre cerebellar vermis (CCpV) men lägre i DCN och den främre regionen vermis (CCaV) jämfört med bulk cerebellar dissekering (Figur 2A). Parvalbumin förekommer på samma sätt i DCN, främre vermis, bakre vermis och halvklotet cerebellar cortices som i bulk cerebellar extrakt (Figur 2B). Kcng4 är signifikant berikad i DCN och den främre vermis (CCaV) och den är inte signifikant berikad i bakre vermis (CCpV) eller halvklot (CCH) jämfört med bulkextraktionen (Figur 2C). Detta resultat följer vad som förväntades baserat på mönstret som ses i Allen Brain Atlas. Således validerar genuttrycksanalys dissekeringsprotokollet och bekräftar att RNA av god kvalitet kan erhållas och testas.
För att direkt jämföra uttrycket av aldolase C över cerebellar cortex jämfördes uttrycksnivåerna med var det ska vara lägst, den främre vermis (CCaV) (Figur 3). Uttrycksnivån för aldolase C var betydligt högre i den bakre vermis (CCpV) och trendiga högre i cerebellar halvklotet (CCH), men inte riktigt signifikant så. Denna trend i cerebellar halvklotet är sannolikt eftersom det finns band av aldolase C på halvklotet, och dissekeringen fångar aldolase negativa och positiva band.
Figur 1: Representativa bilder av cerebellar dissekering
A. Schematisk av mus lillhjärna med vermis i blått och halvklot i gult. Sagittal cerebellar scheman av både vermis och halvklotet. Vermis är i blått, med mörkblå markera främre vermis, och ljusblå markeringen bakre vermis. Halvklotet i gult. DCN är markerade i var och en med rödpåriga rutor. B. Jag är inte så bra på Full hjärna i sagittal mus hjärnmatris, med rakblad ner mittlinjen. C. Placering av tre rakblad 1 mm från varandra på vardera sidan av mittlinjen. D. Jag är inte så bra på De resulterande sex sagittal hjärnsektionerna. Fyra innehåller cerebellarsektioner på laterala/halvklot (de fyra översta bilderna i lila). Två innehåller mediala/vermala cerebellarsektioner (nedersta två bilder, skisserade i ljusblått). E. Representativ cerebellarsektion på lateral/halvklot med DCN-stans dissekerad till höger om avsnittet (avsnitt i rosa i figur 1D). F. F. Cerebellar-sektionen i figur 1D med fyrkantig prickad turquois runt den, dissekerad i främre och bakre vermala lobules. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Relativt genuttryck i isolerade specifika områden i lillhjärnan.
Relativa uttryck för aldolasE C (2A),parvalbumin (2B) och Kcng4 (2C) normaliserade till Rps 18 (protein som är associerat med ribosomal RNA uttryckt i alla celler) och med bulk cerebellar extrakt som referens. Som förväntat var aldolasE C-uttrycket högre i den bakre vermis och lägre i DCN och främre vermis (2A). Som förväntat, baserat på Allen Brain Atlas, uttrycket parvalbumin uttrycks enhetligt över varje extraherad region, medan Kcng4 uttryck är betydligt berikad i DCN och CCaV. Enkelvägs ANOVA, med tukeys post hoc-test. *p<.0.005, ** p<.0.0001 i förhållande till bulk cerebellar extrakt. Histogram representerar medelvärden för N=3 med värden för varje enskild mus som visas som punkter. Felstaplar representerar standardfel för medelvärdet. DCN (Deep cerebellar nuclei), CCaV (cerebellar cortex av främre vermis), CCpV (cerebellar cortex av bakre vermis) och CCH (cerebellar cortex på halvklotet). N=3 möss för cerebellar dissekering regioner. N=1 bulkextrakt. Experiment gjort i tre exemplar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: RTqPCR Relativt genuttryck av aldolasE C över cerebellar cortex
Relativa uttryck av aldolasE C i specifika regioner i cerebellar cortex - främre vermis (CCaV), bakre vermis (CCpV) och halvklot (CCH). Gen uttryck nivå av aldolase C normaliserades till Rps18 och jämfört med uttryck nivån i den främre vermis. Som förväntat berikades aldolase C uttryck i den bakre vermis. Enkelvägs ANOVA, med tukeys post hoc-test. *p<.0.005 i förhållande till CCaV. Felstaplar representerar standardfel för medelvärdet. CCaV (cerebellar cortex av främre vermis), CCpV (cerebellar cortex av bakre vermis) och CCH (cerebellar cortex på halvklotet). N=3 möss, experiment gjort i triplicate. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som beskrivs här gör det möjligt att bedöma det underliggande genuttrycket och molekylära mekanismerna inom fyra distinkta cerebellarregioner – vermis (CCpV) djupa cerebellarkärnan (DCN), vermis (CCAV) främre cerebellarbarken ( cerebellar cortex). Förmågan att bedöma dessa regioner separat kommer att utöka vår kunskap om heterogeniteten i specifika cerebellar regioner och eventuellt kasta ljus över deras bidrag till olika beteenden.
Genom att dela upp hela hjärnvävnaden sagittally är det möjligt att enkelt visualisera och identifiera dessa fyra regioner i lillhjärnan, vilket möjliggör en snabb dissekering. Bäst av författarens kunskap är detta den första beskrivningen av fullständig cerebellar regional dissekering för molekylär analys. I en artikel som nyligen publicerades använde forskare bulk dissekering av de främre lobules av lillhjärnan och nodular lobule av lillhjärnan för molekylär analys22. Men med den beskrivna metoden skulle de inte också kunna dissekera DCN. Försök att isolera DCN stansar med hjälp av en vibratome för att skära 300um tjocka skivor stöter vanligtvis på tre kritiska problem. För det första, på grund av små skillnader i montering av lillhjärnan och vinkeln vid vilken vävnaden skärs, är det inte lätt att reproducerbart isolera samma regioner mellan djur. För det andra tar montering och skivning tid, vilket ökar risken för RNA-nedbrytning och minskad kvalitet på RNA-prov för nedströmsapplikationer. Slutligen ger stansar från 300um tjocka skivor lågt utbyte av RNA.
Data som visas här tyder på att det är möjligt att använda denna teknik för att bedöma relativa genuttryck i cerebellar regioner. Aldolase C är mycket uppreglerad i CCpV. Kcng4 är mycket uppreglerad i DCN och CCaV, och parvalbumin uttrycks relativt lika i alla regioner i lillhjärnan. Även om dessa bara är tre gener, visar dessa resultat att denna dissekeringsmetod kan användas för att identifiera de underliggande molekylära signaturerna i dessa distinkta regioner.
Det finns några kritiska saker att uppmärksamma under hela detta protokoll. Att placera hjärnan i matrisen är ett viktigt steg. I vissa fall kan hjärnan inte ha ställts in perfekt nivå i matrisen eller exakt på mittlinjen. Detta skulle bli tydligt när man tittar på var och en av sagittalsektionerna. Om du till exempel klipper exakt vid mittlinjen kommer de mest mediala cerebellarsektionerna att se nästan identiska ut och har inget DCN synligt. Eftersom dessa landmärken kan identifieras med öga är det möjligt att felsöka hur många sektioner som kvalificerar sig som vermal- eller halvklotets sektioner, och de kan kombineras tillsammans i samma mikrofugerör. Ett annat kritiskt steg är extraktionen av DCN. I vissa fall är det inte tillräckligt tryck att trycka ner ett finger till toppen av rörspetsen på 200 μl för att extrahera vävnadsstansen. Om så är fallet kommer det att vara nödvändigt att skopa ut stansen med en nålnästång och placera stansen i rätt rör. Nästa kritiska steg i detta protokoll är RNA-extraktionen. Medan de listade volymerna har optimerats för maximal RNA-extraktion, kan det också vara nödvändigt att justera mängden lösning i RNA-extraktionsprotokollet för att passa labbets individuella behov. Eftersom det finns lite vävnad att arbeta med finns det en högre risk för fenolförorening i den slutliga RNA-produkten. Detta kan hanteras genom att justera mängden TRIzol som används för att homogenisera vävnaden och säkerställa att den homogeniserade vävnaden blandas noggrant.
Begränsningar av detta protokoll är att medan DCN är uppdelad i tre separata kärnor (laterala, interponerade och mediala) är det svårt att visualisera och reproducerande stansa var och en av dessa av 1 mm sektioner, än mindre ha tillräckligt med vävnad för att extrahera RNA. Tillsammans med denna begränsning visas hälften av det mest mediala DCN i vermis; Men med denna dissekering är det svårt att visualisera och reproducerbart dissekera ut. Som protokollet är för närvarande dissekeras den andra halvan av det mediala DCN och det återstående DCN. Det finns också tio enskilda vermal lobules och åtta lobules i halvklotet, men att dissekera var och en av dessa individuellt och på ett reproducerbart sätt skulle vara svårt och leda till mycket låga RNA koncentration utbyten. Även om denna metod gör det möjligt att gräva mer specifikt i regioner i lillhjärnan, kombinerar den fortfarande distinkta anatomiska regioner i grupper som kan maskera unika förändringar på nivån för enskilda lobules eller sub-lobule enheter.
Sammanfattningsvis gör denna metod det möjligt att samtidigt utforska regionala molekylära skillnader fyra specifika regioner i lillhjärnan. Genom att bedöma lillhjärnan på detta regionspecifika sätt är det möjligt att reta isär underliggande molekylära mekanismer och genuttryck som kännetecknar dessa regioner. Detta kommer att främja vår förståelse av den roll som de distinkta cerebellarregionerna spelar i olika beteenden och möjliggöra framtida arbete att fokusera specifikt på en cerebellar region och utforska dess roll i sjukdom eller målbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Austin Ferro och Juao-Guilherme Rosa i Cvetanovic-labbet för deras hjälp med felsökning av dissektioner och i RNA-extraktion och RTqPCR. Denna forskning finansieras av M. Cvetanovic, R01 NS197387; HHS | Nationella hälsoinstitut (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , Online Preprint (2020).
