Summary
Farklı serebellar bölgelerin farklı davranışsal çıktılarda rol oynadığı belirtilmiştir, ancak alttaki moleküler mekanizmalar bilinmemektedir. Bu çalışma, RNA'yı izole ederek ve gen ifadesindeki farklılıkları test ederek moleküler farklılıkları araştırmak için yarımkürelerin serebellar korteksini, vermisin ön ve arka bölgelerini ve derin serebellar çekirdekleri tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama yöntemini açıklar.
Abstract
Serebellum, hareket kontrolü, denge, biliş, ödül ve etki dahil olmak üzere çeşitli temel işlevlerde önemli bir rol oynar. Görüntüleme çalışmaları farklı serebellar bölgelerin bu farklı fonksiyonlara katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bölgesel serebellar farklılıkları inceleyen moleküler çalışmalar, çoğunlukla serebellar özlerin tamamında yapıldığı için geride kalmaktadır ve böylece belirli serebellar bölgelerdeki ayrımları maskelemektedir. Burada dört farklı serebellar bölgeyi tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama tekniğini açıklıyoruz: derin serebellar çekirdek (DCN), ön ve arka vermal serebellar korteks ve yarımkürelerin serebellar korteksi. Bu farklı bölgelerin diseksiyonunun, denge, hareket, etki ve bilişe benzersiz katkılarının altında yatan moleküler mekanizmaların araştırılmasına izin verir. Bu teknik, çeşitli fare hastalığı modellerinde bu belirli bölgelerin patolojik duyarlılığındaki farklılıkları araştırmak için de kullanılabilir.
Introduction
Beyincik beyindeki nöronların yarısından fazlasını içerir ve tarihsel olarak beyinde motor kontrol ve denge merkezi olarak adlandırılır1. Daha yakın zamanlarda, çalışmalar serebellumun biliş, ödül işleme dahil olmak üzere diğer çeşitli işlevlerde kilit bir rol oynadığını ve 2 , 3,4,5'i etkilediğinigöstermiştir.
Beyincik iyi tanımlanmış anatomiye sahiptir: korteks bölgesi granül, Purkinje ve moleküler katmanlardan oluşur. Granül hücreler granül hücre tabakasını oluşturur ve paralel lifler aracılığıyla moleküler tabakanın Purkinje hücre dendritlerine giriş gönderir ve bu da alt zeytinden kaynaklanan tırmanma liflerinden giriş alır. Purkinje hücreleri, beyincikten ana çıktı görevi gören derin serebellar çekirdekteki (DCN) hücrelere inhibitör projeksiyonlar gönderir. Bu serebellar devrenin çıkışı, Golgi, stellat ve sepet hücreleri de dahil olmak üzere serebellar korteksteki inhibitör internöronların aktivitesi ile daha da modüle edilir4. Bu serebellar fonksiyonel ünite serebellar korteksin tüm lobüllerine dağılmıştır. Beyincik boyunca bu nispeten düzgün devreye rağmen, insan nörogörüntüleme literatüründen ve hasta çalışmalarından elde edilen kanıtlar beyincik6,7'ninfonksiyonel heterojenliğini göstermektedir.
Serebellar korteks iki ana bölgeye ayrılabilir: orta çizgi tanımlı vermis ve lateral yarımküreler. Vermis daha da ön ve arka lobüllere ayrılabilir. Beyinciklerin bu farklı bölgeleri farklı davranışlara katkıda bulunmakla suçlanmıştır. Görev çağrışan veya görevsiz aktivite kalıpları, vermis'in ön bölgelerinin motor fonksiyona daha fazla katkıda bulunduğunu, posterior vermis'in ise biliş6,7'yedaha fazla katkıda bulunduğunu ortaya çıkardı. Vermis ayrıca etki ve duygularla bağlantılıdır, serebellar yarımküreler yürütme, görsel-mekansal, dil ve diğer anımsatıcı işlevlere katkıda bulunur8. Ek olarak, anatomik çalışmalar fonksiyonel olarak farklı serebellar bölgelerin farklı kortikal bölgelerle bağlantılı olduğuna dair kanıtlar sağlamıştır9. Lezyon semptom haritalaması, ön lobları etkileyen inmeleri olan hastaların (lob VI'ya kadar uzanan) ince motor görevlerde daha düşük performansa sahip olduğunu, arka lob bölgelerinde ve yarımkürelerde hasarı olan hastaların serebellar motor sendromunun yokluğunda bilişsel eksiklikler sergilediğini ortaya koydu10. Son olarak, hastalıkta bölgesel serebellar patoloji, fonksiyonel olarak farklı serebellar bölgelerin de hastalığa farklı şekilde duyarlı olduğunu gösterir11,12.
Çok daha az araştırılsa da, ön kanıtlar serebellar kortikal bölgelerde belirgin gen ekspresyon imzaları göstermektedir. Zebrin II'nin Purkinje hücre ifadesi, vermiste bölgeye özgü desenleme gösterir, böylece arka lobüllerde daha fazla Zebrin II pozitif hücre ve ön lobüllerde dahaazdır 13. Bu aynı zamanda Zebrin II negatif Purkinje hücreleri Zebrin II pozitif14olan Purkinje hücrelerinden daha yüksek tonik ateşleme sıklığı gösterdiğinden bölgesel olarak farklı fizyolojik işlevle de ilişkilidir.
Serebellar kortekse ek olarak, serebellum, beyincik için birincil çıktı görevi gören derin serebellar çekirdeği (DCN) içerir. Çekirdekler medial (MN), interposed (IN) ve lateral çekirdeklerden (LN) oluşur. Fonksiyonel görüntüleme ve hasta çalışmaları, DCN'nin çeşitli davranışlara da katıldığını göstermiştir15, ancak çok az çalışma DCN'deki gen ekspresyon değişimini inceler.
Moleküler tekniklerdeki gelişmeler beyindeki bölgesel gen ekspresyonun değerlendirilmesini mümkün kıldı ve hem fizyolojik hem de hastalık durumlarında farklı beyin bölgelerinde ve içinde heterojenliği ortaya çıkardı16. Bu tür çalışmalar, beyinciğerinin diğer beyin bölgelerinden farklı olduğunu ima eder. Örneğin, nöronların glial hücrelere oranı beyincikte diğer beyin bölgelerine göre ters çevrilmiş1. Normal fizyolojik koşullarda bile, proinflamatuar genlerin ekspresyonu beyincikte diğer beyin bölgelerine göre artmaktadır17. Moleküler teknikler, serebellar hastalıkların patogenezine katkıda bulunan yolların tanımlanmasında da çok yararlı olmuştur. Örneğin, tüm serebellar özlerin RNA dizilimi, vahşi tip kontrollerine kıyasla spinocerebellar ataksi tip 1'in (SCA1) Purkinje hücresine özgü transgenik fare modelinde değiştirilen genleri tanımladı. Bu tür kanıtlar, serebellar Purkinje hücrelerinde patogenezin altında kalan temel moleküler yolları ortaya çıkarmıştır ve potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olmuştur18. Bununla birlikte, son çalışmalar serebellar bölgelerde hastalıklara karşı savunmasızlıkta farklılıklar olduğunu göstermektedir11,12,19. Bu, tüm serebellar özlerle maskelenmiş veya tespit edilmemiş olabilecek farklı serebellar bölgelerde meydana gelen önemli değişiklikler olduğunu gösterebilir. Bu nedenle, araştırmacıların farklı serebellar bölgelerdeki moleküler profilleri incelemelerini sağlayan teknikler geliştirmeye ihtiyaç vardır.
Burada önerilen teknik, RNA'yı bu bölgelerden izole etmek ve gen ifadesindeki bölgesel farklılıkları araştırmak için fare beyinciğinin dört farklı bölgesini parçalamak için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklar. Şekil 1A'daki fare beyinciliğinin şeması, vermis'i mavi ve yarımküreleri sarı renkle vurgular. Özellikle, Bu teknik dört bölgenin izole olmasını mümkün kılar: derin serebellar çekirdek (DCN) (Şekil 1A'dakikırmızı noktalı kutular), ön vermis (CCaV) serebellar korteksi (koyu mavi inç) Şekil 1A), arka vermis (CCpV) serebellar korteksi (Şekil 1A'daaçık mavi) ve yarımkürelerin serebeller korteksi (CCH) (Şekil 1A'dasarı). Bu bölgelerin gen ekspresyonunun ayrı ayrı değerlendirilmesi ile bu farklı bölgelerin ayrık fonksiyonlarının altında kalan moleküler mekanizmaların yanı sıra hastalıktaki kırılganlıklarındaki potansiyel farklılıkların araştırılması mümkün olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kurulum
- Kafa kesme makası, künt forseps, diseksiyon makası, vasküler makas, mikrospatula, sagittal fare beyin matrisi, jilet, 200 μL pipet ucu, cam petri kabı, cam kaydırak ve buz kovası dahil olmak üzere gerekli ekipmanları toplayın. Tüm ekipmanları emici bir ped üzerine yer edin.
- Petri kabı, cam tabak ve beyin matrisini buza yerleştirin.
- Dik bir açıda jilet kullanarak, bir 200 μL pipet ucunun ucundan yaklaşık 5 mm kesin. Bu, ucun ucundaki açıklığın boyutunu yaklaşık 1 mm genişliğinde yapar. Bu DCN'i delmek için yeterli olmalı. Ancak bu, diseksiyona bağlı olarak gerektiği gibi de ayarlanabilir. Kolay değiştirme ve ayarlama için birçok ipucunu hazırlayın.
- Etiket 1.5 mL mikrofuge tüpleri hayvan tanımlama ve serebellar bölge (hayvan başına dört tüp).
- Ekstraksiyondan sonra dokuyu flaş dondurmak için cryosafe kabını sıvı nitrojenle doldurun.
2. Beyin çıkarma ve diseksiyon
Tüm deneyler Minnesota Üniversitesi Hayvan Bakım Komitelerinin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi.
- %5 CO2 pozlaması kullanarak fareyi ötenazi edin. Solunum durduktan sonra servikal çıkık gerçekleştirin. Kafa kesme makası ile farenin kafasını koparın ve karkası uygun kapta atın.
- Burundan başlayıp geriye doğru devam eden başın medial sagittal çizgisi boyunca jiletle bir kesi yapın. Orta çizginin her iki tarafına ayrılarak cildi ayırın. Her iki taraftaki kası kesmek için jilet kullanın, kulak kanallarını kesin.
- Kesme makası kullanarak, beyin sapının beyincikle buluştuğu yere kadar herhangi bir omurilik bölgesini kırpın, beyinciğin zarar görmemesine dikkat edin.
- Damar makası bıçaklarından birini beyin sapı ve omur sütunu arasındaki boşluğa yerleştirin ve kulak kanalına doğru kesin, kemiği temiz bir şekilde kesmek için makası kaldırın, ancak dokudaki hasarı sınırlayın.
- Kafatasının kenarı boyunca koku ampullerine doğru kesmeye devam edin, beyin dokusundaki hasarı sınırlamak için keserken kaldırmaya devam edin.
- Künt tokaları kullanarak, kafatasının arkasını yavaşça soyun ve beynin ve beyincik bölgesini ortaya çıkarın.
- Kafatasının kenarındaki künt künt zımsaları kullanarak kafatasının geri kalanını beynin üzerinden soyun. Bu adım kafatası kapağının çoğunu çıkarmalı ve beyni ortaya çıkarmalıdır.
- Kafatasının geri kalanını damar makası ve künt tokalarla kırparak kafatasının çoğunu beynin tepesinden temizleyin.
- Mikrospatula kullanarak, beyni hafifçe kaldırın ve kalan kafatasından koku ampullerini çıkarmak ve optik sistem liflerini kesmek için altına kepçe ve yukarı kaydırın. Beyin bu noktada kolayca serbest gelmelidir.
- Beyni buz üzerinde oturan petri kabına yerleştirin ve kalan kafatasını veya diğer kalıntıları çıkarın.
- Mikrospatulayı kullanarak, beyni dorsal tarafı yukarı olacak şekilde beyin matrisine hafifçe yerleştirin. Matriste seviye ayarlı olduğundan emin olmak için zaman ayırın, özellikle orta çizgi matriste merkezi düşer. Bu matris yetişkin fare beyin dokusu için tasarlanmıştır, genç veya hastalıklı hayvanlardan gelen doku matriste daha düşük dayanabilir, ancak numuneler arasında tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek hala mümkün olmalıdır.
- Yaylı orta çizgi boyunca bir jilet yerleştirin, bıçağın matrisin altına kadar itmesini sağlamak (Şekil 1B).
- İlk bıçağın yanına 1 mm daha jilet yerleştirin (Şekil 1B). Birbirinden 1 mm uzakta iki bıçak daha yerleştirin. Sonuç, beynin bir tarafına yerleştirilmiş üç bıçak olmalıdır, hepsi birbirinden 1 mm uzakta. Aynısını diğer tarafa da yap. Toplamda, 7 bıçak 1mm aralıklarla yerleştirilecektir (Şekil 1C).
- Dikkatlice, jiletlerin ön ve arka uçlarını alın ve matristen yukarı kaldırın. Jiletlerin dışındaki doku atılabilir.
- Yavaşça, doku bölümlerine zarar vermemeye dikkat derek bir seferde bir jilet ayırın.
- Doku bölümünü jiletten dikkatlice kaydırın ve mikrospatula ile cam kaydırağa kaydırın. Toplamda altı sagittal beyin bölümü olacaktır (Şekil 1D).
- En yanal 4 bölüm DCN görünür olacaktır (Mor kutu, Şekil 1D). DCN'yi izole etmek için, kesilmiş 200 μL pipet ucunu DCN üzerinde dik olarak tutun ve dcn'yi çevre dokudan tamamen kesmek için her yöne sallanarak dokudan sıkıca aşağı itin. DCN'yi temiz bir şekilde çıkarmak için doğrudan yukarı kaldırın ve ucundaki dokunun varlığını görsel olarak onaylayın.
- Bir parmağınızı ucun üstüne yerleştirin ve aşağı itin, bu da dokunun şişkinlik yapmasına neden oldu. Ucu doğru etiketlenmiş mikroyakıt tüpüne yerleştirin ve doku delme tüpünün altına yerleştirildiğından emin olun. Kalan üç bölüm için 2.17'yi tekrarlayın ve DCN zımbalarını aynı tüpe yerleştirin. Flaş dondurmak için tüpü sıvı nitrojene yerleştirin. Şekil 1E'deher bir zımbanın boyutunun gösterimi.
- DCN çıkarılan bölümler serebellar yarımküre olarak nitelendirilir. Beyin dokusunun geri kalanını bu bölümlerdeki beyinciklerin etrafına itin. Künt tokalar kullanın ve bu yarımküre serebellar korteks bölümlerini hafifçe alın ve ilgili mikrofuge tüpüne yerleştirin. Flaş dondurun.
- Son iki vermal bölüm için (açık mavi kutu, Şekil1D),sadece beyincik bırakarak çevreleyen beyin dokusunu uzaklaştırın. Jilet kullanarak, ön lobülleri arka lobüllerden ayıran bir kesim yapın. Kesim lobule 6 oluşumundan hemen sonra olmalı ve lobule 10(Şekil 1F)içermemelidir.
- Künt forseps kullanarak, ön serebellar korteks bölümlerini ve posterior serebellar korteks bölümlerini dikkatlice ilgili mikrofuge tüplerine yerleştirin ve tüpleri 5 dakika boyunca sıvı nitrojende bırakarak flaş dondurun. Buradan RNA ekstraksiyonuna ilerleyin veya tüpleri -80 °C'de saklayabilir.
3. RNA ekstraksiyonu
NOT: Bu protokol, TRIzol20ile RNA Ekstraksiyonu için Soğuk Bahar Limanı Protokolü'nden değiştirilmiştir. TRIzol biyolojik malzemeyi çözünür ve RNA çıkarılmasını mümkün hale getirir.
- Dokunun çok hızlı çözülmesini önlemek için mikrobuj tüplerini buza yerleştirin, mikroyapı tüpüne 150 μL soğuk TRIzol uygulayın. Sterilize edilmiş bir pestle ile homojenize edin. Doku homojenize olduktan sonra, kalan dokunun bozulmadığından emin olmak için çözeltiyi yukarı ve aşağı borulayın. Ayrıca küçük doku parçalarını birkaç kez insülin şırındına çekerek parçalayın.
- 350 μL daha TRIzol ekleyin ve iyice karıştırmak için yukarı ve aşağı borulayın. Oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
- Tüpe 150 μL kloroform ekleyin ve kuvvetlice çalkalayın ve ardından 2-3 dakika dinlendirin. Kloroform homojenize doku çözeltisini fazlara (RNA, DNA ve protein) ayırır.
- 12.000 x g'da, 15°C'de 10 dakika santrifüj. Tüm tüplerin aynı yönde olduğundan emin olun.
- Tüpleri dikkatlice çıkarın ve santrifüjün sıcaklığını 4 °C'ye ayarlayın. Sadece berrak sulu fazı yeni bir tüpe çıkarın (bu RNA'dır), opak ara fazı (DNA) bozmamaya dikkat edin. En düşük faz kırmızı olacaktır ve protein içerir. Tüplerde kalan çözelti kaydedilebilir veya atılabilir.
- 1:2 oranında% 100 izopropil alkol ekleyin (200 ul sulu faz çıkarılırsa, 100 μL izopropil alkol ekleyin). Yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika dinlendirin. İzopropil alkol RNA'yı çözeltiden çıkarır.
- 12.000 x g'da, 4°C'de 10 dakika santrifüj. Peletin görselleştirilmesini kolaylaştırmak için tüm tüpleri aynı yönde yerleştirebildiğinden emin olun. Elde edilen pelet çıkarılan RNA olacaktır.
- Tüpleri dikkatlice çıkarın, peletin bozulmamasına dikkat eden bir pipet ile üsttantı çıkarın. Pelet biraz jel benzeridir ve görülmesi zor olacaktır, ancak santrifüjdeki tüplerin yönüne göre nerede olduğunu tahmin edebilmelidir.
- Tüm süpernatantı çıkardıktan sonra, 5 dakika boyunca 5 dakika boyunca 7500 x g'da 500 μL% 75 etanol, girdap ve santrifüj ekleyin. Etanol peletin daha da yıkanır.
- Peletin bozulmasına neden olmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın. Numuneyi kurutmak için kapakları açık bırakın. Bu genellikle 5-10 dakika sürer, ancak pelet üzerinde ne kadar etanol kaldığına bağlı olarak değişebilir. Fazla kurutma.
- Kurutuktan sonra peletin DNase serbest suyuna yeniden koyun. DCN için örneklere 20 μL ve diğerleri için 30 μL ekleyin.
- Yeniden depolandıktan sonra, numuneler -80 °C'de saklanabilir veya daha fazla teste devam edebilir.
4. Gerçek Zamanlı Nicel Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RTqPCR)
- Bu adımdan önce, herhangi bir genomik DNA'yı çıkarmak için RNA'yı tedavi etmek ve BioRad'dan iScript kullanarak cDNA oluşturmak gerekecektir. CDNA yapmadan önce RNA konsantrasyonunun normale döndürdürülmesini unutmayın. Ek olarak, qPCR için astarları optimize etmek önemlidir. Bu adım21'itamamlamak için burada açıklanan yöntemleri izleyin. Aşağıdaki qPCR'nin kısa açıklaması.
- Primer'ların tümü IDT'den satın alınmaktadır. İleri ve ters diziler aynı numune tüpündedir ve 20x konsantrasyonda depolanır.
Rps18 (kontrol geni):
İleri – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
Ters – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
Parvalbumin (Kalsiyum bağlayıcı protein, inhibitör hücreler):
İleri – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
Ters – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3'
Kcng4 (Potasyum kanalı alt birliği):
İleri – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
Ters – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3'
Aldolaz C (Zebrin II, serebellar korteks boyunca farklı olarak ifade edilir):
İleri – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3'
Ters – 5'-TCAGTAGGCATGGGGGGC-3' - qPCR koşulları aşağıdaki gibidir. Ön kuluçka süresi, 5 dakika, 95°C'de. Amplifikasyon süresi, 50 döngü: 95°C'de 10 dakika, 62°C'de 10 dakika ve 72°C'de 10 dakika. Erime eğrisi süresi, 95°C'de 5 saniye, 65°C'de bir dakika ve rampa hızını 97°C hedef sıcaklığına kadar .07°C/saniye olarak ayarlayın. Daha sonra 10 dakika ila 40 °C arasında soğutma süresi. Tüm qPCR reaksiyonları üç taraflı olarak gerçekleştirildi ve gen ekspresyonunun normalleştirilmesi için yükleme kontrolü olarak Rps18 ile 2- ΔΔCt kullanılarak gen ekspresyörü analiz edildi. Referans olarak dökme serebellar ekstre kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu deneyler için dört on bir haftalık dişi vahşi tip C57/Black6 fare kullanıldı. Bir fare, 'dökme beyincik' olarak adlandırılan ve kesilen bölgelerdeki RNA seviyelerinin tam bir diseksiyonla karşılaştırılmasına izin verilen tam bir serebellar diseksiyon yapmak için kullanıldı. Diğer üç fare, bu protokolde açıklanan serebellar diseksiyonu yapmak için kullanılmıştır. Üç fare kullanmak, RNA seviyelerinde tespit edilen eğilimlerin fareler arasında tekrarlanabilir olmasını mümkün kılar.
Şekil 1A, fare beyinciklerini temsil eder - mavi ve yarımküreler sarı ile vermis. Vermiğin sagittal şemaları (koyu mavi ön bölgeler, açık mavi arka bölgeler) ve yarımküre (sarı). DCN kırmızı noktalı kutularda vurgulanır. Başarılı bir diseksiyon, beynin orta çizgisine ilk jilet yerleştirilmesiyle başlayacaktır (Şekil 1B); bu, aşağıdaki altı bıçağın başarılı bir şekilde yerleştirilmesine rehberlik eder (Şekil 1C). Bu, altı sagittal bölüm (Şekil 1D), dört yanal / yarımküre bölümü (mor ile özetlenmiştir) ve iki orta çizgi / vermal bölüm (açık mavi ile özetlenmiştir) bırakır. 4 yanal bölüm DCN içerir; Şekil 1E başarılı bir DCN zımba diseksiyonu tasvir eder. Orta çizgi vermal kesitler büyük olasılıkla 1 mm kalınlığındaki bölümde bulunan en medial DCN'nin yarısına sahip olacaktır, ancak tüm yol boyunca mevcut olmayacaktır ve tekrar tekrar parçalamak mümkün değildir. Orta çizgi vermal kesitleri Şekil 1F'degösterilen ön ve arka lobüllere ayrılmıştır. Başarılı bir diseksiyon, deneylerin geri kalanını başarı için ayarlar.
Gerçek Zamanlı nitel Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RTqPCR) sonuçları, her bir bölgenin gen ekspresyon seviyelerini değerlendirmenin fizibilitesini gösterir ve diseksiyonları doğrulamaya yarar. DCN'de önden arka serebellar kortekse ve zenginleştirmeye kadar gradyan ekspresymasını gösteren genleri tespit eden astarlar kullandık ve ifadelerini toplu serebeller lysates ile karşılaştırdık.
Üç genin ekspresyon düzeylerini değerlendirdik: aldolaz C, parvalbumin ve Kcng4. Aldolaz C, zebrin II olarak da bilinir, beyincik boyunca tutarlı bir bantlama deseninde ifade edilen bir enzimdir. Ön vermisten daha çok posterior vermiste ifade edilir. Yarımkürede de bantlar vardır13,14. İnhibitör hücrelerde ifade edilen kalsiyum bağlayıcı bir protein olan parvalbumin. Allen Beyin Atlası'na dayanarak, parvalbumin serebellar korteks boyunca ve DCN'de (http://mouse.brain-map.org/gene/show/19056) nispeten eşit olarak ifade edilir. Bir potasyum voltaj kapılı kanal alt birliği olan Kcng4, DCN'de ve ön loblarda arka loblara (https://mouse.brain-map.org/gene/show/42576) kıyasla zenginleştirilmiş gibi görünmektedir. Nicel ekspresyon analizi, beklendiği gibi, aldol C'nin arka serebellar vermiste (CCpV) daha yüksek oranda ifade edildiğini, ancak dcn ve vermis ön bölgesinde (CCaV) daha düşükolduğunu göstermiştir. Parvalbumin benzer şekilde DCN, ön vermis, posterior vermis ve yarımküre serebellar kortikallerde, dökme serebellar özlerde olduğu gibi bulunur (Şekil 2B). Kcng4, DCN ve ön vermiste (CCaV) önemli ölçüde zenginleştirilmiştir ve toplu ekstraksiyonla karşılaştırıldığında arka vermis (CCpV) veya yarımkürelerde (CCH) önemli ölçüde zenginleştirilmez (Şekil 2C). Bu sonuç, Allen Beyin Atlası'nda görülen örüntüye dayanarak bekleneni takip eder. Böylece gen ekspresyon analizi diseksiyon protokolünü doğrular ve kaliteli RNA alınıp test edilebileceğini doğrular.
Serebellar korteks boyunca aldolaz C ifadesini doğrudan karşılaştırmak için, ifade düzeyleri en düşük olması gereken yer olan ön vermis (CCaV) (Şekil 3)ile karşılaştırıldı. Aldol C ekspresyon düzeyi posterior vermiste (CCpV) anlamlı olarak daha yüksekti ve serebellar yarımkürelerde (CCH) daha yüksek eğilime sahipdi, ancak oldukça önemli bir şekilde değil. Serebellar yarımkürelerdeki bu eğilim muhtemeldir, çünkü yarımkürede aldol C bantları vardır ve diseksiyon aldolaz negatif ve pozitif bantları yakalar.
Şekil 1: Serebellar diseksiyonun temsili görüntüleri
A. Mavi vermis ve sarı yarımküre ile fare serebellum şeması. Vermis ve yarımkürenin sagittal serebellar şemaları. Vermis mavi, ön vermis işaret koyu mavi ve açık mavi işareti posterior vermis ile. Sarı yarımküre. DCN her birinde kırmızı noktalı kutularla işaretlenir. B. Sagittal fare beyin matrisinde tam beyin, orta çizgide jiletle. C. Orta hattın her iki tarafına 1 mm aralıklarla üç jilet yerleştirilmesi. D. Ortaya çıkan altı sagittal beyin bölümü. Dördü lateral/yarımküre serebellar bölümler içerir (mor ile özetlenen ilk dört resim). İkisi medial/vermal serebellar bölümler içerir (son iki resim, açık mavi ile özetlenmiştir). E. Bölümün sağında DCN zımbası bulunan temsili lateral/yarımküre serebellar kesiti (Şekil 1D'depembe ile özetlenen bölüm). F. Şekil 1D'deki serebellar bölüm, etrafında kare noktalı turkuaz, ön ve arka vermal lobüllere bölünmüş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Beyincinin izole edilmiş belirli bölgelerinde göreceli gen ekspresyumu.
Aldol C (2A), parvalbumin (2B) ve Kcng4 (2C) nispi ekspresyöz ifadesi Rps 18 (tüm hücrelerde ifade edilen ribozomal RNA ile ilişkili protein) normalleştirilmiş ve toplu serebellar ekstreyi referans olarak kullanmıştır. Beklendiği gibi, aldol C ekspresyâtı arka vermiste daha yüksek ve DCN ve ön vermiste daha düşüktü (2A). Beklendiği gibi, Allen Beyin Atlası'na dayanarak, parvalbumin ekspresyy ekspresyoyu çıkarılan her bölgede eşit olarak ifade edilirken, Kcng4 ifadesi DCN ve CCaV'de önemli ölçüde zenginleştirilmiştir. Tek yönlü ANOVA, Tukey'in geçici testiyle. *s<.0.005, ** s<.0.0001 dökme serebellar özüne göre. Histogramlar, N=3 için ortalama değerleri, nokta olarak gösterilen her bir farenin değerleriyle temsil eder. Hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil eder. DCN (Derin serebellar çekirdek), CCaV (ön vermis serebellar korteksi), CCpV (arka vermis'in serebellar korteksi) ve CCH (yarımkürelerin serebellar korteksi). N=Serebellar diseksiyon bölgeleri için 3 fare. N=1 toplu ekstrakt. Deney üç taraflı olarak yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RTqPCR Serebellar korteks boyunca aldol C'nin bağıl gen ekspresyişi
Serebellar korteksin belirli bölgelerinde aldol C'nin göreceli ekspresyârı - ön vermis (CCaV), posterior vermis (CCpV) ve yarımküreler (CCH). Aldol C'nin gen ekspresyon düzeyi Rps18 olarak normalleştirildi ve ön vermisteki ifade düzeyine göre karşılaştırıldı. Beklendiği gibi aldolaz C ekspresyâtı posterior vermiste zenginleştirilmiştir. Tek yönlü ANOVA, Tukey'in geçici testiyle. *CCaV'ye göre s<.0.005. Hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil eder. CCaV (ön vermis'in serebellar korteksi), CCpV (arka vermişin serebellar korteksi) ve CCH (yarımkürelerin serebellar korteksi). N=3 fareler, üç taraflı deneyler yapılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntem, dört ayrı serebellar bölgede altta kalan gen ekspresyonunu ve moleküler mekanizmaların değerlendirilmesini mümkün kılar - derin serebellar çekirdek (DCN), vermisin ön serebellar korteksi (CCaV), vermisin arka serebellar korteksi (CCpV) ve yarımkürelerin serebellar korteksi (CCH). Bu bölgeleri ayrı ayrı değerlendirme yeteneği, belirli serebellar bölgelerin heterojenliği hakkındaki bilgimizi genişletecek ve muhtemelen çeşitli davranışlara katkılarına ışık tutacaktır.
Tüm beyin dokusunu sagittally bölümlere ayırarak, beyinciğinin bu dört bölgesini kolayca görselleştirmek ve tanımlamak mümkündür, bu da hızlı bir diseksiyon sağlar. Yazarın bilgisine göre bu, moleküler analiz için tam serebellar bölgesel diseksiyonun ilk tanımıdır. Yakın zamanda yayınlanan bir makalede, araştırmacılar moleküler analiz için beyincik ön lobüllerinin ve beyinciğin nodüler lobüllerinin toplu diseksiyonunu kullandılar22. Ancak, açıklanan yöntemle DCN'yi de parçalayamayacaklardır. 300um kalınlığında dilimleri kesmek için vibratom kullanarak DCN zımbalarını izole etme girişimleri genellikle üç kritik sorunla karşılaşır. İlk olarak, cerebellanın montajındaki küçük farklılıklar ve dokunun kesildiği açı nedeniyle, aynı bölgeleri hayvanlar arasında tekrar tekrar izole etmek kolay değildir. İkinci olarak, montaj ve dilimleme zaman alır, RNA bozulması olasılığını artırır ve aşağı akış uygulamaları için RNA numunesinin kalitesini azaltır. Son olarak, 300um kalınlığında dilimlerden gelen yumruklar düşük RNA verimi üretir.
Burada gösterilen veriler, serebellar bölgelerde göreceli gen ekspresyonunu değerlendirmek için bu tekniği kullanmanın mümkün olduğunu göstermektedir. Aldolaz C, CCpV'de yüksek oranda yukarı yönlüdür. Bunlar sadece üç gen olmakla birlikte, bu sonuçlar bu diseksiyon yönteminin bu farklı bölgelerin altında kalan moleküler imzaları tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir.
Bu protokol boyunca dikkat etmesi gereken birkaç kritik şey vardır. Beyni matriste konumlandırmak önemli bir adımdır. Bazı durumlarda, beyin matriste veya tam olarak orta çizgide mükemmel bir şekilde ayarlanmış olmayabilir. Bu, sagittal bölümlerin her birine bakıldığında netleşecektir. Örneğin, tam olarak orta çizgide kesilirse, en medial serebellar bölümler neredeyse aynı görünür ve görünür DCN'ye sahip olmaz. Bu yer işaretleri gözle tanımlanabildiğinden, kaç bölümün vermal veya yarımküre bölümü olarak nitelendirilmesi ve aynı mikrofuge tüpünde birleştirilebilmesi sorun gidermek mümkündür. Bir diğer kritik adım da DCN'nin çıkarılmasıdır. Bazı durumlarda, bir parmağı 200 μl pipet ucunun üstüne bastırmak, doku delme ucunu çıkarmak için yeterli basınç değildir. Bu durumda, yumruğu iğne burun tokmaklarıyla çıkarmak ve yumruğu doğru tüpe yerleştirmek gerekecektir. Bu protokolün bir sonraki kritik adımı RNA ayıklamasıdır. Listelenen birimler maksimum RNA ekstraksiyonu için optimize edilmiş olsa da, RNA ekstraksiyon protokolündeki çözelti miktarlarını laboratuvarın bireysel ihtiyaçlarına uyacak şekilde ayarlamak da gerekebilir. Çalışmak için çok az doku olduğundan, son RNA ürününde fenol bulaşma olasılığı daha yüksektir. Bu, dokuyu homojenize etmek için kullanılan TRIzol miktarının ayarlanması ve homojenize dokunun iyice karıştırılmasının sağlanması ile yönetilebilir.
Bu protokolün sınırlamaları, DCN üç ayrı çekirdeğe (yanal, interpoze ve medial) ayrılırken, RNA çıkarmak için yeterli dokuya sahip olmak bir yana, bunların her birini 1 mm'lik bölümlerden görselleştirmek ve tekrar tekrar yumruklamak zordur. Bu sınırlama ile birlikte, en medial DCN'nin yarısı vermiste görünür; ancak, bu diseksiyon ile görselleştirmek ve tekrar tekrar parçalamak zordur. Protokol şu anda olduğu gibi, medial DCN ve kalan DCN'nin diğer yarısı parçalara ayrılırken. Ayrıca yarımkürelerde on ayrı vermal lobül ve sekiz lobül vardır, ancak bunların her birini ayrı ayrı ve tekrarlanabilir bir şekilde parçalamak zor olacaktır ve çok düşük RNA konsantrasyon verimine yol açacaktır. Bu yöntem, beyincik bölgelerine daha spesifik olarak damak mümkün olsa da, farklı anatomik bölgeleri, bireysel lobüller veya alt lobül birimleri seviyesindeki benzersiz değişiklikleri maskeleyen gruplar halinde birleştirir.
Sonuç olarak, bu yöntem serebellumun dört özel bölgesinin bölgesel moleküler farklılıkları aynı anda keşfetmesini mümkün kılar. Serebellumu bölgeye özgü olarak değerlendirerek, bu bölgeleri karakterize eden alttaki moleküler mekanizmaları ve gen ekspresyonunu birbirinden ayırmak mümkündür. Bu, farklı serebellar bölgelerin farklı davranışlarda oynadığı rolü daha da iyi anlayacak ve gelecekteki çalışmaların özellikle bir serebellar bölgeye odaklanmasına ve hastalık veya hedef tedavisindeki rolünü keşfetmesine izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Cvetanovic laboratuvarındaki Austin Ferro ve Juao-Guilherme Rosa'ya, diseksiyonların giderilmesinde ve RNA ekstraksiyonu ve RTqPCR'de yardımları için minnettarız. Bu araştırma M. Cvetanovic, R01 NS197387 tarafından finanse edilir; HHS | Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , Online Preprint (2020).
