Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Eindige element modellering van een cellulair elektrisch micromilieu

Published: May 18, 2021 doi: 10.3791/61928
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3
1Department of Materials, Faculty of Science and Engineering, The University of Manchester, 2Department of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, Faculty of Science and Engineering, The University of Manchester, 3The Henry Royce Institute, Royce Hub Building, The University of Manchester

Summary

Dit artikel presenteert een strategie voor het bouwen van eindige-elementenmodellen van vezelige geleidende materialen die zijn blootgesteld aan een elektrisch veld (EF). De modellen kunnen worden gebruikt om de elektrische input te schatten die cellen die in dergelijke materialen zijn gezaaid, te schatten en de impact te beoordelen van het veranderen van de materiaaleigenschappen, structuur of oriëntatie van de steiger.

Abstract

Klinische studies tonen aan dat elektrische stimulatie (ES) een mogelijke therapie is voor de genezing en regeneratie van verschillende weefsels. Inzicht in de mechanismen van celrespons bij blootstelling aan elektrische velden kan daarom de optimalisatie van klinische toepassingen begeleiden. In vitro experimenten zijn bedoeld om die te helpen ontdekken, met het voordeel van bredere input- en outputbereiken die ethisch en effectief kunnen worden beoordeeld. De vooruitgang in in vitro experimenten is echter moeilijk direct te reproduceren in klinische omgevingen. Dat komt vooral omdat de in vitro gebruikte ES-apparaten aanzienlijk verschillen van de apparaten die geschikt zijn voor gebruik door de patiënt, en het pad van de elektroden naar de beoogde cellen anders is. Het vertalen van de in vitro resultaten naar in vivo procedures is daarom niet eenvoudig. We benadrukken dat de structuur en fysische eigenschappen van het cellulaire micromilieu een bepalende rol spelen in de daadwerkelijke experimentele testomstandigheden en suggereren dat metingen van ladingsverdeling kunnen worden gebruikt om de kloof tussen in vitro en in vivo te overbruggen. Gezien dit, laten we zien hoe in silico eindige element modellering (FEM) kan worden gebruikt om de cellulaire micro-omgeving en de veranderingen gegenereerd door blootstelling aan elektrisch veld (EF) te beschrijven. We benadrukken hoe de EF koppelt met geometrische structuur om de ladingsverdeling te bepalen. Vervolgens tonen we de impact van tijdsafhankelijke ingangen op laadbewegingen. Ten slotte tonen we de relevantie van onze nieuwe in silico-modelmethodologie aan de hand van twee casestudies: (i) in vitro vezelige Poly(3,4-ethyleenioxythiofeen) poly(styrenesulfonaat) (PEDOT-PSS) steigers en (ii) in vivo collageen in extracellulaire matrix (ECM).

Introduction

ES is het gebruik van ES's met als doel biologische cellen en weefsels te controleren. Het mechanisme is gebaseerd op de fysieke stimulus die naar de cel wordt overgedragen wanneer de biomoleculen erin en eromheen worden blootgesteld aan een extern gegenereerde spanningsgradiënt. Geladen deeltjes zijn bezig met een georganiseerde beweging die wordt beheerst door de wet van Coulomb en genereert sleepkrachten op de niet-geladen deeltjes. De resulterende vloeistofstroom en ladingsverdeling veranderen celactiviteiten en functies zoals adhesie, contractie, migratie, oriëntatie, differentiatie en proliferatie1 terwijl de cel zich probeert aan te passen aan de verandering in de micromilieuomstandigheden.

Aangezien ES controleerbaar, niet-invasief, niet-farmacologisch is en een effectieve impact heeft op essentieel celgedrag, is ES een waardevol hulpmiddel voor weefseltechnologie en regeneratieve geneeskunde. Het is met succes gebruikt om neurale2,skelet3,hartspier4,bot5 en huid6 ontwikkeling te begeleiden. Bovendien, aangezien het iontoforese7verbetert, wordt het gebruikt als een alternatieve of aanvullende behandeling voor conventionele farmacologische. De efficiëntie ervan in pijnbestrijding wordt nog steeds besproken omdat klinische proeven van hogere kwaliteit worden verwacht8,9,10. Niettemin werden geen nadelige effecten gemeld en kan het het welzijn van patiënten verbeteren11,12,13,14,15.

Hoewel alleen klinische proeven een definitief oordeel kunnen geven over de werkzaamheid van een procedure, zijn in vitro en in silico-modellen nodig om het ontwerp van voorspelbare ES-behandeling te informeren, omdat ze een sterkere controle bieden over een breder scala aan experimentele omstandigheden. De onderzochte klinische toepassingen van ES zijn botregeneratie16,17,herstel van gedenervateerde spieren18,19,axonale regeneratie na operatie20,21,pijnverlichting22,wondgenezing23,24,25 en iontoforetische medicijnafgifte26. Om ES-apparaten op grote schaal te introduceren op alle mogelijke doeltoepassingen, moeten klinische proeven nog sterker bewijs voor een efficiënte behandeling vaststellen. Zelfs in domeinen waar zowel in vivo dier- als menselijke studies consequent positieve resultaten rapporteren, het grote aantal gerapporteerde methoden in combinatie met te weinig richtlijnen over hoe ze kunnen kiezen en hoge aanschafprijzen, weerhoudt clinici ervan om te investeren in ES-apparaten27. Om dit te verhelpen, kan het doelweefsel niet langer worden behandeld als een zwarte doos (limiet van in vivo experimenten), maar moet het worden gezien als een complexe synergie van meerdere subsystemen (figuur 1).

In de jaren 28 ,29, 30 , 31,32,33,34zijn in vitro meerdere ES-experimenten uitgevoerd . De meeste van deze kenmerken de ES alleen door de spanningsval tussen de elektroden gedeeld door de afstand ertussen - een ruwe benadering van de grootte van het elektrische veld. Het elektrische veld zelf beïnvloedt echter alleen geladen deeltjes, niet cellen direct. Wanneer er meerdere materialen tussen het apparaat en de cellen worden verdeeld, houdt de ruwe benadering mogelijk geen stand.

Een betere karakterisering van het ingangssignaal vereist een duidelijk beeld van hoe de stimulus naar de cel wordt overgedragen. De belangrijkste methoden voor het leveren van ES zijn directe, capacitieve en inductieve koppeling35,36. De voorzieningen voor elke methode verschillen per elektrodetype (staaf, schaafmachine of wikkeling) en plaatsing ten opzichte van het doelweefsel (in contact of geïsoleerd)35. Apparaten die in vivo worden gebruikt voor langere behandelingen moeten draagbaar zijn, dus de elektroden en meestal de energiebron worden geïmplanteerd of bevestigd aan de huid als wondverbanden of elektroactieve pleisters. De gegenereerde spanningsgradiënt verplaatst geladen deeltjes in het behandelingsgebied.

Omdat het de resulterende geladen deeltjesstroom in de buurt van de cellen beïnvloedt, is de steigerstructuur van het grootste belang bij het ontwerp van ES-protocollen. Er ontstaan verschillende laadtransportconfiguraties als het platformmateriaal, de synthesetechniek, de structuur of de oriëntatie ten opzichte van de spanningsgradiënt veranderen. In vivo wordt de beschikbaarheid en beweging van geladen deeltjes niet alleen beïnvloed door cellen, maar ook door het collageennetwerk en de interstitiële vloeistof die het ondersteunende ECM vormen. Ontworpen steigers worden steeds vaker gebruikt om natuurlijke celmicromilieus in vitro1,35beter na te bootsen . Tegelijkertijd is de ECM een complexe natuurlijke steiger.

Kunststeigers zijn gebaseerd op metalen, geleidende polymeren en koolstof, ontworpen met een focus op het balanceren van biocompatibiliteit met elektrochemische prestaties en stabiliteit op lange termijn36. Een veelzijdig steigertype is de elektrospun vezelige mat die een controleerbare nanoschaal topografie biedt. Dit kan worden ontworpen om op de ECM te lijken, dus vergelijkbare mechanische signalen leveren die de regeneratie van een breed scala aan weefsels helpen37. Om ES aanzienlijk te beïnvloeden, moeten de matten tot op zekere hoogte geleidend zijn. Geleidende polymeren zijn echter moeilijk te elektrospineren en mengen met isolerende dragers beperkt de geleidbaarheid van de resulterende vezels38. Een oplossing is het polymeriseren van een geleidend monomeer op het oppervlak van een diëlektrische vezel, wat resulteert in een goede mechanische sterkte en elektrische eigenschappen van het eindproduct38. Een voorbeeld is het coaten van zijden elektrospunvezels met de semi-geleidende PEDOT-PSS39. De combinatie van mechanische en elektromagnetische signalen versnelt de neurietgroeiaanzienlijk 40,41,42. Neurieten volgen steigervezels uitlijning, en verlengen meer na blootstelling aan een EF parallel aan de vezels dan aan een verticale43. Evenzo bevordert de uitlijning van vezelige steigers op de EF ook myogene rijping33.

Ecm is hoofdzakelijk samengesteld uit vezelig-vormende proteïnen44, van die collageen type I die het belangrijkste bestanddeel in alle dierlijke weefsels behalve kraakbeen (rijk aan collageentype II)44zijn. Tropocollagen (TC), drievoudige spiraalvormige conformatie van polypeptidestrengen, is het structurele motief van collageenfibrils45. Transmissie elektronenmicroscopie en atoomkrachtmicroscopie beelden van collageenfibrils tonen een D-periodiek gestreept patroon46 uitgelegd door het Hodge & Petruska model47 als regelmatige arrays van TC-hiaten en overlappingen45. Pezen bestaan uit een uitgelijnde collageenachtige fibrillaire matrix afgeschermd door een niet-collageenachtige zeer hydrofiele proteoglycan matrix48,49. Decorine is een kleine leucine-rijke proteoglycan (SLRP) in staat om de gap regio's van collageen fibrils te binden en verbinding te maken met andere spiegelreflexcamera's via hun glycosaminoglycan (GAG) zijketens49. Studies uitgevoerd op pezen tonen aan dat hun elektrische eigenschappen aanzienlijk veranderen wanneer gehydrateerd50,51, laadtransportmechanisme verandert van protonisch naar ionische naarmate het hydratatieniveau toeneemt51. Dit suggereert dat elektrische geleiding langs een collageen type I-fibril kan worden ingeschakeld door een Decorin-waterlaag, met gap- en overlapregio's met verschillende elektrische geleidingen en diëlektrische constanten.

Aangezien identieke recreatie van het ECM door kunstmatige steigers onwaarschijnlijk is, lijkt de kennis die synergie tussen in vivo en in vitro produceert, mogelijk gemaakt door vertaalbare resultaten, op een dood spoor te zitten. In silico-modellering maakt niet alleen vertaling tussen de twee opnieuw mogelijk, maar voegt het ook belangrijke voordelen toe bij het karakteriseren van de onbekende processen die betrokken zijn bij ES. Het vergelijken van de in vivo waarnemingen met de in vitro kan informatie opleveren over de koppelingssterkte tussen het doelweefsel en de rest van het organisme, maar legt geen actuele kennisgrenzen bloot. Het onbekende kan worden blootgelegd door het verschil te observeren tussen wat er naar verwachting zal gebeuren op basis van de huidige kennis en wat er gebeurt. In silico-experimenten op basis van wiskundige modellering kan het proces worden opgesplitst in bekende en onbekende subprocessen. Op deze manier komen verschijnselen aan het licht die niet in het model worden verantwoord wanneer in silico-voorspellingen worden vergeleken met in vitro en in vivo experimenten.

Het vormen en testen van hypothesen met betrekking tot het onderliggende mechanisme(s) van de manier waarop cellen en weefsels worden beïnvloed door elektrische velden wordt belemmerd door het grote aantal parameters52 dat afzonderlijk moet worden getest. Om representatieve experimentele omstandigheden te definiëren, moet het ES-proces worden opgesplitst in subprocessen (figuur 1) en moeten dominante ingangssignalen worden geïdentificeerd die het celgedrag beïnvloeden. Modellen die fundamentele fysische effecten van ES op cellen vertegenwoordigen, beschrijven het domein dat de EF koppelt aan de cel - dat van geladen deeltjes53. Het gedrag van deeltjes buiten de cel hangt af van de micro-omgeving en kan afzonderlijk van de cel worden onderzocht. Het dominante ingangssignaal voor de cel is de subset van ES-apparaatuitgangen die de grootste mate van variabiliteit in de celrespons veroorzaakt. De kleinste subset van de volledige experimentele parameters die variaties in alle dominante celingangssignalen kan genereren, kan worden gebruikt om de parameterruimtedimensie en het aantal testgevallen te verminderen.

De input van het biologische ES-doelmodel moet een subset zijn van de outputsignalen die door het ES-apparaat worden geproduceerd en die nuttig zijn bij het beschrijven van de fysieke effecten van ES op cellen. Een eenvoudige bioreactor met directe koppeling heeft dezelfde structuur als elektrolytische elektrochemische cellen. Modellen daarvan tonen de primaire (rekening houdend met oplossingsweerstand), secundaire (ook rekening houdend met faradische reacties) of tertiaire (ook rekening houdend met ionendiffusie) stroomdichtheidsverdeling. Omdat complexiteit zich vertaalt in computationele kosten, is het eenvoudigste model het meest geschikt voor parameterruimteverkenningen. Simulaties van vezelige composieten gemotiveerd door materiaaleigenschappen54 richten zich op bulkmateriaaleigenschappen als gevolg van complexe microarchitectuur, waardoor lokale effecten van EF-blootstelling niet kunnen worden beschreven. Bestaande in silico-modellen, gemotiveerd door ES, richten zich op het biologische monster, of het nu gaat om een enkele cel ondergedompeld in een homogeen medium55,56,57, of complexe weefsels met homogene extracellulaire ruimte58. Lading en stroomdichtheid (figuur 2) kunnen fungeren als interfacesignalen tussen modellen van het ES-apparaat en het biologische monster, of tussen verschillende componenten van het ES-apparaat. Het voorgestelde FEM-gebaseerde protocol maakt gebruik van de vergelijkingen beschreven in figuur 2 en werd gebruikt om te bestuderen hoe steigerafhankelijke parameters kunnen worden gebruikt om die twee signalen te moduleren, onafhankelijk van de EF die wordt gegenereerd door een directe koppelingsopstelling. De resultaten benadrukken dat het noodzakelijk is om rekening te houden met de elektrische eigenschappen van steigers of ECM's bij het onderzoeken van de invloed van ES op doelcellen.

Protocol

1. Bouw het model in COMSOL

  1. Open COMSOL en selecteer Leeg model.
  2. Parameters: Klik in Model Buildermet de rechtermuisknop op Globale definities, selecteer Parametersen voeg parameters toe volgens tabel 1.
  3. Materialen: Voeg materialen toe met eigenschappen volgens tabel 2.
    1. Klik in de modelbouwer onder Algemene definitiesmet de rechtermuisknop op Materiaal en selecteer Leeg materiaal.
    2. Materiaaleigenschappen toevoegen: Vouw in de instellingen van het nieuw toegevoegde materiaal materiaaleigenschappen uit > basiseigenschappen, selecteer Relatieve permittiviteit en druk op het symbool '+' om eigenschap toe te voegen. Herhaal de stap voor elektrische geleidbaarheid.
    3. Vul in de materiaalinhoudde huidige materiaaleigenschappen in volgens tabel 2.
  4. Componentdefinitie: Klik op het tabblad Start van het bovenste lint met de linkermuisknop op Component toevoegen en selecteer 3D. Er verschijnt een nieuw componentknooppunt in de Model Builder.
  5. Geometrie: Klik in de Model buildermet de rechtermuisknop op Geometrie, klik met de linkermuisknop , dubbelklik op het volledige model en selecteer de juiste volgorde (SC/SNC/RC/RNC/RNCd).
  6. U kunt de geometrie ook helemaal opnieuw bouwen volgens de onderliggende stappen.
    1. Klik in de Modelbouwermet de linkermuisknop op Geometrie onder het huidige componentknooppunt. Hetzelfde geometrieknooppunt wordt in de volgende onderliggende stappen verwezen. Wijzig in het venster Instellingen de lengte-eenheid in nm en zorg ervoor dat "Waarden schalen bij het wijzigen van eenheden" niet is aangevinkt.
    2. Geometrie van steiger
      1. Klik in de Modelbouwermet de rechtermuisknop op Geometrie en selecteer Blokkeren.
      2. Vul op het tabblad Instellingen het label "Steigerbereiken" in.
      3. Vouw Grootte en vorm uit en vul "Ws", "Ls", "Hs" in voor Breedte, Diepte en Hoogte.
      4. Vouw Positie uit en wijzig de basis in Centreren.
      5. Vouw Selecties van resulterende entiteiten uit,selecteer Nieuw en voeg "Steigerselectie" toe.
    3. Omvang van omringende stof: Klik in de modelbouweronder Geometriemet de rechtermuisknop op Steigerbereiken en selecteer Duplicerenen bewerk het tabblad Instellingen.
      1. Wijzig het label in "Mediabereiken".
      2. Voeg aan elk vak in de sectie Grootte en Sheenpe "med_ratio *" toe vóór de bestaande parameter.
      3. Voeg in de selecties van resulterende entiteitennieuwe selectie toe als 'Mediaselectie'.
    4. Geometrie van een vezel (SC ga naar 1.6.6)
      1. Core (RC naar 1.6.4.2)
        1. Klik in de modelbouwermet de rechtermuisknop op Geometrie, selecteer Cilinderen bewerk het tabblad Instellingen als volgt.
        2. Wijzig het label in "Core".
        3. Vouw grootte en vorm uit en vul "Rc" en "Lf" in voor radius en hoogte.
        4. Vouw Positie uit en vul "-excess*Ws/2" en "-Lf/2" in voor x en y.
        5. Vouw As uit en wijzig Astype in y-as.
        6. Vouw selecties van resulterende entiteiten uit en voeg "Kernselectie" toe.
      2. Vacht (SNC gaat over naar 1.6.5)
        1. Plaat (RC of RNC gaan naar 1.6.4.2.2; RNCd overslaan naar 1.6.4.2.3)
          1. Klik in de modelbouwer onder Geometriemet de rechtermuisknop op Steigerbereiken en selecteer Dupliceren. Zorg ervoor dat het duplicaat (Scaffold extents 1) direct na Core in de geometrievolgorde komt.
          2. Wijzig op het tabblad Instellingen het label in "Coat".
          3. Vouw op het tabblad Instellingen selecties van resulterende entiteiten uit en maak "Vezelselectie".
          4. Ga naar 1.6.5.
        2. Homogene
          1. Klik in de modelbouwer met de rechtermuisknop op Geometrie, selecteer Cilinder en bewerk het tabblad Instellingen als volgt.
          2. Verander het label in "Coat".
          3. Vouw Grootte en vorm uit en vul "Rf" en "Lf" in voor Radius en Hoogte.
          4. Vouw Positie uit en vul "-excess*Ws/2" en "-Lf/2" in voor x en y.
          5. Vouw as uit en wijzig astype in y-as (RC gaat naar 1.6.4.2.2.7).
          6. Vouw Lagenuit, vul "Rf-Rc" in voor Dikte en laat alleen "Lagen aan de zijkant" aangevinkt.
          7. Vouw selecties van resulterende entiteiten uit en voeg "Coat Selection" of, voor RC, "Fiber Selection" toe (RC gaat naar 1.6.5).
          8. Klik in de modelbouwermet de rechtermuisknop op Geometrie en selecteer Entiteiten verwijderen.
          9. Wijzig geometrisch instapniveau op domein op het tabblad Instellingen en kies Jasselectie voor selectie.
          10. Verwijder alle domeinen behalve domein 3 uit het selectievak (de kern van de gelaagde cilinder).
          11. Vouw Selecties van resulterende entiteiten uit en selecteer Jasselectie.
          12. Ga naar 1.6.5.
        3. Periodieke matrix van twee typen
          1. Klik in de modelbouwermet de rechtermuisknop op Geometrie en selecteer Cilinder. Klik met de rechtermuisknop op het nieuw gemaakte element en selecteer Dupliceren. Bewerk het tabblad Instellingen als volgt.
            1. Stel Label in op "Coat 1" / "Coat 2".
            2. Stel de straal in op Rf.
            3. Stel de hoogte in op "D*prop"/"D*(1-prop)".
            4. Breid de positie uit en vul "-excess*Ws/2" in voor zowel op x als "-Lf/2"/"-Lf/2+D*prop" op y.
            5. Vouw as uit en wijzig astype in y-as.
            6. Vouw de sectie Lagen uit en vul "Rf-Rc" in; Zorg ervoor dat alleen het vakje "Lagen aan de zijkant" is ingeschakeld.
            7. Vouw selecties van resulterende entiteiten uit en maak "Coat 1 Selection"/ "Coat 2 Selection".
          2. Klik in de modelbouwermet de rechtermuisknop op Geometrie en selecteer Entiteiten verwijderen.
            1. Wijzig op het tabblad Instellingen geometrisch ingangsniveau in Domein en selecteer cilinder 2 (cyl2) en cilinder 3 (cyl3) in het grafische venster.
            2. Verwijder alle domeinen behalve domein 3 uit het selectievak (de kern van de gelaagde cilinders).
            3. Vouw selecties van resulterende entiteiten uit en maak coatselectie.
          3. Klik in de modelbouwermet de rechtermuisknop op Geometrie, vouw Transformeert uit en selecteer Array. Het tabblad Instellingen als volgt bewerken.
            1. Selecteer "Coat Selection" voor invoerobjecten.
            2. Stel matrixtype in op Lineair.
            3. Stel Grootte in op "Lf/D".
            4. Stel Verplaatsing op y-as in op "D".
    5. Geometrie van een georiënteerde vezelarray
      1. Core Array (RC naar 1.6.5.2)
        1. Klik in de Modelbouwermet de rechtermuisknop op Geometrie, Vouw transformaties uit en selecteer Roteren.
          1. Schakel op het tabblad Instellingen de invoerobjecten Switch in en selecteer Kernselectie in de vervolgkeuzelijst. Zorg ervoor dat het selectievakje Invoerobjecten behouden niet is ingeschakeld.
          2. Vouw rotatiehoek uit en vul "theta" in voor rotatie.
          3. Vouw selecties van resulterende entiteiten uit en maak "Vezelselectie".
        2. Klik in de modelbouwer met de rechtermuisknop op Geometrie, Vouw transformaties uit en selecteer Matrix.
          1. Wijzig het label in "Core Array".
          2. Selecteer Kernselectie in de vervolgkeuzelijst voor invoerobjecten.
          3. Vouw Grootteuit, wijzig Matrixtype in Lineair en vul "n_1*(theta<=45) +n_2*(theta>45)" in voor Grootte.
          4. Vouw Verplaatsing uit en vul "2*tes*Rc*cos(theta)", "2*tes*Rc*sin(theta)" in voor x en y.
          5. Vouw selecties van resulterende entiteiten uit en selecteer "Vezelselectie".
      2. Coat Array (SNC gaat naar 1.6.5.3)
        1. Klik in de Modelbouwermet de rechtermuisknop op Geometrie, Vouw transformaties uit en selecteer Roteren.
          1. Schakel op het tabblad Instellingen de invoerobjecten Schakelen in en selecteer Coat Selection in de vervolgkeuzelijst. Zorg ervoor dat "Vak Invoerobjecten behouden" niet is ingeschakeld.
          2. Vouw rotatiehoek uit en vul "theta" in voor rotatie.
          3. Vouw selecties van resulterende entiteiten uit en selecteer "Vezelselectie".
        2. Klik in de Modelbouwermet de rechtermuisknop op Geometrie, Vouw transformaties uit en selecteer Matrix.
          1. Wijzig het label in "Coat Array".
          2. Selecteer Coat Selection in de vervolgkeuzelijst voor invoerobjecten.
          3. Vouw Grootteuit, wijzig Matrixtype in Lineair en vul "n_1*(theta<=45) +n_2*(theta>45)" in voor Grootte.
          4. Vouw Verplaatsing uit en vul "2*tes*Rc*cos(theta)", "2*tes*Rc*sin(theta)" in voor x en y.
          5. Vouw selecties van resulterende entiteiten uit en selecteer "Vezelselectie".
      3. Snijsteiger
        1. Vezels verenigen: Klik in de modelbouwer met de rechtermuisknop op Geometrie, Vouw Booleans en partities uit en selecteer Union.
          1. Wijzig het label in "Vezels".
          2. Schakel de schakelaar Invoerobjecten in en selecteer Vezelselectie in de vervolgkeuzelijst.
          3. Zorg ervoor dat het vakje Invoerobjecten behouden niet is ingeschakeld.
          4. Zorg ervoor dat "Binnengrenzen behouden" is gecontroleerd.
          5. Vouw selecties van resulterende entiteiten uit en selecteer Steigerselectie in de vervolgkeuzelijst.
        2. Knippen uitvoeren: Klik in de modelbouwer met de rechtermuisknop op Geometrie, vouw Booleans en partities uit en selecteer Snijpunt.
          1. Wijzig het label in "Scaffold".
          2. Schakel de schakelaar Invoerobjecten in en selecteer Steigerselectie in de vervolgkeuzelijst.
          3. Zorg ervoor dat het vakje Invoerobjecten behouden niet is ingeschakeld.
          4. Zorg ervoor dat "Binnengrenzen behouden" is gecontroleerd.
    6. Ensemble Geometrie
      1. Definieer de omringende stofgeometrie.
        1. Klik in de modelbouwermet de rechtermuisknop op Geometrie, vouw Booleans en partities uit en selecteer Verschil. Ga verder naar het tabblad Instellingen.
        2. Selecteer Mediaselectiein de vervolgkeuzelijst Objecten om toe te voegen .
        3. Selecteer Steigerselectiein de vervolgkeuzelijst Objecten die u wilt aftrekken .
        4. Zorg ervoor dat de vakken "Invoerobjecten behouden" en "Binnengrenzen behouden" beide zijn aangevinkt.
      2. Het vak Mediabereiken verwijderen.
        1. Klik in de Modelbouwermet de rechtermuisknop op Geometrie en selecteer Entiteiten verwijderen. Ga verder naar het tabblad Instellingen.
        2. Selecteer Domein in de vervolgkeuzelijst Geometrisch instapniveau.
        3. Selecteer Mediaselectie in de vervolgkeuzelijst Selectie.
        4. Verwijder "dif1" uit het selectievak.
    7. Geometrie bouwen
      1. Controleer onder het knooppunt Geometrie of het laatste element vóór het knooppunt Cumulatieve selecties Form Union is en niet Form Assembly. Klik indien nodig met de rechtermuisknop op Formulierassemblage en wijzig Actie in "Een samenvoeging vormen" op het tabblad Instellingen.
      2. Klik in de modelbouwermet de linkermuisknop op Geometrie en selecteer Alles bouwen.
  7. Materiaal
    1. Klik in de modelbouwer onder het knooppunt Huidig onderdeel met de rechtermuisknop op Materialen en selecteer Materiaalkoppeling.
    2. Herhaal sectie vijf keer voor zo vaak als veel materialen worden beschouwd op basis van het complexiteitsniveau.
    3. Koppel materialen voor elk onderdeel in de volgende volgorde: omringende substantie, lagen, kernen.
    4. Kies op het tabblad Instellingen media/steiger (voor SC, SNC, RC)/Coat/Core-selectie in de vervolgkeuzelijst Selectie.
    5. Vouw de koppelingsinstellingen uit en kies het juiste materiaal in de vervolgkeuzelijst.
  8. Meshen
    1. Klik in de Model Buildermet de linkermuisknop op het meshknooppunt onder het huidige onderdeel.
    2. Selecteer normaal op het tabblad Instellingen in de vervolgkeuzelijst Elementgrootte en klik met de linkermuisknop op Alles bouwen.
  9. Natuurkunde: Klik in de Modelbouwermet de linkermuisknop op huidige component, selecteer Natuurkunde toevoegen, vouw de AC/DC-module uit op het tabblad Natuurkunde toevoegen, selecteer de module Elektrische stromen (ec) en klik op Toevoegen aan component.
    1. Randvoorwaarden: Selecteer op het tabblad Afbeeldingen de xy-weergave.
      1. Grond: Klik in de Modelbouwermet de rechtermuisknop op het knooppunt Elektrische stromen en selecteer Grond.
      2. Zorg ervoor dat de selectieschakelaar voor de grensselectie actief is en klik met de linkermuisknop op het hoogste omringende stofvlak evenwijdig aan het xz-vlak om grens 5 toe te voegen in het vak Grensselectie.
      3. Terminal: Klik in de Model Buildermet de rechtermuisknop op het knooppunt Elektrische stromen en selecteer Terminal.
      4. Zorg ervoor dat de selectieschakelaar voor de grensselectie actief is en klik met de linkermuisknop op het laagste omringende stofvlak evenwijdig aan het xz-vlak om grens 2 toe te voegen in het vak Grensselectie.
      5. Vouw de sectie Terminal uit en selecteer Spanning in de vervolgkeuzelijst Terminaltype; vul V0 in voor Voltage.
    2. Voeg indien nodig complexiteit toe: Sla de huidige component op en ga terug naar stap 1.4 om een ander complexiteitspad te volgen (SC/SNC/RC/RNC/RNCd).

2. Voer simulatie uit

  1. Adaptieve mesh verfijning
    1. Klik in Model Buildermet de linkermuisknop op het hoofdknooppunt van het model en selecteer Studie toevoegen om het tabblad Studie toevoegen te openen, selecteer Stationaire studie en klik met de rechtermuisknop op de knop Studie toevoegen.
    2. Maak een studiestap voor elk gemaakt onderdeel: klik onder Studieknooppunt met de rechtermuisknop op Stap1: Stationaire studie en selecteer Dupliceren.
    3. Wijzig voor elke studiestap het tabblad Instellingen met de details van het bijbehorende onderdeel.
      1. Fysica- en variabelenselectie uitbreiden; laat in de kolom Oplossen voor alleen het huidige onderdeel ingeschakeld.
      2. Vouw studie-extensies uit en vink adaptieve mesh-verfijning aan.
      3. Selecteer de geometrie van de huidige component in de vervolgkeuzelijst naast Aanpassing in geometrie.
    4. Klik in Model Builder met de rechtermuisknop op Studie 1 en selecteer Berekenen. Dit genereert aangepaste mazen voor de geometrieën van alle componenten met hun huidige oriëntatiehoek.
  2. Stel de oriëntatiehoek in en voer een stationair onderzoek uit.
    1. Klik in Model Builderonder Globale definitiesmet de linkermuisknop op Parameters en wijzig parameter theta in de gewenste vezeloriëntatiehoek voor simulatie.
    2. Klik voor elk onderdeel in de Modelbouwer op het knooppunt van het onderdeel met de rechtermuisknop op Geometrie en selecteer Alles bouwen.
    3. Klik in Model Buildermet de rechtermuisknop op de adaptieve mesh-verfijningsstudie en selecteer berekenen.
    4. Klik in Model Builder met de linkermuisknop op het hoofdknooppunt van het model en selecteer Studie toevoegen om het tabblad Studie toevoegen te openen, selecteer Stationaire studie en klik met de rechtermuisknop op de knop Studie toevoegen.
    5. Klik in Model Builderonder de nieuw toegevoegde studie met de linkermuisknop op Stap 1, vouw meshselectie uit en selecteer voor elk onderdeel de meshes die zijn gegenereerd in de adaptieve mesh-verfijningsstudie.
    6. Klik met de rechtermuisknop op de knop Berekenen.
  3. Stel de oriëntatiehoek, het ingangssignaal in en voer tijdsafhankelijk onderzoek uit.
    1. Klik in Model Builderonder Globale definitiesmet de linkermuisknop op Parameters en wijzig parameter theta in de gewenste vezeloriëntatiehoek voor simulatie.
    2. Klik in de Model Buildermet de linkermuisknop op het hoofdknooppunt van het model en selecteer Studie toevoegen om het tabblad Studie toevoegen te openen. Selecteer Tijdafhankelijke studie, klik met de linkermuisknop Op studie toevoegen en bewerk het tabblad Instellingen als volgt.
      1. Stel Tijden in op "bereik(0, (2*pi/omega)/39,2*pi/omega)".
      2. Fysica- en variabelenselectie uitbreiden; laat alleen het selectievakje simulatiecomponent "Oplossen voor" ingeschakeld.
      3. Vouw meshselectie uit en selecteer een mesh voor de simulatiecomponent. Wijzig de mazen van de andere onderdelen in Geen mesh.
      4. Vouw studie-extensies uit en vink het selectievakje Adaptieve mesh-verfijning aan; selecteer de geometrie van de simulatiecomponent in de vervolgkeuzelijst.
    3. Definieer tijdafhankelijke grensvoorwaarde.
      1. Klik onder het huidige componentknooppunt met de rechtermuisknop op Definities en selecteer onder Functies Waveform.
      2. Wijzig op het tabblad Instellingen de functienaam in "Invoer".
      3. Vouw parametersuit, stel type in op Sinus, hoekfrequentie op "omega", amplitude op V0.
      4. Selecteer voor de simulatiecomponent onder het knooppunt Elektrische stromen de optie Terminal en wijzig spanning in "Input(t[1/s])".
    4. Klik met de rechtermuisknop op de knop Berekenen.

3. Analyse

  1. Laaddichtheid
    1. Klik in het knooppunt Modelbouwer met de rechtermuisknop op Resultaten, selecteer 3D-plotgroep en bewerk Instellingen.
      1. Wijzig het label in "Laaddichtheid".
      2. Vouw Gegevens uit en selecteer de parametrische studiegegevensset in de vervolgkeuzelijst Gegevensset.
      3. Vouw Kleurlegende uit en vink "Legenda's weergeven" en "Maximum- en minimumwaarden weergeven" aan.
    2. Klik met de rechtermuisknop op Laaddichtheid onder het knooppunt Resultaten in de Modelbouwer en selecteer Volume; ga verder met het tabblad Instellingen bewerken.
      1. Vouw Gegevens uit en selecteer 'Van bovenliggend' in de vervolgkeuzelijst Gegevensset.
      2. Vouw Expressie uit en vul "ec.rhoq" in het vak Expressie in.
      3. Vouw Bereik uit en schakel het selectievakje Handmatig kleurenbereik in.
        1. Stel het minimum in op "-0,03" en maximaal op "0,03".
      4. Kleur en stijl uitvouwen, kleuring instellen op kleurtabel, kleurtabel op golf, vak Legenda kleuren aanvinken, kleurbereik symmetriseren aanvinken.
      5. Klik met de rechtermuisknop op Volume in Modelbouwer en selecteer Filteren.
        1. Vul op het tabblad Instellingen "abs(ec.rhoq)>0.012" in de logische expressie voor opname in.
    3. Klik met de linkermuisknop om de resultaten in het grafische venster te visualiseren.
  2. Huidige dichtheid
    1. Klik in de modelbouwer met de rechtermuisknop op het knooppunt Resultaten, selecteer 3D-plotgroep en bewerk het tabblad Instellingen.
      1. Wijzig het label in "Huidige dichtheid".
      2. Vouw Gegevens uit en selecteer de parametrische studiegegevensset in de vervolgkeuzelijst Gegevensset.
      3. Vouw Kleurlegendeuit, vink "Legenda's weergeven" en "Maximum- en minimumwaarden weergeven" aan.
    2. Klik met de rechtermuisknop op Huidige dichtheid onder het knooppunt Resultaten in Modelbouwer en selecteer Pijlvolume; ga verder met het tabblad Instellingen bewerken.
      1. Vouw Gegevens uit en selecteer 'Van bovenliggend' in de vervolgkeuzelijst Gegevensset.
      2. Vouw Expressie uit en vul "ec. Jx", "ec. Jy", "ec. Jz" in de expressievakken voor respectievelijk de componenten x, y en z.
      3. Vouw de pijlpositionering uit en vul 20 in voor het aantal punten van alle coördinaten.
      4. Vouw Kleuren en stijluit, stel de lengte van de pijl in op Genormaliseerd, Pijlbasis op Centreren, controleer De factor schalen en stel deze in op 85.
      5. Klik met de rechtermuisknop op Pijlvolume in Modelbouwer en selecteer Kleurexpressie.
        1. Vul op het tabblad Instellingen "ec.normJ" in het vak Expressie in.
        2. Vouw Kleuren en stijluit, stel de kleurtabel in op Verkeer, vink De legenda van de kleur en Omgekeerde kleurentabel aan.
    3. Klik op de plotknop om de resultaten in het grafische venster te visualiseren.

Representative Results

Het voorgestelde model beschrijft kenmerken van een composietmat met parallelle vezels, ondergedompeld in een geleidende stof en blootgesteld aan een extern gegenereerde elektrische potentiaalgradiënt. Simulaties tonen aan dat het verantwoorden van de verschillende componenten van een steiger belangrijk is op microschaal en onderzoeken hoe verandering in uitlijningshoek (ingangssignaal) van de vezels naar de EF variabiliteit kan genereren in de stroom- en ladingsdichtheid (uitgangssignalen) in de buurt van de vezels.

Er worden vijf verschillende geometrische complexiteitsfasen gepresenteerd, die elk een effect hebben op het simulatieresultaat: gladde geleidende plaat (SC), gladde plaat met niet-geleidende ingebedde vezels (SNC), ruw geleidend composiet (RC), ruw composiet met niet-geleidende ingebedde vezels (RNC), ruw composiet met niet-geleidende ingebedde vezels en twee soorten periodieke coating (RNCd) (Figuur 3). In paragraaf 1.5 van het protocol worden de stappen voor het importeren van de geometrieën in een project weergegeven en in paragraaf 1.6 wordt stap voor stap uitgelegd hoe u deze kunt bouwen. De eerste twee modellen houden geen rekening met oppervlaktemorfologie. SC en RC houden geen rekening met de diëlektrische eigenschappen van de vezelkern. De RNC is het voorgestelde model voor nanofibrous kunststeigers, terwijl RNCd het voorgestelde model is voor een ECM-segment.

Minimalisering van de rekenkosten werd bereikt door de geometrie van het ES-apparaat te reduceren tot een modeleenheidvolume dat het micromilieu vertegenwoordigt. Hoewel de breedte en lengte van een ES-apparaat en steiger gemakkelijk in de orde van enkele centimeters kunnen liggen, is de diameter van de vezels meestal lager dan een micron. Hier gebruiken we een steigersnede vergelijkbaar met de vezeldiameter om de rekenkosten veroorzaakt door de beeldverhouding te verminderen en het effect van de vezelachtige aard van de steiger op het elektrische micromilieu te benadrukken. De rest van het ES-apparaat wordt vervangen door gekozen elektrische randvoorwaarden, zodat een ruwe benadering voor de grootte van het elektrische veld 100 V/m is, een vaak gerapporteerde stimulatieparameter. Bovendien wordt aangenomen dat een eenheidsvolume met vijf parallelle vezels - zoals gebruikt in simulaties, gepresenteerd in figuur 3 - representatief is voor een hele planaire vezelige mat. Drie soorten vezels kunnen worden onderscheiden in een 1D-array: binnen centraal (met het longitudinale symmetrievlak van de steiger die ze in tweeën splitst), binnenvergankelijk (met zijdelings oppervlak omgeven door andere vezels, maar met asymmetrische zijkanten) en exterieur (aan de rand van de steiger). Vijf is het minimum aantal vezels dat nodig is om alle drie de gedefinieerde typen op te nemen.

De grootte van het modelmaaselement vereist speciale aandacht omdat het de simulatieresultaten kan beïnvloeden en dus geen belangrijke effecten kan blootleggen (figuur 4). Dit is een algemene regel van de eindige elementenmethode en een implicatie van de nyquist-Shannon bemonsteringsstelling. Hoe sneller de essentiële simulatiesignalen fluctueren in de ruimte, hoe kleiner de mesh-elementen moeten zijn om een loyale weergave van het fenomeen te produceren. Aan de andere kant, hoe kleiner het element, hoe groter het totale aantal modelbouwstenen en de rekenkosten. De in punt 2.1 vastgestelde adaptieve mesh-verfijning is een goede en facile methode om die tegengestelde doelstellingen in evenwicht te brengen door de elementgrootte alleen te verkleinen wanneer en zolang deze bewerking een significante verandering teweegbrengt.

Een te simplistisch model kan belangrijke effecten niet hebben(figuur 5,6). Simulaties tonen aan dat het verantwoorden van oppervlaktemorfologie en elektrische eigenschappen van steigercomponenten niet overbodig is bij het voorspellen van elektrische micromilieus. Hoewel oppervlaktemorfologie een directe invloed heeft op de stationaire EF (vergelijk SC en SNC met RC, RNC en RNCd), toont een vergelijking tussen RC- en RNC-voorspellingen aan dat niet-geleidende vezelkernen dit effect versterken. Vanuit het oogpunt van het modelleren van cellulaire elektrische micromilieus op nanofibroussteigers zijn de SC-, SNC- en RC-modellen dus suboptimaal. Het is echter een goede gewoonte om stapsgewijs complexiteit toe te voegen, aangezien vergelijkingen tussen de verschillende fasen helpen aangeven welke kenmerken tot specifieke effecten leiden.

Modelcomplexiteit beïnvloedt stroom- en ladingsdichtheidsverandering met vezeluitlijning op de EF. Het voorgestelde protocol helpt het effect te benadrukken (figuur 5,6). Hoewel het SC-model geen variatie in de voorgestelde statistieken vertoont wanneer de uitlijning met de elektrische potentiaalgradiënt wordt gewijzigd, voorspellen de RNC-modelsimulaties een krachtig contrast tussen de mateenheid met vezels uitgelijnd op de EF en die met loodrechte vezels (figuur 7). Wanneer de niet-geleidende kernen de stroom in de weg staan, vormen ze periodieke dammen die leiden tot afwisselende gebieden met een hoge en lage ladingsdichtheid.

Dynamische ES-regimes kunnen worden gesimuleerd met tijdsafhankelijke studies. Video's in aanvullende bestanden tonen voorspellingen gemaakt voor een sinusvormige ingangsspanning op een volledig kunstmatig steigermodel (RNC), met vezels parallel of loodrecht op de elektrische potentiaalgradiënt. Kleine stromen langs de vezels loodrecht op de EF verschijnen wanneer de lading van de steiger wordt vrijgegeven naarmate de EF-magnitude afneemt. Dit toont aan dat stimulatie niet alleen kan optreden terwijl de externe EF aanwezig is, maar ook direct nadat deze is losgekoppeld - Zie aanvullende bestanden voor video's.

Figure 1
Figuur 1: Hiërarchisch blokdiagram van modellering - voordelen en beperkingen van modellering met in vivo en in silico-modellen. Blokkleurmarkeringen blokken op hetzelfde hiërarchische niveau. Lagere rangblokken zijn opgenomen in hogere rangblokken. Blokslagkleurmarkeringen kunnen het blok in een bepaald type model opnemen - koppeling met andere systeemblokken hebben geen geel in hun slag, omdat het geen componenten zijn voor in vitro modellen. Kogels werken als kleppen en betekenen de bestuurbaarheid van het blok. Wanneer een klep is ingeschakeld, kan het signaal door alle pijlpaden in de ondergeschikte subsystemen gaan die de kleur van de klep in hun slag hebben. Interpretatie van het diagram: het ES-proces bestaat uit het stimulatieapparaat en het biologische doel, elk met verschillende onderling verbonden deterministische of stochastische subprocessen die niet in vivo of in vitro kunnen worden gescheiden, dus ze hebben geen rode of gele klep. Stochastische processen grijpen ook in op de interface tussen het simulatieapparaat en het biologische monster wanneer ze beide worden gestimuleerd. Een in vitro model ontkoppelt het systeem van belang (d.w.z. huidsegment) van de rest van het organisme. Zo kunnen alleen intrinsieke processen van het systeem van belang worden waargenomen die worden aangevuld door stochastische processen van verschillende aard. De verschillende intrinsieke processen kunnen echter niet afzonderlijk worden gestimuleerd en geïdentificeerd. De in silico-modellen zijn parametrisch voor bekende componenten - hun gedrag zal naar verwachting van een bepaalde vorm zijn - en niet-parametrisch voor het onbekende - omdat er geen mechanistische reden is om geloofwaardigheid te geven aan een bepaalde extrapolatie. Alle in silico componenten kunnen afzonderlijk of in verschillende combinaties worden gesimuleerd, waardoor de weergave van verschillende hypothesen mogelijk is. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: (A) Wet van Coulomb (B) Elektrisch potentiaalveld en mobiele sondelading (C) Elektrische stroom (D) Laaddichtheid (E) Stroomdichtheid (F) Vergelijking van continuïteit (G) Wet op het behoud van ladingen. (A) Elektrisch geladen stationaire deeltjes q en Q werken elektrostatisch samen door de kracht van Coulomb Equation 1 . (B1) Elk geladen deeltje Q genereert een scalair veld dat elektrisch potentieel wordt genoemd op alle posities Equation 2 in de ruimte: Equation 3 . Het maximale werk dat nodig is om een ander geladen deeltje q uit zijn positie te Equation 4 verplaatsen, is het product tussen de lading q en het elektrische potentiaal dat door Q op positie wordt gegenereerd Equation 4 . Het elektrische potentiaalveld dat door meerdere deeltjes wordt gegenereerd, is de som van de velden die door elk afzonderlijk deeltje worden gegenereerd. (B2) Een stationair gebied met vaste generatordeeltjes q en Q, handelt met a Equation 5 op een sondedeeltje met positieve lading qp. Als reactie hierop beweegt qp om het elektrische potentieel van zijn positie te minimaliseren. Om de beweging van qpte beschrijven , kan men Equation 5 en het elektrische veld afleiden uit het elektrische Equation 6 potentiaalveld: Equation 7 . (C) Meerdere mobiele positief geladen sondedeeltjes die gelijkmatig vrijkomen in een stilstaand elektrisch veld volgen een georganiseerde beweging. Om de ladingsconfiguratie te volgen zonder elk deeltje te volgen, kan men op elk moment specificeren: (D) hoe de ruimte wordt ingenomen door deeltjes, waarbij een ladingsdichtheid wordt toegewezen Equation 8 aan elk infinitesimaal volume, volgens de wet van Gauss, en (E) hoe deeltjes door de grensoppervlakken tussen naburige infinitesimale volumes gaan, waarbij een stroomdichtheid aan elke grens wordt toegewezen volgens de Equation 9 wet van Ohm. (F) Lading en stroomdichtheid evolueren co-afhankelijk volgens de vergelijking van continuïteit, aangezien niet-uniforme deeltjesverplaatsing leidt tot accumulatie of verlies van deeltjes in een bepaald volume. (G) Binnen een geïsoleerd systeem prevaleert de wet inzake het behoud van lading en is er geen in- of uitstroom van geladen deeltjes. Gebruikte notaties:- q,Q,qp lading en naam van het geladen deeltje; Equation 10 - Euclidische norm van de positievector; k - Coulomb's constante; Equation 11 - verloopoperator, εa - absolute permittiviteit van het medium; σ - geleidbaarheid van medium. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Vijf verschillende niveaus van complexiteit voor een vezelige mat. SC- glad met geleidende ingebedde vezels, het eenvoudigste model, geen rekening houdend met oppervlaktemorfologie of verschillende eigenschappen van de samenstellende componenten; SNC- glad met niet-geleidende ingebedde vezels; RC- ruw met geleidende ingebedde vezels, goed voor oppervlaktemorfologie, maar niet voor verschillende componenteigenschappen; RNC- ruw met niet-geleidende ingebedde vezels, volledig voorgesteld model van nanofibrous kunstmatige steigers; RNCd- ruw met niet-geleidende ingebedde vezels bedekt met twee verschillende materialen, volledig voorgesteld model voor een vel collageenvezels. Gebruikte lengte-eenheid: nanometers. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Voorbeeldresultaten van de adaptieve mesh verfijning en de resulterende ladingsdichtheid na de simulatie. (Links) Automatisch gegenereerd gaas met extra grove tetraëdrische elementen; (Rechts) Initiële mesh adaptief verfijnd tijdens stationair onderzoek; kleinere elementen zijn nodig voor een nauwkeurig resultaat in de gebieden waar gesimuleerde signalen abrupte ruimtelijke veranderingen hebben. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Vezeluitlijningshoek naar elektrische potentiële gradiënt beïnvloedt de EF-sterkte in omringende celkweekmedia wanneer voldoende complexiteit wordt verantwoord. SC, SNC, RC, RNC en RNCd zijn de verschillende niveaus van complexiteit voor het vezelige matmodel in figuur 3. Verticale as markeert de uitlijningshoek van de vezels ten opzichte van de elektrische potentiaalgradiënt. Abstracte elektroden gekenmerkt - onderkant met hoog elektrisch potentieel en bovenkant met laag elektrisch potentieel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Vezeluitlijningshoek naar elektrische potentiële gradiënt beïnvloedt de ruimteladingsdichtheid in omringende celkweekmedia wanneer voldoende complexiteit wordt verantwoord. SC, SNC, RC, RNC en RNCd zijn de verschillende niveaus van complexiteit voor het vezelige matmodel in figuur 3. Verticale as markeert de uitlijningshoek van de vezels ten opzichte van de elektrische potentiaalgradiënt. Abstracte elektroden gekenmerkt-onderkant met hoog elektrisch potentieel en bovenkant met laag elektrisch potentieel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Laadbeweging wordt beïnvloed door steigervezeluitlijning ten opzichte van de EF. Beide panelen illustreren steady state RNC-modelvoorspellingen. Aan de linkerkant zijn de vezels evenwijdig aan de EF, terwijl ze aan de rechterkant loodrecht staan. Het lichtrode tot blauwe kleurvolume markeert de laaddichtheid, terwijl het pijlvolume de huidige dichtheidsoriëntatie markeert. De kleur van de pijlen komt overeen met de huidige dichtheidsnorm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Naam Uitdrukking Beschrijving
Ws 10 * Rc * med_ratio Steigerbreedte
Ls 10 * Rc * med_ratio Steigerlengte
Hs 2* Rf Steigerhoogte
med_ratio 1.5 Verhouding celkweekmedia tot steiger
Rc 278,5[nm] De kernradius van de vezel
r 1.5 Vezelkern-vachtverhouding
Rf Rc*r Vezel met vachtradius
thèta 90[deg] Vezel oriëntatie hoek
Lf 1.3*(Ls*cos(theta)+Ws*zonde(theta)) Vezellengte
Tes 1 Verhouding vezelkernradius tot afstand tussen vezels
n_1 2*(fix((Ws/(2*cos(theta))-Rf)/(2*tes*Rc))+3)*(cos(theta)!=0)+1*(cos(theta)==0) Maximum aantal vezels als theta<=45
n_2 2*(fix((Ls/(2*sin(theta))-Rf)/(2*tes*Rc))+3)*(sin(theta)!=0)+1*(sin(theta)==0) Maximum aantal vezels als theta>45
overmaat 1.2+0.3*abs (zonde(2*theta)) Eerste vezel relatieve offset van steiger
D Lf/5 De periodiciteit van de laag
steun 0.46 Lengte van de eerste laag ten opzichte van periodiciteit D
E 100[mV/mm] Elektrische gebiedsgrootte
V0 E*Ls*med_ratio Eindspanning
omega 500[Hz] Tijdsafhankelijke studie Spanningsfrequentie
p_sigma 0.5 Tweede coating relatieve geleidbaarheid
p_eps 1.5 Tweede coating relatieve diëlektrische constante

Tabel 1: Parameters die worden gebruikt voor simulatie

Cultuur Media PEDOT: PSS 1 PEDOT: PSS 2 Collageen Gehydrateerd 1 Collageen Gehydrateerd 2 Zijde Fibroïne Collageen Droog
Elektrische geleidbaarheid (S/m) 1.7014 1.00E-01 p_sigma * 0,1 2.00E-05 p_sigma * 2e-5 1.00E-08 2.50E-08
Relatieve permittiviteit 80.1 2.2 p_eps * 2,2 9.89 p_eps * 9,89 7.81E+00 4.97

Tabel 2: Materiaaleigenschappen gebruikt in simulatie

Aanvullende bestanden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het voorgestelde protocol stelt een uniforme modelleringsoplossing voor natuurlijke en kunstmatige steigers voor en benadrukt de noodzaak om de nanostructuur van vezelige steigers in overweging te nemen bij het inspecteren van de effecten van EF op cellen die op dergelijke materialen worden gezaaid. Hoewel een grove benadering van de EF-intensiteit (elektrodepotentiaalverschil gedeeld door de afstand tussen de elektroden) ons ertoe zou brengen een veldsterkte van 100 mV/mm te verwachten, voorspellen simulaties stationaire veldsterktes tot 30% hoger in verschillende gebieden van de mat (Figuur 5). Dit resultaat moet van belang zijn voor het ontwerp van ES-experimenten en de interpretatie van gegevens, aangezien celdood kan worden veroorzaakt door te sterke EFs. Het blootstellen van de elektrische micro-omgeving zou een directe correlatie tussen ES en cellulaire ontwikkeling mogelijk maken. Hoewel verschillende studies een gedetailleerde morfologische analyse van de gebruikte steigers33,43,59presenteren, onderzoeken ze niet het samenspel tussen de structuur, elektrische eigenschappen van de materialen en de EF. Dit protocol kan deze koppeling mogelijk maken, omdat parameters zoals vezelradius, laagdikte, afstand tussen vezels en elektrische eigenschappen van de componentmaterialen kunnen worden gewijzigd volgens elk experiment door de globale definities in stap 1.2 en 1.3 te wijzigen. Daarom kunnen aangepaste 3D-ruimtelijk opgeloste ladings- en stroomdichtheidsvoorspellingen worden gemaakt voor zowel statische als dynamische ES-regimes.

Steigerontwerpoptimalisatie kan worden gericht via de RNC- en RNCd-modellen met verkenningen met een breed parameterbereik, waarbij de voorgestelde morfologieën of delen ervan worden geschaald. Als alternatief kunnen andere steigerconfiguraties worden onderzocht met het voorgestelde protocol door de arraytypen in sectie 1.6.5 van lineair naar driedimensionaal te wijzigen en steigergeometrie aan te passen in punt 1.6.2. Steigeroptimalisatie kan echter niet zonder doelstelling. Terwijl voor weefseltechniek de belangrijkste focus het lot van cellen is, is een duidelijker beeld van welke stimuli de belangrijkste determinanten zijn essentieel als de betrouwbare controle ervan gewenst is. Lading en stroomdichtheid zijn goede descriptoren van cellulaire elektrische micromilieus, omdat ze het samenspel laten zien tussen de EF en de elektrische eigenschappen van de verschillende componenten van complexe steigers zoals ECM. Het protocol laat zien hoe voorspellingen voor die statistieken kunnen worden berekend met een nanofibrous steigergeometrie en benadrukt het belang van de uitlijningshoek van de vezels met de EF. Voorspellingen van lading en stroomdichtheid kunnen dan worden gekoppeld aan cellulaire ontwikkeling en dus kunnen steiger- en ES-regimes vervolgens worden geoptimaliseerd voor specifieke taken.

Interessant is dat een studie aantoont dat ef-blootstelling mechanische stress meer dan verdubbelde in sterkte in samengestelde films met nanovezels loodrecht op de externe EF in vergelijking met films met parallelle uitlijning60. De gerapporteerde mechanische belasting kan het gevolg zijn van Coulomb-krachten die werken tussen geladen vezels, voorspeld door de ruwe modelsimulaties (RC, RNC, RNCd) (Figuur 6). Hoewel deze simulaties nuttig kunnen zijn bij het onderzoeken van deze hypothese, moet worden opgemerkt dat de gerapporteerde experimentele resultaten werden verkregen in een systeem met capacitieve koppeling en dat de simulatie directe koppeling presenteert.

Een beperkende factor voor toekomstig mogelijk gebruik van het protocol om een cellulair ingangssignaal te schatten, is parameteronzekerheid. Geometrische onzekere parameters zijn coatinglaagdikte en afstand tussen vezelkernen. De eerste kan worden afgeleid door de waarde te vinden die leidt tot een bulkimpedantie die experimenteel kan worden gevalideerd. De tweede kan worden geëxtraheerd uit materiaalscans met hoge resolutie. Parameters die de fysische eigenschappen van de materialen beschrijven, worden ook beïnvloed door onzekerheid. De elektrische geleidbaarheid en diëlektrische constante van voorbeeldige materialen verschillen echter veel meer dan experimentele meetprecisie (tabel 2). Daarom zouden de gerapporteerde effecten ondanks matige meetfouten worden gehandhaafd.

De resultaten laten zien hoe onvoldoende modelcomplexiteit relevante informatie kan verbergen. Het is belangrijk om te erkennen dat het protocol een vereenvoudigde versie simuleert van het fysische fenomeen dat plaatsvindt, omdat het geen rekening houdt met de verschillende aard van materialen die betrokken zijn bij het proces - geleider (elektroden), halfgeleider (coating), diëlektrische (vezelkernen) en elektrolytische (omringende stof) - die het ladingstransport kunnen beïnvloeden. Dit probleem kan worden verantwoord in toekomstige modeluitbreidingen door energieoverdrachtsvertragingen toe te voegen op de interfaces (d.w.z. Faradische reacties) en ionentransportvertragingen binnen het elektrolyt. Het toevoegen van complexiteit moet echter worden geleid door experimentele validatie, omdat een eenvoudig model dat het grootste deel van wat wordt waargenomen, nuttiger is dan een opmerkelijk nauwkeurig model dat weinig meer informatie toevoegt, maar diep gevoelig is voor de onzekerheid van veel samenstellende parameters.

Aangezien het einddoel van weefseltechniek is om bioreactoren te creëren die niet alleen een of twee aspecten van in vivo omgevingen nabootsen, maar ook alle cellulaire ontwikkelingssignalen repliceren en controleren61,moeten elektromagnetische en mechanische in silico-modellen en modellen van warmteoverdracht tussen bioreactorcomponenten worden gecombineerd. In een volgende modelleringsfase kunnen ook koppelingsverschijnselen tussen die interacties zoals ohmse verwarming, elektrolytische vloeistofstroom, morfologische steigervervormingen als reactie op elektrischestimulatie 60 en piëzo-elektriciteit62 worden toegevoegd. Modellen mogen echter pas worden samengevoegd nadat ze experimenteel zijn gevalideerd. Op deze manier kunnen we een beter begrip krijgen van de invloed van elk onderdeel in de cellulaire micro-omgeving en hoe stimuli kunnen worden geoptimaliseerd.

Als het voorgestelde model experimenteel wordt gevalideerd, kan het worden gecombineerd met modellen van biologische cellen - figuur 1. Ladingsdichtheidspatronen en modulaties kunnen de activiteit van specifieke ionenpompen asymmetrisch beïnvloeden, de hechting aan de vezel van eiwitten beïnvloeden die de membraanadhesie63 aandrijven en dus migratie, proliferatiepatronen en morfogenesebegeleiden 64. Het verkennen van deze hypothesen is de weg vooruit in het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan weefsel- en celresponsen op ES.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het 4-jarige Wellcome Trust PhD Programme in Quantitative & Biophysical Biology

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Comsol multiphysics 5.2 AC/DC module COMSOL - FEM modelling software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, S., Mehta, A. S., Zhao, M. Biomedical applications of electrical stimulation. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (14), 2681-2699 (2020).
  2. Gordon, T. Electrical Stimulation to Enhance Axon Regeneration After Peripheral Nerve Injuries in Animal Models and Humans. Neurotherapeutics. 13 (2), 295-310 (2016).
  3. Pedrotty, D. M., et al. Engineering skeletal myoblasts: Roles of three-dimensional culture and electrical stimulation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 288, 1620-1626 (2005).
  4. Stoppel, W. L., Kaplan, D. L., Black, L. D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 135-155 (2016).
  5. Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  6. Du, S., et al. Bioinspired hybrid patches with self-adhesive hydrogel and piezoelectric nanogenerator for promoting skin wound healing. Nano Research. 13 (9), 2525-2533 (2020).
  7. Gratieri, T., Santer, V., Kalia, Y. N. Basic principles and current status of transcorneal and transscleral iontophoresis. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (9), 1091-1102 (2017).
  8. Kroeling, P., Gross, A., et al. Electrotherapy for neck pain. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2013 (8), (2013).
  9. Hurlow, A., et al. Transcutaneous electric nerve stimulation (TENS) for cancer pain in adults. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2012 (3), (2012).
  10. Claydon, L. S., Chesterton, L. S., Barlas, P., Sim, J. Dose-specific effects of transcutaneous electrical nerve stimulation (TENS) on experimental pain: A systematic review. Clinical Journal of Pain. 27 (7), 635-647 (2011).
  11. Sbruzzi, G., Silveira, S. A., Silva, D. V., Coronel, C. C., Plentz, R. D. M. Estimulação elétrica nervosa transcutânea no pós-operatório de cirurgia torácica: Revisão sistemática e metanálise de estudos randomizados. Brazilian Journal of Cardiovascular Surgery. 27 (1), 75-87 (2012).
  12. Jin, D. M., Xu, Y., Geng, D. F., Yan, T. b Effect of transcutaneous electrical nerve stimulation on symptomatic diabetic peripheral neuropathy: A meta-analysis of randomized controlled trials. Diabetes Research and Clinical Practice. 89 (1), 10-15 (2010).
  13. Bjordal, J. M., et al. Short-term efficacy of physical interventions in osteoarthritic knee pain. A systematic review and meta-analysis of randomised placebo-controlled trials. BMC Musculoskeletal Disorders. 8 (1), 51 (2007).
  14. Johnson, M., Martinson, M. Efficacy of electrical nerve stimulation for chronic musculoskeletal pain: A meta-analysis of randomized controlled trials. Pain. 130 (1-2), 157-165 (2007).
  15. Johnson, M. I. Transcutaneous Electrical Nerve Stimulation (TENS). eLS. , 1-13 (2012).
  16. Griffin, M., Bayat, A. Electrical stimulation in bone healing: critical analysis by evaluating levels of evidence. Eplasty. 11, (2011).
  17. Mollon, B., Da Silva, V., Busse, J. W., Einhorn, T. A., Bhandari, M. Electrical stimulation for long-bone fracture-healing: A meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 90 (11), 2322-2330 (2008).
  18. Eberstein, A., Eberstein, S. Electrical stimulation of denervated muscle: Is it worthwhile. Medicine and Science in Sports and Exercise. 28 (12), 1463-1469 (1996).
  19. Mödlin, M., et al. Electrical stimulation of denervated muscles: First results of a clinical study. Artificial Organs. 29 (3), 203-206 (2005).
  20. Gordon, T., Amirjani, N., Edwards, D. C., Chan, K. M. Brief post-surgical electrical stimulation accelerates axon regeneration and muscle reinnervation without affecting the functional measures in carpal tunnel syndrome patients. Experimental Neurology. 223 (1), 192-202 (2010).
  21. Chan, K. M., Curran, M. W. T., Gordon, T. The use of brief post-surgical low frequency electrical stimulation to enhance nerve regeneration in clinical practice. Journal of Physiology. 594 (13), 3553-3559 (2016).
  22. Vance, C. G. T., Dailey, D. L., Rakel, B. A., Sluka, K. A. Using TENS for pain control: the state of the evidence. Pain management. 4 (3), 197-209 (2014).
  23. Peters, E. J., Lavery, L. A., Armstrong, D. G., Fleischli, J. G. Electric stimulation as an adjunct to heal diabetic foot ulcers: A randomized clinical trial. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 82 (6), 721-725 (2001).
  24. Lundeberg, T. C. M., Eriksson, S. V., Malm, M. Electrical nerve stimulation improves healing of diabetic ulcers. Annals of Plastic Surgery. 29 (4), 328-331 (1992).
  25. Houghton, P. E., et al. Electrical Stimulation Therapy Increases Rate of Healing of Pressure Ulcers in Community-Dwelling People With Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 91 (5), 669-678 (2010).
  26. Bikbova, G., Bikbov, M. Standard corneal collagen crosslinking versus transepithelial iontophoresis-assisted corneal crosslinking, 24 months follow-up: randomized control trial. Acta Ophthalmologica. 94 (7), 600-606 (2016).
  27. Bhavsar, M. B., et al. Electrical stimulation-based bone fracture treatment, if it works so well why do not more surgeons use it. European Journal of Trauma and Emergency Surgery. 46 (2), 245-264 (2020).
  28. Erickson, C. A., Nuccitelli, R. Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields. Journal of Cell Biology. 98 (1), (1984).
  29. Hammerick, K. E., Longaker, M. T., Prinz, F. B. In vitro effects of direct current electric fields on adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 397 (1), 12-17 (2010).
  30. Shao, S., et al. Osteoblast function on electrically conductive electrospun PLA/MWCNTs nanofibers. Biomaterials. 32 (11), 2821-2833 (2011).
  31. Forciniti, L., Ybarra Iii, J., Zaman, M. H., Schmidt, C. E. Schwann cell response on polypyrrole substrates upon electrical stimulation. Acta Biomaterialia. , (2014).
  32. Kumar, A., Nune, K. C., Misra, R. D. K. Electric field-mediated growth of osteoblasts-the significant impact of dynamic flow of medium. Biomaterials Science. 4 (1), 136-144 (2016).
  33. Hyun Ko, U., et al. Promotion of Myogenic Maturation by Timely Application of Electric Field Along the Topographical Alignment. Tissue Engineering Part A. 24 (10), 752-760 (2018).
  34. Lynch, K., Skalli, O., Sabri, F. Growing Neural PC-12 Cell on Crosslinked Silica Aerogels Increases Neurite Extension in the Presence of an Electric Field. Journal of Functional Biomaterials. 9 (2), 30 (2018).
  35. Balint, R., Cassidy, N. J., Cartmell, S. H. Electrical stimulation: A novel tool for tissue engineering. Tissue Engineering - Part B: Reviews. 19 (1), 48-57 (2013).
  36. Chen, C., Bai, X., Ding, Y., Lee, I. S. Electrical stimulation as a novel tool for regulating cell behavior in tissue engineering. Biomaterials Research. 23 (1), (2019).
  37. Purushothaman, A. E., Thakur, K., Kandasubramanian, B. Development of highly porous, Electrostatic force assisted nanofiber fabrication for biological applications. International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials. 69 (8), 477-504 (2020).
  38. Yanılmaz, M., Sarac, A. S. A review: Effect of conductive polymers on the conductivities of electrospun mats. Textile Research Journal. 84 (12), 1325-1342 (2014).
  39. Tsukada, S., Nakashima, H., Torimitsu, K. Conductive polymer combined silk fiber bundle for bioelectrical signal recording. PLoS ONE. 7 (4), 33689 (2012).
  40. Nguyen, H. T., et al. Electric field stimulation through a biodegradable polypyrrole-co- polycaprolactone substrate enhances neural cell growth. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 102 (8), 2554-2564 (2014).
  41. Song, J., et al. Polymerizing pyrrole coated poly (l-lactic acid-co-ε-caprolactone) (PLCL) conductive nanofibrous conduit combined with electric stimulation for long-range peripheral nerve regeneration. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).
  42. Lee, J. Y., Bashur, C. A., Goldstein, A. S., Schmidt, C. E. Polypyrrole-coated electrospun PLGA nanofibers for neural tissue applications. Biomaterials. 30 (26), 4325-4335 (2009).
  43. Du, L., et al. Combined effects of electrospun nanofibrous scaffold and electrical field on the neuronal outgrowth. Materials Letters. 256, (2019).
  44. Theocharis, A. D., Skandalis, S. S., Gialeli, C., Karamanos, N. K. Extracellular matrix structure. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 4-27 (2016).
  45. Shoulders, M. D., Raines, R. T. Collagen structure and stability. Annual Review of Biochemistry. 78, 929-958 (2009).
  46. Fang, M., et al. Type i collagen D-spacing in fibril bundles of dermis, tendon, and bone: Bridging between nano- and micro-level tissue hierarchy. ACS Nano. 6 (11), 9503-9514 (2012).
  47. PETRUSKA, J. A., HODGE, A. J. a Subunit Model for the Tropocollagen Macromolecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica. 51 (5), 871-876 (1964).
  48. Kastelic, J., Galeski, A., Baer, E. The multicomposite structure of tendon. Connective Tissue Research. 6 (1), 11-23 (1978).
  49. Thorpe, C. T., Birch, H. L., Clegg, P. D., Screen, H. R. C. The role of the non-collagenous matrix in tendon function. International Journal of Experimental Pathology. 94 (4), 248-259 (2013).
  50. Chapman, G. E., McLauchlan, K. A. The hydration structure of collagen. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 173 (31), 223-234 (1969).
  51. Bardelmeyer, G. H. Electrical conduction in hydrated collagen. I. Conductivity mechanisms. Biopolymers. 12 (10), 2289-2302 (1973).
  52. Budde, K., et al. Requirements for Documenting Electrical Cell Stimulation Experiments for Replicability and Numerical Modeling. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 1082-1088 (2019).
  53. Zhao, S., Mehta, A. S., Zhao, M. Biomedical applications of electrical stimulation. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (14), 2681-2699 (2020).
  54. Zhang, T., Yi, Y. B. Monte Carlo simulations of effective electrical conductivity in short-fiber composites. Journal of Applied Physics. 103 (1), 14910 (2008).
  55. Meny, I., Burais, N., Buret, F., Nicolas, L. Finite element modeling of cell exposed to harmonic and transient electric fields. 12th Biennial IEEE Conference on Electromagnetic Field Computation, CEFC 2006. 43 (4), 310 (2006).
  56. Schoenbach, K. H., et al. Ultrashort electrical pulses open a new gateway into biological cells. Proceedings of the IEEE. 92 (7), 1122-1136 (2004).
  57. Gowrishankar, T. R., Smith, K. C., Weaver, J. C. Transport-based biophysical system models of cells for quantitatively describing responses to electric fields. Proceedings of the IEEE. 101 (2), 505-517 (2013).
  58. Pietak, A., Levin, M. Exploring instructive physiological signaling with the bioelectric tissue simulation engine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).
  59. Babaie, A., et al. Synergistic effects of conductive PVA/PEDOT electrospun scaffolds and electrical stimulation for more effective neural tissue engineering. European Polymer Journal. 140, 110051 (2020).
  60. Zhou, J., Fukawa, T., Kimura, M. Directional electromechanical properties of PEDOT/PSS films containing aligned electrospun nanofibers. Polymer Journal. 43 (10), 849-854 (2011).
  61. Castro, N., et al. Physically Active Bioreactors for Tissue Engineering Applications. Advanced Biosystems. 4 (10), 1-29 (2020).
  62. Ribeiro, S., Gomes, A. C., Etxebarria, I., Lanceros-Méndez, S., Ribeiro, C. Electroactive biomaterial surface engineering effects on muscle cells differentiation. Materials Science and Engineering. , (2018).
  63. Marzocchi, M., et al. Physical and Electrochemical Properties of PEDOT:PSS as a Tool for Controlling Cell Growth. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (32), 17993-18003 (2015).
  64. Leronni, A., Bardella, L., Dorfmann, L., Pietak, A., Levin, M. On the coupling of mechanics with bioelectricity and its role in morphogenesis. Journal of the Royal Society Interface. 17 (167), 20200177 (2020).

Tags

Bioengineering Elektrische stimulatie Eindige elementen modelleren Computationele modellering Geleidende steiger Collageen fibril Extracellulaire matrix Experiment ontwerp
Eindige element modellering van een cellulair elektrisch micromilieu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Verdes, M., Disney, C., Phamornnak,… More

Verdes, M., Disney, C., Phamornnak, C., Margetts, L., Cartmell, S. Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment. J. Vis. Exp. (171), e61928, doi:10.3791/61928 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter