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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Modelado de elementos finitos de un microambiente eléctrico celular

Published: May 18, 2021 doi: 10.3791/61928
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3
1Department of Materials, Faculty of Science and Engineering, The University of Manchester, 2Department of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, Faculty of Science and Engineering, The University of Manchester, 3The Henry Royce Institute, Royce Hub Building, The University of Manchester

Summary

Este artículo presenta una estrategia para construir modelos de elementos finitos de materiales conductores fibrosos expuestos a un campo eléctrico (EF). Los modelos se pueden utilizar para estimar la entrada eléctrica que reciben las células sembradas en dichos materiales y evaluar el impacto de cambiar las propiedades, la estructura o la orientación del material constituyente del andamio.

Abstract

Los estudios clínicos muestran que la estimulación eléctrica (ES) es una terapia potencial para la curación y regeneración de varios tejidos. Por lo tanto, comprender los mecanismos de respuesta celular cuando se expone a campos eléctricos puede guiar la optimización de las aplicaciones clínicas. Los experimentos in vitro tienen como objetivo ayudar a descubrirlos, ofreciendo la ventaja de rangos de entrada y salida más amplios que pueden evaluarse de manera ética y efectiva. Sin embargo, los avances en experimentos in vitro son difíciles de reproducir directamente en entornos clínicos. Principalmente, esto se debe a que los dispositivos ES utilizados in vitro difieren significativamente de los adecuados para el uso del paciente, y la ruta desde los electrodos hasta las células objetivo es diferente. Por lo tanto, traducir los resultados in vitro en procedimientos in vivo no es sencillo. Enfatizamos que la estructura y las propiedades físicas del microambiente celular juegan un papel determinante en las condiciones reales de prueba experimental y sugerimos que las medidas de distribución de carga se pueden usar para cerrar la brecha entre in vitro e in vivo. Teniendo en cuenta esto, mostramos cómo el modelado de elementos finitos in silico (FEM) se puede utilizar para describir el microambiente celular y los cambios generados por la exposición al campo eléctrico (EF). Destacamos cómo el EF se acopta con la estructura geométrica para determinar la distribución de la carga. Luego mostramos el impacto de las entradas dependientes del tiempo en el movimiento de carga. Finalmente, demostramos la relevancia de nuestra nueva metodología de modelo in silico utilizando dos estudios de caso: (i) andamios fibrosos in vitro de poli(3,4-etilendioxitiofeno) poli(estirenosulfonato) (PEDOT-PSS) fibrosos e (ii) colágeno in vivo en matriz extracelular (ECM).

Introduction

ES es el uso de EF con el objetivo de controlar las células y tejidos biológicos. Su mecanismo se basa en el estímulo físico transducido a la célula cuando las biomoléculas dentro y alrededor de ella están expuestas a un gradiente de voltaje generado externamente. Las partículas cargadas están involucradas en un movimiento organizado gobernado por la ley de Coulomb, generando fuerzas de arrastre sobre las partículas no cargadas. El flujo de fluido resultante y la distribución de carga alteran las actividades y funciones celulares como la adhesión, la contracción, la migración, la orientación, la diferenciación y la proliferación1 a medida que la célula intenta adaptarse al cambio en las condiciones microambientales.

Como los EF son controlables, no invasivos, no farmacológicos y han demostrado tener un impacto efectivo en el comportamiento celular esencial, la ES es una herramienta valiosa para la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa. Se ha utilizado con éxito para guiar el desarrollo neural2,esquelético3,músculo cardíaco4,hueso5 y piel6. Además, como potencia la iontoforesis7,se utiliza como tratamiento alternativo o complementario a los farmacológicos convencionales. Su eficacia en el manejo del dolor aún se debate ya que se esperan ensayos clínicos de mayor calidad8,9,10. Sin embargo, no se informaron efectos adversos y tiene el potencial de mejorar el bienestar del paciente11,12,13,14,15.

Si bien solo los ensayos clínicos pueden dar un veredicto definitivo sobre la eficacia de un procedimiento, se requieren modelos in vitro e in silico para informar el diseño de un tratamiento predecible de LA CE, ya que ofrecen un control más fuerte sobre una gama más amplia de condiciones experimentales. Los usos clínicos investigados de la ES son la regeneración ósea16,17,la recuperación de los músculos denervados18,19,la regeneración axonal después de la cirugía20,21,el alivio del dolor22,la cicatrización de heridas23,24,25 y la administración de fármacos iontoforéticos26. Para que los dispositivos ES se introduzcan ampliamente en todas las aplicaciones objetivo posibles, los ensayos clínicos aún no han establecido pruebas más sólidas para un tratamiento eficiente. Incluso en dominios donde tanto los estudios in vivo en animales como en humanos informan consistentemente resultados positivos, el gran número de métodos reportados junto con muy poca orientación sobre cómo elegir entre ellos y el alto precio de adquisición disuade a los médicos de invertir en dispositivos ES27. Para superar esto, el tejido objetivo ya no puede tratarse como una caja negra (límite de experimentos in vivo), sino que debe verse como una sinergia compleja de múltiples subsistemas(Figura 1).

Múltiples experimentos DE ES se han llevado a cabo in vitro a lo largo de los años28,29,30,31,32,33,34. La mayoría de estos solo caracterizan el ES a través de la caída de voltaje entre los electrodos dividida por la distancia entre ellos, una aproximación aproximada de la magnitud del campo eléctrico. Sin embargo, el campo eléctrico en sí solo influye directamente en las partículas cargadas, no en las células. Además, cuando se interponen múltiples materiales entre el dispositivo y las celdas, la aproximación aproximada puede no mantenerse.

Una mejor caracterización de la señal de entrada requiere una visión clara de cómo se transduce el estímulo a la célula. Los principales métodos de entrega de ES son el acoplamiento directo, capacitivo e inductivo35,36. Los dispositivos para cada método difieren según el tipo de electrodo (varilla, plano o devanado) y la colocación en relación con el tejido objetivo (en contacto o aislado)35. Los dispositivos utilizados in vivo para tratamientos más largos deben ser portátiles, por lo tanto, los electrodos y la mayoría de las veces la fuente de energía se implantan o se adhieren a la piel como apósitos para heridas o parches electroactivos. El gradiente de voltaje generado desplaza las partículas cargadas en el área de tratamiento.

A medida que afecta el flujo de partículas cargadas resultante en las cercanías de las células, la estructura del andamio es de suma importancia en el diseño de los protocolos ES. Diferentes configuraciones de transporte de carga surgen si el material de la plataforma, la técnica de síntesis, la estructura o la orientación en relación con el gradiente de voltaje cambian. In vivo, la disponibilidad y el movimiento de las partículas cargadas se ven afectados no solo por las células, sino también por la red de colágeno y el líquido intersticial que compone la ECM de soporte. Los andamios de ingeniería se utilizan cada vez más para recrear mejor los microambientes celulares naturales in vitro1,35. Al mismo tiempo, el ECM es un andamio natural complejo.

Los andamios artificiales se basan en metales, polímeros conductores y carbono, diseñados con un enfoque en equilibrar la biocompatibilidad con el rendimiento electroquímico y la estabilidad a largo plazo36. Un tipo de andamio versátil es la estera fibrosa electrospun que ofrece una topografía a nanoescala controlable. Esto puede diseñarse para parecerse al ECM, entregando así señales mecánicas similares que ayudan a la regeneración de una amplia gama de tejidos37. Para impactar significativamente en la ES, las alfombras deben ser conductoras hasta cierto punto. Sin embargo, los polímeros conductores son difíciles de electroespin y la mezcla con portadores aislantes limita la conductividad de las fibras resultantes38. Una solución es polimerizar un monómero conductor en la superficie de una fibra dieléctrica, lo que resulta en una buena resistencia mecánica y propiedades eléctricas del producto final38. Un ejemplo es el recubrimiento de fibras electrospun de seda con el semiconductivo PEDOT-PSS39. La combinación de señales mecánicas y electromagnéticas acelera significativamente el crecimiento deneuritas 40,41,42. Las neuritas siguen la alineación de las fibras de los andamios, y se alargan más después de la exposición a una EF paralela a las fibras que a una vertical43. Del mismo modo, la alineación de los andamios fibrosos con la FE también promueve la maduración miogénica33.

La ECM está compuesta principalmente por proteínas formadoras de fibrosos44, siendode las que el colágeno tipo I es el principal constituyente en todos los tejidos animales aparte del cartílago (rico en colágeno tipo II)44. Tropocolágeno (TC), triple conformación helicoidal de hebras polipeptídicas, es el motivo estructural de las fibrillas de colágeno45. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión y microscopía de fuerza atómica de fibrillas de colágeno muestran un patrón de bandas D-periódicas46 explicado por el modelo47 de Hodge & Petruska como matrices regulares de brechas y superposiciones de TC45. Los tendones están compuestos por una matriz fibrilar colágena alineada protegida por una matriz proteoglica no colágena altamente hidrofílica48,49. La decorina es un pequeño proteoglicano rico en leucina (SLRP) capaz de unir las regiones de brecha de las fibrillas de colágeno y conectarse con otras SLRP a través de sus cadenas laterales de glicosaminoglicano (GAG)49. Los estudios realizados en tendones muestran que sus propiedades eléctricas cambian significativamente cuando sehidratan 50,51,el mecanismo de transporte de carga cambia de ónico a iónico a medida que aumenta el nivel de hidratación51. Esto sugiere que la conducción eléctrica a lo largo de una fibrilla de colágeno tipo I podría ser habilitada por una capa de agua de decorina, con regiones de brecha y superposición que tienen diferentes conductividades eléctricas y constantes dieléctricas.

Como la recreación idéntica de la ECM por andamios artificiales es improbable, el conocimiento que produce sinergia entre in vivo e in vitro habilitado por resultados traducibles parece estar en un callejón sin salida. El modelado in silico no solo vuelve a permitir la traducción entre los dos, sino que también agrega importantes beneficios al caracterizar los procesos desconocidos involucrados en ES. La comparación de las observaciones in vivo con las in vitro puede aportar información sobre la fuerza de acoplamiento entre el tejido diana y el resto del organismo, pero no descubre los límites de conocimiento actuales. Lo desconocido puede ser expuesto observando la diferencia entre lo que se espera que suceda en base al conocimiento actual y lo que sucede. Los experimentos in silico basados en modelos matemáticos permiten dividir el proceso en subprocesos conocidos y desconocidos. De esta manera, los fenómenos no contabilizados en el modelo salen a la luz cuando las predicciones in silico se comparan con experimentos in vitro e in vivo.

La formación y prueba de hipótesis con respecto a los mecanismos subyacentes de cómo las células y los tejidos se ven afectados por los campos eléctricos se ve obstaculizada por la gran cantidad de parámetros52 que deben probarse por separado. Para definir condiciones experimentales representativas, el proceso ES debe dividirse en subprocesos(Figura 1)y se deben identificar las señales de entrada dominantes que afectan el comportamiento celular. Los modelos que representan los efectos físicos fundamentales de la ES en las células describen el dominio que acopla la EF con la célula: el de las partículas cargadas53. El comportamiento de las partículas externas a la célula depende del microambiente y se puede investigar por separado de la célula. La señal de entrada dominante para la célula es el subconjunto de salidas del dispositivo ES que causa el mayor grado de variabilidad en la respuesta de la célula. El subconjunto más pequeño de los parámetros experimentales completos que pueden generar variaciones en todas las señales de entrada de la celda dominante se puede utilizar para disminuir la dimensión del espacio de parámetros y el número de casos de prueba.

La entrada del modelo objetivo biológico de ES debe ser un subconjunto de las señales de salida producidas por el dispositivo ES que sean útiles para describir los efectos físicos de ES en las células. Un biorreactor simple con acoplamiento directo tiene la misma estructura que las celdas electroquímicas electrolíticas. Los modelos de estos muestran la distribución de densidad de corriente primaria (teniendo en cuenta la resistencia de la solución), secundaria (que también tiene en cuenta las reacciones farádicas) o terciaria (que también tiene en cuenta la difusión de iones). Como la complejidad se traduce en costo computacional, el modelo más simple es el más adecuado para las exploraciones espaciales de parámetros. Las simulaciones de compuestos fibrosos motivados por las propiedades del material54 se centran en las propiedades de los materiales a granel como resultado de una microarquictura compleja, por lo que no pueden describir los efectos locales de la exposición a la EF. Los modelos in silico existentes, motivados por LA ES, se centran en la muestra biológica, ya sea una sola célula inmersa en un medio homogéneo55,56,57,o tejidos complejos con espacio extracelular homogéneo58. La carga y la densidad de corriente(Figura 2)pueden actuar como señales de interfaz entre los modelos del dispositivo ES y la muestra biológica, o entre diferentes componentes del dispositivo ES. El protocolo basado en FEM propuesto utiliza las ecuaciones descritas en la Figura 2 y se utilizó para estudiar cómo se pueden utilizar los parámetros dependientes del andamio para modular esas dos señales, independientemente de la EF generada por una configuración de acoplamiento directo. Los resultados enfatizan que es necesario tener en cuenta las propiedades eléctricas del andamio o ECM al investigar cómo la ES afecta a las células objetivo.

Protocol

1. Construye el modelo en COMSOL

  1. Abra COMSOL y seleccione Modelo en blanco.
  2. Parámetros: En Model Builder,haga clic con el botón derecho en Definiciones globales,seleccione Parámetrosy agregue parámetros de acuerdo con la Tabla 1.
  3. Materiales: Añadir materiales con propiedades según la Tabla 2.
    1. En el Generador de modelos, en Definiciones globales, haga clic con el botón secundario en Material y seleccione Material en blanco.
    2. Agregar propiedades de material: en la configuración del material recién agregado, expanda Propiedades de material > Propiedades básicas,seleccione Permitividad relativa y presione el símbolo '+' para agregar propiedad. Repita el paso para Conductividad eléctrica.
    3. En el Contenido del material,rellene las propiedades actuales del material de acuerdo con la Tabla 2.
  4. Definición de componente: En la pestaña Inicio de la cinta superior, haga clic con el botón izquierdo en Agregar componente y seleccione 3D. Aparecerá un nuevo nodo de componente en el Generador de modelos.
  5. Geometría: En el Generador de modelos,haga clic con el botón derecho en Geometría,haga clic con el botón izquierdo en insertar,haga doble clic en el Modelo completo y seleccione la secuencia adecuada (SC/SNC/RC/RNC/RNCd).
  6. Alternativamente, construya la geometría desde cero siguiendo los pasos subordinados.
    1. En el Generador de modelos, haga clic con el botón izquierdo en Geometría en el nodo componente actual. El mismo nodo de geometría se hará referencia en los siguientes pasos subordinados. En la ventana Configuración, cambie la unidad Longitud a nm y asegúrese de que "Valores de escala al cambiar unidades" no esté marcado.
    2. Geometría del andamio
      1. En el Constructor de modelos,haga clic con el botón derecho en Geometría y seleccione Bloquear.
      2. En la pestaña Configuración, rellene la etiqueta "Extensiones de andamio".
      3. Expanda Tamaño y Forma y rellene "Ws", "Ls", "Hs" para Ancho, Profundidad y Altura.
      4. Expanda Posición y cambie la Base a Central.
      5. Expanda Selecciones de entidades resultantes,seleccione Nuevo y agregue "Selección de andamios".
    3. Extensiones de la sustancia circundante: en el Generador de modelos,en Geometría, haga clic con el botón derecho en Extensiones de andamio y seleccione Duplicary edite la pestaña Configuración.
      1. Cambie la etiqueta a "Extensiones de medios".
      2. A cada cuadro de la sección Tamaño y Shape, agregue "med_ratio *" antes del parámetro existente.
      3. En selecciones de entidades resultantes,agregue Nueva selección como "Selección de medios".
    4. Geometría de una fibra (salto SC a 1.6.6)
      1. Núcleo (salto RC a 1.6.4.2)
        1. En el Generador de modelos, haga clic con el botón secundario en Geometría, seleccione Cilindroy edite la ficha Configuración de la siguiente manera.
        2. Cambie la etiqueta a "Core".
        3. Expanda Tamaño y forma y rellene "Rc" y "Lf" para Radio y Altura.
        4. Expanda Posición y rellene "-excess*Ws/2" y "-Lf/2" para x e y.
        5. Expanda Eje y cambie el tipo de eje a eje y.
        6. Expanda Selecciones de entidades resultantes y agregue "Selección principal".
      2. Abrigo (salto SNC a 1.6.5)
        1. Losa (RC o RNC salto a 1.6.4.2.2; RNCd saltar a 1.6.4.2.3)
          1. En el Generador de modelos, en Geometría, haga clic con el botón secundario en Extensiones de andamio y seleccione Duplicar. Asegúrese de que el duplicado (extensiones de andamio 1) viene justo después de Core en la secuencia de geometría.
          2. En la pestaña Configuración, cambie la etiqueta a "Abrigo".
          3. En la pestaña Configuración, expanda Selecciones de entidades resultantes y cree "Selección de fibra".
          4. Saltar a 1.6.5.
        2. Homogénea
          1. En el Constructor de modelos, haga clic con el botón derecho en Geometría,seleccione Cilindro y edite su ficha Configuración de la siguiente manera.
          2. Cambie la etiqueta a "Abrigo".
          3. Expanda Tamaño y forma y rellene "Rf" y "Lf" para Radio y Altura.
          4. Expanda Posición y rellene "-excess*Ws/2" y "-Lf/2" para x e y.
          5. Expanda Eje y cambie el tipo de eje a eje y (salto RC a 1.6.4.2.2.7).
          6. Expanda Capas,rellene "Rf-Rc" para Espesor y deje solo marcada la opción "Capas laterales".
          7. Expanda Selecciones de entidades resultantes y agregue "Selección de capa" o, para RC, "Selección de fibra" (RC saltar a 1.6.5).
          8. En el Generador de modelos, haga clic con el botón secundario en Geometría y seleccione Eliminar entidades.
          9. En la pestaña Configuración, cambie Nivel de entrada geométrico a Dominio y elija Selección de capa para Selección.
          10. Elimine todos los dominios excepto el dominio 3 del cuadro de selección (el núcleo del cilindro en capas).
          11. Expanda Selecciones de entidades resultantes y seleccione Selección de capa.
          12. Saltar a 1.6.5.
        3. Matriz periódica de dos tipos
          1. En el Generador de modelos, haga clic con el botón derecho en Geometría y seleccione Cilindro. Haga clic con el botón derecho en el elemento recién creado y seleccione Duplicar. Edite su pestaña Configuración de la siguiente manera.
            1. Establezca la etiqueta en "Coat 1" / "Coat 2".
            2. Establezca el radio en Rf.
            3. Establezca la altura en "D*prop"/"D*(1-prop)".
            4. Expanda la posición y rellene "-excess*Ws/2" tanto para x como para "-Lf/2"/"-Lf/2+D*prop" en y.
            5. Expanda Eje y cambie el tipo de eje a eje y.
            6. Expanda la sección Capas y rellene "Rf-Rc"; Asegúrese de que solo esté marcada la casilla "Capas laterales".
            7. Expanda Selecciones de entidades resultantes y cree "Selección de coat 1"/ "Selección de capa 2".
          2. En el Generador de modelos, haga clic con el botón secundario en Geometría y seleccione Eliminar entidades.
            1. En la pestaña Configuración, cambie Nivel de entrada geométrico a Dominio y seleccione el cilindro 2 (cyl2) y el cilindro 3 (cyl3) en la ventana gráfica.
            2. Elimine todos los dominios excepto el dominio 3 del cuadro de selección (el núcleo de los cilindros en capas).
            3. Expanda Selecciones de entidades resultantes y cree Selección de capa.
          3. En el Generador de modelos, haga clic con el botón secundario en Geometría, expanda Transformaciones y seleccione Matriz. Edite la pestaña Configuración de la siguiente manera.
            1. Seleccione "Selección de capa" para los objetos de entrada.
            2. Establezca tipo de matriz en Lineal.
            3. Establezca el tamaño en "Lf/D".
            4. Establezca Desplazamiento en el eje y en "D".
    5. Geometría de una matriz de fibras orientadas
      1. Arreglo de discos de núcleo (salto RC a 1.6.5.2)
        1. En el Generador de modelos, haga clic con el botón secundario en Geometría, Expanda transformaciones y seleccione Rotar.
          1. En la pestaña Configuración, active el conmutador de objetos de entrada y seleccione Selección de núcleo en la lista desplegable. Asegúrese de que la casilla Mantener objetos de entrada no esté marcada.
          2. Expanda Ángulo de rotación y rellene "theta" para Rotación.
          3. Expanda Selecciones de entidades resultantes y cree "Selección de fibra".
        2. En el Generador de modelos, haga clic con el botón secundario en Geometría, Expanda transformaciones y seleccione Matriz.
          1. Cambie la etiqueta a "Core Array".
          2. Seleccione Selección de núcleo en la lista desplegable de objetos de entrada.
          3. Expanda Tamaño, cambie tipo de matriz a Lineal y rellene "n_1*(theta<=45) +n_2*(theta>45)" para Tamaño.
          4. Expanda Desplazamiento y rellene "2*tes*Rc*cos(theta)", "2*tes*Rc*sin(theta)" para x e y.
          5. Expanda Selecciones de entidades resultantes y seleccione "Selección de fibra".
      2. Matriz de capas (salto SNC a 1.6.5.3)
        1. En el Generador de modelos, haga clic con el botón secundario en Geometría, Expanda transformaciones y seleccione Rotar.
          1. En la pestaña Configuración, active el interruptor de objetos de entrada y seleccione Selección de capa en la lista desplegable. Asegúrese de que la casilla "Mantener objetos de entrada" no esté marcada.
          2. Expanda Ángulo de rotación y rellene "theta" para Rotación.
          3. Expanda Selecciones de entidades resultantes y seleccione "Selección de fibra".
        2. En el Generador de modelos, haga clic con el botón secundario en Geometría , Expanda transformaciones y seleccione Matriz.
          1. Cambie la etiqueta a "Coat Array".
          2. Seleccione Selección de capa en la lista desplegable de objetos de entrada.
          3. Expanda Tamaño, cambie tipo de matriz a Lineal y rellene "n_1*(theta<=45) +n_2*(theta>45)" para Tamaño.
          4. Expanda Desplazamiento y rellene "2*tes*Rc*cos(theta)", "2*tes*Rc*sin(theta)" para x e y.
          5. Expanda Selecciones de entidades resultantes y seleccione "Selección de fibra".
      3. Andamio cortado
        1. Unir fibras: En el Constructor de modelos, haga clic con el botón derecho en Geometría, Expanda Booleanos y particiones y seleccione Unión.
          1. Cambie la etiqueta a "Fibras".
          2. Active el interruptor de objetos de entrada y seleccione Selección de fibra en la lista desplegable.
          3. Asegúrese de que la casilla "Mantener objetos de entrada" no esté marcada.
          4. Asegúrese de que la casilla "Mantener límites interiores" esté marcada.
          5. Expanda Selecciones de entidades resultantes y seleccione Selección de andamios en la lista desplegable.
        2. Realizar corte: En el Generador de modelos, haga clic con el botón derecho en Geometría,expanda Booleanos y particiones y seleccione Intersección.
          1. Cambie la etiqueta a "Andamio".
          2. Encienda el interruptor de objetos de entrada y seleccione Selección de andamio en la lista desplegable.
          3. Asegúrese de que la casilla "Mantener objetos de entrada" no esté marcada.
          4. Asegúrese de que la casilla "Mantener límites interiores" esté marcada.
    6. Geometría del conjunto
      1. Definir la geometría de la sustancia circundante.
        1. En el Generador de modelos, haga clic con el botón derecho en Geometría, expanda Booleanos y particiones y seleccione Diferencia. Continúe con la pestaña Configuración.
        2. En la lista desplegable Objetos para agregar, seleccione Selección de medios.
        3. En la lista desplegable Objetos para restar, seleccione Selección de andamio.
        4. Asegúrese de que las casillas "Mantener objetos de entrada" y "Mantener límites interiores" estén marcadas.
      2. Eliminar extensiones de medios cuadro.
        1. En el Generador de modelos, haga clic con el botón secundario en Geometría y seleccione Eliminar entidades. Continúe con la pestaña Configuración.
        2. Seleccione Dominio en la lista desplegable Nivel de entrada geométrico.
        3. Seleccione Selección de medios en la lista desplegable Selección.
        4. Elimine "dif1" del cuadro de selección.
    7. Geometría de construcción
      1. En el nodo Geometría, asegúrese de que el último elemento antes del nodo Selecciones acumulativas es Unión de formulario y no Conjunto de formulario. Si es necesario, haga clic con el botón derecho en Ensamblado de formulario y cambie Acción a "Formar una unión" en la pestaña Configuración.
      2. En el Generador de modelos, haga clic con el botón izquierdo en Geometría y seleccione Generar todo.
  7. Materiales
    1. En el Generador de modelos, en el nodo Componente actual, haga clic con el botón secundario en Materiales y seleccione Enlace de material.
    2. Repita la sección cinco veces por tantas veces como se consideren tantos materiales de acuerdo con el nivel de complejidad.
    3. Asocie materiales para cada componente en el siguiente orden: sustancia circundante, capas, núcleos.
    4. En la pestaña Configuración, elija Media/Scaffold (para SC, SNC, RC)/Coat/Core Selection en la lista desplegable Selección.
    5. Expanda la configuración del enlace y elija el material apropiado de la lista desplegable.
  8. Mallado
    1. En el Generador de modelos, haga clic con el botón izquierdo en el nodo Malla debajo del componente actual.
    2. En la pestaña Configuración, seleccione Normal en la lista desplegable Tamaño del elemento y haga clic con el botón izquierdo en Generar todo.
  9. Física: En el Generador de modelos,haga clic con el botón izquierdo en el componente actual, seleccione Agregar física,expanda el módulo AC/DC en la pestaña Agregar física, seleccione el módulo Corrientes eléctricas (ec) y haga clic en Agregar al componente.
    1. Condiciones de contorno: en la pestaña Gráficos, seleccione la vista xy.
      1. Tierra: En el Constructor de modelos,haga clic con el botón derecho en el nodo Corrientes eléctricas y seleccione Tierra.
      2. Asegúrese de que el interruptor de selección para la selección de límites esté activo y haga clic con el botón izquierdo en la cara de la sustancia circundante más alta paralela al plano xz para agregar el límite 5 en el cuadro de selección de límites.
      3. Terminal: En el Constructor de modelos,haga clic derecho en el nodo Corrientes eléctricas y seleccione Terminal.
      4. Asegúrese de que el interruptor de selección para la selección de límites esté activo y haga clic con el botón izquierdo en la cara de la sustancia circundante más baja paralela al plano xz para agregar el límite 2 en el cuadro de selección de límites.
      5. Expanda la sección Terminal y seleccione Voltaje en la lista desplegable Tipo de terminal; rellene V0 para Voltaje.
    2. Agregue complejidad si es necesario: guarde el componente actual y vuelva al paso 1.4 para seguir otra ruta de complejidad (SC/SNC/RC/RNC/RNCd).

2. Realizar simulación

  1. Refinamiento de malla adaptativa
    1. En Model Builder, haga clic con el botón izquierdo en el nodo raíz del modelo y seleccione Agregar estudio para abrir la pestaña Agregar estudio, seleccione Estudio estacionario y haga clic con el botón derecho en Agregar estudio.
    2. Cree un paso de estudio para cada componente creado: en El nodo Estudio, haga clic con el botón derecho en Paso 1: Estudio estacionario y seleccione Duplicar.
    3. Para cada paso de estudio, modifique la pestaña de configuración con los detalles del componente correspondiente.
      1. Expanda Física y Selección de Variables; en la columna Resolver para, deje sólo marcado el componente actual.
      2. Expanda Extensiones de estudio y marque la casilla Refinamiento de malla adaptativa.
      3. Seleccione la geometría del componente actual en la lista desplegable situada junto a Adaptación en geometría.
    4. En Model Builder, haga clic con el botón secundario en Estudio 1 y seleccione Calcular. Esto generará mallas adaptadas para todas las geometrías de los componentes con su ángulo de orientación actual.
  2. Establezca el ángulo de orientación y realice un estudio estacionario.
    1. En Model Builder, en Definiciones globales, haga clic con el botón izquierdo en Parámetros y cambie el parámetro theta al ángulo de orientación de fibra deseado para la simulación.
    2. Para cada componente, en el Generador de modelos, expanda el nodo del componente, haga clic con el botón secundario en Geometría y seleccione Generar todo.
    3. En Model Builder, haga clic con el botón secundario en el estudio de refinamiento de malla adaptable y seleccione compute.
    4. En Model Builder, haga clic izquierdo en el nodo raíz del modelo y seleccione Agregar estudio para abrir la pestaña Agregar estudio, seleccione Estudio estacionario y haga clic con el botón derecho en Agregar estudio.
    5. En Model Builder, en el estudio recién agregado, haga clic con el botón izquierdo en Paso 1, expanda la selección de malla y, para cada componente, seleccione las mallas generadas en el estudio de refinamiento de malla adaptativa.
    6. Haga clic con el botón derecho en el botón Calcular.
  3. Establezca el ángulo de orientación, la señal de entrada y realice un estudio dependiente del tiempo.
    1. En Model Builder, en Definiciones globales, haga clic con el botón izquierdo en Parámetros y cambie el parámetro theta al ángulo de orientación de fibra deseado para la simulación.
    2. En el Generador de modelos, haga clic con el botón izquierdo en el nodo raíz del modelo y seleccione Agregar estudio para abrir la pestaña Agregar estudio. Seleccione Estudio dependiente del tiempo, haga clic con el botón izquierdo en Agregar estudio y edite la pestaña Configuración de la siguiente manera.
      1. Establezca los tiempos en "rango(0, (2*pi/omega)/39,2*pi/omega)".
      2. Expanda Física y Selección de Variables; deje marcada solo la casilla de verificación "Resolver para" del componente de simulación.
      3. Expanda Selección de malla y seleccione una malla para el componente de simulación. Cambie las mallas de los otros componentes a Sin malla.
      4. Expanda Extensiones de estudio y marque la casilla Refinamiento de malla adaptativa; seleccione la geometría del componente de simulación en la lista desplegable.
    3. Defina la condición de límite dependiente del tiempo.
      1. En el nodo componente actual, haga clic con el botón secundario en Definiciones y, en Funciones, seleccione Forma de onda.
      2. En la pestaña Configuración, cambie el nombre de la función a "Entrada".
      3. Expanda Parámetros, establezca Tipo en Seno, Frecuencia angular en "omega", Amplitud en V0.
      4. Para el componente de simulación, en su nodo Corrientes eléctricas, seleccione Terminal y cambie Voltaje a "Entrada(t[1/s])".
    4. Haga clic con el botón derecho en el botón Calcular.

3. Análisis

  1. Densidad de carga
    1. En el nodo Generador de modelos, haga clic con el botón secundario en Resultados,seleccione Grupo de trazado 3D y edite Configuración .
      1. Cambie la etiqueta a "Densidad de carga".
      2. Expanda Datos y seleccione el conjunto de datos del estudio paramétrico en la lista desplegable Conjunto de datos.
      3. Expanda Leyenda de color y marque "Mostrar leyendas" y "Mostrar valores máximos y mínimos".
    2. Haga clic con el botón derecho en Densidad de carga en el nodo Resultados del Generador de modelos y seleccione Volumen; vaya a editar la pestaña Configuración.
      1. Expanda Datos y seleccione "Desde el padre" en la lista desplegable Conjunto de datos.
      2. Expanda Expresión y rellene "ec.rhoq" en el cuadro Expresión.
      3. Expanda Rango y marque la casilla Rango de color manual.
        1. Establezca el mínimo en "-0.03" y el máximo en "0.03".
      4. Expanda Coloración y estilo, establezca Colorear en Tabla de colores, Tabla de colores en Onda, marque la casilla Leyenda de color, marque Simetrizar gama de colores.
      5. Haga clic con el botón derecho en Volumen en Model Builder y seleccione Filtrar.
        1. En la ficha Configuración, rellene "abs(ec.rhoq)>0.012" en la expresión Lógica para su inclusión.
    3. Haga clic izquierdo en el botón Trazar para visualizar los resultados en la ventana gráfica.
  2. Densidad de corriente
    1. En el Generador de modelos, haga clic con el botón secundario en el nodo Resultados, seleccione Grupo de trazado 3D y edite la ficha Configuración.
      1. Cambie la etiqueta a "Densidad de corriente".
      2. Expanda Datos y seleccione el conjunto de datos del estudio paramétrico en la lista desplegable Conjunto de datos.
      3. Expanda Leyenda de color,marque "Mostrar leyendas" y "Mostrar valores máximos y mínimos".
    2. Haga clic con el botón secundario en Densidad actual en el nodo Resultados en Model Builder y seleccione Volumen de flecha; vaya a editar la pestaña Configuración.
      1. Expanda Datos y seleccione "Desde el padre" en la lista desplegable Conjunto de datos.
      2. Expanda Expresión y rellene "ec. Jx", "ec. Jy", "ec. Jz" en los cuadros de expresión para los componentes x, y y z respectivamente.
      3. Expanda el posicionamiento de la flecha y rellene 20 para todas las coordenadas, número de puntos.
      4. Expanda Coloración y estilo,establezca longitud de flecha en Normalizado, base de flecha en Centro, marque Factor de escala y configáralo en 85.
      5. Haga clic con el botón secundario en Volumen de flecha en Model Builder y seleccione Expresión de color.
        1. En la pestaña Configuración, rellene "ec.normJ" en el cuadro Expresión.
        2. Expanda Coloración y estilo,establezca Tabla de color en Tráfico, marque Leyenda de color y Tabla de color inversa.
    3. Haga clic en el botón Trazar para visualizar los resultados en la ventana gráfica.

Representative Results

El modelo propuesto describe las características de una estera compuesta con fibras paralelas, inmersa en una sustancia conductora y expuesta a un gradiente de potencial eléctrico generado externamente. Las simulaciones muestran que la contabilidad de los diferentes componentes de un andamio es importante en una microescala y exploran cómo el cambio en el ángulo de alineación (señal de entrada) de las fibras al EF puede generar variabilidad en la corriente y la densidad de carga (señales de salida) en las cercanías de las fibras.

Se presentan cinco etapas de complejidad geométrica diferentes, cada una de las que tiene un efecto sobre el resultado de la simulación: losa conductora lisa (SC), losa lisa con fibras incrustadas no conductoras (SNC), compuesto conductor rugoso (RC), compuesto rugoso con fibras incrustadas no conductoras (RNC), compuesto rugoso con fibras incrustadas no conductoras y dos tipos de recubrimiento periódico (RNCd)(Figura 3). La sección 1.5 del protocolo presenta los pasos para importar las geometrías en un proyecto y la sección 1.6 muestra cómo compilarlos paso a paso. Los dos primeros modelos no tienen en cuenta la morfología de la superficie. SC y RC no tienen en cuenta las propiedades dieléctricas del núcleo de fibra. El RNC es el modelo propuesto para andamios artificiales nanofibreros, mientras que RNCd es el modelo propuesto para un segmento ECM.

La minimización del costo computacional se logró reduciendo la geometría del dispositivo ES a un volumen unitario modelo que representa el microambiente. Mientras que el ancho y la longitud de un dispositivo ES y un andamio pueden ser fácilmente del orden de unos pocos centímetros, el diámetro de las fibras que lo contienen suele ser inferior a una micra. Aquí, utilizamos un corte de andamio comparable al diámetro de la fibra para reducir el costo computacional inducido por la relación de aspecto y resaltar el efecto de la naturaleza fibrosa del andamio en el microambiente eléctrico. El resto del dispositivo ES se reemplaza con condiciones de contorno de potencial eléctrico elegidas para que una aproximación aproximada para la magnitud del campo eléctrico sea de 100 V / m, un parámetro de estimulación informado con frecuencia. Además, se supone que un volumen unitario con cinco fibras paralelas, como el utilizado en las simulaciones, presentado en la Figura 3, es representativo de toda una estera fibrosa plana. Se pueden distinguir tres tipos de fibras en una matriz 1D: central interior (con el plano de simetría longitudinal del andamio dividiéndolas por la mitad), interior transitoria (con superficie lateral rodeada de otras fibras pero con lados asimétricos) y exterior (en el borde del andamio). Cinco es el número mínimo de fibras requeridas para incluir los tres tipos definidos.

El tamaño del elemento de malla del modelo requiere una atención especial, ya que puede afectar los resultados de la simulación y, por lo tanto, no exponer efectos importantes (Figura 4). Esta es una regla general del método de elementos finitos y una implicación del teorema de muestreo de Nyquist-Shannon. Cuanto más rápido fluctúan las señales de simulación esenciales en el espacio, más pequeños deben ser los elementos de malla para producir una representación leal del fenómeno. Por otro lado, cuanto más pequeño es el elemento, mayor es el número total de bloques de construcción del modelo y el costo computacional. El refinamiento de la malla adaptativa establecido en la sección 2.1 es un método bueno y fácil para equilibrar aquellos objetivos opuestos disminuyendo el tamaño del elemento solo donde y mientras esta operación produzca un cambio significativo.

Un modelo demasiado simplista puede fallar presentando efectos importantes(Figura 5,6). Las simulaciones muestran que tener en cuenta la morfología de la superficie y las propiedades eléctricas de los componentes del andamio no es redundante para predecir los microambientes eléctricos. Si bien la morfología de la superficie tiene un impacto directo en la EF estacionaria (compare SC y SNC con RC, RNC y RNCd), una comparación entre las predicciones de RC y RNC muestra que los núcleos de fibra no conductores amplifican este efecto. Desde el punto de vista de la modelización de microambientes eléctricos celulares en andamios nanofibrosos, los modelos SC, SNC y RC son, por lo tanto, subóptimos. Sin embargo, es una buena práctica agregar complejidad de manera incremental, ya que las comparaciones entre las diferentes etapas ayudan a indicar qué características dan lugar a efectos específicos.

La complejidad del modelo afecta el cambio de densidad de corriente y carga con la alineación de la fibra con el EF. El protocolo propuesto ayuda a resaltar el efecto (Figura 5,6). Mientras que el modelo SC no muestra variación en las métricas propuestas cuando se cambia su alineación con el gradiente de potencial eléctrico, las simulaciones del modelo RNC predicen un poderoso contraste entre la unidad de estera con fibras alineadas a la EF y la que tiene fibras perpendiculares(Figura 7). Cuando los núcleos no conductores se encuentran en el camino del flujo de corriente, forman presas periódicas que conducen a regiones alternas de alta y baja densidad de carga.

Los regímenes dinámicos de ES se pueden simular con estudios dependientes del tiempo. Los videos en archivos complementarios muestran predicciones hechas para un voltaje de entrada sinusoidal en un modelo de andamio artificial completo (RNC), con fibras paralelas o perpendiculares al gradiente de potencial eléctrico. Pequeñas corrientes a lo largo de las fibras perpendiculares a la EF aparecen cuando se libera carga del andamio a medida que disminuye la magnitud de la EF. Esto muestra que la estimulación podría ocurrir no solo mientras el EF externo está presente, sino también justo después de que se desconecte - Ver archivos complementarios para videos.

Figure 1
Figura 1: Diagrama jerárquico de bloques de modelado - ventajas y limitaciones del modelado con modelos in vivo e in silico. El color del bloque marca los bloques en el mismo nivel jerárquico. Los bloques de rango inferior se incluyen en los de rango superior. Las marcas de color de trazo de bloque pueden incluir el bloque en un determinado tipo de modelo: el acoplamiento con otros bloques del sistema no tiene amarillo en su trazo, ya que no son componentes para modelos in vitro. Las balas actúan como válvulas y significan la capacidad de control del bloque. Cuando una válvula está encendida, la señal puede pasar a través de todas las trayectorias de flecha en los subsistemas subordinados que tienen el color de la válvula en su carrera. Interpretación del diagrama: el proceso ES está compuesto por el dispositivo de estimulación y la diana biológica, cada uno con varios subprocesos deterministas o estocásticos interconectados que no se pueden separar in vivo o in vitro, por lo que no tienen válvula roja o amarilla. Los procesos estocásticos también intervienen en la interfaz entre el dispositivo de simulación y la muestra biológica cuando ambos son estimulados. Un modelo in vitro desacopla el sistema de interés (es decir, el segmento de la piel) del resto del organismo. Por lo tanto, solo se pueden observar procesos intrínsecos del sistema de interés coronados por procesos estocásticos de diferente naturaleza. Sin embargo, los diferentes procesos intrínsecos involucrados no pueden ser estimulados e identificados por separado. Los modelos in silico son paramétricos para componentes conocidos -se espera que su comportamiento sea de cierta forma- y no paramétricos para lo desconocido -ya que no hay ninguna razón mecanicista para dar crédito a una cierta extrapolación-. Todos los componentes in silico se pueden simular por separado o en diferentes combinaciones, lo que permite la representación de diferentes hipótesis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: (A) Ley de Coulomb (B) Campo potencial eléctrico y carga de sonda móvil (C) Corriente eléctrica (D) Densidad de carga (E) Densidad de corriente (F) Ecuación de continuidad (G) Ley de conservación de carga. (A) Las partículas estacionarias cargadas eléctricamente q y Q interactúan electrostáticamente a través de la fuerza de Equation 1 Coulomb. (B1) Cada partícula cargada Q genera un campo escalar llamado potencial eléctrico en todas las posiciones Equation 2 del espacio: Equation 3 . El trabajo máximo requerido para mover otra partícula cargada q de su posición Equation 4 es el producto entre la carga q y el potencial eléctrico generado por Q en la posición. Equation 4 El campo potencial eléctrico generado por múltiples partículas es la suma de los campos generados por cada partícula individual. (B2) Un campo estacionario con partículas fijas del generador q y Q, actúa con una Equation 5 partícula de sonda con carga positiva qp. En respuesta, qp se mueve para minimizar el potencial eléctrico de su posición. Para describir el movimiento de qp, se puede derivar Equation 5 y el campo eléctrico del campo potencial Equation 6 eléctrico: Equation 7 . (C) Múltiples partículas móviles de sonda cargadas positivamente liberadas uniformemente en un campo eléctrico estacionario siguen un movimiento organizado. Para rastrear la configuración de carga sin rastrear cada partícula, se puede especificar en cada instante: (D) cómo el espacio está ocupado por las partículas, asignando una densidad de carga Equation 8 a cada volumen infinitesimal, de acuerdo con la Ley de Gauss, y (E) cómo las partículas pasan a través de las superficies límite entre los volúmenes infinitesimales vecinos, asignando una densidad de corriente Equation 9 a cada límite de acuerdo con la Ley de Ohm. (F) La carga y la densidad de corriente evolucionan codependientemente de acuerdo con la Ecuación de continuidad, ya que el desplazamiento no uniforme de partículas conduce a la acumulación o pérdida de partículas en un cierto volumen. (G) Dentro de un sistema aislado, prevalece la ley de conservación de la carga y no hay entrada o salida de partículas cargadas. Notaciones utilizadas:- q,Q,qp carga y nombre de la partícula cargada; Equation 10 - Norma euclidiana del vector de posición; k - constante de Coulomb; Equation 11 - operador de gradiente, εa - permitividad absoluta del medio; σ - conductividad del medio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Cinco niveles diferentes de complejidad para una estera fibrosa. SC- liso con fibras incrustadas conductoras, el modelo más simple, sin tener en cuenta la morfología de la superficie o las diferentes propiedades de los componentes constituyentes; SNC- liso con fibras incrustadas no conductoras; RC- rugoso con fibras incrustadas conductoras, que tienen en cuenta la morfología de la superficie pero no las diferentes propiedades de los componentes; RNC- áspero con fibras incrustadas no conductoras, modelo completo propuesto de andamios artificiales nanofibrósicos; RNCd- áspero con fibras incrustadas no conductoras recubiertas con dos materiales diferentes, modelo propuesto completo para una lámina de fibras de colágeno. Unidad de longitud utilizada: nanómetros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Ejemplos de resultados del refinamiento de la malla adaptativa y la densidad de carga resultante después de la simulación. (Izquierda) Malla generada automáticamente con elementos tetraédricos extra gruesos; (Derecha) Malla inicial refinada adaptativamente durante el estudio estacionario; se requieren elementos más pequeños para un resultado preciso en las áreas donde las señales simuladas tienen cambios espaciales abruptos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5:El ángulo de alineación de la fibra con respecto al gradiente de potencial eléctrico afecta la fuerza de la EF en los medios de cultivo celular circundantes cuando se tiene en cuenta la suficiente complejidad. SC, SNC, RC, RNC y RNCd son los diferentes niveles de complejidad para el modelo de estera fibrosa presentado en la Figura 3. El eje vertical marca el ángulo de alineación de las fibras con respecto al gradiente de potencial eléctrico. Electrodos abstractos presentados: lado inferior con alto potencial eléctrico y lado superior con bajo potencial eléctrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6:El ángulo de alineación de la fibra con respecto al gradiente de potencial eléctrico afecta la densidad de carga espacial en los medios de cultivo celular circundantes cuando se tiene en cuenta la suficiente complejidad. SC, SNC, RC, RNC y RNCd son los diferentes niveles de complejidad para el modelo de estera fibrosa presentado en la Figura 3. El eje vertical marca el ángulo de alineación de las fibras con respecto al gradiente de potencial eléctrico. Electrodos abstractos presentados:lado inferior con alto potencial eléctrico y lado superior con bajo potencial eléctrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: El movimiento de carga está influenciado por la alineación de la fibra del andamio en relación con el EF. Ambos paneles ilustran las predicciones del modelo RNC en estado estacionario. En el lado izquierdo las fibras son paralelas al EF, mientras que en el lado derecho son perpendiculares. El volumen de color rojo claro a azul marca la densidad de carga, mientras que el volumen de la flecha marca la orientación de la densidad actual. El color de las flechas corresponde a la norma de densidad actual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre Expresión Descripción
Ws 10 * Rc * med_ratio Ancho del andamio
Ls 10 * Rc * med_ratio Longitud del andamio
Hs 2 * Rf Altura del andamio
med_ratio 1.5 Relación entre los medios de cultivo celular y el andamio
Rc 278,5[nm] Radio del núcleo de fibra
r 1.5 Relación entre el núcleo de fibra y la capa
Rf Rc*r Fibra con radio de recubrimiento
theta 90[deg] Ángulo de orientación de la fibra
Si 1.3*(Ls*cos(theta)+Ws*sin(theta)) Longitud de la fibra
tes 1 Relación entre el radio del núcleo de la fibra y la distancia entre las fibras
n_1 2*(fix((Ws/(2*cos(theta))-Rf)/(2*tes*Rc))+3)*(cos(theta)!=0)+1*(cos(theta)==0) Número máximo de fibras si theta<=45
n_2 2*(fix((Ls/(2*sin(theta))-Rf)/(2*tes*Rc))+3)*(sin(theta)!=0)+1*(sin(theta)==0) Número máximo de fibras si theta>45
exceso 1.2+0.3*abs(sin(2*theta)) Primer desplazamiento relativo de fibra del andamio
D Lf/5 Periodicidad del pelaje
puntal 0.46 Longitud de la primera capa en relación con la periodicidad D
E 100[mV/mm] Magnitud del campo eléctrico
V0 E*Ls*med_ratio Voltaje del terminal
omega 500[Hz] Estudio dependiente del tiempo Frecuencia de voltaje
p_sigma 0.5 Conductividad relativa del segundo recubrimiento
p_eps 1.5 Segundo recubrimiento relativo a la constante dieléctrica

Tabla 1: Parámetros utilizados para la simulación

Medios culturales PEDOT:PSS 1 PEDOT:PSS 2 Colágeno Hidratado 1 Colágeno Hidratado 2 Fibroína de seda Colágeno seco
Conductividad eléctrica (S/m) 1.7014 1.00E-01 p_sigma * 0.1 2.00E-05 p_sigma * 2e-5 1.00E-08 2.50E-08
Permitividad relativa 80.1 2.2 p_eps * 2.2 9.89 p_eps * 9.89 7.81E+00 4.97

Tabla 2: Propiedades del material utilizadas en la simulación

Archivos complementarios. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El protocolo propuesto sugiere una solución de modelado uniforme para andamios naturales y artificiales y destaca la necesidad de considerar la nanoestructura de los andamios fibrosos al inspeccionar los efectos de la FE en las células sembradas en dichos materiales. Aunque una aproximación gruesa para la intensidad de EF (diferencia de potencial del electrodo dividida por la distancia entre los electrodos) nos llevaría a esperar una intensidad de campo de 100 mV/ mm, las simulaciones predicen intensidades de campo estacionarias hasta un 30% más altas en diferentes áreas de la estera (Figura 5). Este resultado debería ser de interés en el diseño de experimentos de ES y la interpretación de datos, ya que la muerte celular puede ser causada por EF demasiado fuertes. Exponer el microambiente eléctrico permitiría una correlación directa entre la ES y el desarrollo celular. Si bien varios estudios presentan un análisis morfológico detallado de los andamios utilizados33,43,59,no investigan la interacción entre la estructura, las propiedades eléctricas de los materiales y el EF. Este protocolo puede habilitar este enlace, ya que parámetros como el radio de la fibra, el grosor de la capa de recubrimiento, la distancia entre las fibras y las propiedades eléctricas de los materiales componentes se pueden modificar de acuerdo con cada experimento cambiando las definiciones globales en los pasos 1.2 y 1.3. Por lo tanto, se pueden realizar predicciones personalizadas de carga y densidad de corriente resueltas espacialmente en 3D para regímenes ES estáticos y dinámicos.

La optimización del diseño de andamios se puede orientar a través de los modelos RNC y RNCd con exploraciones de amplio rango de parámetros, escalando las morfologías propuestas o partes de ellas. Alternativamente, se pueden investigar otras configuraciones de andamios con el protocolo propuesto cambiando los tipos de matriz de lineal a tridimensional en la sección 1.6.5 y adaptando la geometría del andamio en la sección 1.6.2. Sin embargo, la optimización del andamio no se puede hacer sin un objetivo. Mientras que para fines de ingeniería de tejidos el enfoque principal es el destino celular, una imagen más clara sobre qué estímulos son sus principales determinantes es esencial si se desea su control confiable. La carga y la densidad de corriente son buenos descriptores de microambientes eléctricos celulares, ya que muestran la interacción entre el EF y las propiedades eléctricas de los diferentes materiales componentes de andamios complejos como el ECM. El protocolo muestra cómo calcular predicciones para esas métricas dada una geometría de andamio nanofibrosa y destaca la importancia del ángulo de alineación de las fibras con el EF. Las predicciones de carga y densidad de corriente podrían vincularse al desarrollo celular y, por lo tanto, los regímenes de andamios y ES podrían optimizarse para tareas específicas.

Curiosamente, un estudio muestra que la exposición a ef generó estrés mecánico de más del doble de fuerza en películas compuestas con nanofibras perpendiculares a la EF externa en comparación con películas con alineación paralela60. La tensión mecánica reportada podría ser el resultado de las fuerzas de Coulomb que actúan entre fibras cargadas, predichas por las simulaciones del modelo aproximado (RC, RNC, RNCd)(Figura 6). Si bien estas simulaciones podrían ser útiles para investigar esta hipótesis, debe tenerse en cuenta que los resultados experimentales reportados se obtuvieron en un sistema con acoplamiento capacitivo, y la simulación presenta acoplamiento directo.

Un factor limitante hacia futuros posibles usos del protocolo para estimar una señal de entrada celular es la incertidumbre de los parámetros. Los parámetros geométricos inciertos son el espesor de la capa de recubrimiento y la distancia entre los núcleos de fibra. El primero podría inferirse encontrando el valor que conduce a una impedancia masiva que puede ser validada experimentalmente. El segundo se puede extraer de escaneos de material de alta resolución. Los parámetros que describen las propiedades físicas de los materiales también se ven afectados por la incertidumbre. Sin embargo, la conductividad eléctrica y la constante dieléctrica de los materiales ejemplificados difieren mucho más que la precisión de medición experimental(Tabla 2). Por lo tanto, los efectos informados se mantendrían a pesar de los errores de medición moderados.

Los resultados muestran cómo la complejidad insuficiente del modelo podría ocultar información relevante. Es importante reconocer que el protocolo simula una versión simplificada del fenómeno físico que tiene lugar, ya que no tiene en cuenta la diferente naturaleza de los materiales involucrados en el proceso -conductor (electrodos), semiconductor (recubrimiento), dieléctrico (núcleos de fibra) y electrolítico (sustancia circundante)- que pueden influir en el transporte de carga. Este problema se puede explicar en futuras expansiones de modelos agregando retrasos de transferencia de energía en las interfaces (es decir, reacciones farádicas) y retrasos en el transporte de iones dentro del electrolito. Sin embargo, la adición de complejidad debe guiarse por la validación experimental, ya que un modelo simple que reproduce la mayor parte de lo que se observa es más útil que uno notablemente preciso que agrega poca más información, pero es profundamente sensible a la incertidumbre de muchos parámetros constituyentes.

Como el objetivo final de la ingeniería de tejidos es crear biorreactores que no solo imiten uno o dos aspectos de los entornos in vivo, sino que repliquen y controlen todas las señales de desarrollo celular61,los modelos electromagnéticos y mecánicos in silico, así como los modelos de transferencia de calor entre los componentes del biorreactor deberán combinarse. En una fase de modelado posterior, también se pueden agregar fenómenos de acoplamiento entre esas interacciones como el calentamiento óhmico, el flujo de fluido electrolítico, las deformaciones morfológicas del andamio en respuesta a la estimulación eléctrica60 y la piezoelectricidad62. Sin embargo, los modelos deben fusionarse solo después de que cada uno haya sido validado experimentalmente. De esta manera, podemos obtener una mejor comprensión de la influencia de cada componente en el microambiente celular y cómo se pueden optimizar los estímulos.

Si el modelo propuesto se valida experimentalmente, se puede combinar con modelos de células biológicas - Figura 1. Los patrones y modulaciones de densidad de carga podrían influir asimétricamente en la actividad de las bombas de iones específicas, afectar la unión a la fibra de las proteínas que impulsan la adhesión de la membrana63 y, por lo tanto, guiar la migración, los patrones de proliferación y la morfogénesis64. Explorar esas hipótesis es el camino a seguir para comprender los mecanismos que sustentan las respuestas de los tejidos y las células a la ES.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Programa de Doctorado Wellcome Trust de 4 años en Biología Cuantitativa y Biofísica

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Comsol multiphysics 5.2 AC/DC module COMSOL - FEM modelling software

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Modelado de elementos finitos de un microambiente eléctrico celular
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Verdes, M., Disney, C., Phamornnak, C., Margetts, L., Cartmell, S. Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment. J. Vis. Exp. (171), e61928, doi:10.3791/61928 (2021).

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