Summary
이 프로토콜은 비침습적으로 최대 8 주 동안 얼룩말 피시의 고혈당을 유도합니다. 이 프로토콜을 사용하여 고혈당증의 부작용에 대한 심층적인 연구가 이루어질 수 있습니다.
Abstract
Zebrafish(Danio rerio)는만성 고혈당증의 효과를 조사하는 훌륭한 모델이며, 유형 II 당뇨병 멜리투스 (T2DM)의 특징입니다. 이 대체 침지 프로토콜은 최대 8 주 동안 고혈당증을 유도하는 비침습적, 단계별 방법입니다. 성인 얼룩말 물고기는 설탕 (포도당)과 물에 각각 24 시간 동안 번갈아 노출됩니다. 제브라피쉬는 2주 동안 1% 포도당 용액에서 치료를 시작하고, 2주 동안 2% 용액을, 그리고 마지막으로 남은 4주 동안 3%의 용액을 치료합니다. 수처리(스트레스) 및 매니톨 처리(삼투성) 대조군과 비교하여 포도당 처리 된 제브라피쉬는 혈당 수치가 현저히 높습니다. 포도당 처리된 얼룩말fish는 4 주 및 8 주 고혈당증이 모두 달성 될 수 있음을 시사, 대조군의 3 배의 혈당 수치를 보여줍니다. 지속적인 고혈당증은 증가 된 글리아 피동 산성 단백질 (GFAP) 및 망막및 생리적 반응 감소의 증가 핵 인자 카파 B (NF-kB) 수준과 연관되었다, 뿐만 아니라 이 프로토콜을 시사 하는 인지 적자 질병 합병증을 모델링 하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
제브라피쉬(다리오리리오)는질병과 인지1을모두 연구하기 위해 널리 사용되는 동물 모델이 되고 있다. 초기 발달 단계를 통해 유전 조작 및 배아 투명성의 용이성, 알려진 유전 적 기초로 인간 질병을 연구 할 수있는 주요 후보만들기. 예를 들어, 제브라피쉬는 홀트-오람 증후군, 심근병증, 구종구성 신장질환, 근이영양증 및 당뇨병 멜리투스(DM)를 연구하는 데 사용되어왔다 1. 또한, 제브라피쉬 모델은 종의 작은 크기, 유지 보수의 용이성, 높은 fecundity2,3때문에 이상적입니다.
제브라피시 췌장은 해부학적으로나 기능적으로 포유류 췌장4와유사하다. 따라서, 크기, 높은 fecundity 및 유사한 내분비 구조의 독특한 특성은 제브라피쉬를 DM 관련 합병증을 연구하기에 적합한 후보로 만듭니다. 제브라피시에서는, DM의 특징인 장기간 고혈당증을 유도하는 데 사용되는 두 가지 실험 방법이 있다: 포도당의 유입(모델링 타입 2) 및 인슐린 분비의 중단(modeling Type 1)5,6. 실험적으로, 인슐린 분비를 중지하기 위하여는, 췌장 β 세포는 연쇄토조토신 (STZ) 또는 알록산 주사를 사용하여 화학적으로 파괴될 수 있습니다. STZ는 설치류 및 제브라피시에 성공적으로 사용되어 망막병증7,8,9,인지 장애10,사지 재생11과관련된 합병증을 초래한다. 그러나, 제브라피시에서, β 세포는 치료 후 재생, 당뇨병 조건을 유지하기 위해 필요한 STZ의 "부스터 주사"를 일으키는12. 또는, 제브라피시의 췌장은6을제거할 수 있다. 이들은 모두 매우 침습적인 절차, 여러 주사 로 인해, 그리고 광범위 한 복구 시간.
반대로, 고혈당증은 외인성 포도당에 노출을 통해 비침습적으로 유도될 수 있다. 본 프로토콜에서,물고기는 24시간5,13또는 2주14,15,16에대해 지속적으로 고농축 포도당 용액에 침수된다. 외인성 포도당은 경피적으로, 섭취에 의해, 및/또는 아가미를 가로질러 올려진 혈당 수치를 초래합니다. 이 비침습적 기술은 인슐린 수준을 직접 조작하지 않기 때문에, 그것은 타입-2 DM을 유도하기 위하여 주장할 수 없습니다. 그러나, 타입-2 DM의 주요 현상의 한개인 고혈당증에 의해 유도된 합병증을 검사하기 위하여 이용될 수 있습니다.
최근에는 제브라피쉬 돌연변이pdx1-/-인간에서 타입-2 DM의 유전적 원인에 연결된 유전자인 췌장 및 십이지장 동종박스 1 유전자를 조작하여 개발되었다. 이 돌연변이를 사용하여, 연구원은 췌장 발달 중단, 높은 혈당을 복제하고, 고혈당 유도 당뇨병 망막증17,18을연구할 수 있었습니다.
이 논문에서는 교대침 침지 프로토콜을 사용하는 비침습적 고혈당 유도 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 후속 합병증이 관찰된 최대 8주 동안 고혈당 상태를 유지합니다. 간단히 말해서, 성인 얼룩말fish는 24 시간 동안 설탕 용액에 넣고 24 시간 동안 물 용액을 넣습니다. 외부 포도당 솔루션에 지속적인 몰입과는 달리 설탕과 물 사이의 교대로 당뇨병에서 혈당의 상승과 하락을 모방합니다. 번갈아 가는 포도당 프로토콜은 제브라피시가 높은 외부 포도당 조건을 보상할 수 없을 만큼 더 긴 기간 동안 고혈당증을 유도할 수 있게 합니다. 원칙의 증거로, 우리는 이 프로토콜을 사용하여 유도된 고혈당증이 망막 화학 및 생리학을 변경한다는 것을 보여주는 데이터를 제공합니다.
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Protocol
모든 절차는 미국 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 솔루션 탱크 준비
- 6개의 탱크, 각 실험군(포도당, 매니톨 및 물)에 대해 2개를 얻습니다. 두 탱크 중 하나를 '하우징 탱크'(물고기를 수용할 것)라고 표시하고 다른 '용액 탱크'(솔루션을 보유)라고 표시합니다.
참고: 매니톨 처리 군은 삼투압 대조군이며, 수처리 군은 핸들링/응력 조절이다. 탱크, 항공사/에어스톤, 뚜껑 및 청소 용품을 각 처리 그룹에 대해 별도로 유지하는 것이 중요합니다. - 사용된 물고기의 총 수가 20 미만인 경우 2L 탱크를 사용합니다. 사용되는 물고기의 총 수가 20 개 이상인 경우 4 L 탱크를 사용합니다.
참고: 샘플링 시점당 치료 그룹당 5-10의 N을 사용합니다. - 수온을 유지하기 위해 탱크를 28-29 °C의 수조에 보관하십시오.
- 1일째에는 물고기를 각각의 치료 용액(포도당, 매니톨, 물)에 24시간 동안 넣습니다('물로 처리'). 2일째에는 처리 용액에서 물로 물고기를 24시간 동안 옮기는 것입니다('처리에서 물로 처리'). 3일째에는 물고기를 물에서 처리 솔루션('물로 처리'으로 전송)으로 옮기습니다. 이러한 교대 노출은 실험의 나머지 기간 동안 계속된다(그림1). 매일 물로 처리된 제어어를 물에서 물로 옮습니다.
- 실험 기간 내내 매일 같은 2시간 의 창 내에서 물고기를 먹이고 옮기는지 확인합니다.
2. 물고기 준비
- 성인 제브라피쉬 사용 (4개월 ~ 1년)5.
- 실험실에 도착하면 매일 물고기 지상 테트라닌 플레이크를 먹이.
- 모든 탱크의 pH 및 온도를 기록하고 물고기의 일반적인 상태를 기록합니다.
3. 물고기 전송
- 각 처리군에서 물고기를 하우징 탱크에서 표준 어망을 이용하여 해당 용액 탱크로 이송한다.
- 물고기가 들어 있는 탱크를 수조에 다시 놓고 기석과 탱크 뚜껑을 교체하십시오. 이 탱크는 이제 '하우징 탱크'이며 이전에 물고기를 잡은 탱크가 이제 '용액 탱크'가되었습니다.
- 포도당과 매니톨의 축적을 방지하기 위해 탱크 뚜껑, 항공사, 기석 및 그물과 함께 오래된 솔루션을 버리고 탱크를 청소하십시오.
참고: 비누로 물건을 씻지 마십시오. 각 처리 조건에 물과 전용 스크럽 브러시/스폰지를 사용하여 탱크를 올바르게 청소하십시오. - 종이 타월로 새로 청소 된 '용액 탱크'를 말리십시오. 이 탱크를 사용하여 다음 날용액을 준비합니다. 다른 품목이 적절한 치료 그룹에 의해 건조되고 분리되었는지 확인하십시오.
참고: 물고기가 매일 전송되는 솔루션과 다음 날 동안 준비된 솔루션에 대한 로그를 보관하십시오. 예를 들어, 포도당에서 H2O로 옮겨진 물고기, 내일을 위해 준비된 새로운 1% 포도당 용액.
4. 전송 후 솔루션 준비
- 설탕 솔루션 준비
- 각 용액 탱크를 시스템 워터의 2L(또는 4L)로 채우면(시스템 워터는 염액의 정확한 비율로 처리되고 재고 및 처리 탱크와 동일한 온도에 있는 물로 정의됩니다).
- 각 화학 물질에 대해 최고 적재 규모와 별도의 계량 보트를 사용하여 정확한 양의 포도당및 매니톨(아래 단계 5 참조)을 측정합니다.
- 계량 된 포도당 또는 매니톨 알리쿼트를 시스템 물만 포함하는 적절한 세척 용액 탱크에 추가하십시오.
- 설탕이 완전히 녹을 때까지 별도의 유리 저어봉으로 포도당과 매니톨 용액을 저어줍니다.
- 용액 탱크를 수조로 되돌리고 해당 뚜껑으로 덮습니다.
- 물 솔루션 준비
- 시스템 워터로 실험 탱크(2L 또는 4L)를 채웁니다.
- 이 '용액 탱크'를 수조에 반환하고 해당 뚜껑으로 덮습니다.
5. 백분율 변경
- 치료의 첫 2 주 동안 1 % 용액에서 물고기를 유지 : 4 L 탱크에서 포도당 또는 매니톨 40 g.
- 4 L 탱크에서 포도당 또는 매니톨의 80 g : 치료의 주 3 및 4 동안 2 % 용액에서 물고기를 유지합니다.
- 마지막 4주 동안 3% 용액으로 물고기를 유지하십시오: 4L 탱크에 있는 포도당 또는 매니톨 120 g.
6. 혈당 수치를 측정하고 조직 수집
- 0.02% 트리카인 용액으로 한 번에 생선 2를 마취합니다.
- 면도날을 사용하여 아가미 바로 뒤에 물고기를 참수합니다.
- 혈당 값을 측정합니다.
참고: 혈액 포도당 계측기(예: 자유형 라이트)를 사용하여 혈당을 측정하고 노출된 심장(심장 혈액 샘플)에 직접 테스트 스트립을 배치합니다. - 물고기 (뇌, 근육 등)에서 원하는 조직을 해부.
- 드라이 아이스에 플래시 동결 및 -80 °C 냉동고에 저장, 4 % 파라 포름 알데히드에 고정, 또는 즉시 사용하기 위해 완충액에 배치하여 수집 된 조직을 저장합니다.
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Representative Results
이프로토콜(도 1)을이용하여, 혈당 값은 4주 및 8주 치료(도2A)이후 크게 상승하며, 고혈당증은 수처리 및 매니톨 처리군 모두에서 대조군 평균을 3배로 정의한다. 수처리 제어는 매일 물 안팎으로 이송되어 응력/처리 제어를 제공합니다. 매니톨은 포도당과 같은 6탄소 설탕이지만 세포에 의해 채택되지 않기 때문에 체외 포도당 연구19,20에서삼투압 조절역할을 합니다. 이러한 연구와 일치하기 위해,제브라피시(21)의다른 연구 결과, 우리는 포도당 노출 또는 포도당 특이적 효과로 인한 높은 발진성 때문인지 관찰된 효과가 있는지 확인하기 위해 포도당과 동일한 농도의 매니톨을 투여했다.
혈당은 아가미 운동이 느려질 때까지 0.02 % 트리카인을 사용하여 물고기를 마취한 다음 참수함으로써 측정됩니다. 혈당 측정기(도2B)로측정된 혈당 수준은 천공 된 심장 (즉, 심장 혈액)에 직접 글루코메터 테스트 스트립을 배치에서 결정됩니다.
고혈당증4주 후에 수집된 망막 조직은 글리아 세동 산성 단백질(GFAP)수준(도 3A)의증가를 표시한다. GFAP 발현은 당뇨병 성망막증(22,23)에서변경되는 망막내의 뮬러 신경교 세포에서 관찰된다. 증가된 GFAP 함량 및/또는 면역 반응성 패턴은 또한 STZ 유도 당뇨병 쥐24,25,26,27,28, pdx1-/- 돌연변이물고기(17)및 당뇨병 인간으로부터망막에서관찰된다. 이러한 GFAP의 증가는 핵인자 Kappa B(NF-kB)수준(도 3B)30의증가와 관련이 있으며, 대체 침수 프로토콜을 사용하여 제브라피시에 유도된 고혈당을 시사하는 것은 염증 반응 및 반응성 글리오시스를 유발한다. ERG 는 4주 간의 치료 후 기록으로, 매니톨 처리 된 대조군(도4A)에비해 포도당 처리망막에서 감소된 반응을 확인하였다. 고혈당어(도4B)에서파(광수용체)와 b-파(bi-polar cells) 성분의 진폭이 감소한다. 이러한 변경된 ERG 응답은 고혈당 모욕에 특히 민감한 것처럼 보이는 빨간색 및/또는 녹색 콘30,21의특정 변화와 상관 관계가 있습니다. 변경된 ERG 반응은 또한 당뇨병31,32,33,34,35 및당뇨병 인간의 동물 모형에서 관찰됩니다. 포도당 처리된 제브라피쉬는 또한 감소된 인지 성과를 보여줍니다 (Rowe et al., 2020, 이 문제점에서), 장기간된 고혈당증은 또한 더 오래된 당뇨병 환자에서 보고되는 인지 기능 적자로 이끌어 내는 것을 건의합니다.
그림 1: 대체 침지 프로토콜의 회로도. 이는 전송 프로세스의 시각적 표현입니다. 물고기는 2 주 동안 1 % 솔루션, 2 주 동안 2 % 용액, 나머지 4 주 동안 3 % 솔루션으로 유지됩니다. 매일 생선은 설탕이나 물 용액으로 옮겨갑니다. 대조군 치료는 24시간마다 또는 매니톨(삼투압 대조)을 오가며, 포도당에 사용되는 물고기와 평행을 이복으로 옮기는 것으로 나타났다. 우리는 혈액 포도당 수준을 측정하고, 실험을 수행하고, 4 및 8 주 치료 (박스)를 받은 후 조직을 수집했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 혈액 포도당 수준은 치료의 4 그리고 8 주 후에 상승됩니다. (A)포도당 처리된 물고기는 물과 매니톨 처리된 대조어에 비해 혈당의 3배 이상을 가지며, 상당한 증가(p = 0.029 at 4주, p< 0.001 8주). 이것은 포도당으로 취급된 제브라피쉬가 고혈당이었다는 것을 4- 8 주 둘 다 후에 의미합니다. 데이터는 n = 5 매니톨 처리 물고기, n = 8 포도당 처리 물고기, 및 n = 3 물 대조어에서 4 주에 수집되었다; n = 5 매니톨 처리 물고기, n = 10 포도당 처리 물고기, 그리고 n = 7 8 주에 물 처리 물고기. (B)우리가 혈당 수치를 측정하는 데 사용하는 제브라피시와 자유형 라이트 혈당 계측기의 시각적 표현. 혈당 수치는 물고기가 0.02% 트리카인 용액으로 마취되고 참수된 후 심장 혈액 샘플에서 측정됩니다. 값은 ± SE. 별표는 * = p < 0.05의 중요한 차이를 나타냅니다. = p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 포도당 처리 된 제브라피시에서 GFAP 수치가 증가합니다. 포도당 처리 된 제브라피쉬는(A)신경교 세동 산성 단백질 (GFAP; 1:1000) 및(B)Rel-A (NfK-B; 1:1000)의 수준을 증가하여 서양 얼룩의 밀도 분석에서 결정하였다. β 액틴(1:1000)은 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. Rel-A 수준의 증가는 유의했습니다 (p < 0.003, 별표). W = 수처리 대조군, G = 포도당 처리, M = 매니톨 처리. W2, G2, M2는 W, G 및 M용으로 복제됩니다. 이것은 반응성 글리오증을 일으키는 원인이 되는 고혈당 얼룩말fish에 있는 망막에 모욕이 있다는 것을 건의합니다. (그림 7에서수정, Tanvir 외, 201830,CC-BY 라이센스의 조건에 따라 원래 게시). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 포도당 처리된 물고기에서 ERG 반응이 감소됩니다. (A)대표적인 ERG 는 포도당 처리(빨강), 매니톨 처리(녹색), 및 수처리(블랙) 제브라피쉬 망막으로부터 붉은 색 적응 배경에 570nm 자극을 불러일으켰다. 글루타민산 수용체 차단제 CNQX(50μM)는 광수용체 및 ON 양극성 세포 반응을 격리하기 위한 목욕 용액에 존재하였다. 단위: y축 = μV, x축 = 시간. 제곱파 펄스는 광 펄스의 지속 시간을 반영합니다. (B)반응 진폭의 변화를 정량화합니다. 광수용체 a-waves(a1 진폭, 오른쪽)에 대한 정규화된 반응 진폭을 의미하며, 정사각형 광 펄스의 시작 시 피크 하향 편향으로 측정되고, 양극성 세포 b-waves(b2 진폭, 왼쪽)는 광 펄스 동안 트로프에서 피크까지 측정한다. 두 값 모두 포도당 대 매니톨 처리 조직에서 현저히 감소하였다(p < 0.001 a1, p < 0.0001 p2; n = 14 눈 치료 당). 값은 수처리 제어로 정규화되었습니다. 이것은 그밖 당뇨병 동물 모형 (설치류와 같은) 및 당뇨병을 가진 인간에서 일치합니다. (그림 4에서 가져온, Tanvir 외. 201830,CC-BY 라이센스의 조건에 따라 원래 게시). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
당뇨병은 전국적인 문제입니다. 연구에 따르면 2030년까지 약 4억 명이 당뇨병을 앓고 있습니다. 설치류 모델에서, 타입-2 DM은 유전 조작을 사용하여 공부됩니다. 쥐에서는, 주커 당뇨성 지방쥐 (ZDF), 그리고 오츠카 롱 에반스 도쿠시마 지방 쥐 (OLETF), 타입-2 DM10의효력에 대한 자세한 정보를 제공하고 있습니다. 또한, 고지방 식단은 고혈당증을 유도하기 위해 설치류에 사용되어 왔다. 이것은 이 백서에 제안된 비침범성 절차를 반영합니다. 우리의 비침습적 프로토콜을 사용하여, 우리는 최대 8 주 동안 고혈당증을 유도할 수 있습니다, 그러므로 그렇지 않으면 건강한 얼룩말fish에 있는 연장된 고혈당증을 시뮬레이션합니다.
혈당을 측정한 후, 조직(망막과 뇌)은 후속 분석을 위해 수집될 수 있다. 전세전(ERG) 레코딩과 같은 생리학적 차이는 망막안구컵(21,30)에서직접 측정할 수 있다. 행동 반응(즉, 광운동 반응 또는 인지 차이(Rowe et al., 2020)은 혈당 측정 전에 평가될 수 있다. 단백질 수준의 웨스턴 블롯 측정을 위해 조직은 RIPA 버퍼 또는 플래시 냉동에 배치되어 -80 °C에 저장됩니다. 크기/단백질 함량의 차이로 인해 분석 전에 여러 망막이 풀려야 할 수도 있습니다. 면역 세포화학의 경우, 조직은 24시간 동안 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정된 다음 동결 된 단면(20 μm)까지 전에 30% 자당 용액으로 평형화됩니다.
결과를 최적화하기 위해, 신중하게 매니톨과 포도당을 모두 무게, 그리고 솔루션이 철저하게 혼합되어 있는지 확인합니다. 또한 설탕과 물이 매일 그리고 하루 중 동시에 번갈아 가며 있는지 확인하기 위해 전송 일의 활성 일정을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 또한, 너무 적거나 너무 많이 용액의 농도를 변경할 수 있기 때문에 신중하게 물을 측정해야합니다. 마지막으로, 물고기를 극단적 인 솔루션으로 옮기는 것이 물고기를 충격에 빠시키고 사망을 일으킬 수 있으므로 pH및 솔루션의 온도를 주의 깊게 모니터링합니다. 포도 당 노출 장기간 또는 포도 당의 높은 농도 증거가 있다, 점차적으로 노출 될 때, 제브라피시에 독성 효과. 프로토콜을 올바르게 따르는 경우 제브라피시의 불필요한 사망은 예상되지 않아야 합니다.
이것은 고혈당증을 유도하는 입증된 방법이지만,이 프로토콜의 한계는 물고기가 희생 될 때까지 고혈당임을 확인할 수 없다는 것입니다. 또 다른 제한은 우리가 췌장 또는 인슐린 수준을 평가하지 않으며, 그러므로, 우리는 타입-2 당뇨병을 유도하기 위하여 주장할 수 없다는 것입니다, 단지 우리가 고혈당증을 유도한다는 것입니다. 그러나, 이것은 또한 경쟁 방법 보다는 이 절차를 더 좋게 만드는 무슨입니다: 비 침략적입니다. 우리는 설치류 모형 및 당뇨병 개별에서 보고되는 이 프로토콜에 의해 유도된 장기간 고혈당증의 합병증을 관찰했습니다. 미래에는 이 절차를 사용하여 망막증과 같은 DM의 증상을 완화하는 데 도움이되는 치료 기술을 볼 수 있습니다.
요약하자면, 이 비침습적 번갈아 침지 프로토콜은 최대 8주 동안 고혈당증을 유도하는 효과적인 방법입니다. 이 방법은 만성 고혈당증의 합병증을 검사하고 치료 치료의 후속 결정을 할 수있는 강력한 도구입니다. 그것은 또한 모형 유기체에 걸쳐 생물 의학 연구 사실 인정을 비교하는 기회를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는이 프로토콜의 개발에 대한 VPC, CJR 및 MCP를 인정하고 싶습니다. EMM은 이 연구를 수행하기 위해 미국 예술 과학 대학원 학생 지원 대학에서 재정 지원을 받았습니다. 이 작품은 또한 미국 대학 교수 멜론 상과 예술 과학의 미국 대학 대학을 통해 자금에 의해 지원되었다 (모두 VPC에).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airline Tubing | petsmart | 5291863 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airpump | petsmart | 5094984 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airstones | petsmart | 5149683 | This can be used in the tank to circulate air |
| D-glucose | Sigma | G8270-5KG | |
| D-mannitol | Acros Organics | AC125340050 | |
| Freestyle Lite Meter | Amazon | B01LMOMLTU | |
| Freestyle Lite Strips | Amazon | B074ZN3H2Z | |
| Net | petsmart | 5175115 | |
| Tanks | Amazon | B0002APZO4 |
References
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