Summary
Dieses Protokoll induziert nichtinvasiv Hyperglykämie bei Zebrafischen für bis zu 8 Wochen. Mit diesem Protokoll kann eine eingehende Untersuchung der nebenwirkungen von Hyperglykämie durchgeführt werden.
Abstract
Zebrafische (Danio rerio) sind ein hervorragendes Modell, um die Auswirkungen der chronischen Hyperglykämie, einem Kennzeichen des Typ-II-Diabetes Mellitus (T2DM), zu untersuchen. Dieses alternative Immersionsprotokoll ist eine nichtinvasive, schrittweise Methode zur Induktion von Hyperglykämie für bis zu acht Wochen. Erwachsene Zebrafische werden abwechselnd 24 Stunden lang Zucker (Glukose) und Wasser ausgesetzt. Der Zebrafisch beginnt die Behandlung in einer 1% igen Glukoselösung für 2 Wochen, dann einer 2% igen Lösung für 2 Wochen und schließlich einer 3% igen Lösung für die restlichen 4 Wochen. Im Vergleich zu wasserbehandelten (Stress) und mannitolbehandelten (osmotischen) Kontrollen haben glukosebehandelte Zebrafische signifikant höhere Blutzuckerspiegel. Die mit Glukose behandelten Zebrafische zeigen blutzuckerwerte, die 3-mal so hoch sind wie die der Kontrollen, was darauf hindeutet, dass nach vier und acht Wochen hyperglykämie erreicht werden kann. Anhaltende Hyperglykämie war mit einem erhöhten Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) und einem erhöhten Kernfaktor Kappa B (NF-kB) in der Netzhaut und verminderten physiologischen Reaktionen sowie kognitiven Defiziten verbunden, die darauf hindeuten, dass dieses Protokoll zur Modellierung von Krankheitskomplikationen verwendet werden kann.
Introduction
Zebrafische (Danio rerio) werden schnell zu einem weit verbreiteten Tiermodell, um sowohl Krankheiten als auch Kognition zu untersuchen1. Die Leichtigkeit der genetischen Manipulation und die embryonale Transparenz durch die frühen Entwicklungsstadien machen sie zu einem erstklassigen Kandidaten, um menschliche Krankheiten mit einer bekannten genetischen Grundlage zu untersuchen. Zum Beispiel wurden Zebrafische verwendet, um Holt-Oram-Syndrom, Kardiomyopathien, glomerulozystische Nierenerkrankungen, Muskeldystrophie und Diabetes mellitus (DM) unter anderenKrankheiten zuuntersuchen 1 . Darüber hinaus ist das Zebrafischmodell aufgrund der geringen Größe der Art, der Wartungsfreundlichkeit und der hohen Fruchtbarkeit2,3ideal.
Die Zebrafisch-Bauchspeicheldrüse ist sowohl anatomisch als auch funktionell der Säugetier-Bauchspeicheldrüse ähnlich4. So machen die einzigartigen Eigenschaften von Größe, hoher Fruchtbarkeit und ähnlichen endokrinen Strukturen Zebrafische zu einem geeigneten Kandidaten für die Untersuchung von DM-bedingten Komplikationen. Beim Zebrafisch gibt es zwei experimentelle Methoden, um die für DM charakteristische verlängerte Hyperglykämie zu induzieren: einen Zustrom von Glukose (Modellierung Typ 2) und die Beendigung der Insulinsekretion (Modellierung Typ 1)5,6. Um die Insulinsekretion zu stoppen, können Pankreas- β-Zellen experimentell entweder mit Streptozotocin (STZ) oder Alloxan-Injektionen chemisch zerstört werden. STZ wurde erfolgreich bei Nagetieren und Zebrafischen eingesetzt, was zu Komplikationen im Zusammenhang mit Retinopathie7,8,9, kognitivenBeeinträchtigungen10und Gliedmaßenregeneration11führte . Bei Zebrafischen regenerieren sich jedoch β-Zellen nach der Behandlung, was dazu führt, dass "Booster-Injektionen" von STZ notwendig sind, um diabetischeErkrankungen aufrechtzuerhalten 12. Alternativ kann die Bauchspeicheldrüse des Zebrafisches entfernt werden6. Dies sind sowohl hochinvasive Verfahren, aufgrund der mehrfachen Injektionen, als auch eine lange Erholungszeit.
Umgekehrt kann Hyperglykämie nichtinvasiv durch Exposition gegenüber exogener Glukose induziert werden. In diesem Protokoll werden Fische für 24 Stunden5,13 oder kontinuierlich für 2 Wochen 14,15, 16in eine hochkonzentrierte Glukoselösung getaunken. Exogene Glukose wird transdermal, durch Einnahme und/ oder über die Kiemen aufgenommen, was zu erhöhten Blutzuckerspiegeln führt. Da diese nicht-invasive Technik den Insulinspiegel nicht direkt manipuliert, kann sie nicht behaupten, Typ-2-DM zu induzieren. Es kann jedoch verwendet werden, um Komplikationen zu untersuchen, die durch Hyperglykämie induziert werden, die eines der Hauptsymptome von Typ 2 DM ist.
Vor kurzem wurde die Zebrafischmutante pdx1-/- durch Manipulation des Pankreas- und Zwölffingerdarm-Homöobox-1-Gens entwickelt, einem Gen, das mit der genetischen Ursache von Typ 2 DM beim Menschen verbunden ist. Mit dieser Mutante konnten Forscher Pankreasentwicklungsstörungen, hohen Blutzucker replizieren und Hyperglykämie-induzierte diabetische Retinopathieuntersuchen 17,18.
In diesem Artikel beschreiben wir eine nichtinvasive Hyperglykämie-Induktionsmethode, die ein alternierendes Immersionsprotokoll verwendet. Dieses Protokoll hält hyperglykämische Zustände für bis zu 8 Wochen aufrecht, wobei nachfolgende Komplikationen beobachtet werden. Kurz gesagt, erwachsene Zebrafische werden für 24 Stunden in eine Zuckerlösung und dann für 24 Stunden in eine Wasserlösung gelegt. Im Gegensatz zum kontinuierlichen Eintauchen in externe Glukoselösungen ahmt der Wechsel zwischen Zucker und Wasser den Anstieg und Abfall des Blutzuckers bei Diabetes nach. Ein alternierendes Glukoseprotokoll ermöglicht es zusätzlich, Hyperglykämie über längere Zeiträume zu induzieren, da die Zebrafische die hohen äußeren Glukosebedingungen nicht so gut kompensieren können. Als Beweis für das Prinzip liefern wir Daten, die zeigen, dass Hyperglykämie, die mit diesem Protokoll induziert wird, die Netzhautchemie und -physiologie verändert.
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Protocol
Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der American University genehmigt.
1. Vorbereitung der Lösungstanks
- Erhalten Sie sechs Tanks, zwei für jede experimentelle Gruppe (Glukose, Mannit und Wasser). Kennzeichnen Sie einen der beiden Tanks als "Gehäusetank" (er wird den Fisch beherbergen) und beschriften Sie den anderen "Lösungstank" (er enthält die Lösung).
HINWEIS: Die Mannitol-Behandlungsgruppe ist die osmotische Kontrolle, und die Wasseraufbereitungsgruppe ist eine Handhabungs- / Stresskontrolle. Es ist wichtig, die Tanks, Fluggesellschaften / Luftsteine, Deckel und Reinigungsmittel für jede Behandlungsgruppe getrennt zu halten - Verwenden Sie einen 2-L-Tank, wenn die Gesamtzahl der verwendeten Fische weniger als 20 beträgt. Verwenden Sie einen 4-L-Tank, wenn die Gesamtzahl der verwendeten Fische mehr als 20 beträgt.
HINWEIS: Verwenden Sie ein N von 5-10 pro Behandlungsgruppe und Probenahmezeitpunkt. - Halten Sie die Tanks in einem Wasserbad bei 28-29 °C, um die Wassertemperatur zu halten.
- An Tag 1 legen Sie die Fische für 24 Stunden in ihre jeweiligen Behandlungslösungen (Glukose, Mannit, Wasser) ("Water to Treatment"). An Tag 2 die Fische für 24 Stunden von ihren Behandlungslösungen ins Wasser überführen ("Treatment to Water"). Am Tag 3 den Fisch vom Wasser zu Behandlungslösungen ("Water to Treatment") überführen. Diese alternierende Exposition setzt sich für den Rest des Experiments fort (Abbildung 1). Übertragen Sie wasserbehandelte Kontrollfische täglich von Wasser zu Wasser.
- Stellen Sie sicher, dass die Fische während der gesamten Dauer des Experiments jeden Tag innerhalb desselben 2-Stunden-Fensters gefüttert und übertragen werden.
2. Zubereitung des Fisches
- Verwenden Sie erwachsene Zebrafische (4 Monate – 1 Jahr)5.
- Füttern Sie die fischgemahlenen Tetraminflocken täglich bei der Ankunft im Labor.
- Notieren Sie den pH-Wert und die Temperatur aller Becken und zeichnen Sie den Allgemeinzustand der Fische auf.
3. Übertragen von Fischen
- Übertragen Sie Fische in jeder Behandlungsgruppe mit einem Standardfischnetz aus dem Haltungsbecken in das entsprechende Lösungsbecken.
- Stellen Sie den Tank mit dem Fisch wieder in das Wasserbad, ersetzen Sie den Luftstein und den Tankdeckel. Dieser Tank ist jetzt der "Wohntank" und der Tank, in dem sich der Fisch zuvor befand, ist jetzt der "Lösungstank".
- Entsorgen Sie die alte Lösung und reinigen Sie den Tank zusammen mit den Tankdeckeln, Fluggesellschaften, Luftsteinen und Netzen, um die Ansammlung von Glukose und Mannit zu verhindern.
HINWEIS: Waschen Sie Gegenstände nicht mit Seife. Verwenden Sie Wasser und eine spezielle Peelingbürste / Schwamm für jede Behandlungsbedingung, um die Tanks richtig zu reinigen. - Trocknen Sie die neu gereinigten "Lösungstanks" mit einem Papiertuch. Bereiten Sie die Lösungen für den nächsten Tag mit diesem Tank vor. Stellen Sie sicher, dass die anderen Gegenstände getrocknet und durch geeignete Behandlungsgruppen getrennt sind.
HINWEIS: Führen Sie ein Protokoll darüber, aus welchen Lösungen die Fische jeden Tag transferiert werden, sowie die Lösungen, die für den nächsten Tag vorbereitet werden. Zum Beispiel: Fisch von Glukose aufH2O übertragen, neue 1% ige Glukoselösung, die für morgen vorbereitet ist.
4. Vorbereitung der Lösung nach dem Transfer
- Herstellung von Zuckerlösungen
- Füllen Sie jeden Lösungstank mit 2 L (oder 4 L) Systemwasser (Systemwasser ist definiert als Wasser, das mit dem richtigen Verhältnis von Salzlösung behandelt wurde und die gleiche Temperatur wie Lager- und Behandlungstanks hat).
- Messen Sie die richtige Menge an Glukose und Mannit (siehe Schritt 5 unten) mit einer Top-Ladewaage und separaten Wiegebooten für jede Chemikalie.
- Geben Sie die gewogene Glukose oder Mannitol aliquot in den entsprechenden, gereinigten Lösungstank, der nur Systemwasser enthält.
- Rühren Sie die Glukose- und Mannitollösungen mit separaten Glasrührstäben um, bis die Zucker vollständig aufgelöst sind.
- Die Lösungstanks werden in das Wasserbad zurückgelegen und mit den entsprechenden Deckeln abgedeckt.
- Vorbereitung von Wasserlösungen
- Füllen Sie Versuchstanks (2 L oder 4 L) mit Systemwasser.
- Bringen Sie diese "Lösungstanks" in das Wasserbad zurück und bedecken Sie sie mit den entsprechenden Deckeln.
5. Prozentsätze ändern
- Halten Sie den Fisch in einer 1% igen Lösung während der ersten 2 Wochen der Behandlung: 40 g Glukose oder Mannit in einem 4 L Tank.
- Halten Sie den Fisch in einer 2% igen Lösung während der Wochen 3 und 4 der Behandlung: 80 g Glukose oder Mannit in einem 4 L Tank.
- Halten Sie den Fisch in einer 3% igen Lösung für die letzten 4 Wochen der Behandlung: 120 g Glukose oder Mannit in einem 4 L Tank.
6. Blutzuckerspiegel messen und Gewebe sammeln
- Betäuben Sie Fische 2 auf einmal in einer 0,02% igen Tricainlösung.
- Enthaupten Sie den Fisch direkt hinter den Kiemen mit einer Rasierklinge.
- Blutzuckerwert messen.
HINWEIS: Wir verwenden ein Blutzuckermessgerät (z.B. Freestyle Lite) zur Blutzuckermessung und legen den Teststreifen direkt auf das exponierte Herz (Herzblutprobe). - Sezieren Sie das gewünschte Gewebe aus dem Fisch (Gehirn, Muskel usw.).
- Lagern Sie gesammeltes Gewebe durch Schockgefrieren auf Trockeneis und Lagern in einem -80 °C-Gefrierschrank, fixieren Sie es in 4% Paraformaldehyd oder legen Sie es zur sofortigen Verwendung in eine Pufferlösung.
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Representative Results
Unter Verwendung dieses Protokolls (Abbildung 1) sind die Blutzuckerwerte sowohl nach 4- als auch nach 8-wöchiger Behandlung signifikant erhöht (Abbildung 2A), wobei hyperglykämie als 3x der Kontrollmittelwerte sowohl von wasserbehandelten als auch von Mannitol-behandelten Gruppen definiert ist. Wasserbehandelte Steuerungen werden täglich in und aus dem Wasser übertragen, um eine Stress- / Handhabungskontrolle zu bieten. Mannitol dient als osmotische Kontrolle in in vitro Glukosestudien19,20, da es ein 6-Kohlenstoff-Zucker wie Glukose ist, aber nicht von Zellen aufgenommen wird. Um mit diesen Studien und anderen Studien an Zebrafisch21in Einklang zu stehen, verabreichten wir Mannit in den gleichen Konzentrationen wie Glukose, um festzustellen, ob die beobachteten Wirkungen auf die hohe Osmolarität zurückzuführen waren, die sich aus der Glukoseexposition oder einer glukosespezifischen Wirkung ergab.
Der Blutzucker wird gemessen, indem der Fisch mit 0,02% Tricain betäubt wird, bis sich die Kiemenbewegungen verlangsamt haben, und dann enthauptet wird. Der blutzuckermessierte Blutzuckerspiegel , gemessen mit einem Blutzuckermessgerät (Abbildung 2B), wird bestimmt, indem der Glucometer-Teststreifen direkt auf das punktierte Herz (d. H. Herzblut) gelegt wird.
Netzhautgewebe, das nach 4 Wochen Hyperglykämie gesammelt wurde, zeigt einen Anstieg des Spiegels des Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) (Abbildung 3A). Die GFAP-Expression wird in Muller-Gliazellen in der Netzhaut beobachtet, die bei diabetischer Retinopathie verändert sind22,23. Erhöhte GFAP-Gehalte und/oder Immunreaktivitätsmuster werden auch bei STZ-induzierten diabetischen Ratten24,25,26,27,28, pdx1- mutierten Fischen17und in Netzhäuten von diabetischen Menschen29beobachtet. Dieser Anstieg der GFAP ist mit einem Anstieg des Kernfaktors Kappa B (NF-kB) verbunden (Abbildung 3B)30, was darauf hindeutet, dass die hyperglykämie, die bei Zebrafischen unter Verwendung des alternativen Immersionsprotokolls induziert wird, eine Entzündungsreaktion und reaktive Gliose auslöst. ERG-Aufzeichnungen nach 4-wöchiger Behandlung identifizierten ein vermindertes Ansprechen der mit Glukose behandelten Netzhaut im Vergleich zu mannitolbehandelten Kontrollen (Abbildung 4A). Die Amplituden sowohl der a-Wellen- (Photorezeptor) als auch der b-Wellen-Komponenten (bipolare Zellen) sind bei hyperglykämischen Fischen verringert(Abbildung 4B). Diese veränderten ERG-Reaktionen korrelieren mit spezifischen Veränderungen der roten und/oder grünen Zapfen30,21, die besonders empfindlich auf hyperglykämische Beleidigungen reagieren. Veränderte ERG-Reaktionen werden auch in Tiermodellen von Diabetes31,32,33,34,35und diabetischen Menschen beobachtet. Glukosebehandelte Zebrafische zeigen auch eine verminderte kognitive Leistungsfähigkeit (siehe Rowe et al., 2020, in dieser Ausgabe), was darauf hindeutet, dass eine verlängerte Hyperglykämie auch zu kognitiven Funktionsdefiziten führt, die auch bei älteren Diabetikern berichtet werden.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des alternativen Immersionsprotokolls. Dies ist eine visuelle Darstellung des Transferprozesses. Fische werden in 1% iger Lösung für 2 Wochen, 2% iger Lösung für 2 Wochen und dann 3% ige Lösung für die restlichen 4 Wochen gehalten. Jeden Tag werden Fische entweder in Zucker oder Wasserlösung überführt. Die Kontrollbehandlungen übertragen Fische alle 24 Stunden in und aus dem Wasser (0% Glukose - Handhabungskontrolle) oder in und aus Mannitol (osmotische Kontrolle), wobei die Mannitolkonzentrationen denen entsprechen, die für Glukose verwendet werden. Wir haben den Blutzuckerspiegel gemessen, Experimente durchgeführt und nach 4 und 8 Wochen Behandlung Gewebe gesammelt (verpackt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Der Blutzuckerspiegel ist nach 4 und 8 Wochen Behandlung erhöht. (A) Die mit Glukose behandelten Fische haben mehr als das 3-fache der Blutzuckermenge im Vergleich zu wasser- und Mannitol-behandelten Kontrollfischen, ein signifikanter Anstieg (p = 0,029 nach 4 Wochen; p < 0,001 nach 8 Wochen). Dies bedeutet, dass sowohl nach 4- als auch nach 8-Wochen die mit Glukose behandelten Zebrafische hyperglykämisch waren. Die Daten wurden von n = 5 mit Mannitol behandelten Fischen, n = 8 glukosebehandelten Fischen und n = 3 Wasserkontrollfischen nach 4 Wochen gesammelt; n = 5 mannitolbehandelte Fische, n = 10 glukosebehandelte Fische und n = 7 wasserbehandelte Fische nach 8 Wochen. (B) Eine visuelle Darstellung eines Zebrafisches und des Freestyle Lite Blutzuckermessgeräts, mit dem wir den Blutzuckerspiegel messen. Der Blutzuckerspiegel wird aus einer Herzblutprobe gemessen, nachdem die Fische in einer 0,02% igen Tricainlösung betäubt und enthauptet wurden. Werte sind Mittelwerte ± SE. Sternchen bezeichnen signifikante Unterschiede, wobei * = p < 0,05; = p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die GFAP-Spiegel sind bei mit Glukose behandelten Zebrafischen erhöht. Glukosebehandelte Zebrafische haben erhöhte Spiegel von (A) Gliafibrillary Acidic Protein (GFAP; 1:1000) und (B) Rel-A (NfK-B; 1:1000), wie aus der Densitometrie-Analyse von Western Blots bestimmt. β-Aktin (1:1000) diente als Ladekontrolle. Der Anstieg der Rel-A-Werte war signifikant (p < 0,003, Sternchen). W = wasserbehandelte Kontrolle, G = glukosebehandelt, M = Mannitol-behandelt. W2, G2, M2 sind Replikate für W, G und M. Dies deutet darauf hin, dass es eine Beleidigung der Netzhaut bei hyperglykämischen Zebrafischen gibt, die eine reaktive Gliose verursacht. (Modifiziert aus Abbildung 7,Tanvir et al., 201830,ursprünglich unter den Bedingungen einer CC-BY-Lizenz veröffentlicht). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die ERG-Reaktion ist bei mit Glukose behandelten Fischen reduziert. (A) Repräsentative ERG-Spuren von glukosebehandelten (rot), mannitolbehandelten (grün) und wasserbehandelten (schwarzen) Zebrafisch-Netzhäuten, die mit einem 570-mm-Reiz auf rotem Hintergrund evoziert werden. Der Glutamatrezeptorblocker CNQX (50μM) war in der Badelösung vorhanden, um Photorezeptor- und ON-bipolare Zellreaktionen zu isolieren. Einheiten: y-Achse = μV, x-Achse = Zeit. Der Rechteckwellenpuls reflektiert die Dauer des Lichtpulses. (B) Quantifizierung von Änderungen der Ansprechamplituden. Mittlere normalisierte Antwortamplituden für Photorezeptor-a-Wellen (a1-Amplitude, rechts), gemessen als maximale Abwärtsablenkung zu Beginn des quadratischen Lichtpulses, und bipolare Zell-B-Wellen (b2-Amplitude, links), gemessen von Trog zu Spitze während des Lichtpulses. Beide Werte waren signifikant in Glukose- vs. Mannitol-behandelten Geweben reduziert (p < 0,001 für a1; p < 0,0001 für b2; n = 14 Augen pro Behandlung). Die Werte wurden auf die wasserbehandelte Kontrolle normalisiert. Dies stimmt mit anderen diabetischen Tiermodellen (wie Nagetieren) und bei Menschen mit Diabetes überein. (Entnommen aus Abbildung 4, Tanvir et al. 201830, ursprünglich unter den Bedingungen einer CC-BY-Lizenz veröffentlicht). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diabetes ist ein bundesweites Problem. Studien zeigen, dass bis 2030 schätzungsweise 400 Millionen Menschen irgendeine Form von Diabetes haben werden. In Nagetiermodellen wird Typ 2 DM mittels genetischer Manipulation untersucht. Bei Ratten liefern die Zucker diabetischen Fettratten (ZDF) und die Otsuka Long-Evans Tokushima Fettratten (OLETF) weitere Informationen über die Wirkung von Typ 2 DM10. Darüber hinaus wurden fettreiche Diäten bei Nagetieren verwendet, um Hyperglykämie zu induzieren. Dies spiegelt das in diesem Papier vorgeschlagene nichtinvasive Verfahren wider. Mit unserem nichtinvasiven Protokoll können wir Hyperglykämie für bis zu 8 Wochen induzieren und so eine verlängerte Hyperglykämie bei ansonsten gesunden Zebrafischen simulieren.
Nach der Blutzuckermessung kann Gewebe (Netzhaut und Gehirn) zur anschließenden Analyse entnommen werden. Physiologische Unterschiede, wie z.B. Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen, können direkt aus Netzhautaugenbechern gemessen werden21,30. Verhaltensreaktionen (d.h. optomotorische Reaktionen oder kognitive Unterschiede (Rowe et al., 2020) können vor der Blutzuckermessung beurteilt werden. Zur Bestimmung des Proteingehalts des Western Blot wird das Gewebe in den RIPA-Puffer gelegt oder flashgefroren und bei -80 °C gelagert. Aufgrund von Größen-/Proteingehaltsunterschieden müssen vor der Analyse möglicherweise mehrere Netzhäute gepoolt werden. Für die Immunzytochemie wird das Gewebe für 24 Stunden in einer 4% igen Paraformaldehydlösung fixiert und dann in einer 30% igen Saccharoselösung vor dem Einfrieren (20 μm) ausgeglichen.
Um die Ergebnisse zu optimieren, wägen Sie sowohl Mannit als auch Glukose sorgfältig ab und stellen Sie sicher, dass die Lösungen gründlich gemischt werden. Es ist auch sehr wichtig, einen aktiven Zeitplan der Transfertage einzuhalten, um sicherzustellen, dass zucker und wasser sich täglich und zur gleichen Tageszeit abwechseln. Achten Sie außerdem darauf, das Wasser sorgfältig zu messen, da zu wenig oder zu viel die Konzentration der Lösung verändern kann. Überwachen Sie schließlich sorgfältig den pH-Wert und die Temperatur der Lösungen, da die Übertragung von Fischen in extreme Lösungen die Fische schockieren und Sterblichkeit verursachen kann. Es gibt keine Hinweise darauf, dass eine längere Glukoseexposition oder hohe Glukosekonzentrationen, wenn sie allmählich exponiert werden, toxische Wirkungen auf Zebrafische haben. Wenn das Protokoll korrekt befolgt wird, ist kein Fremdsterben des Zebrafisches zu erwarten.
Während dies eine bewährte Methode zur Induktion von Hyperglykämie ist, besteht eine Einschränkung dieses Protokolls darin, dass man erst nach dem Opfer feststellen kann, dass die Fische hyperglykämisch sind. Eine weitere Einschränkung ist, dass wir den Bauchspeicheldrüsen- oder Insulinspiegel nicht beurteilen und daher nicht behaupten können, Typ-2-Diabetes zu induzieren, sondern nur, dass wir Hyperglykämie induzieren. Dies ist jedoch auch das, was dieses Verfahren besser macht als konkurrierende Methoden: Es ist nicht-invasiv. Wir haben Komplikationen einer verlängerten Hyperglykämie beobachtet, die durch dieses Protokoll induziert werden und in Nagetiermodellen und Diabetikern berichtet werden. In Zukunft ist es möglich, dass wir dieses Verfahren verwenden können, um therapeutische Techniken zu betrachten, die helfen, Symptome von DM, wie Retinopathie, zu lindern.
Zusammenfassend ist dieses nichtinvasive alternierende Immersionsprotokoll ein effektiver Weg, um Hyperglykämie für bis zu 8 Wochen zu induzieren. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug, mit dem die Komplikationen der chronischen Hyperglykämie untersucht und anschließend therapeutische Behandlungen bestimmungsweisen können. Es bietet auch die Möglichkeit, biomedizinische Forschungsergebnisse über Modellorganismen hinweg zu vergleichen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir möchten VPC, CJR und MCP für die Entwicklung dieses Protokolls danken. EMM erhielt finanzielle Unterstützung vom American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support, um diese Forschung durchzuführen. Diese Arbeit wurde auch durch einen Mellon Award der American University Faculty und eine Finanzierung durch das American University College of Arts and Sciences (beide an VPC) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airline Tubing | petsmart | 5291863 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airpump | petsmart | 5094984 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airstones | petsmart | 5149683 | This can be used in the tank to circulate air |
| D-glucose | Sigma | G8270-5KG | |
| D-mannitol | Acros Organics | AC125340050 | |
| Freestyle Lite Meter | Amazon | B01LMOMLTU | |
| Freestyle Lite Strips | Amazon | B074ZN3H2Z | |
| Net | petsmart | 5175115 | |
| Tanks | Amazon | B0002APZO4 |
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