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Neuroscience

Inmersión alternativa en glucosa para producir hiperglucemia prolongada en el pez cebra

Published: May 5, 2021 doi: 10.3791/61935
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1
1Department of Biology, American University, 2Center for Behavioral Neuroscience, American University, 3Department of Chemistry, American University

Summary

Este protocolo no invasiva induce hiperglucemia en el pez cebra durante un tiempo de hasta 8 semanas. Usando este protocolo, un estudio profundizado de los efectos nocivos de la hiperglucemia puede ser hecho.

Abstract

Los peces cebra(Danio rerio)son un excelente modelo para investigar los efectos de la hiperglucemia crónica, un sello distintivo de la Diabetes Mellitus Tipo II (DM2). Este protocolo alternativo de inmersión es un método no invasivo y gradual para inducir la hiperglucemia hasta por ocho semanas. Los peces cebra adultos se exponen alternativamente al azúcar (glucosa) y al agua durante 24 horas cada uno. El pez cebra comienza el tratamiento en una solución de glucosa al 1% durante 2 semanas, luego una solución al 2% durante 2 semanas y, finalmente, una solución al 3% durante las 4 semanas restantes. En comparación con los controles tratados con agua (estrés) y manitol (osmóticos), el pez cebra tratado con glucosa tiene niveles de azúcar en la sangre significativamente más altos. El pez cebra tratado con glucosa muestran niveles de azúcar en la sangre de 3 veces el de los controles, lo que sugiere que después de cuatro y ocho semanas se puede lograr la hiperglucemia. La hiperglucemia continua fue asociada a la proteína ácida fibrilosa glial creciente (GFAP) y a los niveles nucleares crecientes de la Kappa B (N-F-kB) del factor en retina y a respuestas fisiológicas disminuidas, así como los déficits cognoscitivos que sugerían que este protocolo se puede utilizar para modelar complicaciones de la enfermedad.

Introduction

El pez cebra(Danio rerio)se está convirtiendo rápidamente en un modelo animal ampliamente utilizado para estudiar tanto la enfermedad como la cognición1. La facilidad de la manipulación genética y la transparencia embrionaria a través de las primeras etapas del desarrollo, los convierten en un candidato principal para estudiar enfermedades humanas con una base genética conocida. Por ejemplo, el pez cebra se ha utilizado para estudiar el síndrome de Holt-Oram, las cardiomiopatías, la enfermedad renal glomerulocística, la distrofia muscular y la diabetes mellitus (DM) entre otras enfermedades1. Además, el modelo de pez cebra es ideal debido al pequeño tamaño de la especie, la facilidad de mantenimiento y la alta fecundidad2,3.

El páncreas del pez cebra es anatómica y funcionalmente similar al páncreas demamíferos 4. Por lo tanto, las características únicas de tamaño, alta fecundidad y estructuras endocrinas similares hacen del pez cebra un candidato adecuado para estudiar las complicaciones relacionadas con la DM. En el pez cebra, existen dos métodos experimentales utilizados para inducir la hiperglucemia prolongada que es característica de la DM: una afluencia de glucosa (modelado tipo 2) y el cese de la secreción de insulina (modelado tipo 1)5,6. Experimentalmente, para parar la secreción de la insulina, las β-células pancreáticas se pueden destruir químicamente usando las inyecciones del Streptozotocin (STZ) o del Alloxan. STZ se ha utilizado con éxito en roedores y pez cebra, dando lugar a complicaciones asociadas conla retinopatía 7,8,9,deterioro cognitivo10,y la regeneración de extremidades11. Sin embargo, en el pez cebra, las células β se regeneran después del tratamiento, haciendo que las "inyecciones de refuerzo" de STZ sean necesarias para mantener las condiciones diabéticas12. Alternativamente, el páncreas del pez cebra se puede extirpar6. Estos son procedimientos altamente invasivos, debido a las múltiples inyecciones, y un extenso tiempo de recuperación.

Inversamente, la hiperglucemia se puede inducir no invasor con la exposición a la glucosa exógena. En este protocolo, los peces se sumergen en una solución de glucosa altamente concentrada durante 24 horas5,13 o continuamente durante 2 semanas14,15,16. La glucosa exógena se toma por vía transdérmica, por ingestión, y /o a través de las branquias, lo que resulta en niveles elevados de azúcar en la sangre. Dado que esta técnica no invasiva no manipula directamente los niveles de insulina, no puede pretender inducir dm tipo 2. Sin embargo, se puede utilizar para examinar las complicaciones inducidas por la hiperglucemia, que es uno de los principales síntomas de la DM tipo 2.

Recientemente, el mutante de pez cebra pdx1-/- fue desarrollado mediante la manipulación del gen homeobox 1 pancreático y duodenal, un gen vinculado a la causa genética del tipo 2 DM en humanos. Usando este mutante, los investigadores han podido replicar la interrupción del desarrollo pancreático, el alto nivel de azúcar en la sangre y estudiar la retinopatía diabética inducida por hiperglucemia17,18.

En este papel, describimos un método no invasor de la inducción de la hiperglucemia que utilice un protocolo de la inmersión que se alterna. Este protocolo mantiene condiciones hyperglycemic por hasta 8 semanas con las complicaciones subsecuentes observadas. En resumen, los peces cebra adultos se colocan en una solución de azúcar durante 24 horas y luego en una solución de agua durante 24 horas. A diferencia de la inmersión continua en soluciones externas de glucosa, la alternancia de días entre el azúcar y el agua imita el aumento y la caída del azúcar en la sangre en la diabetes. Un protocolo de glucosa alterna, además, permite que la hiperglucemia sea inducida por períodos de tiempo más largos, ya que el pez cebra no es tan capaz de compensar las altas condiciones externas de glucosa. Como prueba del principio, proporcionamos los datos que muestran que la hiperglucemia inducida usando este protocolo altera química y fisiología retinianas.

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Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de american university.

1. Preparación de los tanques de solución

  1. Obtenga seis tanques, dos para cada grupo experimental (glucosa, manitol y agua). Etiquete uno de los dos tanques como "tanque de alojamiento" (albergará el pescado) y etiquete el otro "tanque de solución" (sostendrá la solución).
    NOTA: El grupo de tratamiento de manitol es el control osmótico, y el grupo de tratamiento de agua es un control de manejo / estrés. Es importante mantener los tanques, las líneas aéreas/airstones, las tapas y los suministros de limpieza separados para cada grupo de tratamiento
  2. Utilice un tanque de 2 L si el número total de peces utilizados es menor que 20. Utilice un tanque de 4 L si el número total de peces utilizados es superior a 20.
    NOTA: Utilice un N de 5-10 por grupo de tratamiento por punto de tiempo de muestreo.
  3. Mantenga los tanques en un baño de agua a 28-29 °C para mantener la temperatura del agua.
  4. El día 1, coloque los peces en sus respectivas soluciones de tratamiento (glucosa, manitol, agua) durante 24 horas ('Agua a tratamiento'). El día 2, transfiera los peces de sus soluciones de tratamiento al agua durante 24 horas ('Tratamiento a agua'). El día 3, transfiera los peces del agua a las soluciones de tratamiento ('Agua a tratamiento'). Esta exposición alterna continúa durante el resto del experimento (Figura 1). Transfiera diariamente los peces de control tratados con agua del agua al agua.
  5. Asegúrese de que los peces sean alimentados y transferidos dentro de la misma ventana de 2 horas cada día durante la duración del experimento.

2. Preparación del pescado

  1. Utilizar pez cebra adulto (4 meses – 1 año)5.
  2. Alimente a los peces molidos con escamas tetramin diariamente a su llegada al laboratorio.
  3. Registrar el pH y la temperatura de todos los tanques y registrar el estado general de los peces.

3. Transferencia de peces

  1. Transfiera los peces de cada grupo de tratamiento del tanque de alojamiento al tanque de solución correspondiente utilizando una red de pescado estándar.
  2. Coloque el tanque que contiene los peces de nuevo en el baño de agua, reemplace la piedra de aire y la tapa del tanque. Este tanque es ahora el "tanque de alojamiento" y el tanque que anteriormente contenía el pez es ahora el "tanque de solución".
  3. Deseche la solución vieja y limpie el tanque, junto con las tapas del tanque, las líneas aéreas, las piedras de aire y las redes para evitar la acumulación de glucosa y manitol.
    NOTA: No lave los artículos con jabón. Use agua y un cepillo/esponja de exfoliación dedicado para cada condición de tratamiento para limpiar adecuadamente los tanques.
  4. Seque los "tanques de solución" recién limpiados con una toalla de papel. Prepare las soluciones para el día siguiente utilizando este tanque. Asegúrese de que los demás elementos estén secos y separados por los grupos de tratamiento apropiados.
    NOTA: Mantenga un registro de las soluciones de las que los peces se transfieren fuera y hacia cada día, así como las soluciones que se preparan para el día siguiente. Por ejemplo: Pescado transferido de glucosa aH2O, nueva solución de glucosa al 1% preparada para mañana.

4. Preparación de la solución posterior a la transferencia

  1. Preparación de soluciones de azúcar
    1. Llene cada tanque de solución con 2 L (o 4 L) de agua del sistema (el agua del sistema se define como el agua que ha sido tratada con la proporción correcta de solución salina y está a la misma temperatura que los tanques de stock y tratamiento).
    2. Mida la cantidad correcta de glucosa y manitol (consulte el paso 5 a continuación) utilizando una báscula de carga superior y botes de pesaje separados para cada producto químico.
    3. Agregue la alícuota de glucosa o manitol pesada al tanque de solución limpia apropiado, que contiene solo agua del sistema.
    4. Revuelva las soluciones de glucosa y manitol con barras de agitación de vidrio separadas hasta que los azúcares se disuelvan por completo.
    5. Devolver los tanques de solución al baño de agua y cubrir con sus correspondientes tapas.
  2. Preparación de soluciones de agua
    1. Llene los tanques experimentales (2 L o 4 L) con agua del sistema.
    2. Devuelva estos 'tanques de solución' al baño de agua y cubra con sus tapas correspondientes.

5. Cambio de porcentajes

  1. Mantenga el pescado en una solución al 1% durante las primeras 2 semanas de tratamiento: 40 g de glucosa o manitol en un tanque de 4 L.
  2. Mantener el pescado en una solución al 2% durante las semanas 3 y 4 de tratamiento: 80 g de glucosa o manitol en un tanque de 4 L.
  3. Mantenga el pescado en una solución al 3% durante las últimas 4 semanas de tratamiento: 120 g de glucosa o manitol en un tanque de 4 L.

6. Medición de los niveles de glucosa en sangre y recolección de tejido

  1. Anestesiar los peces 2 a la vez en una solución Tricaine al 0,02%.
  2. Decapitar los peces directamente detrás de las branquias usando una navaja de afeitar.
  3. Mida el valor del azúcar en la sangre.
    NOTA: Utilizamos un medidor de glucosa en sangre (por ejemplo, Freestyle Lite) para medir la glucosa en sangre y colocar la tira reactiva directamente en el corazón expuesto (muestra de sangre cardíaca).
  4. Diseccionar el tejido deseado de los peces (cerebro, músculo, etc.).
  5. Almacene el tejido recolectado mediante congelación repentina sobre hielo seco y almacenamiento en un congelador de -80 °C, fijando en paraformadehído al 4% o colocándolo en una solución tampón para uso inmediato.

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Representative Results

Utilizando este protocolo(Figura 1),los valores de azúcar en sangre se elevan significativamente después de 4 semanas y 8 semanas de tratamiento(Figura 2A),con hiperglucemia definida como 3 veces los promedios de control de los grupos tratados con agua y manitol. Los controles tratados con agua se transfieren dentro y fuera del agua diariamente, proporcionando un control de estrés / manejo. El manitol sirve como un control osmótico en estudios de glucosa in vitro19,20,ya que es un azúcar de 6 carbonos como la glucosa, pero no es tomado por las células. Para ser consistentes con esos estudios, y otros estudios en pez cebra21,administramos manitol en las mismas concentraciones que la glucosa para determinar si los efectos observados se debían a la alta osmolaridad resultante de la exposición a la glucosa o a un efecto específico de la glucosa.

El azúcar en la sangre se mide anestesiando el pescado usando Tricaine al 0.02% hasta que los movimientos de las branquias se hayan ralentizado, y luego decapitando. Los niveles de glucosa en sangre, medidos con un medidor de glucosa en sangre (Figura 2B), se determinan a partir de la colocación de la tira reactiva del glucómetro directamente sobre el corazón perforado (es decir, sangre cardíaca).

El tejido retiniano recolectado después de 4 semanas de hiperglucemia muestra un aumento en los niveles de proteína ácida fibrilosa glial (GFAP) (Figura 3A). La expresión de GFAP se observa en las células gliales de Muller en la retina, que se alteran en la retinopatía diabética22,23. El contenido creciente de GFAP y/o los patrones del immunoreactivity también se observan en ratas diabéticas STZ-inducidas24,25, 26,27,28, pdx1-/- pescado del mutante17,y en retinas de seres humanos diabéticos29. Este aumento de la GFAP se asocia con un aumento de los niveles de factor nuclear Kappa B (NF-kB)(Figura 3B)30,lo que sugiere que la hiperglucemia inducida en el pez cebra mediante el protocolo de inmersión alternativa desencadena una respuesta inflamatoria y gliosis reactiva. Las grabaciones de ERG después de 4 semanas de tratamiento identificaron una respuesta disminuida en retinas glucosa-tratadas comparadas a controles manitol-tratados (figura 4A). Las amplitudes de los componentes de onda a (fotorreceptor) y onda b (células bipolares) disminuyen en peces hiperglucémicos(Figura 4B). Estas respuestas alteradas del ERGIO se correlacionan con cambios específicos en los conos rojos y/o verdes30,21,que parecen particularmente sensibles al insulto hiperglucémico. Las respuestas alteradas del ERGIO también se observan en modelos animales de diabetes31,32,33,34,35 y humanos diabéticos. El pez cebra tratado con glucosa también muestra una disminución del rendimiento cognitivo (ver Rowe et al., 2020, en este número), lo que sugiere que la hiperglucemia prolongada también conduce a déficits de función cognitiva que también se informa en pacientes diabéticos mayores.

Figure 1
Figura 1: Esquema del protocolo de inmersión alternativo. Esta es una representación visual del proceso de transferencia. Los peces se mantienen en solución al 1% durante 2 semanas, solución al 2% durante 2 semanas y luego solución al 3% durante las 4 semanas restantes. Cada día, los peces se transfieren a una solución de azúcar o agua. Los tratamientos de control transfieren peces dentro y fuera del agua (0% de glucosa - control de manejo) cada 24 horas o dentro y fuera del manitol (control osmótico), con concentraciones de manitol paralelas a las utilizadas para la glucosa. Hemos medido niveles de la glucosa en sangre, hemos realizado experimentos, y hemos recogido el tejido después de 4 y 8 semanas del tratamiento (encajonado). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Los niveles de glucosa en sangre se elevan después de 4 y 8 semanas de tratamiento. (A)Los pescados glucosa-tratados tienen más de 3x la cantidad de azúcar de sangre comparada al agua y a los pescados manitol-tratados del control, un aumento significativo (p = 0,029 en 4 semanas; p < 0,001 en 8 semanas). Esto significa que después de 4 y 8 semanas el pez cebra tratado con glucosa era hiperglucemiante. Los datos fueron recogidos de n = 5 pescados tratados manitol, n = 8 pescados glucosa-tratados, y n = 3 pescados del control del agua en 4 semanas; n = 5 pescados manitol-tratados, n = 10 pescados glucosa-tratados, y n = 7 pescados tratados agua en 8 semanas. (B)Una representación visual de un pez cebra y el medidor de glucosa en sangre Freestyle Lite que utilizamos para medir los niveles de glucosa en sangre. Los niveles de azúcar en la sangre se miden a partir de una muestra de sangre cardíaca después de que los peces se anestesian en una solución de tricaina al 0,02% y se decapitan. Los valores son medios ± SE. Los asteriscos denotan diferencias significativas donde * = p < 0,05; = p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Los niveles de GFAP se incrementan en el pez cebra tratado con glucosa. El pez cebra tratado con glucosa ha aumentado los niveles de(A)proteína ácida fibrilosa glial (GFAP; 1:1000) y(B)Rel-A (NfK-B; 1:1000) según lo determinado a partir del análisis de densitometría de manchas azules occidentales. β-actina (1:1000) sirvió como control de carga. El aumento en los niveles de Rel-A fue significativo (p < 0,003, asteriscos). W = control tratado con agua, G = glucosa-tratado, M = manitol-tratado. W2, G2, M2 son réplicas para W, G y M. Esto sugiere que hay insulto a la retina en el pez cebra hiperglucémico que causa gliosis reactiva. (Modificado de la Figura 7,Tanvir et al., 201830, publicado originalmente bajo los términos de una licencia CC-BY). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La respuesta del ERG se reduce en los peces tratados con glucosa. (A)Rastros representativos de ERG de retinas de pez cebra tratadas con glucosa (rojo), tratadas con manitol (verde) y tratadas con agua (negro) evocadas con un estímulo de 570nm sobre un fondo de adaptación rojo. El bloqueador del receptor de glutamato CNQX (50μM) estaba presente en la solución de baño para aislar el fotorreceptor y las respuestas de las células bipolares ON. Unidades: eje y = μV, eje x = tiempo. El pulso de onda cuadrada refleja la duración del pulso de luz. (B) Cuantificación de los cambios en las amplitudes de respuesta. Amplitudes medias de respuesta normalizadas para ondas a fotorreceptoras (amplitud a1, derecha), medidas como la deflexión descendente máxima al inicio del pulso de luz cuadrada, y ondas b de células bipolares (amplitud b2, izquierda), medidas de valle a pico durante el pulso de luz. Ambos valores fueron reducidos perceptiblemente en la glucosa contra los tejidos manitol-tratados (p < 0,001 para a1; p < 0,0001 para b2; n = 14 ojos por el tratamiento). Los valores fueron normalizados al control agua-tratado. Esto es consistente con otros modelos animales diabéticos (como roedores) y en humanos con diabetes. (Tomado de la Figura 4, Tanvir et al. 201830, publicado originalmente bajo los términos de una licencia CC-BY). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Discussion

La diabetes es un problema nacional. Los estudios muestran que para 2030, se estima que 400 millones de personas tendrán algún tipo de diabetes. En modelos de roedores, la DM tipo 2 se estudia mediante manipulación genética. En ratas, las ratas grasas diabéticas de Zucker (ZDF), y las ratas grasas de Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF), están proporcionando más información sobre los efectos del tipo - 2 DM10. Además, las dietas altas en grasas se han utilizado en roedores para inducir hiperglucemia. Esto refleja el procedimiento no invasivo propuesto en este documento. Usando nuestro protocolo no invasor, podemos inducir la hiperglucemia por hasta 8 semanas, por lo tanto simulando hiperglucemia prolongada en el pez cebra de otra manera sano.

Después de medir el azúcar en la sangre, se puede recolectar tejido (retina y cerebro) para su posterior análisis. Las diferencias fisiológicas, como las grabaciones de electrorretinograma (ERG), se pueden medir directamente desde las copas ocularesde la retina 21,30. Las respuestas conductuales (es decir, las respuestas optomotoras o las diferencias cognitivas (Rowe et al., 2020) se pueden evaluar antes de la medición del azúcar en la sangre. Para la determinación de los niveles de proteína de Western Blot, el tejido se coloca en un tampón RIPA o flash congelado y almacenado a -80 °C. Debido a las diferencias en el tamaño/contenido de la proteína, varias retinas pueden tener que ser agrupadas antes de análisis. Para la inmunocitoquímica, el tejido se fija en una solución de paraformadehído al 4% durante 24 horas y luego se equilibra en una solución de sacarosa al 30% antes del seccionamiento congelado (20 μm).

Para optimizar los resultados, sopese cuidadosamente tanto el manitol como la glucosa, y asegúrese de que las soluciones se mezclen a fondo. También es muy importante mantener un horario activo de los días de transferencia, para asegurarse de que el azúcar y el agua se alternn diariamente y a la misma hora del día. Además, asegúrese de medir cuidadosamente el agua, ya que demasiado poco o demasiado puede cambiar la concentración de la solución. Por último, controle cuidadosamente el pH y la temperatura de las soluciones, ya que la transferencia de peces a soluciones extremas puede impactar a los peces y causar mortalidad. No ha habido pruebas de que la exposición prolongada a la glucosa o las altas concentraciones de glucosa, cuando se exponen gradualmente, tenga efectos tóxicos sobre el pez cebra. Si el protocolo se sigue correctamente, no se deben esperar muertes extrañas del pez cebra.

Mientras que éste es un método probado de inducir hiperglucemia, una limitación de este protocolo es que uno no puede comprobar que los pescados son hyperglycemic hasta después de que se sacrifiquen. Otra limitación es que no evaluamos los niveles de páncreas o insulina y, por lo tanto, no podemos pretender inducir diabetes tipo 2, solo que inducimos hiperglucemia. Sin embargo, esto es también lo que hace que este procedimiento sea mejor que los métodos de la competencia: no es invasivo. Hemos observado complicaciones de la hiperglucemia prolongada inducida por este protocolo que se divulgan en modelos del roedor y en individuos diabéticos. En el futuro, es posible que podamos utilizar este procedimiento para observar técnicas terapéuticas que ayudan a aliviar los síntomas de la DM, como la retinopatía.

En resumen, este protocolo de inmersión alterna no invasivo es una forma efectiva de inducir hiperglucemia hasta por 8 semanas. Este método es una herramienta poderosa que permite examinar las complicaciones de la hiperglucemia crónica y la posterior determinación de tratamientos terapéuticos. También ofrece la oportunidad de comparar los resultados de la investigación biomédica entre organismos modelo.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a VPC, CJR y MCP por el desarrollo de este protocolo. EMM recibió apoyo financiero de la American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support para llevar a cabo esta investigación. Este trabajo también fue apoyado por un Premio Mellon de la Facultad de la Universidad Americana y la financiación a través de la American University College of Arts and Sciences (ambos a VPC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Airline Tubing petsmart 5291863 This can be used in the tank to circulate air
Airpump petsmart 5094984 This can be used in the tank to circulate air
Airstones petsmart 5149683 This can be used in the tank to circulate air
D-glucose Sigma G8270-5KG
D-mannitol Acros Organics AC125340050
Freestyle Lite Meter Amazon B01LMOMLTU
Freestyle Lite Strips Amazon B074ZN3H2Z
Net petsmart 5175115
Tanks Amazon B0002APZO4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Retractación Número 171 Danio rerio, Hiperglucemia,Glucosa Retinopatía Inmersión Alterna
Inmersión alternativa en glucosa para producir hiperglucemia prolongada en el pez cebra
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McCarthy, E., Rowe, C. J.,… More

McCarthy, E., Rowe, C. J., Crowley-Perry, M., Connaughton, V. P. Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish. J. Vis. Exp. (171), e61935, doi:10.3791/61935 (2021).

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