Her presenterer vi en protokoll for mikropatternceller ved encellet oppløsning ved hjelp av DNA-programmert vedheft. Denne protokollen bruker en stasjonær fotolitografiplattform for å lage mønstre av DNA-oligonukleotider på en glasssklie og merker deretter cellemembraner med kommersielt tilgjengelige komplementære oligonukleotider. Hybridisering av oligos resulterer i programmert celleadhesjon.
Den relative plasseringen av celler er et sentralt trekk ved mikromiljøet som organiserer cellecelleinteraksjoner. For å studere interaksjonene mellom celler av samme eller annen type, har mikropatterningsteknikker vist seg nyttige. DNA-programmert montering av celler (DPAC) er en mikropatteringsteknikk som retter seg mot vedheft av celler til et substrat eller andre celler ved hjelp av DNA-hybridisering. De mest grunnleggende operasjonene i DPAC begynner med å dekorere cellemembraner med lipidmodifiserte oligonukleotider, og deretter strømme dem over et substrat som har blitt mønstret med komplementære DNA-sekvenser. Celler holder seg selektivt til substratet bare der de finner en komplementær DNA-sekvens. Ikke-tilhengerceller vaskes bort, og avslører et mønster av tilhengerceller. Ytterligere operasjoner inkluderer ytterligere runder med celle-substrat eller cellecelleadhesjon, samt overføring av mønstrene dannet av DPAC til en innebygd hydrogel for langsiktig kultur. Tidligere krevde metoder for mønster av oligonukleotider på overflater og dekorasjon av celler med DNA-sekvenser spesialisert utstyr og tilpasset DNA-syntese. Vi rapporterer en oppdatert versjon av protokollen, ved hjelp av en billig stasjonær fotolitografi oppsett og kommersielt tilgjengelig kolesterol modifisert oligonukleotider (CMOer) distribuert ved hjelp av et modulært format. CMO-merkede celler holder seg til høy effektivitet til DNA-mønstrede substrater. Denne tilnærmingen kan brukes til å mønstre flere celletyper samtidig med høy presisjon og til å lage matriser med mikrobrikker innebygd i en ekstracellulær matrise. Fordelene med denne metoden inkluderer dens høye oppløsning, evne til å bygge inn celler i et tredimensjonalt mikromiljø uten å forstyrre mikropatternet, og fleksibilitet i å mønstre en hvilken som helst celletype.
Plasseringen av celler med hensyn til hverandre i et vev er et viktig trekk ved mikromiljøet1,2,3,4. Teknikker som brukes til å mønstre levende celler i romlig kontrollerte ordninger er verdifulle eksperimentelle verktøy for å studere differensiering4,5,6,7,8, cellemotilitet9, morfogenese10,11,12, metabolisme13og cellecelleinteraksjoner7,14 . Det finnes en rekke metoder for mønsterceller, hver med sine egne fordeler og ulemper3,4. Metoder som skaper klebende øyer med ekstracellulære matriseproteiner (ECM), for eksempel mikrokontakttrykk og laserkuttede sjablonger, er enkle og skalerbare. Det er imidlertid vanskelig å mønstre mer enn en eller to celletyper om gangen fordi limegenskapene til forskjellige celletyper til forskjellige ECM-molekyler ofte er like15,16,17. Mer komplekse mikropatterner kan opprettes med lysindusert molekylær adsorpsjon (LIMAP), en teknikk som bruker UV-lys til å fyre opp PEG-belagte regioner og tillate påfølgende protein adsorpsjon18,19. Denne prosessen kan gjentas for å opprette mikropatterner med høy oppløsning med flere celletyper. Kryssbinding av celler til de forskjellige proteinplaster kan imidlertid forekomme, noe som resulterer i dårlig mønster spesifisitet19. Fysiske metoder som såddceller på mikromekaniske rekonfigurerbare kulturenheter kan skape strukturerte samkulturer med dynamisk kontroll, men uten fleksibiliteten i mønsterdesign av mikrokontakttrykk eller LIMAP14,8. I motsetning til de andre teknikkene kan bioprinting skape tredimensjonale ordninger av celler i hydrogeler20,21. Bioprinted konstruksjoner har imidlertid mye lavere oppløsning enn andre mikropatterningsteknikker, med en gjennomsnittlig funksjonsstørrelse på størrelse med hundrevis av mikron22. En ideell cellemønstermetode vil ha høy oppløsning, mønster flere celletyper, bruke utstyr og reagenser som er lett tilgjengelige, og ha muligheten til å legge inn vellykkede mønstre i en hydrogel for tredimensjonal (3D) cellekultur. I denne artikkelen presenterer vi CMO-DPAC, en cellemikropatteringsteknikk som bruker fleksibiliteten og hastigheten til DNA-hybridisering for å målrette celleadhesjon mot et substrat. Denne metoden er tilpasset fra våre tidligere protokoller23,24 for å gjøre den rimeligere, modulær og tilgjengelig. Ved hjelp av den nåværende protokollen skal ethvert laboratorium kunne sette opp et fullt funksjonelt system uten spesialisert utstyr eller ekspertise.
DNA-programmert montering av celler (DPAC) er en kraftig vevsteknikkteknikk som mønstrer celler ved encellet oppløsning med presis kontroll over cellecelleavstand og vevsgeometri. I DPAC er cellemembraner dekorert med DNA-oligonukleotider (oligos) ved hjelp av to lipidmodifiserte oligoer designet for å hybridisere på cellemembranen. Fordi oligoene er konjugert til hydrofobe lipider, partisjonerer de raskt til cellemembranen25 der de hybridiserer, øker netto hydrofobiskheten til de ikke-kovalent bundne molekylene, og dermed forbedrer levetiden på celleoverflaten26. Oligoene presenteres på celleoverflaten på en måte der de kan hybridisere med komplementære oligoer på andre celler eller DNA-funksjonaliserte glasssklier for å lage definerte 2D- eller 3D-cellemønstre med foreskrevet sammensetning, cellecelleavstand og geometri23,24. De mønstrede mikrotissuene kan spaltes av overflaten enzymatisk og legges inn i en hydrogel for langvarig 3D-kultur. Når de brukes i kombinasjon med primære celler eller stamceller, kan de resulterende samlingene av celler gjennomgå morfogenese og dannes i organoider23,27,28. DPAC har blitt brukt til å undersøke dynamikken i voksen nevral stamcelle skjebne som svar på konkurrerende signaler6,29, for å studere selvorganisering av pattedyr epitelceller23,28, og for å generere “vev origami” gjennom mesenchymal kondensasjon27.
DPAC muliggjør nøyaktig plassering av flere cellepopulasjoner og har vesentlig bedre oppløsning enn ekstruderingsbaserte bioprintere (i størrelsesorden mikron)22,23. I tillegg, i motsetning til ECM-baserte mønstermetoder som mikrokontaktutskrift, krever ikke DPAC differensialadhesjon av de forskjellige celletypene til en ECM-belagt overflate15,23. Det er ideelt for å svare på spørsmål om hvordan sammensetningen av et vev påvirker atferden, hvordan celler integrerer flere cellulære og mikroenvironmentale signaler når de tar beslutninger6,29, og hvordan par celler samhandler med hverandre. En fordel med denne metoden i forhold til andre mikropatterningsmetoder er at den kan brukes til 3D-cellekultur i et enkelt bildeplan, noe som letter tidsforløpstudier av vev selvorganisering og organoid morfogenese23,27,30.
Til tross for disse fordelene har vellykket implementering av DPAC krevd syntese av tilpassede oligonukleotidreagenser og tilgang til spesialisert utstyr for DNA-mønster23,24, noe som begrenser utbredt adopsjon. For eksempel må de optimale lipidmodifiserte oligoene (LMOene) som brukes i den opprinnelige protokollen, tilpasses syntetisert, modifisert med lignocerinsyre eller palmesyre og renset26. Denne prosessen krever bruk av en DNA-synthesizer og et høytytende flytende kromatografiinstrument, samt kjøp av tilhørende reagenser som metylamin, et kontrollert stoff som er underlagt både institusjonelle og føderale forskrifter. Som et alternativ kan LMOer tilpasses kjøpt i bulk, men dette krever en betydelig forhåndsinvestering i teknologien.
For å overvinne disse begrensningene har vi utviklet en revidert versjon av DPAC som bruker kommersielt tilgjengelige kolesterolmodifiserte oligos (CMOer) i stedet for de tilpassede syntetiserte LMOene. For ytterligere å redusere kostnadene og øke fleksibiliteten til plattformen, har vi endret oss til et modulært, tre-oligo-system. I stedet for å bestille en ny kolesterolmodifisert oligo for hver unike cellepopulasjon, kan en bruker av denne protokollen i stedet bruke de samme kolesterolmodifiserte oligoene (“Universal Anchor” og “Universal Co-Anchor”) for hver cellepopulasjon og deretter bruke en billig, umodifisert oligo (“Adapter Strand”) som hybridiserer med både Universal Anchor og enten det aminfunksjonaliserte DNA på overflaten eller Adapter Strand av en annen celletype.
En annen begrensning i den opprinnelige DPAC-protokollen var at den opprettet dna-mønstrede lysbilder ved hjelp av en høyoppløselig væskeskriver (f.eks. Nano eNabler, BioForce Nanosciences)23,24. Selv om dette instrumentet har ekstraordinær oppløsning og lave reagenskrav, er det ikke tilgjengelig for de fleste institusjoner og har en relativt lav utskriftshastighet (omtrent 1 funksjon mønstret per sekund). Nylig har to fotolittografiske metoder blitt utviklet for å mønstre DNA-funksjoner på overflater. Viola og kolleger brukte et polyakrylamid- og benzofenonbelegg som kovalent bundet enkeltstrenget DNA-oligos ved eksponering for UV-lys30. Ved hjelp av denne metoden var de i stand til å lage vevstillaser som gjennomgikk store, programmerte formendringer som følge av cellekontraktilitet og selvorganisering. Scheideler et al. utviklet en metode som bruker UV-eksponering av en positiv fotoresist for selektivt å eksponere aminmodifiserte DNA-oligos til et aldehydfunksjonalisert lysbilde29. Etter baking og reduktiv aminering er det aminmodifiserte DNA-et kovalent bundet til overflaten. Denne metoden ble brukt til å undersøke responsen til voksne nevrale stamceller for å presentere selvfornyelse og differensieringssignaler. Denne artikkelen tilpasser Scheideler et al.s protokoll for å lage DNA-mønstrene som vil fange CMO-merkede celler. Denne fotopatterningsprotokollen kan utføres uten å bruke et rent rom. Den bruker billig og kommersielt tilgjengelig utstyr som enkelt kan distribueres på en benkeplate eller avtrekkshette. Bruken av billig eller DIY (gjør-det-selv) fotolittografiutstyr øker tilgjengeligheten til forskere uten tilgang til rene romfasiliteter og lar forskere prøve teknikken uten en stor investering av tid eller ressurser31,32. Imidlertid kan bedre oppløsning og justering av flere DNA-funksjoner oppnås ved å bruke den kommersielle spinnfrakkeren og maskejusteringen som vanligvis finnes i renromsanlegg.
Her beskriver vi en metode for å mønster celler ved encellet oppløsning ved hjelp av DNA-basert vedheft. For det første brukes fotopatterning med en positiv fotoresist til å lage høyoppløselige mønstre av aminmodifisert DNA på et aldehydmodifisert glasssubstrat. Deretter behandles lysbildet for å redusere ikke-spesifikt cellevedlegg, og PDMS-flytceller opprettes for å begrense celler over mønstrede områder. Celler merkes deretter med korte DNA-oligonukleotider som er funksjonalisert med kolesterol og som et resultat settes inn i cellemembranen. Cellene blir deretter strømmet over DNA-mikropatternene. Hybridisering mellom celleoverflate-DNA og DNA på glassoverflaten resulterer i spesifikk vedheft av cellene til DNA-mønsteret. Ikke-tilhengerceller vaskes bort, og avslører det tilhengercellemønsteret. Denne prosessen kan gjentas for å mønstre flere celletyper eller opprette flerlagsstrukturer. Om ønskelig kan cellene bygges helt inn i en ECM for 3D-cellekultur.
I denne artikkelen presenterer vi en detaljert protokoll for høyoppløselig mønster av celler i 2D og 3D for in vitro cellekultureksperimenter. I motsetning til tidligere publiserte versjoner av denne metoden, fokuserer protokollen som presenteres her på brukervennlighet: den krever ikke høyt spesialisert utstyr, og alle reagenser kan kjøpes fra leverandører i stedet for å kreve tilpasset syntese. I motsetning til andre cellemikropatterningsmetoder er denne metoden rask og celletype agnostisk: det krever ikke spesifikk vedheft til ekstracellulære matriseproteiner15. Celler mønstret av CMO-DPAC kan bygges inn i en ekstracellulær matrise som Matrigel eller kollagen, noe som resulterer i 3D-kulturer med mye høyere romlig oppløsning enn det som for tiden er mulig med ekstruderingsutskriftsbaserte metoder22. CMO-DPAC kan brukes til å lage hundrevis til tusenvis av mikroskopiske funksjoner per lysbilde, slik at mange replikeringer kan utføres samtidig.
En av de viktigste parametrene for å lykkes med denne protokollen er tettheten av celler som legges til flytcellene på toppen av det mønstrede lysbildet. Ideelt sett bør tettheten være minst 25 millioner celler / ml. Når den lastes inn i strømningscellene, resulterer denne tettheten av celler i en nesten tettpakket monolayer av celler over mønsteret (Supplerende figur 2B). Disse høye celletetthetene maksimerer sannsynligheten for at en celle vil bosette seg direkte på toppen av et DNA-sted og følge. Hvis du reduserer celletettheten, reduseres den totale mønstereffektiviteten. Et annet kritisk trinn i denne protokollen er å suspendere cellene grundig i PBS eller serumfrie medier før du legger til CMO-løsningen. CMO-ene partisjonerer veldig raskt i cellemembraner og legger cmo-løsningen direkte til en cellepellet vil resultere i heterogen merking av celler. Etter å ha lagt CMO-løsningen til cellefjæringen, er det viktig å blande grundig ved pipettering slik at cellene er jevnt merket med CMOene. Etter inkubasjonene er det nødvendig å vaske ut overflødige CMOer grundig gjennom flere sentrifugerings- og vasketrinn. Overflødig gratis CMO tilstede i cellefjæringen vil binde seg til det mønstrede aminmodifiserte DNA-et på glasssklie, blokkere hybridisering og vedheft av CMO-modifiserte celler i suspensjon. Tid er også en viktig faktor for denne protokollen. Det er viktig å jobbe så raskt som mulig når du bruker CMOer og for å holde cellene på is for å minimere internalisering av CMOene og maksimere celle levedyktigheten. Flowcytometriforsøk har vist at CMOer ikke vedvarer så lenge på celleoverflaten som LMOer, med 25% tap av CMO-komplekser over to timer inkubasjon på is36. Videre vil levedyktigheten til celler reduseres etter hvert som cellehåndteringstiden øker. Levedyktighet kan maksimeres ved å jobbe raskt, holde celler på is, bruke iskalde reagenser og bruke serumfrie medier for å gi noen næringsstoffer.
Selv om CMO-DPAC kan være en kraftig måte å studere cellebiologi ved å mønstre celler med høy presisjon, har den sine begrensninger. CMO-DPAC-eksperimenter kan være utfordrende, spesielt ettersom den eksperimentelle kompleksiteten legges til med flere celletyper, lag eller 3D-cellekultur (Tilleggsfil 1). Eksperimentelle feil kan være vanlige når du starter denne protokollen, som beskrevet i tabell 1. Derfor anbefaler vi at brukere innfører kvalitetskontrollkontroller (bekrefter at DNA er til stede på lysbildet, bekrefter at cellene er tilstrekkelig merket med DNA (trinn 8), som bekrefter at overflødige celler er grundig vasket bort, etc.) for å sikre at eksperimentet lykkes og for å identifisere trinn som kan kreve ytterligere optimalisering. Vi håper at informasjonen i dette manuskriptet og dets tilleggsfiler vil bidra til å lette enhver nødvendig feilsøking.
Kolesterol er et bioaktivt molekyl hvis internalisering kan påvirke cellemetabolisme, genuttrykk og membranfluiditet37,38. En tidligere studie sammenlignet effektene på genuttrykk av CMO- og LMO-merkede celler ved hjelp av enkeltcellet RNA-sekvensering. CMO-merkede HEK-celler hadde endret genuttrykk sammenlignet med umerkede og LMO-merkede celler36. Merking av celler med CMOer resulterte i differensialuttrykket (> 1,5 ganger) av åtte gener i forhold til umerkede kontroller, inkludert AP2B1, som har vært knyttet til kolesterol og sphingolipid transport (GeneCards) og MALAT1, en lang ikke-koding RNA som regulerer kolesterolakkumulering39. Selv om de er små, kan disse transkripsjonelle responsene likevel være av bekymring hvis det aktuelle eksperimentet studerer metabolisme, membrandynamikk eller andre kolesterolrelaterte veier i celler.
Denne protokollen er fleksibel og kan justeres for å møte behovene til hvert eksperiment. Fordi CMO setter seg inn i lipidmembranen i stedet for å bruke en bestemt reseptor, er metoden celletypeagnostisk (HUVECer, MCF10As, HEKs og MDCK er demonstrert her). Selv om kolesterol er et annet hydrofobt anker enn våre tidligere publiserte LMOer, har vi så langt funnet at de oppfører seg på samme måte. Dermed forventer vi at CMOene fungerer med noen av de mange forskjellige celletypene som vi tidligere har publisert med LMOer, inkludert, men ikke begrenset til nevrale stamceller, fibroblaster, perifere mononukleære celler i blodet, tumorceller og primære pattedyrepiterieceller6,23,27,29,36 . CMO-merking stimulerer ikke TLR9, noe som tyder på at protokollen er kompatibel med immunceller. Membran inkorporering av CMO er en funksjon av total cellestørrelse og graden av negativ ladning i cellen glykokalyx35. Dermed har vi inkludert en protokoll (trinn 8) for å teste omfanget av membraninnretning som er egnet til rask optimalisering. De spesifikke egenskapene til hvert cellemønster vil uunngåelig variere basert på eksperimentell design (se Tilleggsfil 1 for mer veiledning). Selv om fotopatterningsprotokollen beskrevet ovenfor for mønster av DNA anbefales, bør enhver metode for romlig begrensende dråper med amin-DNA-løsning fungere, for eksempel bruk av høyoppløselige dråpeskrivere. Mønsteroppløsningen og minimumsavstanden for funksjoner varierer avhengig av metoden som brukes. Det er også teoretisk mulig å kombinere DNA-fotopatterning-delene av denne protokollen med andre metoder som har blitt brukt til å merke celler med DNA, for eksempel med DNA hybridisert til membran-uttrykte sinkfingre40, ved hjelp av NHS-konjugert DNA41, og reagerer azido sialsyrerester på celleoverflaten med fosfinkonjugert DNA42 . CMO-DPAC kan brukes på en rekke eksperimenter som krever tett kontroll over cellecelleavstand, inkludert studier av interaksjoner mellom cellepar, samkultureksperimenter som ser på overføring av signaler fra “avsender” celler til “mottaker” celler, og undersøkelser av effekten av nærliggende ekstracellulære signaler på stamcelledifferensiering6,29 . Metoden kan også brukes til å lage mikrobrikker som kan brukes til å studere cellemigrering i tre dimensjoner, selvorganisering av celler i vev23,27og det dynamiske samspillet mellom celler og ECM27. Vi håper at denne protokollen vil gi forskere en tilgjengelig plattform for å utforske nye anvendelser av DNA-basert cellemønster med høy oppløsning i sine egne laboratorier.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke Jeremy Garcia for å ha testet denne protokollen og Bhushan Kharbikar for å ha gitt opplæring i utstyret ved UCSF Biomedical Micro and Nanotechnology Core. Denne forskningen ble delvis støttet av tilskudd fra Department of Defense Breast Cancer Research Program (W81XWH-10-1-1023 og W81XWH-13-1-0221), NIH (U01CA199315, DP2 HD080351-01, 1R01CA190843-01, 1R21EB019181-01A og 1R21CA182375-01A1), NSF (MCB1330864) og UCSF Center for Cellular Construction (DBI-1548297), et NSF Science and Technology Center. O.J.S ble finansiert av et NSF Graduate Research Fellowship, et Siebel-stipend og et P.E.O. Scholarship. Z.J.G og A.R.A. er Chan-Zuckerberg BioHub-etterforskere.
2-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155379 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Adapter with External SM1 Threads and Internal SM3 Thread | ThorLabs | SM3A1 | |
Aldehyde Functionalized Slides | Schott | Nexterion Slide AL | Store under dry conditions after opening. |
All Plastic Syringes, 1 mL | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
Amine-Modified DNA Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Aspheric Condenser Lens | ThorLabs | ACL7560 | |
Borosilicate Disc, 6in Diameter X 1/2in Thick | Chemglass | CG-1906-23 | |
Cell Culture Dishes 60×15 mm style | Corning | 353002 | |
Cholesterol-Modified Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Diamond Scribe | Excelta | 475B | |
DNA Oligonucleotide | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Isopropyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
Methylene Chloride (Stabilized/Certified ACS) | Fisher Scientific | D37-4 | |
MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Microposit S1813 Positive Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Ø3" Adjustable Lens Tube, 0.81" Travel | ThorLabs | SM3V10 | |
Oven | Thermo Scientific | 51-028-112H | |
PE-50 Compact Benchtop Plasma Cleaning System | Plasma Etch | PE-50 | |
Photomask (custom) | CAD/Art Services | n/a | Minimum feature size guaranteed by CAD/Art Services is 10 microns. |
Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
RCT Basic Hot Plate | IKA | 3810001 | |
Silicon Wafer (100 mm) | University Wafer | 590 | |
Sodium Borohydride, 98%, granules | Acros Organics | 419471000 | |
Spin Coater Kit | Instras | SCK-200 | This is a low cost option, but any spin coater that can maintain a speed of 3000 rpm will suffice. |
SU-8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 4000L1PE | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 2646340 | |
Syringe Needles | Sigma-Aldrich | Z192341 | |
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | ThorLabs | LEDD1B | |
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl dimethylchlorosilane | Gelest | SIT8170.0 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 90335 | |
Turbo DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
Tweezers Style N7 | VWR | 100488-324 | The curved shape of these tweezers is essential for delicately picking up the PDMS flow cells containing patterned tissues. |
UV LED (365 nm, 190 mW (Min) Mounted LED, 700 mA) | ThorLabs | M365L2 | |
Wafer Tweezers | Agar Scientific | T5063 | |
WHEATON Dry-Seal vacuum desiccator | Millipore Sigma | W365885 |