Denne protokol gør det muligt at opretholde hvilende menneskelige hæmatopoietiske stamceller in vitro ved at efterligne knoglemarvsmikromiljøet ved hjælp af rigelige fedtsyrer, kolesterol, lavere koncentrationer af cytokiner og hypoxi.
Humane hæmatopoietiske stamceller (HSC’er), som andre pattedyr HSC’er, opretholde livslang hæmatopoiesis i knoglemarven. HSC’er forbliver hvilende in vivo, i modsætning til mere differentierede forfædre, og kommer hurtigt ind i cellecyklussen efter kemoterapi eller bestråling til behandling af knoglemarvsskade eller in vitro-kultur. Ved at efterligne knoglemarvsmikromiljøet i nærværelse af rigelige fedtsyrer, kolesterol, lav koncentration af cytokiner og hypoxi opretholder humane HSC’er quiescence in vitro. Her beskrives en detaljeret protokol til vedligeholdelse af funktionelle HSC’er i hviletilstandsin vitro. Denne metode vil gøre det muligt at undersøge adfærden hos humane HSC’er under fysiologiske forhold.
Hæmatopoietiske stamceller (HSC’er) og multipotente stamceller (MPP’er) danner koordinat et reservoir til kontinuerlig genopfyldning af differentierede celler for at opretholde hæmatopoiesis gennem livet hos mennesker1. Cellecyklus quiescence er et fremtrædende træk ved HSC’er, der adskiller dem fra MPP’er2. Konventionelt, HSC menes at opholde sig på toppen af hierarkiet af det hæmatopoietiske system, der producerer alle differentierede blodlegemer. Denne hierarkiske model blev for det meste udledt af transplantationseksperimenter3. Nylige undersøgelser viste imidlertid , at HSC’ernes dynamik varierer in vivo sammenlignet med dynamikken i transplantationsforsøg4,5,6,7. Afstamningssporingseksperimenter ved hjælp af flere stregkodesystemer afslørede, at fænotypiske murine HSC’er ikke er en unik celletype, der bidrager til hematopoiesis med stabil tilstand, og MPPs, der viser begrænset selvfornyelsesaktivitet ved transplantationsindstillinger, leverer kontinuerligt modne blodlegemer4,5,8. I modsætning hertil øges HSC’ernes bidrag til modne celler efter knoglemarvsskade4. Dette kan tilskrives drastiske ændringer i mikromiljøet efter knoglemarvsabblation, herunder knoglemarvstransplantation. Selv om det er vanskeligt at anvende afstamningssporing af murinceller på menneskelige celler, afslørede fylogenetisk analyse, der kombinerer encellet koloniisolation og hele genomsekvensering, en lignende egenskab ved det hæmatopoietiske system, hvor både HSC’er og MPP’er er ansvarlige for den daglige produktion af modne celler7. Selvom transplantation er afgørende for at undersøge murin eller menneskelig HSC-aktivitet, er andre eksperimentelle modeller således nødvendige for at forstå HSC’ernes adfærd under fysiologiske forhold.
Dyrkningsmetoder for HSC’er er blevet undersøgt i detaljer for at forstå deres kliniske anvendelser og egenskaber. Human HSC’er kan udvides in vitro ved hjælp af en kombination af cytokiner, rekonstituering af ekstracellulære matricer, fjernelse af selvfornyelsesantagonister, co-kultur med mesenchymale eller endotelceller, tilsætning af albumin eller dets udskiftning, transduktion af selvfornyelsestransskriptionsfaktorer og tilsætning af småmolekyleforbindelser9,10. Nogle af disse metoder, herunder tilsætning af små forbindelser SR111 og UM17112, er blevet testet i kliniske forsøg med lovende resultater9. I betragtning af den hvilende karakter af HSC’er in vivo, opretholde HSC’er med minimal celle cykling er afgørende for at opsummere HSC adfærd in vitro. Hvilende og voksende HSC’er udviser differentialcellecyklusindgang13, metabolisk status14og tolerance over for flere belastninger15 . De metoder, der anvendes til at opretholde quiescence af humane HSC’er in vitro er begrænsede.
Ved at efterligne knoglemarvens mikromiljø (hypoksisk og rig på lipider) og optimere koncentrationen af cytokiner kan humane HSC’er opretholdes udifferentierede og hvilende under kulturen. En opsummering af HSC’ernes hvilende karakter vil forbedre forståelsen af HSC’ernes stabile egenskaber og muliggøre eksperimentel manipulation af HSC’er.
For nylig er flere metoder til at udvide HSC’er med minimal differentiering blevet rapporteret18,19,20,21. Selv om disse metoder er fremragende, er HSC’er tvunget til at aktivere deres cellecyklusser i nærværelse af høje niveauer af cytokiner, som adskiller sig fra in vivo-situationen, hvor HSC’er viser minimal cykling. Denne protokol er nyttig til opretholdelse af HSC’er som hvilende, som observeret in vivo, ved at opsummere knoglemarvsmikromiljøet.
Ved at dyrke humane HSC’er under lave cytokin-, lipidrige og hypoksiske forhold viste HSC’er minimal cykling, samtidig med at de bevarede deres markørphoenotyper. Det kritiske skridt i denne protokol er forberedelsen af medium, der indeholder en høj koncentration af fedtsyrer og kolesterol og lave cytokinkoncentrationer og kultur under hypoxi (trin 1, trin 2 og trin 4). Uden kolesterol og/eller fedtsyrer falder vedligeholdelseshastigheden af HSC’er under lave cytokinkoncentrationer22. Dyrkning af celler under hypoksiske tilstande er også vigtig, som rapporteret tidligere23.
Dyrkningsbetingelserne svarede til dem, der blev anvendt til murin-HSC’er, bortset fra cytokinkoncentrationerne. Murine HSC’er overlever uden TPO, mens humane HSC’er kræver mindst 2 ng/mL TPO med 3 ng/mL SCF22. Da koncentrationen af TPO er meget højere end koncentrationen i humant serum (~100 pg/mL), kan de betingelser, der anvendes i denneprotokol, mangle specifikke faktorer til støtte for overlevelsen af humane HSC’er. Tilføjelsen af sin ligand FLT3LG reducerer behovet for , at TPO opretholderHSC’er 22.
HumanE HSC’er kræver højere koncentrationer af kolesterol sammenlignet med murin HSC’er, formentlig på grund af manglende evne til at fremkalde udtrykket af kolesterolsyntetiserende enzymer og modtagelighed for lipotoksicitet under høje koncentrationer (>400 μg/mL) af fedtsyrer22. Selv om kun kombinationen af palmitiske, oliesyrer, linolsyrer og stearinsyrer blev testet, som er rigeligt findes i det menneskelige serum, andre kombinationer af lipider bør evalueres for at reducere lipotoksicitet og forbedre hastigheden af opretholde funktionelle HSC’er.
Selv om repopulationsaktiviteten af dyrkede humane HSC’er i immundefektmus efter to ugers kultur er blevet bekræftet22, opsummerer dette kultursystem ikke fuldt ud HSC’ernes nichefunktioner in vivo. Det forlyder , at udtrykket af CD45RA er blevet øget , og at genbefolkningskapaciteten er ringere end for nysorterede HSC’er22. Koncentrationerne af næringsstoffer, såsom glukose, aminosyre, pyruvat og insulin, som tilsættes til mediet ved suprafysiologiske niveauer, kan dog optimeres. Forurenende stoffer i BSA kan også kompromittere vedligeholdelsen afHSC’er 18,25. Derudover gennemgår nogle dyrkede celler celledød, mens andre gennemgår celledeling; Vedligeholdelsen af det samlede cellenummer kan således ikke angive hvilestatus for hver celle.
På trods af disse begrænsninger vil de kulturbetingelser, der er beskrevet i protokollen, der er udviklet i denne undersøgelse, bidrage til at fremme forskning og teknik af HSC’er, især under næsten fysiologiske forhold. Kulturforhold, der opretholder HSC’er med minimal differentierings- og cykelaktivitet, ville være egnede til at teste biologiske og kemiske forbindelser, der specifikt virker på HSC’er, manipulere HSC’er via lentivirustransduktion eller genomredigering uden tab af stængelhed og belyse det første trin i transformationen forårsaget af leukæmirelaterede gener.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker M. Haraguchi og S. Tamaki for teknisk support og laboratorieledelse og K. Shiroshita for at tage billeder. HK blev delvist støttet af KAKENHI Grant fra MEXT/JSPS (bevilling nr. 19K17847) og National Center for Global Health and Medicine. KT blev delvist støttet af KAKENHI Grants fra MEXT/JSPS (bevilling nr. 18H02845 og 18K19570), National Center for Global Health and Medicine (bevillingsnr. 26-001 og 19A2002), AMED (tilskudsnr. JP18ck0106444, JP18ae0201014 og JP20bm0704042), Ono Medical Research Foundation, Kanzawa Medical Research Foundation og Takeda Science Foundation.
Human bone marrow CD34+ progenitor cells | Lonza | 2M-101C | |
NOD/Shi-scid,IL-2RγKO Jic | In-Vivo Science Inc. | https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html | |
Anti-human CD34-FITC (clone: 581) | BD biosciences | Cat# 560942; RRID: AB_10562559 | |
Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5 | BD biosciences | Cat# 551400; RRID: AB_394184 | |
Anti-human CD45RA-PE | BD biosciences | Cat# 555489; RRID: AB_395880 | |
Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10) | BD biosciences | Cat# 561558; RRID: AB_10714644 | |
Anti-human CD13-PE (clone: WM15) | BioLegend | Cat# 301703; RRID: AB_314179 | |
Anti-human CD33-PE (clone: WM53) | BD biosciences | Cat# 561816; RRID: AB_10896480 | |
Anti-human CD19-APC (clone: SJ259) | BioLegend | Cat# 363005; RRID: AB_2564127 | |
Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7) | BD biosciences | Cat# 561800; RRID: AB_10895381 | |
Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30) | BD biosciences | Cat# 563880; RRID:AB_2744402 | |
Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | Cat# 103114; RRID: AB_312979 | |
Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119) | BD biosciences | Cat# 557853; RRID: AB_396898 | |
Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2) | BD Biosciences | Cat# 553142; RRID: AB_394657 | |
Phosphate buffered saline | Nacalai Tesque | Cat# 14249-24 | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 26140079 | |
DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11320-033 | |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | Cat# 51500056 | |
Penicillin | Meiji Seika | PGLD755 | |
Streptomycin sulfate | Meiji Seika | SSDN1013 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | Cat# A4503 | |
Sodium palmitate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# P0007 | |
Sodium oleate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# O0057 | |
Cholesterol | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# C0318 | |
Ammonium Chloride | Fujifilm | Cat# 017-2995 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Fujifilm | Cat# 191-01305 | |
EDTA・2Na | Fujifilm | Cat# 345-01865 | |
Heparine Na | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. | Cat# 224122557 | |
Sevoflurane | Fujifilm | Cat# 193-17791 | |
Dextran | Nacalai Tesque | Cat# 10927-54 | |
Recombinant Human SCF | PeproTech | Cat# 300-07 | |
Recombinant Human TPO | PeproTech | Cat# 300-18 | |
Recombinant human Flt3 ligand | PeproTech | Cat# 300-19 | |
Propidium iodide | Life Technologies | Cat# P3566 | |
Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | Cat# 7547053 | |
FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
AutoMACS Pro | Miltenyi Biotec | N/A | |
FACS Aria3u | BD Biosciences | N/A | |
VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator) | VELVO-CLEAR | N/A | |
Nitrogen gas cylinder | KOIKE SANSHO CO., LTD | N/A | |
Gas regulator | Astec | Cat# IM-055 | |
Multigas incubator | Astec | Cat# SMA-30DR | |
Glass tube, 16 mL | Maruemu corporation | N-16 | |
Glass tube, 50 mL | Maruemu corporation | NX-50 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGPR33RS |