यह प्रोटोकॉल प्रचुर मात्रा में फैटी एसिड, कोलेस्ट्रॉल, साइटोकिन्स की कम सांद्रता और हाइपोक्सिया का उपयोग करके बोन मैरो माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करके विट्रो में शांत मानव हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव में सक्षम बनाता है।
अन्य स्तनधारी एचएससी की तरह मानव हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी), अस्थि मज्जा में आजीवन हेमेटोपोसिस बनाए रखते हैं। एचएससी अधिक विभेदित जनकों के विपरीत वीवो में शांत रहते हैं, और बोन मैरो इंजरी या इन विट्रो कल्चर के इलाज के लिए कीमोथेरेपी या विकिरण के बाद तेजी से सेल चक्र में प्रवेश करते हैं। प्रचुर मात्रा में फैटी एसिड, कोलेस्ट्रॉल, साइटोकिन्स की कम एकाग्रता, और हाइपोक्सिया की उपस्थिति में बोन मैरो माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करके, मानव एचएससी विट्रो में क्विसेंस बनाए रखते हैं। यहां, विट्रो में शांत राज्य में कार्यात्मक एचएससी को बनाए रखने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। इस विधि शारीरिक परिस्थितियों में मानव HSCs के व्यवहार के अध्ययन में सक्षम हो जाएगा।
हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी) और मल्टीपॉटेंट जनक कोशिकाएं (एमपीपी) मनुष्यों में जीवन भर हेमेटोपोइसिस को बनाए रखने के लिए विभेदित कोशिकाओं की निरंतर भरपाई के लिए एक जलाशय बनाती हैं1। सेल चक्र क्विसेंस एचएससी की एक प्रमुख विशेषता है, जो उन्हें एमपीपीएस2से अलग करती है। परंपरागत रूप से, एचएससी को हेमेटोपोइटिक सिस्टम के पदानुक्रम के शीर्ष पर रहने के लिए सोचा जाता है, जो सभी विभेदित रक्त कोशिकाओं का उत्पादन करता है। इस पदानुक्रमित मॉडल को ज्यादातर प्रत्यारोपण प्रयोगों से कम किया गया था3. हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि प्रत्यारोपण प्रयोगों में उन लोगों की तुलना में वीवो में एचएससी की गतिशीलता भिन्न है4,5,6,7. कई बार्कोडिंग सिस्टम का उपयोग करके वंश ट्रेसिंग प्रयोगों से पता चला है कि फेनोटाइपिक मुरीन एचएससी एक अद्वितीय सेल प्रकार नहीं है जो स्थिर-राज्य हेमेटोपोसिस में योगदान देता है, और एमपीपी, जो प्रत्यारोपण सेटिंग्स पर सीमित आत्म-नवीकरण गतिविधि प्रदर्शित करता है, लगातार परिपक्व रक्त कोशिकाओं की आपूर्ति4,5,8। इसके विपरीत, बोन मैरो इंजरी 4 के बाद परिपक्व कोशिकाओं में एचएसएससी का योगदान बढ़ायाजाताहै । यह अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण सहित अस्थि मज्जा एब्लेशन के बाद माइक्रोएनवायरमेंट में भारी परिवर्तन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। हालांकि मानव कोशिकाओं के लिए मुरीन कोशिकाओं के वंश का पता लगाने को लागू करना मुश्किल है, एकल कोशिका-व्युत्पन्न कॉलोनी अलगाव और पूरे जीनोम अनुक्रमण के संयोजन से फिलोजेनेटिक विश्लेषण ने हेमेटोपोइटिक सिस्टम की एक समान संपत्ति का पता चला, जिसमें एचएससी और एमपीपी दोनों परिपक्व कोशिकाओं के दैनिक उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं7। इस प्रकार, हालांकि प्रत्यारोपण मुरीन या मानव एचएससी गतिविधि की जांच के लिए आवश्यक है, शारीरिक परिस्थितियों में एचएससी के व्यवहार को समझने के लिए अन्य प्रयोगात्मक मॉडलों की आवश्यकता होती है।
एचएससी के लिए खेती के तरीकों का विस्तार से अध्ययन किया गया है ताकि उनके नैदानिक अनुप्रयोगों और विशेषताओं को समझा जा सके। मानव एचएससी को साइटोकिन्स के संयोजन, बाह्य-मित्रिफियों के पुनर्गठन, स्व-नवीकरण विरोधी को हटाने, मेसेंचिमल या एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति, एल्बुमिन या इसके प्रतिस्थापन के अलावा, आत्म-नवीकरण प्रतिलेखन कारकों के लेनदेन, और छोटे अणु यौगिकों के अलावा9,10के संयोजन का उपयोग करके विट्रो में विस्तारित किया जा सकता है। इनमें से कुछ तरीकों, जिनमें छोटे यौगिकों को जोड़ दिया गयाएसआर1 11 और यूएम17112,नैदानिक परीक्षणों में आशाजनक परिणाम9के साथ परीक्षण किया गया है। वीवो में एचएससी की शांत प्रकृति को ध्यान में रखते हुए, न्यूनतम सेल साइकिलिंग के साथ एचएससी को बनाए रखना विट्रो में एचएससी व्यवहार को फिर से काटना महत्वपूर्ण है। ल्यूसेंट और प्रसार एचएससी अंतर कोशिका चक्र प्रविष्टि13, मेटाबोलिक स्थिति14और कई तनावों के खिलाफ सहिष्णुता का प्रदर्शन करते हैं15 . विट्रो में मानव एचएससी की quiescence बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों सीमित हैं।
बोन मैरो (हाइपोक्सिक और लिपिड में समृद्ध) के माइक्रोएनवायरनमेंट की नकल करके और साइटोकिन्स की एकाग्रता को अनुकूलित करके, मानव एचएससी को संस्कृति के तहत अविभेदित और शांत बनाए रखा जा सकता है। विट्रो में एचएससी की शांत प्रकृति को पुनः निर्धारित करने से एचएससी के स्थिर राज्य गुणों की समझ में सुधार होगा और एचएससी के प्रायोगिक हेरफेर को सक्षम किया जा सकेगा।
हाल ही में, न्यूनतम भेदभाव के साथ एचएससी के विस्तार के लिए कई तरीकों की सूचना दी गई है18,19,20,21. हालांकि ये विधियां उत्कृष्ट हैं, एचएससी को साइटोकिन्स के उच्च स्तर की उपस्थिति में अपने सेल चक्रों को सक्रिय करने के लिए मजबूर किया जाता है, जो वीवो स्थिति में से अलग होता है जिसमें एचएससी न्यूनतम साइकिलिंग दिखाते हैं। यह प्रोटोकॉल एचएससी को शांत के रूप में बनाए रखने के लिए उपयोगी है, जैसा कि वीवो में मनाया जाता है, बोन मैरो माइक्रोएनवायरमेंट को फिर से शुरू करके।
कम साइटोकिन, लिपिड-समृद्ध और हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत मानव एचएससी को बनाकर, एचएससी ने अपने मार्कर फेनोटाइप को बनाए रखते हुए न्यूनतम साइकिलिंग दिखाई। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हाइपोक्सिया (चरण 1, चरण 2, और चरण 4) के तहत फैटी एसिड और कोलेस्ट्रॉल और कम साइटोकिन सांद्रता और संस्कृति की उच्च एकाग्रता वाले माध्यम की तैयारी है। कोलेस्ट्रॉल और/या फैटी एसिड के बिना, कम साइटोकिन सांद्रता के तहत एचएससी की रखरखाव दर22कम हो जाती है । हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत कोशिकाओं की खेती भी महत्वपूर्ण है, जैसा कि पहले23बताया गया था ।
संस्कृति की स्थितियां साइटोकिन सांद्रता को छोड़कर, मुरीन एचएससी के लिए उपयोग की जाने वाली स्थितियों के समान थीं। मुरीन एचएससी टीपीओ के बिना जीवित रहते हैं, जबकि मानव एचएससी को एससीएफ 22 के 3 एनजी/एमएल के साथ टीपीओ के कम से2एनजी/एमएल की आवश्यकता होती है । चूंकि टीपीओ की एकाग्रता मानव सीरम (~ 100 पीजी/एमएल) की तुलना में बहुत अधिक है, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली स्थितियां मानव एचएससी के अस्तित्व का समर्थन करने के लिए विशिष्ट कारकों को याद कर सकती हैं। FLT3 मानव एचएससीएस24पर व्यक्त किया गया है। इसके लिगांड FLT3LG के अलावा 22 एचएससी22को बनाए रखने के लिए टीपीओ के लिए आवश्यकता को थोड़ा कम कर देता है ।
मानव एचएससी को मुरीन एचएससी की तुलना में कोलेस्ट्रॉल की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है, संभवतः कोलेस्ट्रॉल संश्लेषित एंजाइमों की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने में असमर्थता और फैटी एसिड22के उच्च सांद्रता (>400 माइक्रोग्राम/एमएल) के तहत लिपोटॉक्सिकता के लिए संवेदनशीलता के कारण। यद्यपि केवल पामिटिक, ओलिक, लिनोलिक और स्टीरिक एसिड के संयोजन का परीक्षण किया गया था, जो मानव सीरम में प्रचुर मात्रा में पाए जाते हैं, लिपिड के अन्य संयोजनों का मूल्यांकन लिपोटॉक्सिकिटी को कम करने और कार्यात्मक एचएससी को बनाए रखने की दर में सुधार करने के लिए किया जाना चाहिए।
यद्यपि दो सप्ताह की संस्कृति के बाद इम्यूनोडिरकी चूहों में सुसंस्कृत मानव एचएससी की पुनर्जनसंख्या गतिविधि की पुष्टि की गई है22,यह संस्कृति प्रणाली वीवो में एचएससी के आला कार्यों को पूरी तरह से पुन: रीकैपिटल नहीं करती है। CD45RA की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है और पुनर्जनसंख्या क्षमता हौसले से हल किए गए एचएससीएस22से कम है । हालांकि, ग्लूकोज, अमीनो एसिड, पाइरुवेट और इंसुलिन जैसे पोषक तत्वों की सांद्रता, जो सुपराफिजियोलॉजिकल स्तर पर माध्यम में जोड़ी जाती है, अनुकूलित की जा सकती है। बीएसए में संदूषक एचएससी18,25के रखरखाव से भी समझौता करसकतेहैं . इसके अलावा, कुछ सुसंस्कृत कोशिकाओं को कोशिका मृत्यु से गुजरना पड़ता है, जबकि अन्य कोशिका विभाजन से गुजरते हैं; इस प्रकार, कुल सेल संख्या के रखरखाव प्रत्येक कोशिका की शांत स्थिति का संकेत नहीं हो सकता है।
इन सीमाओं के बावजूद, इस अध्ययन में विकसित प्रोटोकॉल में वर्णित संस्कृति की स्थिति एचएससी के अनुसंधान और इंजीनियरिंग को आगे बढ़ाने में मदद करेगी, विशेष रूप से लगभग शारीरिक परिस्थितियों में । संस्कृति की स्थिति है कि ंयूनतम भेदभाव और साइकिल चालन गतिविधि के साथ HSCs बनाए रखने के जैविक और रासायनिक विशेष रूप से HSCs पर अभिनय यौगिकों के परीक्षण के लिए उपयुक्त होगा, स्टेमनेस के नुकसान के बिना लेंटीवायरस ट्रांसडक्शन या जीनोम संपादन के माध्यम से HSCs हेरफेर, और ल्यूकेमिया से जुड़े जीन द्वारा प्रेरित परिवर्तन के प्रारंभिक कदम को स्पष्ट ।
The authors have nothing to disclose.
हम एम हरगुची और एस तामाकी को तकनीकी सहायता और प्रयोगशाला प्रबंधन और के शिरोशिता को फोटोग्राफ लेने के लिए धन्यवाद देते हैं । HK को एमईएक्सटी/जेएसपीएस (ग्रांट नंबर 19K17847) और नेशनल सेंटर फॉर ग्लोबल हेल्थ एंड मेडिसिन से काकेनही ग्रांट द्वारा भाग में समर्थन दिया गया था । केटी को एमईएक्सटी/जेएसपीएस (अनुदान नग 18H02845 और 18K19570), नेशनल सेंटर फॉर ग्लोबल हेल्थ एंड मेडिसिन (अनुदान नग 26-001 और 19A2002), एएमईड (अनुदान नग) से KAKENHI अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था । JP18ck0106444, JP18ae0201014, और JP20bm0704042), ओनो मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, कंजावा मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, और Takeda विज्ञान फाउंडेशन।
Human bone marrow CD34+ progenitor cells | Lonza | 2M-101C | |
NOD/Shi-scid,IL-2RγKO Jic | In-Vivo Science Inc. | https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html | |
Anti-human CD34-FITC (clone: 581) | BD biosciences | Cat# 560942; RRID: AB_10562559 | |
Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5 | BD biosciences | Cat# 551400; RRID: AB_394184 | |
Anti-human CD45RA-PE | BD biosciences | Cat# 555489; RRID: AB_395880 | |
Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10) | BD biosciences | Cat# 561558; RRID: AB_10714644 | |
Anti-human CD13-PE (clone: WM15) | BioLegend | Cat# 301703; RRID: AB_314179 | |
Anti-human CD33-PE (clone: WM53) | BD biosciences | Cat# 561816; RRID: AB_10896480 | |
Anti-human CD19-APC (clone: SJ259) | BioLegend | Cat# 363005; RRID: AB_2564127 | |
Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7) | BD biosciences | Cat# 561800; RRID: AB_10895381 | |
Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30) | BD biosciences | Cat# 563880; RRID:AB_2744402 | |
Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | Cat# 103114; RRID: AB_312979 | |
Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119) | BD biosciences | Cat# 557853; RRID: AB_396898 | |
Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2) | BD Biosciences | Cat# 553142; RRID: AB_394657 | |
Phosphate buffered saline | Nacalai Tesque | Cat# 14249-24 | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 26140079 | |
DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11320-033 | |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | Cat# 51500056 | |
Penicillin | Meiji Seika | PGLD755 | |
Streptomycin sulfate | Meiji Seika | SSDN1013 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | Cat# A4503 | |
Sodium palmitate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# P0007 | |
Sodium oleate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# O0057 | |
Cholesterol | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# C0318 | |
Ammonium Chloride | Fujifilm | Cat# 017-2995 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Fujifilm | Cat# 191-01305 | |
EDTA・2Na | Fujifilm | Cat# 345-01865 | |
Heparine Na | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. | Cat# 224122557 | |
Sevoflurane | Fujifilm | Cat# 193-17791 | |
Dextran | Nacalai Tesque | Cat# 10927-54 | |
Recombinant Human SCF | PeproTech | Cat# 300-07 | |
Recombinant Human TPO | PeproTech | Cat# 300-18 | |
Recombinant human Flt3 ligand | PeproTech | Cat# 300-19 | |
Propidium iodide | Life Technologies | Cat# P3566 | |
Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | Cat# 7547053 | |
FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
AutoMACS Pro | Miltenyi Biotec | N/A | |
FACS Aria3u | BD Biosciences | N/A | |
VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator) | VELVO-CLEAR | N/A | |
Nitrogen gas cylinder | KOIKE SANSHO CO., LTD | N/A | |
Gas regulator | Astec | Cat# IM-055 | |
Multigas incubator | Astec | Cat# SMA-30DR | |
Glass tube, 16 mL | Maruemu corporation | N-16 | |
Glass tube, 50 mL | Maruemu corporation | NX-50 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGPR33RS |