Denne protokollen gjør det mulig å opprettholde quiescent human hematopoietiske stamceller in vitro ved å etterligne benmargsmikromiljøet ved hjelp av rikelig fettsyre, kolesterol, lavere konsentrasjoner av cytokiner og hypoksi.
Humane hematopoietiske stamceller (HSC), som andre pattedyr HSC, opprettholder livslang hematopoiesis i benmargen. HSC-er forblir passiv in vivo, i motsetning til mer differensierte forfedre, og går raskt inn i cellesyklusen etter kjemoterapi eller bestråling for å behandle benmargsskade eller in vitrokultur. Ved å etterligne benmargsmikromiljøet i nærvær av rikelige fettsyrer, kolesterol, lav konsentrasjon av cytokiner og hypoksi, opprettholder menneskelige HSC-er passivence in vitro. Her beskrives en detaljert protokoll for vedlikehold av funksjonelle HSC-er i passiv tilstand in vitro. Denne metoden vil muliggjøre studier av oppførselen til menneskelige HSC-er under fysiologiske forhold.
Hematopoietiske stamceller (HSC) og multipotente stamceller (MPPer) danner koordinat et reservoar for kontinuerlig etterfylling av differensierte celler for å opprettholde hematopoiesis gjennom livet hos mennesker1. Cellesyklus passivisens er et fremtredende trekk ved HSC-er, og skiller dem fra MPPer2. Konvensjonelt antas HSC å ligge på toppen av hierarkiet i det hematopoietiske systemet, og produserer alle differensierte blodlegemer. Denne hierarkiske modellen ble for det meste utledet fra transplantasjonsforsøk3. Nyere studier indikerte imidlertid at dynamikken i HSC-er varierer in vivo sammenlignet med de i transplantasjonsforsøk4,5,6,7. Lineage tracing eksperimenter ved hjelp av flere barkodingssystemer avslørte at fenotypisk murine HSC-er ikke er en unik celletype som bidrar til steady-state hematopoiesis, og MPPer, som viser begrenset selvfornyelsesaktivitet ved transplantasjonsinnstillinger, leverer kontinuerlig modne blodlegemer4,5,8. Derimot forbedres bidraget fra HSC til modne celler etter benmargsskade4. Dette kan tilskrives drastiske endringer i mikromiljøet etter benmargsablasjon, inkludert benmargstransplantasjon. Selv om det er vanskelig å bruke avstamningssporing av murine celler på menneskelige celler, avslørte fylogenetisk analyse som kombinerer encellet koloniisolasjon og hele genomsekvensering en lignende egenskap av det hematopoietiske systemet, der både HSC og MPPer er ansvarlige for den daglige produksjonen av modne celler7. Således, selv om transplantasjon er avgjørende for å undersøke murin eller menneskelig HSC-aktivitet, er det nødvendig med andre eksperimentelle modeller for å forstå oppførselen til HSC under fysiologiske forhold.
Culturing metoder for HSC har blitt studert i detalj for å forstå deres kliniske anvendelser og egenskaper. Menneskelige HSC-er kan utvides in vitro ved hjelp av en kombinasjon av cytokiner, rekonstituering av ekstracellulære matriser, fjerning av selvfornyelsesantagonister, samkultur med mesenchymale eller endotelceller, tillegg av albumin eller erstatning, transduksjon av selvfornyelsestranskripsjonsfaktorer og tilsetning av småmolekylforbindelser9,10. Noen av disse metodene, inkludert tilsetning av små forbindelser SR111 og UM17112, har blitt testet i kliniske studier med lovende resultater9. Tatt i betraktning den passive naturen til HSC-er in vivo, er vedlikehold av HSC-er med minimal cellesykling avgjørende for å rekapitulere HSC-oppførsel in vitro. Passiv og prolifererende HSC-er viser differensialcellesyklusoppføring13, metabolsk status14og toleranse mot flere påkjenninger15 . Metodene som brukes for å opprettholde passivheten til menneskelige HSC-er in vitro er begrenset.
Ved å etterligne mikromiljøet i benmargen (hypoksisk og rik på lipider) og optimalisere konsentrasjonen av cytokiner, kan menneskelige HSC-er opprettholdes uavklart og passivisert under kultur. Recapitulating den passiv karakter av HSC in vitro vil forbedre forståelsen av steady state egenskaper av HSC og muliggjør eksperimentell manipulering av HSC.
Nylig har flere metoder for å utvide HSC-er med minimal differensiering blitt rapportert18,19,20,21. Selv om disse metodene er gode, er HSC-er tvunget til å aktivere cellesyklusene sine i nærvær av høye nivåer av cytokiner, som er forskjellig fra in vivo-situasjonen der HSC-er viser minimal sykling. Denne protokollen er nyttig for å opprettholde HSC-er som passivitet, som observert in vivo, ved å rekapitlere benmargsmikromiljøet.
Ved å dyrke menneskelige HSC-er under lave cytokin-, lipidrike og hypoksiske forhold, viste HSC minimal sykling samtidig som de opprettholdt sine markørfenotyper. Det kritiske trinnet i denne protokollen er utarbeidelsen av medium som inneholder en høy konsentrasjon av fettsyrer og kolesterol og lave cytokinkonsentrasjoner og kultur under hypoksi (trinn 1, trinn 2 og trinn 4). Uten kolesterol og / eller fettsyrer reduseres vedlikeholdshastigheten til HSC-er under lave cytokinkonsentrasjoner22. Culturing av celler under hypoksiske forhold er også viktig, som rapportert tidligere23.
Kulturforholdene var lik de som ble brukt til murine HSC-er, bortsett fra cytokinkonsentrasjonene. Murine HSC overlever uten TPO, mens menneskelige HSC-er krever minst 2 ng/ml TPO med 3 ng/ml SCF22. Siden konsentrasjonen av TPO er mye høyere enn i humant serum (~ 100 pg / ml), kan forholdene som brukes i denne protokollen mangle spesifikke faktorer for å støtte overlevelsen til menneskelige HSC-er. FLT3 uttrykkes på menneskelige HSC24. Tillegg av sin ligand FLT3LG reduserer litt kravet om at TPO skal opprettholde HSC22.
Menneskelige HSC-er krever høyere konsentrasjoner av kolesterol sammenlignet med murine HSC-er, antagelig på grunn av manglende evne til å indusere uttrykket av kolesterolsyntetiserende enzymer og følsomhet for lipotoksisitet under høye konsentrasjoner (>400 μg / ml) av fettsyrer22. Selv om bare kombinasjonen av palmittiske, oljesyrer, linolsyrer og stearinsyrer ble testet, som er rikelig funnet i det menneskelige serumet, bør andre kombinasjoner av lipider evalueres for å redusere lipotoksisitet og forbedre hastigheten på å opprettholde funksjonelle HSC-er.
Selv om repopulation aktiviteten til kultiverte menneskelige HSC-er i immunodeficient mus etter to uker med kultur er bekreftet22, dette kultursystemet ikke fullt ut rekapitulere nisjefunksjonene til HSC in vivo. Uttrykket av CD45RA har blitt rapportert å øke og repopulation kapasiteten er dårligere enn for nysorterte HSC22. Imidlertid kan konsentrasjonene av næringsstoffer, som glukose, aminosyre, pyruvat og insulin, som legges til mediet ved suprafysiologiske nivåer, optimaliseres. Forurensninger i BSA kan også kompromittere vedlikeholdet av HSC18,25. I tillegg gjennomgår noen dyrkede celler celledød, mens andre gjennomgår celledeling; Vedlikehold av det totale cellenummeret kan derfor ikke indikere passivstatusen til hver celle.
Til tross for disse begrensningene vil kulturforholdene som er beskrevet i protokollen utviklet i denne studien bidra til å fremme forskning og prosjektering av HSC-er, spesielt under nesten fysiologiske forhold. Kulturforhold som opprettholder HSC-er med minimal differensierings- og sykkelaktivitet, vil være egnet for testing av biologiske og kjemiske forbindelser som spesifikt virker på HSC-er, manipulere HSC via lentivirustransduksjon eller genomredigering uten tap av stemness, og belyse det første trinnet i transformasjon indusert av leukemi-assosierte gener.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker M. Haraguchi og S. Tamaki for teknisk støtte og laboratorieledelse og K. Shiroshita for å ha tatt bilder. HK ble delvis støttet av KAKENHI Grant fra MEXT/JSPS (tilskudd nr. 19K17847) og National Center for Global Health and Medicine. KT ble delvis støttet av KAKENHI Grants fra MEXT/JSPS (tilskuddsnr. 18H02845 og 18K19570), National Center for Global Health and Medicine (grant nos. 26-001 og 19A2002), AMED (grant nos. JP18ck0106444, JP18ae0201014 og JP20bm0704042), Ono Medical Research Foundation, Kanzawa Medical Research Foundation og Takeda Science Foundation.
Human bone marrow CD34+ progenitor cells | Lonza | 2M-101C | |
NOD/Shi-scid,IL-2RγKO Jic | In-Vivo Science Inc. | https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html | |
Anti-human CD34-FITC (clone: 581) | BD biosciences | Cat# 560942; RRID: AB_10562559 | |
Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5 | BD biosciences | Cat# 551400; RRID: AB_394184 | |
Anti-human CD45RA-PE | BD biosciences | Cat# 555489; RRID: AB_395880 | |
Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10) | BD biosciences | Cat# 561558; RRID: AB_10714644 | |
Anti-human CD13-PE (clone: WM15) | BioLegend | Cat# 301703; RRID: AB_314179 | |
Anti-human CD33-PE (clone: WM53) | BD biosciences | Cat# 561816; RRID: AB_10896480 | |
Anti-human CD19-APC (clone: SJ259) | BioLegend | Cat# 363005; RRID: AB_2564127 | |
Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7) | BD biosciences | Cat# 561800; RRID: AB_10895381 | |
Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30) | BD biosciences | Cat# 563880; RRID:AB_2744402 | |
Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | Cat# 103114; RRID: AB_312979 | |
Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119) | BD biosciences | Cat# 557853; RRID: AB_396898 | |
Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2) | BD Biosciences | Cat# 553142; RRID: AB_394657 | |
Phosphate buffered saline | Nacalai Tesque | Cat# 14249-24 | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 26140079 | |
DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11320-033 | |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | Cat# 51500056 | |
Penicillin | Meiji Seika | PGLD755 | |
Streptomycin sulfate | Meiji Seika | SSDN1013 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | Cat# A4503 | |
Sodium palmitate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# P0007 | |
Sodium oleate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# O0057 | |
Cholesterol | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# C0318 | |
Ammonium Chloride | Fujifilm | Cat# 017-2995 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Fujifilm | Cat# 191-01305 | |
EDTA・2Na | Fujifilm | Cat# 345-01865 | |
Heparine Na | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. | Cat# 224122557 | |
Sevoflurane | Fujifilm | Cat# 193-17791 | |
Dextran | Nacalai Tesque | Cat# 10927-54 | |
Recombinant Human SCF | PeproTech | Cat# 300-07 | |
Recombinant Human TPO | PeproTech | Cat# 300-18 | |
Recombinant human Flt3 ligand | PeproTech | Cat# 300-19 | |
Propidium iodide | Life Technologies | Cat# P3566 | |
Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | Cat# 7547053 | |
FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
AutoMACS Pro | Miltenyi Biotec | N/A | |
FACS Aria3u | BD Biosciences | N/A | |
VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator) | VELVO-CLEAR | N/A | |
Nitrogen gas cylinder | KOIKE SANSHO CO., LTD | N/A | |
Gas regulator | Astec | Cat# IM-055 | |
Multigas incubator | Astec | Cat# SMA-30DR | |
Glass tube, 16 mL | Maruemu corporation | N-16 | |
Glass tube, 50 mL | Maruemu corporation | NX-50 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGPR33RS |